CN118108858A - 编码hsa的核酸分子、dx88与hsa融合蛋白及其核酸分子和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因治疗技术领域，具体涉及编码HSA的核酸分子、DX88与HSA融合蛋白及其核酸分子和应用。具体地，本发明提供一种融合蛋白，其包含直接连接的DX88与特定序列的HSA。本公开发明人经过深入研究发现，采用特定氨基酸序列的HSA与DX88连接，不需要连接子，并且经过进一步优化，为HAE的治疗提供有力支持。

Description

编码HSA的核酸分子、DX88与HSA融合蛋白及其核酸分子和 应用
技术领域
本发明涉及基因治中疗技术领域，具体涉及编码HSA的核酸分子、DX88与HSA融合蛋白及其核酸分子和应用。
背景技术
遗传性血管水肿(Hereditary angioedema，HAE)是一种罕见的常染色体显性遗传病，发病年龄不限，常见于儿童或青少年时期。主要表现为反复发生的皮肤、呼吸道和内脏器官肿胀，当水肿发生于气道时，可致喉水肿，甚至窒息死亡；当水肿发生于胃肠道，会出现腹痛、恶心、呕吐。该疾病给患者和家属带来了沉重的经济和精神负担。
通常根据患者是否存在补体1酯酶抑制剂(C1-INH)基因(serping1)突变，将HAE分为C1-INH缺乏型(HAE-C1-INH)和非C1-INH缺乏型(HAE-nC1-INH)，以C1-INH缺乏型为主，约占病例的85％。
C1-INH也称为C1酯酶抑制剂，是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)蛋白质超家族的成员之一。作为一种具有大量糖基化的丝氨酸蛋白酶抑制剂，C1-INH主要能够抑制补体系统的自发性活化，在调控激肽释放酶(kallikrein)-激肽(kinin)放大级联方面起关键作用，还参与调控凝血和纤维蛋白溶解系统(Hereditary Angioedema.NEJM.2020.DOI:10.1056/NEJMra1808012)。凝血酶因子XII和血浆前激肽释放酶(PK)是受到C1-INH调控的两种内源酶，前者活化可激活后者生成血浆激肽释放酶(PKa)，之后两者形成循环正反馈。血浆激肽释放酶(PKa)主要作用是降解高分子量激肽原(HK)生成缓激肽(BK)，它可通过结合缓激肽受体B2R引发炎症、血管舒张、血管通透性增加以及疼痛等生理效应。正常情况下，凝血酶因子XII和PK活性受调控处于稳态，同时缓激肽半衰期极短，不会引发严重不良反应。但当C1-INH水平/活性不足，或者凝血酶因子XII异常激活引起下游血浆激肽释放酶异常情况下，会导致发生各种疾病，例如遗传性血管水肿、由环境、激素诱导或药物诱导的非遗传性血管水肿、晚期糖尿病性黄斑水肿、神经炎性疾病如脱髓鞘症等。
因此，可以通过补充C1-INH或其他功能类似的药物，来治疗HAE这些与血浆激肽释放酶(PKa)和/或凝血酶因子XIIa的活性亢进相关疾病或适应症。已报道的例子包括血浆来源(Berinert、Haegarda、Cinryze)和重组蛋白来源(Ruconest)的C1-INH，以及Ecallantide，Lanadelumab和Icatibant，分别通过抑制下游血浆激肽释放酶(PKa)和缓激肽受体B2R发挥药效。其中，Ecallantide(DX-88)是由Dyax公司通过噬菌体展示技术筛选得到的重组Kunitz结构域蛋白，能够高亲和力的结合并抑制激肽释放酶，抑制缓激肽的产生。DX-88已被FDA批准用于治疗HAE。DX-88由于在体内的半衰期仅为2小时，只以皮下注射的方式对急性发病患者给药。
已报道过使用人血清白蛋白(HSA)作为融合伴侣构建各种N末端或C末端融合蛋白，但为了避免融合影响功能蛋白的结构和活性，通常会使用各种接头作为间隔元件来连接二者。此外，也报道过将功能蛋白连接在HSA的非末端残基上的融合蛋白构建方法(Zhiwei Huang et al.，International Journal of Biological Macromolecules,Volume 205,Pages 49-54)。
发明内容
本公开的发明人经过深入研究发现，采用特定氨基酸序列的HSA与DX88连接，不仅不需要连接子(linker)，并且，优化的HSA核酸序列能显著提升直接连接的DX88与HSA核酸序列的表达，进一步的体外实验和动物体内研究发现，相对于野生型的HSA核酸序列，优化的HSA与DX88的融合核酸序列能显著提升其抑制PKa活性以及抑制人血清中HK降解的作用，并且显著抑制了血管渗透性的增加，为HAE的治疗提供有力支持。
因此，本发明的第一目的在于提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含直接连接的DX88与HSA，其中，所述HSA的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，所述连接发生在DX88的N端与HSA的C端、或者DX88的C端与HSA的N端；优选地发生在DX88的C端与HSA的N端。
