CN118109500A - 水稻OsGLTF基因或其编码的蛋白在提高水稻产量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水稻基因工程技术领域，具体涉及水稻OsGLTF基因或其编码的蛋白在提高水稻产量中的应用。本发明公开了水稻OsGLTF基因或其编码的蛋白在提高水稻产量中的应用，涉及生物工程技术领域。本发明通过过表达水稻中OsGLTF基因，使得转基因水稻粒长粒重增加、穗型增大；而在osgltf敲除突变体水稻中粒长粒厚和粒重均减少，说明OsGLTF基因能调控水稻粒型和产量，具有生产应用的潜能。
Description
技术领域
本发明属于水稻基因工程技术领域，具体涉及水稻OsGLTF基因或其编码的蛋白在提高水稻产量中的应用。
背景技术
水稻产量潜力直接由穗数、每穗实粒数、千粒重决定，此外，抽穗期、株高、株型等性状间接影响水稻产量。
GATA转录因子能够特异识别并结合靶基因启动子上的(T/A)GATA(G/A)序列，因此被命名为GATA转录因子(Arguello-Astorga and Herrera-Estrella 1998)。一个典型的GATA转录因子通常含有一个特殊的IV类锌指结构(C-X2-C-X17-20-C-X2-C)，在植物中第一个被鉴定的GATA转录因子，为烟草的TNL1(Danielvedele and Caboche 1993)。目前在水稻中已经有多个编码GATA转录因子的基因被克隆，其中SNFL1(Short and narrow flag leaf1)上一个碱基的错位突变被报道能够造成水稻剑叶发育的严重缺陷，造成水稻剑叶短小(He,Wang et al.2018)。NECK LEAF 1(NL1)的功能缺失能造成水稻开花推迟、穗型缩小，证明NL1参与水稻器官发育的调控(Wang,Yin et al.2009)。CYTOKININ-RESPONSIVE GATATRANSCRIPTION FACTOR1(CGA1)的表达受到光照、氮素和细胞分裂素的诱导，并且受到黑暗和赤霉素GA信号的抑制，功能分析实验证明CGA1的参与了水稻灌浆、叶绿体形成以及器官衰老等多个生物学途径(Hudson,Guevara et al.2013)。OsGATA7被报道参与调控水稻的株高、叶夹角、穗型、粒型，并且OsGATA7参与了油菜素内酯信号介导的植物生长调控(Zhang,Zhang et al.2018)。OsGATA8位于耐盐相关的saltol QTL位点，后续分析证明OsGATA8的表达能够显著被盐、干旱以及ABA所诱导，过量表达OsGATA8能够显著提高正常条件以及盐胁迫下水稻的生物量积累和光合效率(Nutan,Singla-Pareek etal.2020)。OsGATA12的过量表达可以显著提高水稻叶片中叶绿体的数量、推迟植物衰老并提高产量(Lu,Casaretto etal.2017)。由上述已被克隆的水稻GATA转录因子可以看出，GATA转录因子在水稻中广泛参与了光合作用、器官发育、激素信号传导等多种生物进程。但是有关GATA转录因子详细参与水稻籽粒发育和调控产量的报道很少，且关于OsGLTF调控水稻粒型和产量的功能未见报道、机理尚未明晰。
发明内容
为了挖掘OsGLTF基因的新用途，本发明公开了以下的技术方案：
本发明公开了水稻OsGLTF基因或OsGLTF蛋白在提高水稻产量中的应用，所述水稻OsGLTF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述OsGLTF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，由所述水稻OsGLTF基因编码得到。
本发明还公开了水稻OsGLTF基因或OsGLTF蛋白在调控水稻株高、谷粒粒长和粒重中至少一种的应用，所述水稻OsGLTF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述OsGLTF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，由所述水稻OsGLTF基因编码得到。
一种提高水稻产量的方法，在水稻作物中超表达或过表达OsGLTF基因，所述OsGLTF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
一种提高水稻产量的方法，具体包括以下步骤：
(1)将OsGLTF基因与质粒连接，构建含有OsGLTF基因的超表达或过表达载体；
(2)将步骤(1)构建的OsGLTF基因的超表达或过表达载体导入水稻的细胞中，培养后获得转基因植株。
优选地，在步骤(1)中所述质粒载体双元表达载体。
优选地，在步骤(2)将含有OsGLTF基因的超表达或过表达载体转入农杆菌基因工程菌后，侵染水稻的细胞。
优选地，所述农杆菌基因工程菌为农杆菌EHA105菌株。
优选地，在步骤(2)农杆菌基因工程菌侵染的水稻的细胞来源为水稻种子的愈伤组织。
本发明的有益效果：
