CN118109474A - 一种核酸适体、荧光分子探针及其在检测石斑鱼虹彩病毒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种核酸适体，核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明所提供的核酸适体能够在体内、体外检测石斑鱼虹彩病毒，具有特异性强、灵敏度高、在体内外无免疫原性、分子量小、便于体外标记及化学合成、制备周期短、易于编辑、易于运输及保存等优点。采用本发明所提供的核酸适体构建荧光分子探针或检测试剂盒，操作简单迅速、结果精确、稳定性强。这对于水产养殖行业针对石斑鱼虹彩病毒早发现早治疗具有重要意义，在水产病原检测领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别地，涉及一种核酸适体、荧光分子探针及其在检测石斑鱼虹彩病毒中的应用。
背景技术
石斑鱼是我国水产养殖名贵品种之一，具有极高的经济价值。石斑鱼因其味道鲜美、营养丰富、且含有丰富的不饱和脂肪酸，深受人们喜爱。近些年，石斑鱼养殖行业迅猛发展，但是随之而来的是各类疫病频繁暴发，这严重制约石斑鱼养殖产业的可持续健康发展。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)是石斑鱼养殖行业中的高致病性传染性病毒之一，石斑鱼幼苗易患此病，感染后表现出食欲不振及肝脾脏肿大的典型症状，如不及时发现并治疗短时间内会造成大量死亡，死亡率可达90％以上，给石斑鱼养殖产业带来严重的经济损失。而目前市面上主要的检测方法仍然是实验室内的实时荧光定量核酸扩增检测系统，该种方法具有较高的特异性、灵敏性和精确性等优点，但是同时存在耗时长，操作繁琐、对操作人员的专业要求高。因此研发操作便捷、耗时短、成本低、准确度高的快速检测技术，来监控石斑鱼虹彩病毒给水产养殖业带来的危害极其重要。
近年来，核酸适体在水产养殖行业对病害检测及防控领域逐渐崭露头角。核酸适体是指经过指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX)在体外经过多轮严格筛选得到的高特异性识别靶物质的单链寡核苷酸。核酸适体对机体无免疫原性，且对靶细胞具有极高的亲和性和特异性，其结构稳定，在体外易于合成和修饰，且对温度等外界环境的耐受性高等诸多优点，因而被国内外学者广泛应用到医疗、生物等行业，因此利用核酸适体开发检测石斑鱼虹彩病毒在水产养殖行业具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核酸适体、荧光分子探针及其在检测石斑鱼虹彩病毒中的应用，以开发针对石斑鱼虹彩病毒特异性强、灵敏度高的快速检测产品。
根据本发明的一个方面，提供一种核酸适体，核酸适体的核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示。
优选地，核苷酸序列的二级结构如下所示：
优选地，核苷酸序列上结合有标记物。
优选地，标记物选自生物素、发光物质、酶中的至少一种。
根据本发明的第二个方面，提供上述核酸适体在制备检测石斑鱼虹彩病毒的产品中的应用。
优选地，上述检测石斑鱼虹彩病毒的产品包括荧光分子探针和/或检测试剂盒。
根据本发明的第三个方面，提供一种荧光分子探针，包括上述核酸适体，核酸适体的核苷酸序列上结合有标记物，标记物为发光物质。
根据本发明的第四个方面，提供一种检测试剂盒，包括上述核酸适体。
根据本发明的第五个方面，提供一种核酸适体检测石斑鱼虹彩病毒的方法，包括以下操作：取标记物标记的核酸适体，将核酸适体与待测样品孵育，洗涤并弃掉未结合的核酸适体，最后检测标记物的信号强度，通过标记信号的强度判断待测样品中是否感染石斑鱼虹彩病毒。
与现有的抗体免疫学检测方法相比，本发明所提供的核酸适体的优点在于具有更高的亲和力和特异性。本发明通过SELEX技术特异性筛选得到核酸适体(如SEQ ID No：1所示)，该核酸适体制备周期短、分子量小，易于体外合成和修饰、重现性好、序列稳定、方便运输和保存。而且应用该核酸适体能够制备检测石斑鱼虹彩病毒的荧光分子探针或检测试剂盒，以实现简单、快速、高准确率和高灵敏度地检测石斑鱼虹彩病毒。
与现有的实时荧光定量核酸扩增检测系统相比，本发明所提供的核酸适体的优点在于：操作简便，对环境、仪器、操作人员均无严格要求。采用本发明的核酸适体构建荧光分子探针或检测试剂盒，并结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测设备，实现石斑鱼虹彩病毒的快速精确检测。这对于水产养殖行业针对石斑鱼虹彩病毒早发现早治疗具有重要意义，在水产病原检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的核酸适体的二级结构预测图。
图2是实施例2中带有花氰染料Cy5标记的如SEQ ID No：1所示的核酸适体与待测样品孵育后的显微镜测试结果。
图3是实施例3中带有花氰染料Cy5标记的如SEQ ID No：1所示的核酸适体与感染不同病毒的待测样品孵育后的流式细胞仪测试结果。
图4是实施例4中带有花氰染料Cy5标记的如SEQ ID No：1所示的核酸适体与石斑鱼肝脾肾组织孵育后的流式细胞仪测试结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例1核酸适体的筛选和制备
S1.第一ssDNA文库的构建和引物的合成
设计合成第一ssDNA文库Library 50，其核苷酸序列如下：5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC。其中，两端为固定序列，中间50个核苷酸为随机序列。
上游引物包括如SEQ ID No：2所示的DNA序列，并被花氰染料(Cy5)标记，其具体的序列为：5’-FAM-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’。