在一些可能的实施方式中，所述DX88的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
本发明的另一个目的在于提供一种核酸分子，其编码如上所述的融合蛋白，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:17至19中任一项所示的核苷酸序列，优选所述核酸分子包含如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。优选地，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。
本发明的另一个目的在于提供一种转基因表达盒，其属于以下的任一种：
a)表达如上所述的融合蛋白；
b)含有上述的所述的核酸分子。
比如，在一些可能的实施方式中，所述转基因表达盒表达直接连接的DX88与HSA，其中，HSA的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。在一些可能的实施方式中，所述转基因表达盒表达直接连接的DX88与HSA，其中，HSA的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，DX88的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。直接连接的DX88与HSA说明DX88与HSA两者之间没有连接子(或称连接序列)存在。连接发生在DX88的N端与HSA的C端、或者DX88的C端与HSA的N端，优选地发生在DX88的C端与HSA的N端。
比如，在一些可能的实施方式中，所述转基因表达盒含有如SEQ ID NO:17至19中任一项所示的核苷酸序列，优选含有如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。在一些可能的实施方式中，所述转基因表达盒含有如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。其中，每个表达盒中可以含有一个或多个上述的核苷酸序列。
另外，从数量上来说，所述的一种转基因表达盒可以表示一个转基因表达盒，也可以表示多个转基因表达盒，多个转基因表达盒可以是相同的表达盒，也可以是不同的转基因表达盒；从种类上来说，所述的一种转基因表达盒可以表示一种转基因表达盒，也可以表示多种转基因表达盒；一种或多种转基因表达盒均可以是相同的转基因表达盒，也可以是不同的转基因表达盒。
本发明还提供了一种编码HSA的核酸分子，其包含如SEQ ID NO:17至19中任一种所示的核苷酸序列，优选包含如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。
进一步地，所述转基因表达盒还包含选自TAA、TAG或TGA中任一者的终止密码子。
进一步地，所述转基因表达盒还包含与上述的核酸分子可操作地连接地调控元件。可选地，所述调控元件选自增强子、启动子、内含子或终止子中的任一者或其任意组合；可选地，所述启动子选自CAG启动子、CMV启动子、SerpinG1基因启动子、ALB基因启动子、SerpinA1基因启动子、HLP基因启动子或LP基因启动子，优选地，所述启动子为SerpinA1基因启动子，更优选地，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；和/或所述内含子为截短的SerpinA1内含子，优选地，所述截短的SerpinA1内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；和/或，所述终止子选自BGH polyA、hGH polyA或GH polyA，优选地，所述终止子为BGHpolyA，更优选地，所述BGH polyA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；和/或，所述增强子为ApoE HCR增强子，优选地，所述ApoE HCR增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步地，所述转基因表达盒还包括位于所述内含子和所述核酸分子之间的信号肽，可选地，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示。
具体地，本发明提供了的一种转基因表达盒，其具有如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列。
本发明的另一个目的在于提供一种重组腺相关病毒，其表达如上所述的任一项融合蛋白、或包含如上所述的任一项核酸分子、或包含如上所述的任一项转基因表达盒。优选地，所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或rhAAV10；更优选地，所述AAV为AAV8。
本发明提供的重组腺相关病毒，经实验验证，能够长时间地存在于体内并稳定表达，并具有显著的抑制PKa的活性和显著抑制HK降解的作用，达到显著抑制血管渗透性的增加。本发明中上述的重组腺相关病毒均是现有的产品。