本发明通过过表达或超表达OsGLTF基因，与野生型植株相比，转基因水稻谷粒粒长和千粒重均增加；而在水稻中敲除OsGLTF基因，水稻谷粒粒长、粒宽和千粒重均减少，说明OsGLTF基因能调控水稻粒型和产量，具有生产应用的潜能。
附图说明
图1OsGLTF转基因以及敲除突变体构建和鉴定。(A)为敲除载体和过表达载体示意图；(B)过表达株系定量qPCR结果；(C)敲除载体测序情况。
图2OsGLTF转基因材料、突变体和野生型的株高表型，(A)为植株表型照片，(B)为植株株高统计结果。其中，**表示p＜0.01，*表示p＜0.05。
图3为OsGLTF转基因材料、突变体和野生型的穗表型，(A)为穗表型照片，(B)为穗长统计结果。其中，**表示p＜0.01，*表示p＜0.05。
图4为OsGLTF转基因材料、突变体和野生型的粒型粒重表型。A)为千粒重统计数据照片，(B)为粒长表型图片，(C)为粒厚表型图片，(D)为粒宽表型统计结果。**表示p＜0.01，*表示p＜0.05。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.CRISPR/Cas9敲除载体构建
根据RAP-DB(RAPDB-水稻基因数据库)网站提供的OsGLTF(Os07g0246901)的基因组序列(序列如SEQ ID NO.1所示：aggcagaaatggggaggggttggatggggttttatactacgcttctcaccgctgcatgcatatggtgtccatgagtggtcagggacttgttctttccctgccctgcattagcatgggctgaccttggttttaggagaggggagtgtgccctgtgtgacaaatgttgcatttctatcttcctgtctcgttttggtgtttacttttagttccatttgtttttttttcaaaaaaaggtaattgtatttgttttggtcacaaatataagatcattggtgtcctctctattatatataccatcgatcgtcaccacttataaacaagatgtaaacagtgatttgcagtagaaattacagcgcgtctatggtttcccgtgacaccaatgcactggtctatgggttaactcaccagagtaatttattattttcatgtttatgttgtgaataaaaatgtaagcattcgtattgaaaatactctctccgtgcagaaatgtacaacatttgaggaactatacaaccaattttcttcttactttaccggtgatgtataaaagaacaatggtacaaatttttttatgaaatatctcccttctataatagtttgtttttattttcatatgcatataccatgaaatatatgggcgatcaatatatcaaaaccatgtattggcatagtacccatgtccagggcatcctactttcaaaaaaaaaaaggatggaccactattcagtattaccccgagccatatcctatatcctatagtcgatggttttgtgcatcttcataggttacatttccaattaaatataacaagcaaaaatcagaccaaaggcaaccatgggacttgtgtgacaaatgttgcatttggtgtttagtgttgcatttgttttggttgcagatctgtgtcaccgggttaatcccttggggcaattatttttcctgtatgttgctgttgttgtgaaaaaaaaatataagtagagaaccgatattgaaaatactgctaacacagaaatgtactccgtttactttttaaatttaatcaagtttattaaaaattaaatataacaccaattttgtattattaaatcgagcattggatagattttaataatatatttgttttatcttaaaaatgttaccattttttatgaacttattcaaacttaaaaagaaagtcaaaatactttatagtatgaaatgaagggagtatactaattgggataccatgaacccagttttcctcttaattttgaccctattaatttttcatgaaaagtttcattgatatagtagttgtcttctttttcatatccatattttgtaaaagaaatatagtggtcaatctgtcaaaatcgtgtactgtacacatgtcactccagaacatcctactttctaaaaaaagatggagtacgcttaagtggattctaatctctcgagggaataccccatcgtgtatatttttcttcaaatttaatgcaaatggttgttaagaaatctaaaaaacccaacacggtagagtatagtaaagagtatagtaatgtcttatcactccaccaaaatcatgcatcttactcaatatgtacgttgaaaaaaaaggagacaaattcgggatgaattgtactatctaattttcatatgttgaattttcctttttatttttcaatatgtgatttgtgtttagaattaagattttctggagatatctatatcgtatgaatgcttcctttttagttttgtgtgtgagtcttacaagaaaaagtccaagatgtgagctcttctcctccgaaagctaatttgctgacaatatagctaactaagcccatgcctattttgcaagaagagggagaagaagacgacgaccaaaaaagtcaagcatggaacagaagcttgcgtgtgatagttttacactttaatgggaagtaaaaagttcgaattaccccaaaaactactatatggccagtacgaatttatcctatgaacaacaaaactagacatccttcactctcaacttttcataccgacaaattatcctctgactcgctctggagcggttttggtcctacgtggcgcacacgtgacagtccagttagcataaaaaaattaataagtgatgggcccacatgtcaatactggtttttttattttctaaaatgtttaaatccacagatcaaaactaacatgtggaccactgttttttattttttttatgctaattgaattgccacatgtgtgcaacgtaggaccaaaaccgctccagagtgagggaagtaattcgtctggtatgaaaagctaaggatgaagaatgtctagttttgtgatttagggggtaattcgtactgtccctatagtttaggggtgtaattccgactttttcctagtgggaatgggaacttataaaacatataaaatgattctgtaaaagtaaatctgaaagcacctcaccctatcacaaatatggatgtatacacaattgtgttcgatttcacattatttccttttttttattcaatgtgcggatatcaaaactttaaaacctcccaaaatatccatcctacctcctcccgcacacagatacacatagaaacaagaaagccaggctgtgctcaagatcctgtgctctctccaatggaacctgagtcctccctccacaaggtaacctaaggatcggaagcttagattgtactcaatttcttcctgctataattatcacaaactcatatgaccatcttggtgttttggcgttgaaggttgttgttcctttagatctaaactatccgaggatttgttcccactgccaaaccagcaaaacatcggtatggcgcaacggcccctttggccccaaggtaaagaatagatctataaatcatctagatatagcacctatatgttgctcagagcttgttgatttgaggccaattctttttttaattacgatatgtttatgtagtctttgtgcaatgcttgtgggatccgatatcacagaaagggaattgatgctcttgagttagaaggtaagaggagcaaagacaagaagaggaagacgagtagaaacgaggttccactccggaggggattgaggaaaaataataagaatgcaaaggaggtagattttggagtgaggatgatgatggagggatgccaatcagaaccgatgctaacacagggccaacaatacgaagatgatgtgaagaaggctgctatccaactaatgtacctttcaagggccgcaaacacttaatcaagcacaagcaatagagctctctatgttgttctctattttgtatgaaacttgtcataatcaaatcagaaaagtgataatgcagtatttaatttgactgactactaaattgatattccaaattatgtatcttgcttgtagttaaaacaaagagtaatagtctaagagatgatagctgatactttcaactatttctgaataatttatttcaatagttt)，通过CRISPRdirect(https://crispr.dbcls.jp/)网站选择特异性较高、脱靶效应低的含有NGG(PAM)的靶位点。最后确定了位于OsGLTF基因内含子上的靶位点序列1(cctgctataattatcacaaactc)和外显子上的靶位点序列2(ctttagatctaaactatccgagg)为编辑靶点，设计引物OsGLTF-Cas1F/R和OsGLTF-Cas2F/R，构建双位点敲除载体。所用载体和方法参考文献(MAX L，ZHANG QY，ZHU QL，et al，2015.A Robust CRISPR/Cas9 System forConvenient，High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and DicotPlants.Molecular plant，8(8)：1274-1284.DOI：10.1016/j.molp.2015.04.007.)。