下游引物包括如SEQ ID No：3所示的DNA序列，其具体的序列为：5’-Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3’。
第一ssDNA文库和引物均由上海生工生物有限公司合成。
S2.SELEX筛选获得特异性识别感染石斑鱼虹彩病毒的石斑鱼脾细胞(GS细胞)的核酸适体(阳性筛选)
S2.1将10nmol上述第一ssDNA文库溶解在500μL PBS中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的第一ssDNA文库与石斑鱼虹彩病毒细胞在冰上孵育1h；
S2.2孵育结合完成后，离心移除上清，用10mL的PBS洗涤石斑鱼虹彩病毒细胞，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清，即为特异性识别石斑鱼虹彩病毒细胞的第二ssDNA文库。
S3.PCR扩增
取100μL筛选得到的第二ssDNA文库，使其与上游引物、下游引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下(1000μL)：10×Buffer 100μL,dNTP Mix(2.5mM)80μL，上游引物40μL，下游引物40μL，第二ssDNA文库100μL，rTaq酶12.5μL，ddH2O 627.5μL。按照如下程序进行PCR扩增：92℃5分钟，92℃1分钟，60℃30秒，72℃1分钟，经过25轮循环；72℃5分钟。第一轮循环筛选后得到的上清，要全部用于进行后续的PCR扩增，得到扩增后的dsDNA文库。
S4.第三ssDNA文库的制备
将100μL链酶亲和素标记的磁珠与dsDNA文库在常温下孵育20min，利用dsDNA文库上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将dsDNA文库结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清，用2mL PBS洗涤磁珠，然后在EP管中加入200μL NaOH溶液(200mM)，常温反应15min，使dsDNA文库变性解链，带有生物素的一条链与链亲和素结合留在磁珠上，以与磁珠结合的单链DNA作为第三ssDNA文库，利用磁性分离架回收得到上清液；将上清液中正向单链核酸用PCR纯化回收试剂盒纯化回收，收集到的溶液用于下一轮的筛选。
S5.反复筛选
将S4中得到的第三ssDNA文库代替第一ssDNA文库，重复S2～S4所示的阳性筛选过程、PCR扩增及单链DNA文库的制取过程12次。
S6.阴性筛选
在S5的第二轮及第二轮以后筛选中，用正常石斑鱼脾细胞(GS)为对照，将S5后筛选得到的ssDNA文库进行阴性筛选以提高筛选效率。具体的阴性筛选过程为：将筛选得到的ssDNA文库溶解，在92℃下恒温水浴，与GS细胞在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液，即为经过阴性筛选的ssDNA文库。
S7.12轮筛选
将S6中收集到含有ssDNA文库的上清液，经过S3的PCR扩增和S4的ssDNA文库制备后，依次重复进行S6、S2、S3和S4的过程，利用流式细胞仪检测所得ssDNA文库对石斑鱼虹彩病毒细胞的识别能力的变化情况，重复进行11轮筛选，此时得到的ssDNA文库对石斑鱼虹彩病毒识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到本实施例中可用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，其核苷酸序列为：
TGCACGGAGGGGTCCCCAGGGCGAGCCATACTTCAAGAGAGTACGCG CGG(SEQ ID No：1)
利用MFOLD软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)在线预测SEQ ID No：1的二级结构，预测结果如图1所示，核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的核酸适体形成特殊的茎环结构和发卡结构。
实施例2验证核酸适体(SEQ ID No：1)对感染SGIV的石斑鱼脾细胞(GS细胞)的特异性
1.待测样品
实验组1：将核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的核酸适体用花氰染料(Cy5)进行标记，取500nmol Cy5标记的核酸适体溶解在PBS中，制得500μL混合液。将混合液于92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的核酸适体与感染SGIV的GS细胞(GS细胞经赫斯特染料Hoechst 33342染色)4℃孵育1h，孵育结合完成后离心移除上清液，用PBS洗三次，加入400μL PBS重悬细胞，得到细胞重悬液。
对照组1：将核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的核酸适体用花氰染料(Cy5)进行标记，取500nmol Cy5标记的核酸适体溶解在PBS中，制得500μL混合液。将混合液于92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的核酸适体与正常未感染SGIV的GS细胞(GS细胞经赫斯特染料Hoechst 33342染色)4℃孵育1h，孵育结合完成后离心移除上清液，用PBS洗三次，加入400μLPBS重悬细胞，得到细胞重悬液。
2.测试方法