本发明的另一个目的在于提供一种宿主细胞，其表达如上所述的任一项融合蛋白、或包含如上所述的任一项核酸分子、或包含如上所述的任一项转基因表达盒、或者包含或感染有如上所述的任一项重组腺相关病毒。
本发明的另一个目的在于提供一种组合物，其包括选自如上所述的融合蛋白、如上所述的核酸分子、如上所述的的转基因表达盒、如上所述的重组腺相关病毒、或者如上所述的宿主细胞中的任一者或其任意组合。
优选地，所述组合物为药物组合物；更优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明还提供了如上所述的融合蛋白、如上所述的核酸分子、如上所述的转基因表达盒、如上所述的重组腺相关病毒、如上所述的宿主细胞、或者如上所述的组合物中的任一者或其任意组合在制备用于治疗与血浆激肽释放酶(PKa)和/或凝血酶因子XIIa的活性亢进相关的疾病或适应症的药物中的应用。
所述与血浆激肽释放酶(PKa)和/或凝血酶因子XIIa的活性亢进相关的疾病或适应症包括遗传性血管性水肿(HAE)、由环境、激素诱导或药物诱导的非遗传性血管水肿、晚期糖尿病性黄斑水肿、神经炎性疾病如脱髓鞘症等。
本发明还提供了治疗与血浆激肽释放酶(PKa)和/或凝血酶因子XIIa的活性亢进相关的疾病或适应症的方法，所述方法包括向需要的受试者施用有效量的如上所述的融合蛋白、如上所述的核酸分子、如上所述的转基因表达盒、如上所述的重组腺相关病毒、如上所述的宿主细胞、或者如上所述的组合物中的任一者或其任意组合。可选地，与血浆激肽释放酶(PKa)和/或凝血酶因子XIIa的活性亢进相关的疾病至少包括遗传性血管性水肿、由环境、激素诱导或药物诱导的非遗传性血管水肿、晚期糖尿病性黄斑水肿、神经炎性疾病如脱髓鞘症等。
通过合适的途径将上述物质施用于有此需要的受试者。如可以通过静脉内、腹膜内、皮下或皮内途径施用。在一些实施方案中，皮内施用包括通过使用“基因枪”或基因枪粒子递送系统施用。在一些实施方式中，可以通过非病毒脂质纳米颗粒施用。如上述物质可以包含一种或多种稀释剂、缓冲液、脂质体、脂质、脂质复合物。在一些实施方案中，施用物被包含在微球或纳米颗粒内，例如脂质纳米颗粒或无机纳米颗粒。
附图说明
图1示出了实施例1中DX88-HSA表达盒结构的示意图；
图2示出了实施例2中将DX88和HSA直接连接(无接头)以及通过不同接头连接时的PKa抑制剂活性曲线图；
图3示出了实施例2中将DX88和HSA直接连接(无接头)以及通过不同接头连接时的Western印迹检测结果；
图4示出了实施例3中不同HSA优化序列的表达情况图；
图5示出了实施例4中纯化的DX88-HSA融合蛋白的电泳图；
图6示出了实施例5中DX88-HSA融合蛋白抑制猴血清中的PKa活性的曲线图；
图7示出了根据实施例5中DX88-HSA融合蛋白抑制猴血清中的PKa活性计算IC50的曲线图；
图8示出了实施例5中DX88-HSA融合蛋白抑制人血清中HK降解的电泳图；
图9为对图8进行灰度归一化处理得到的柱形图；
图10示出了实施例6中由野生型序列和优化序列编码的融合蛋白的Western印迹结果；
图11为对图10进行灰度归一化处理得到的柱形图；
图12示出了实施例6中向小鼠注射不同剂量的重组病毒载体后，血清中的DX88-HSA的ELISA分析结果；
图13分别示出了实施例6中向小鼠注射5e11剂量的重组病毒载体后，测得的小鼠血清DX88-HSA融合蛋白的ELISA结果、DNA拷贝数和RNA水平；
图14示出了实施例7中血清DX88-HSA ELISA分析结果图；
图15示出了实施例8中Western印迹检测结果；
图16为对图15进行灰度归一化处理得到的柱形图；
图17示出了实施例8中PKa活性的结果图；
图18示出了实施例8中HK蛋白的Western印迹检测结果；
图19为对图18进行灰度归一化处理得到的柱形图；
图20示出了实施例8中血管渗透性检测的柱形图。
具体实施方式
定义
除非本文另外定义，否则与本公开关联使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。术语的含义和范围应是明晰的，然而，在存在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。
除非另外定义或由上下文明确指示，否则本文中所使用的名词或术语应当按照本领域内普通技术人员的常规知识和用法来理解。除非另外说明，本申请所具体采用的操作方法(包括：制备工艺、实验步骤、检测手段等)采用本技术领域常规的生物化学实验、细胞生物学实验、分子生物学实验、基因编辑(例如，重组DNA技术)、动物学实验及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sam brook等MolecularCloning:a Laboratory Manual第四版，冷泉港实验室出版社，2012年；Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley在线出版社，不定期更新；Kursad Turksen等，Embryonic Stem Cell Protocols第三版，Springer出版社，2016年；P.Nagarajan等，Essentials of Laboratory Animal Science:Principles and Practices，Springer出版社，2021年；以及Jann Hau等，Handbook of Laboratory Animal Science:EssentialPrinciples and Practices，第四版，CRC出版社，2021年。