引物序列如下：
OsGLTF-Cas1F：gagtttgtgataattatagc
OsGLTF-Cas1R：gctataattatcacaaactc
OsGLTF-Cas2F：ctttagatctaaactatccg
OsGLTF-Cas2R：cggatagtttagatctaaag
2.OsGLTF过表达载体构建
使用植物双元表达质粒pCAMBIA1300-UBI构建OsGLTF过表达载体。设计引物OsGLTF-OX-F/R，以中花11的cDNA为模板，扩增OsGLTF基因全长CDS序列(核苷酸序列如SEQID NO.2所示：atggaacctgagtcctccctccacaaggttgttgttcctttagatctaaactatccgaggatttgttcccactgccaaaccagcaaaacatcggtatggcgcaacggcccctttggccccaagtctttgtgcaatgcttgtgggatccgatatcacagaaagggaattgatgctcttgagttagaaggtaagaggagcaaagacaagaagaggaagacgagtagaaacgaggttccactccggaggggattgaggaaaaataataagaatgcaaaggaggtagattttggagtgaggatgatgatggagggatgccaatcagaaccgatgctaacacagggccaacaatacgaagatgatgtgaagaaggctgctatccaactaatgtacctttcaagggccgcaaacacttaa；编码蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示：mepesslhkvvvpldlnypricshcqtsktsvwrngpfgpkslcnacgiryhrkgidalelegkrskdkkrktsrnevplrrglrknnknak evdfgvrmmmegcqsepmltqgqqyeddvkkaaiqlmylsraant)。同时用KpnI和BamHI双酶切pCAMBIA1300-UBI载体，回收后得到线性化片段，用T4连接酶将OsGLTF全长CDS和线性化载体连接。酶切和测序验证得到正确的过表达载体：pCAMBIA1300-UBI-OsGLTF。将pCAMBIA1300-UBI-OsGLTF转化根癌农杆菌EHA105感受态，得到pCAMBIA1300-UBI-OsGLTF农杆菌菌液。
引物序列如下：
OsGLTF-OX-F：gaggatccATGGAACCTGAGTCCTCCCTCC；
OsGLTF-OX-R：ttgggtaccAGTGTTTGCGGCCCTTGAA。
3.农杆菌转化法构建OsGLTF过表达株系
为获得OsGLTF的敲除和过表达材料，采用农杆菌介导的遗传转化方法，OsGLTF过表达载体转入野生型中花11品种中，OsGLTF敲除载体转入野生型中花11(ZH11)品种中。具体操作步骤如下：
1)水稻愈伤组织培养：选择成熟饱满的水稻种子，约20克，进行剥壳。在超净台上，首先用无菌水清洗两次。随后，将种子浸泡于75％酒精中，处理2分钟，然后再次用无菌水冲洗两次，每次操作后都进行一次灭菌。接着，将种子浸泡在次氯酸钠消毒液中，密封处理，并置于摇床中摇动20分钟。在超净台上，用无菌水冲洗种子直至无泡沫为止。为确保无菌状态，处理后的种子放置在无菌滤纸上，超净台中吹干表面水分。将经过灭菌处理的种子用消毒后的镊子均匀平铺于N6B5培养基上，确保在超净台上进行，并将培养皿置于28℃的暗室中进行培养。为降低种子污染的风险，务必避免将细菌污染到培养基中。在培养过程中，确保维持良好的无菌条件，检查并记录培养基的状态，注意防止细菌的污染。
2)农杆菌浸染愈伤组织：将含有敲除、过表达和mCherry融合标签质粒分别转入农杆菌中，然后收集培养好的菌液进行离心。用PHI悬浮液重新悬浮菌体，并调整浓度至OD600在0.08到0.1之间。随后，按照0.2％(v/v)的比例加入乙酰丁香酮(As)。接下来，收集生长状态良好的愈伤组织，置于无菌培养瓶中，加入约40毫升预先调配好的PHI农杆菌悬浮液，然后在室温下静置20分钟，每5分钟摇动一次。倒掉悬浮液，将愈伤组织放在无菌纸上，在超净台上晾干。最后，将愈伤组织转移到带有新的无菌纸的培养皿中，使用封口膜密封，将其放置在19℃的暗室环境中培养3天。
3)抗性愈伤筛选：将上述共培养的愈伤组织转移到含500mg/L头孢噻肟、400mg/L羧苄青霉素和50mg/L潮霉素的N6B5筛选培养基上，大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，去除褐化的愈伤组织，保留抗性愈伤组织准备继代。
4)分化与生根：在无菌超净台上进行操作，将阳性愈伤组织迁移到分化培养基，该培养基含有50mg/L潮霉素B和250mg/L羧苄青霉素。随后，将分化培养基上生长约2cm的小苗转移至生根培养基，该培养基包含50mg/L潮霉素B和200mg/L羧苄青霉素。
5)壮苗和移栽：培养两周左右，选择高约10cm且根系发达的小苗，用温水清洗掉培养基，移栽到温室。