利用激光共聚焦显微镜分别观察实验组1中Cy5标记的核酸适体与感染SGIV的GS细胞、对照组1中Cy5标记的核酸适体与未感染SGIV的GS细胞结合后的荧光强度，通过观察待测样品Cy5荧光强度判断核酸适体的特异性。
3.测试结果：
测试结果如图2所示。由图2可知，实验组1出现明显的红色荧光，而对照组1无荧光情况。由此说明，与对照组1相比，本发明所提供的核酸适体(SEQ ID No：1)能够特异性识别实验组1中感染石斑鱼虹彩病毒的GS细胞，且亲和力较高。
实施例3验证核酸适体(SEQ ID No：1)对感染不同病毒的GS细胞的结合效果及特异性
1.待测样品：
实验组2：将核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的核酸适体用花氰染料(Cy5)进行标记，取500nmol Cy5标记的核酸适体溶解在PBS中，制得500μL混合液。将混合液于92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的核酸适体与感染SGIV的GS细胞4℃孵育1h，孵育结合完成后离心移除上清液，用PBS洗三次，加入400μL PBS重悬细胞，得到细胞重悬液。
对照组2：将核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的核酸适体用花氰染料(Cy5)进行标记，取500nmol Cy5标记的核酸适体溶解在PBS中，制得500μL混合液。将混合液于92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的核酸适体与正常未感染SGIV的GS细胞4℃孵育1h，孵育结合完成后离心移除上清液，用PBS洗三次，加入400μL PBS重悬细胞，得到细胞重悬液。
对照组3：将核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的核酸适体用花氰染料(Cy5)进行标记，取500nmol Cy5标记的核酸适体溶解在PBS中，制得500μL混合液。将混合液于92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的核酸适体与感染石斑鱼神经坏死病毒的GS细胞4℃孵育1h，孵育结合完成后离心移除上清液，用PBS洗三次，加入400μL PBS重悬细胞，得到细胞重悬液。
2.测试方法：
利用流式细胞仪分别检测实验组2中Cy5标记的核酸适体与感染SGIV的GS细胞、对照组2中Cy5标记的核酸适体与未感染SGIV的GS细胞、对照组3中Cy5标记的核酸适体与感染石斑鱼神经坏死病毒的GS细胞结合后的荧光值，通过待测样品Cy5荧光值的强度判断核酸适体对感染不同病毒的GS细胞的结合效果及特异性。
3.测试结果：
测试结果如图3所示。由图3可知，实验组2的荧光值明显高于对照组2、3，且对照组2、3的荧光值无明显差异。由此说明，与对照组2、3相比，本发明所提供的核酸适体(SEQ IDNo：1)能够检测实验组2中感染了石斑鱼虹彩病毒的细胞，且特异性强。
实施例4验证核酸适体(SEQ ID No：1)与感染SGIV的石斑鱼肝脾肾组织的结合效果
1.待测样品：
实验组3：将核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的核酸适体用花氰染料(Cy5)进行标记，取500nmol Cy5标记的核酸适体溶解在PBS中，制得500μL混合液。将混合液于92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的核酸适体与感染SGIV的石斑鱼肝脾肾组织组织4℃孵育1h，孵育结合完成后离心移除上清液，用PBS洗三次，加入400μL PBS重悬细胞，得到细胞重悬液。
对照组4：将核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的核酸适体用花氰染料(Cy5)进行标记，取500nmol Cy5标记的核酸适体溶解在PBS中，制得500μL混合液。将混合液于92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的核酸适体与未感染SGIV的石斑鱼肝脾肾组织组织4℃孵育1h，孵育结合完成后离心移除上清液，用PBS洗三次，加入400μL PBS重悬细胞，得到细胞重悬液。
2.测试方法：
利用流式细胞仪分别检测实验组3中Cy5标记的核酸适体与感染SGIV的石斑鱼肝脾肾组织、对照组4中Cy5标记的核酸适体与未感染SGIV的石斑鱼肝脾肾组织结合后的荧光值，通过待测样品Cy5荧光值的大小判断核酸适体对感染SGIV的石斑鱼肝脾肾组织的结合效果。
3.测试结果：
测试结果如图4所示。由图4可知，实验组3的荧光值明显高于对照组4。由此说明，与对照组4相比，本发明所提供的核酸适体(SEQ ID No：1)能够特异性识别实验组3中感染石斑鱼虹彩病毒的石斑鱼肝脾肾组织。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.如权利要求1所述核酸适体，其特征在于，所述核苷酸序列的二级结构如下所示：
3.如权利要求1或2所述核酸适体，其特征在于，所述核苷酸序列上结合有标记物。
4.如权利要求3所述核酸适体，其特征在于，所述标记物选自生物素、发光物质、酶中的至少一种。
5.如权利要求1～4任一项所述核酸适体在制备检测石斑鱼虹彩病毒的产品中的应用。
6.如权利要求5所述核酸适体在制备检测石斑鱼虹彩病毒的产品中的应用，其特征在于，所述检测石斑鱼虹彩病毒的产品包括荧光分子探针和/或检测试剂盒。
7.一种荧光分子探针，其特征在于，包括如权利要求1～4任一项所述核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列上结合有标记物，所述标记物为发光物质。
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