词语“包括”、“包含”应被解释为包容性的而不是排他性的。词语“由”、“由”及其变体应被排他地解释，而不是包含性地解释。尽管本说明书中的各个实施例是使用“包括”语言来呈现的,但在其他情况下,相关实施例也旨在使用“由......组成”或“基本上由......组成”语言来解释和描述。
本文所使用的术语“启动子”在本文定义为这样的DNA序列，其结合RNA聚合酶并指导该聚合酶到达多核苷酸的正确下游转录起始位点以起始转录，所述多核苷酸编码具有生物学活性的多肽。RNA聚合酶有效地催化与编码区的适当DNA链互补的信使RNA装配。
如本文所用,术语“可操作地连接”是指与目的基因邻近的表达控制序列和反式或相距一定距离起作用以控制目的基因的表达控制序列。
应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而并非旨在进行限制。如在本说明书和所附权利要求中所使用，除非内容另外明确指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物。除非明确规定或从上下文显而易见，否则如本文所使用，术语“或”被理解为包括在内。除非本文中或和说明书其余部分下文中另有定义，否则本文使用的所有技术性和科学性术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。
本文所使用的“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。合适的药物载体的例子是本领域众所周知的,包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂,例如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。药物组合物可以是冻干形式。此类载体可通过常规方法配制并以治疗有效量施用于受试者。
本文所使用的术语“DX-88”或称为“DX88”还可称为艾卡仑肽(Ecallantide)，是一种血浆激肽释放酶抑制剂，能够抑制缓激肽的产生，其优选具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。但是，根据本领域技术人员对肽类药物的常识，在一些可能的实施方式中，DX-88也可以是在SEQ ID NO:20所示氨基酸序列中具有一个或几个缺失、取代或添加的氨基酸残基的变体，只要其仍具有抑制缓激肽产生的活性。在另一些情况下，DX-88可以具有常用于肽类药物的修饰，例如，其可以在一个或多个组成其肽链的氨基酸残基上包含翻译后修饰，如聚乙二醇化、糖基化、乙酰化等。在一些情况下，DX-88可以完全由天然氨基酸残基组成，也可以包含一个或多数个非天然氨基酸残基。
给药的“受试者”包括但不限于：人(即，任何年龄组的男性或女性，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童、青少年)或成人受试者(例如，年轻的成人、中年的成人或年长的成人))和/或非人的动物，例如，哺乳动物，例如，灵长类(例如，食蟹猴、恒河猴)、牛、猪、马、绵羊、山羊、啮齿动物、猫和/或狗。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人动物。本文可互换使用术语“人”、“患者”和“受试者”。
除非另作说明，否则，本文使用的术语“治疗”包括受试者患有具体疾病、障碍或病症时所发生的作用，它降低疾病、障碍或病症的严重程度，或延迟或减缓疾病、障碍或病症的发展(“治疗性治疗”)，或减少疾病、障碍或病症的发作率，还包括在受试者开始患有具体疾病、障碍或病症之前发生的作用(“预防性治疗”)。
通常，“有效量”是指足以引起目标生物反应的数量。正如本领域普通技术人员所理解的那样，本公开的有效量可以根据下列因素而改变：例如，生物学目标、药物组合物的药代动力学、所治疗的疾病、给药模式以及受试者的年龄健康情况和症状。有效量包括治疗有效量和预防有效量。
除非另作说明，否则，本文使用的“治疗有效量”是在治疗疾病、障碍或病症的过程中足以提供治疗益处的量，或使与疾病、障碍或病症有关的一或多种症状延迟或最小化的量。治疗有效量是指单独使用或与其它疗法联用时，治疗剂的量，它在治疗疾病、障碍或病症的过程中提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以包括改善总体治疗、降低或避免疾病或病症的症状或病因、或增强其它治疗剂的治疗效果的量。