OsGLTF过表达株系用潮霉素引物(hygF/hygR)进行PCR检测。结果表明，随机选取的17株转基因植株中，8株潮霉素鉴定为阳性，初步说明pCAMBIA1300-UBI-OsGLTF过表达载体已经成功转入水稻植株中(图1)。
引物序列如下：
hygF：5′-GTGCTTGACATTGGGGAGTT-3′；
hygR：5′-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3′。
通过CRISPR/Cas9技术得到28株OsGLTF敲除转基因株系，通过扩增潮霉素基因片段(引物hygF/hygR)共检测到27株阳性株系，经多世代自交种植后，通过引物Cr-OsGLTF-F/R扩增包含靶位点的目的片段进行敲除类型检测，得到去除转基因背景后的两种纯合OsGLTF敲除株系：缺失4碱基(命名为cr-OsGLTF-4)，另一种为缺失77个碱基(，命名为cr-OsGLTF-77)(图1)。
检测引物序列如下：
Cr-OsGLTF-F：5′-ACACATAGAAACAAGAAAGCCAGGC-3′；
Cr-OsGLTF-R：5′-CAAATCAACAAGCTCTGAGCAACA-3′。
实施例2
OsGLTF基因过表达及突变体株水稻种植和产量表型分析
CRISPR-Cas9敲除突变株使用实施例1构建得到的两个纯合突变株系(cr-OsGLTF-4、cr-OsGLTF-77)，OsGLTF过表达株系采用优选的表达量最高的两个株系(OE-OsGLTF-3、OE-OsGLTF-8)(图1)。水稻种子用70％酒精清洗后用纯水浸种萌发，在平盘上育秧一周后，转种于大田中长至谷粒成熟。其中，种子大小，千粒重比较使用完全成熟并烘干后的种子。所有统计数据均为多于30棵的水稻苗的平均值。
图2为野生型与突变体株全株的比较，其中，A图从左至右为CRISPR-Cas9技术敲除OsGLTF的突变株、野生型以及OsGLTF过表达转基因植株。B图为野生型，敲除突变体以及野生型植株株高统计数据，表明CRISPR-Cas9技术敲除OsGLTF的突变株比野生型和过表达植株更为矮小，过量表达OsGLTF基因比野生型和突变体材料株高更为高大。
图3为野生型与突变株的穗大小比较，其中A图从左至右依次为过表达、野生型和突变体材料。B图为野生型、过表达材料和突变体材料的穗长统计数据。这些表明过表达OsGLTF突变株的一级分支和二级分枝比WT多，穗型大。
图4为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsGLTF突变体积过表达材料的粒长、粒宽、粒厚和千粒重的统计比较。从图中可以明显看出OsGLTF过表达增加水稻籽粒粒长对粒宽粒厚无影响，增加千粒重。突变体粒长、粒宽与野生型无显著差异，粒厚降低，千粒重减少。
以上图2～4结果表明，OsGLTF基因过表达可以增加水稻的株高、增加粒长并增大粒重，显著提高水稻的产量。
Claims (8)
1.水稻OsGLTF基因或OsGLTF蛋白在提高水稻产量中的应用，其特征在于，所述水稻OsGLTF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述OsGLTF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，由所述水稻OsGLTF基因编码得到。
2.水稻OsGLTF基因或OsGLTF蛋白在调控水稻株高、谷粒粒长和粒重中至少一种的应用，其特征在于，所述水稻OsGLTF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述OsGLTF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，由所述水稻OsGLTF基因编码得到。
3.一种提高水稻产量的方法，其特征在于，在水稻作物中超表达或过表达OsGLTF基因，所述OsGLTF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将OsGLTF基因与质粒连接，构建含有OsGLTF基因的超表达或过表达载体；
(2)将步骤(1)构建的OsGLTF基因的超表达或过表达载体导入水稻的细胞中，培养后获得转基因植株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中所述质粒载体双元表达载体。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(2)将OsGLTF基因的超表达或过表达载体转入农杆菌基因工程菌后，侵染水稻的细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述农杆菌基因工程菌为农杆菌EHA105菌株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(2)农杆菌基因工程菌侵染的水稻的细胞来源为水稻种子的愈伤组织。
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