除非另作说明，否则，本文使用的“预防有效量”是足以预防疾病、障碍或病症的量，或足以预防与疾病、障碍或病症有关的一或多种症状的量，或防止疾病、障碍或病症复发的量。预防有效量是指单独使用或与其它药剂联用时，治疗剂的量，它在预防疾病、障碍或病症的过程中提供预防益处。术语“预防有效量”可以包括改善总体预防的量，或增强其它预防药剂的预防效果的量。
“组合”以及相关术语是指同时或依次给药本申请药物组合物和其它治疗剂。例如，本公开的药物组合物可以与其它治疗剂以分开的单位剂型同时或依次给药，或与其它治疗剂一起在单一单位剂型中同时给药。
实施例
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。涉及的动物实验均遵守动物伦理要求和动物实验操作规范。本文中，如无特殊说明，则氨基酸序列均解释为按照N端至C端方向、核苷酸序列均解释为按照5’至3’方向进行描述。若说明书中记载的序列与序列表中不一致，则以说明书中记载的序列为准。
实施例1
本实施例涉及DX88-HSA表达盒和hKLKB1表达盒的构建。
1.1、DX88-HSA野生型表达盒的构建
DX88-HSA表达盒的结构如图1所示，其中，表达盒从5’-3’依次包含5’ITR、ApoEHCR增强子、SerpinA1启动子、截短的SerpinA1内含子、Kozak序列、ALB信号肽、编码DX88-HSA融合蛋白的核苷酸序列(目的基因序列)、终止密码子、BGH polyA和3’ITR。在DX88-HSA野生型表达盒中：ALB信号肽位于目的基因(DX88和HSA)序列之前，其核酸序列如SEQ IDNO:24所示；DX88的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该HSA的核苷酸序列为野生型，具体如SEQ ID NO:2所示，使用TAA作为终止密码子；5’ITR、ApoE HCR增强子、SerpinA1启动子、截短的SerpinA1内含子、BGH polyA和3’ITR的核苷酸序列依次如SEQ ID NOs:3～8所示。其中，ApoE HCR增强子为人源载脂蛋白E的肝细胞控制区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；Kozak序列被插入到ALB信号肽基因序列之前，其核苷酸序列为：gccacc；BGH polyA为牛生长激素聚腺苷酸化信号，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
示例性的，DX88-HSA野生型表达盒具有如SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列，从5'端至3'端依次包含5'ITR、ApoE HCR增强子、SerpinA1启动子、截短的SerpinA1内含子、Kozak序列、ALB信号肽、目的基因(DX88和HSA)、BGH polyA和3'ITR，其核苷酸序列如SEQ IDNO:26所示。
1.2、人源KLKB1(简称hKLKB1)表达盒的构建
按1.1相同的方法和顺序构建hKLKB1表达盒，区别仅在于将编码ALB信号肽和DX88-HSA融合蛋白的核苷酸序列替换为hKLKB1的编码核苷酸序列(SEQ ID NO:32)。
因此，所得到的hKLKB1表达盒从5'端至3'端依次包含5'ITR、ApoE HCR增强子、SerpinA1启动子、截短的SerpinA1内含子、Kozak序列、hKLKB1的编码核苷酸序列、BGHpolyA和3'ITR。
2、腺相关病毒的生产和纯化
使用1.1中制备的DX88-HSA表达盒构建穿梭质粒。具体而言，将DX88-HSA表达盒替换骨架质粒(参见例如中国专利公开号CN115896135，SEQ NO ID:113)的限制性酶KpnI和BglII的酶切位点识别序列之间片段，得到能够表达DX88-HSA融合蛋白的重组穿梭质粒。通过同样的方法，利用1.2中制备的hKLKB1表达盒制备穿梭质粒。采用三质粒系统(穿梭质粒、带AAV载体rep、cap基因的pRepCap质粒(其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，并由金唯智合成)和辅助质粒pHelper(其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，并由金唯智合成)，以PEI为转染试剂，共同转染HEK293细胞，重组包装出AAV病毒载体；转染后48h进行收获，收获液经纯化后获得一定纯度的重组AAV病毒载体。
所述纯化方法如下：
首先对收获液进行预处理：充分裂解HEK293细胞，释放出细胞内的AAV病毒载体，同时加入核酸酶对游离的核酸进行消化，消化结束后，采用离心取上清除去细胞碎片，0.22μm滤膜过滤后滤液用于亲和层析上样。
亲和层析利用配基与蛋白的特异性吸附捕获收获液中的AAV病毒载体，并除去大部分工艺相关杂质，达到浓缩与除杂的效果。将收集的洗脱液混匀，并用中和缓冲液中和，保存在无菌储液瓶中作为阴离子层析上样液。
阴离子层析利用不同组分的等电点差异分离实心与空壳AAV病毒，同时继续去除残留杂质，洗脱液收集在新的无菌储液瓶中，再经超滤浓缩的方法置换缓冲液为制剂稳定的缓冲液，同时病毒滴度浓缩至约1×1013vg/mL，最后除菌过滤分装后备用。
3、AAV病毒载体的滴度定量
以AAV病毒载体的共有序列BGH PolyA设计引物探针，其序列具体如下所示：
F引物序列：5'-tgccttccttgaccctgg-3'(SEQ ID NO:11)；
R引物序列：5'-actcagacaatgcgatgcaa-3'(SEQ ID NO:12)；
探针序列：5'-cactcccactgtcctttcctaata-3'(SEQ ID NO:13)；
然后进行Q-PCR检测，从而对AAV病毒载体进行定量。
其中，在基因组滴度检测过程中，首先要进行标准曲线的建立，阳性标准质粒使用样品稀释液稀释至2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102拷贝/μL，作为标准曲线模板，标准曲线需要控制其线性和扩增效率，一般要求R2>0.99，扩增效率在90％-110％之间。之后采用纯化后的AAV病毒载体(rAAV)样品稀释后进行Q-PCR检测，确保样品检测Ct值在标准曲线范围内，根据样品的Ct值代入到标准曲线中进行rAAV样品基因组滴度的计算，对产品的含量进行定量。
实施例2
本实施例涉及linker的选择。
实施例1中制备的DX88-HSA表达盒包含的是彼此直接连接的DX88和HSA，即二种编码序列之间没有linker。在该表达盒的基础上，在DX88和HSA之间增加不同的linker核酸序列，包括：6xHis*(该序列后为终止序列，即该表达盒只表达DX88)，(GGGGS)2，(EAAAK)2，其核酸序列分别依次如SEQ ID NOs:14～16所示。这样，得到不同的穿梭质粒，标注为DX88-Null-HSA、DX88-(GGGGS)2-HSA、DX88-(EAAAK)2-HSA、DX88-6×His*-HSA。
2、脂质体转染质粒实验
上述不同的穿梭质粒采用脂质体转染质粒的方法，将目的基因导入Huh-7细胞中进行瞬时转染表达。
脂质体转染质粒的方法如下：消化人肝癌细胞系Huh-7(购自中国科学院细胞库，货号SCSP-526)，并按2.7×104细胞/孔接种于96板中，同时加入P3000/Lipo3000/DNA转染复合物进行质粒转染实验，每组3个复孔。转染试剂与穿梭质粒按60ng/孔质粒、0.12μL/孔P3000和0.18μL/孔Lipo 3000(ThermoFisher，L3000015)混合，加入96孔板细胞中，置于CO2恒温培养箱培养48小时。更换培养基为FreeStyle293(购自ThermoFisher，12338018)，之后继续培养48小时，收集上清用于后续PKa抑制剂活性分析和Western印迹检测分析。
3、PKa抑制剂活性分析
PKa抑制剂活性分析。取转染后的细胞培养基上清25μL与100ng HumanKallikrein(Enzyme Research，HPKa 1303)混合，加入75μL含荧光底物H-Pro-Phe-Arg-AMC(GLPBIO，GA22857)的缓冲液，立即用酶标仪(BioTek)在345/445nm读取荧光信号，每分钟记录一次。得到的结果如图2所示。从图2可以看出，DX88和HSA之间不加入linker的组(即DX88-Null-HSA)相对于其他带有接头组而言，对PKa表现出显著更高的抑制活性，该效果不符合接头通常有利于各融合组件维持正确三维结构、进而有利于融合蛋白活性的共识，是预料不到的。
4、目的蛋白的Western印迹检测分析
细胞培养上清与5x SDS上样缓冲液(雅酶，LT103)以4：1比例混合，95℃变性5分钟。SDS-PAGE上样5μL蛋白电泳，之后转移到PVDF膜上，5％脱脂牛奶室温封闭1小时，加抗体孵育，ECL液显影，用ChemiDoc Touch Imaging System(Bio-Rad)拍照，图片用Image J软件进行灰度分析。所用抗体信息如下，Anti-HSA(Sino biological，68001-R101)，二抗为羊抗兔IgG HRP(SouthernBiotech，4050-05)。结果如图3所示。一般认为，接头肽的存在可以避免因融合组件之间相互干扰导致错误折叠、进而导致表达量下降，而从图3可以看出，本文公开的融合蛋白(即Null组)的蛋白表达量反而高于通过不同linker连接二者而得的融合蛋白组。
实施例3
本实施例涉及HSA优化核酸序列的筛选。
1、质粒的构建
对HSA的野生型核苷酸序列(SEQ ID NO:2)进行密码子优化，记为HSA Opt-1～3，Opt-1～3的核苷酸序列依次如SEQ ID NOs:17～19所示。使用SEQ ID NOs:17～19所示氨基酸序列分别替换实施例1中的1.1小节制备的DX88-HSA野生型表达盒中的野生型HSA编码序列，得到三种不同的DX88-HSA优化序列表达盒，其分别包含编码DX88-HSA Opt-1、DX88-HSAOpt-2或DX88-HSA Opt-3融合蛋白的核苷酸序列。作为示例，DX88-HSA Opt-3优化序列表达盒具有如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列，使用TGA作为终止密码子。
用三种优化序列表达盒分别替换实施例1中的2小节制备的穿梭质粒中的DX88-HSA野生型表达盒，得到携带不同HSA优化核酸序列的穿梭质粒。通过与实施例1相同的方法扩增穿梭质粒后，提纯得到用于后续转染的质粒。
2、小鼠尾静脉高压注射质粒转染
8周龄的C57BL/6雄性小鼠，10μg质粒溶于2mL PBS中，通过小鼠尾静脉在5～7秒内注射完毕。于注射后第三天眶周采血约200μL制备血清。
3、融合蛋白的Western印迹检测分析
血清样本用含1×SDS上样缓冲液(雅酶，LT101L)的RIPA裂解液(碧云天，P0013B)1：20稀释，95℃变性10分钟。SDS-PAGE上样5μL蛋白电泳，之后转移到PVDF膜上，用5％脱脂牛奶室温封闭1小时，加抗体Anti-HSA(Sino biological，68001-R101)孵育，ECL液显影，用ChemiDoc Touch Imaging System(Bio-Rad)拍照，图片用Image J软件进行灰度分析。结果如图4所示。从图4中可以看出，使用包含DX88-HSA Opt-3表达盒的质粒所表达产生的DX-88-HSA融合蛋白的量显著高于使用包含其他两条优化核酸序列的表达盒编码的融合蛋白的表达量。
实施例4
制备DX88-HSA-6xHis融合蛋白
1、融合蛋白表达及纯化
DX88-HSA-6xHis融合蛋白由HEK293F细胞表达，按照实施例1的方法制备含有DX88-HSA-6xHis(SEQ ID NO:22+SEQ ID NO:14)的质粒，转染时细胞密度为2e6细胞/mL，用PEI(聚乙烯亚胺)与质粒混合，质粒用量为1μg每mL细胞，于72小时离心收集细胞上清，过Ni柱(Genscript，L00683-51)纯化，再用30kDa超滤管(Merck，UFC903096)置换缓冲液。蛋白最终溶于1x PBS，蛋白分装保存于-80℃。
2、融合蛋白浓度及纯度测定。使用BCA法(Beyotime，P0009)对蛋白浓度定量，用ELISA法测定样本摩尔浓度(方法参见实施例6)，统一使用HSA(国家药品标准物质，280023)作为标准品。用实际摩尔浓度除以总蛋白理论摩尔浓度，即为融合蛋白纯度。最后蛋白用SDS-PAGE电泳，上样量约12μg/well，结果如图5所示，其中M为蛋白Marker(ThermoFisher，26616)，NR为非还原处理，R为还原处理。
从图5可以看出，DX88-HSA在还原条件下跑胶分子量～70kDa，在非还原条件下～60kDa，且观察到二聚体等多聚体存在，初步说明DX88-HSA融合后未影响HSA空间结构，保留了HSA基本特点。此外，可以看出DX88-HSA纯化蛋白纯度较高。
实施例5
本实施例涉及DX88-HSA融合蛋白的体外活性
1、融合蛋白在猴血清中的活性
血清样本内源PKa活性检测。将通过实施例4制备的融合蛋白用猴血清稀释到如图6所示浓度，取该血清80μL，加入20μL含荧光底物H-Pro-Phe-Arg-AMC(GLPBIO，GA22857，PKa特异底物)和硫酸葡聚糖DXS(Solarbio，D8320)的缓冲液，立即放入酶标仪读取信号。
结果如图6和图7所示，图6中，RFU为相对荧光单位，+DXS表示添加终浓度为20μg/mL的DXS激活PKa。PKa激活速率随DXS的浓度提高而提高，经测试DXS20μg/mL时，激活速率接近最大，高于病理条件。标记浓度为所添加的DX88-HSA融合蛋白在反应体系中的终浓度。每个剂量均独立重复3次。从图6中可以看出，与未添加DXS的对照相比，添加了DXS的各组中，均观察到由激活的血浆激肽释放酶(PKa)激发荧光底物发光；并且，相对荧光强度在未添加任何DX88-HSA融合蛋白的对照中最高，随着DX88-HSA融合蛋白的添加量增加而减弱，表明本文制备的DX88-HSA融合蛋白能剂量依赖性地抑制猴血清中PKa活性。从图7可以得到，DX88-HSA在该条件下抑制猴血清中PKa所需IC50为243.4nM。
2、融合蛋白在人血清中的活性
将通过实施例4制备的DX88-HSA融合蛋白用人血清(健康志愿者捐献，由5份血清制备混合池)稀释到如图8所示浓度。以未添加融合蛋白的人血清作为对照，取上述血清各20μL，分别与4μL 120μg/mL的DXS或等体积的水充分混合(即，使DXS的终浓度成为20μg/mL)，立即放置冰上。分别于6、7、8或9分钟后，从各组分别吸出2μL反应液，与38μL含1×SDS上样缓冲液混合，95℃变性10分钟。通过实施例3所述的Western印迹方法检测全长HK水平，使用的抗体为Anti-Kininogen 1(abcam，ab124737)。结果如图8和图9所示。
从图8可以看出，与未添加DXS的对照(第1列)相比，添加DXS使PKa活化后，血清中的HK蛋白(高分子量激肽原，high-molecular-weight kininogen)被完全降解(第2列)；HK蛋白的降解可以被外源添加的DX88-HSA融合蛋白显著抑制，且该抑制活性对DX88-HSA融合蛋白的添加量呈现典型的浓度依赖性(第3～6列)。
图9根据图8的灰度计算得到，通过除以对照样品(-DXS，第1列)灰度值，得到各处理组相对未激活样品水平。从图9可知，DX88-HSA在体外显著抑制人血清中HK降解所需浓度约为250nM。
实施例6
本实施例比较了密码子优化表达盒(含Opt-3)和野生型表达盒(含HSA-WT)在小鼠体内的基因、转录和翻译水平
1、病毒载体构建
如实施例1中的2小节所述，制备包含DX88-HSA WT(简称WT)的AAV8病毒载体。通过将实施例1构建的病毒载体中的野生型表达盒(SEQ ID NO:26)替换为实施例3中的1小节制备的DX88-HSA Opt-3优化序列表达盒(SEQ ID NO:25)，得到携带DX88-HSA Opt-3(简称Opt-3)的AAV8病毒载体。
2、小鼠尾静脉注射AAV8病毒
向8周龄的C57BL/6雄性小鼠中分别通过尾静脉注射野生型和密码子优化的重组腺病毒，每只注射体积为200μL，病毒原液提前用溶媒稀释到图10至13所示剂量。于注射后2周和4周眶周采血约200μL制备血清。
3、检测小鼠血清DX88-HSA蛋白水平
3.1通过实施例3所述的Western印迹方法检测小鼠血清中的DX88-HSA蛋白水平。
3.2小鼠血清中DX88-HSA蛋白水平使用ELISA方法检测。流程如下，(1)用100μLCapture抗体(Sino biological，68001-R101)包板(ThermoFisher,446469)过夜，用300μLPBST漂洗3遍，(2)加300μL 2％PVP/PVA封闭2小时，再次漂洗，(3)之后加入标准品(国家药品标准物质，280023)和经过相同倍数稀释的待检血清样品各100μL，室温孵育2小时后漂洗，(4)再用100μL Detection抗体(abcam，ab24207)孵育1.5小时后漂洗，(5)加入100μLStreptavidin-HRP(Jackson ImmunoResearch，016-030-084)结合20分钟后漂洗，(6)最后用TMB显色，用酶标仪(BioTek)在OD450 nm读取吸光值。
4、AAV病毒DNA 拷贝数
小鼠肝脏AAV病毒DNA拷贝数检测。小鼠肝脏DNA提取使用血液/组织基因组DNA提取试剂盒(Qiagen，69504)，拷贝数检测使用TaqMan探针法PCR(TaKaRa，RR392A)法，正向引物DX-F(5’-GCACTCCTTCTGTGCCTTCA-3’,SEQ ID NO:27)，反向引物DX-R(5’-CTTCTTGCACTCCTCCAGGG-3’,SEQ ID NO:28)，探针DX-P(5’-ATGGCCCCTGCAGAGCTGCA-3’,SEQID NO:29)，标准品为线性化的含目标基因的载体质粒，各样品病毒载体拷贝数用DNA浓度校准，结果表示为每μg DNA中病毒载体拷贝数。
5、小鼠肝脏AAV病毒RNA水平检测。
小鼠肝脏RNA提取使用总RNA小量提取试剂盒(Qiagen，74106)，对提取RNA进行定量，使用1μg总RNA进行逆转录(TaKaRa，RR047A)。病毒载体RNA水平检测使用SYBR相对定量PCR(TaKaRa，RR820A)法，目的基因正向引物DX-F(SEQ ID NO:27)，反向引物DX-R(SEQ IDNO:28)，内参基因使用小鼠Tbp，正向引物Tbp-F(5’-CCGTGAATCTTGGCTGTAAACT-3’，SEQ IDNO:30)，反向引物Tbp-R(5’-TGTCCGTGGCTCTCTTATTC-3’，SEQ ID NO:31)。
结果如图10～13所示。图10和图11为小鼠注射两周后取样进行目的蛋白的Western印迹检测分析。图10为蛋白跑胶图，图11为图10的灰度分析图。图12为小鼠注射图中所示不同剂量的病毒载体，并在四周后取样进行小鼠血清DX88-HSA ELISA分析得到的图。从图10至图12中可以看出，在相同的注射量下，使用Opt-3在体内产生的融合蛋白水平显著高于WT，表明使用经过优化的编码序列能够在体内产生显著高于野生型的融合蛋白产量。
图13显示了注射剂量为5e11的病毒载体在注射小鼠4周后取样进行小鼠血清DX88-HSAELISA、DNA拷贝数和RNA水平检测的结果图。从该图可以看出，与用HSA野生型编码序列构建的重组病毒载体相比，使用优化编码序列Opt-3构建的重组载体在相似的病毒拷贝数的情况下，能够实现显著提高的转录水平和翻译水平，表明使用Opt-3构建的融合蛋白编码序列的转录效率和表达效率明显提升。
实施例7
按照实施例6中的方法向8周龄的C57BL/6雄性小鼠注射不同剂量的病毒载体，每组5只，在注射后的不同时间点(2周、4周、8周、12周、16周、20周、24周)采血，采用实施例6中小鼠血清DX88-HSAELISA检测方法进行检测，结果如图14所示。从图14可以看出，不同注射剂量的AAV8 Opt-3在小鼠体内均可长期被检测到稳定表达，并且其表达量还在一定程度上呈现出经时地增加，表明本文公开的病毒载体能够长时间地存在于体内并稳定表达产生本发明的融合蛋白。
实施例8
人源KLKB1模型小鼠构建及药效评价
1、病毒载体构建
通过实施例1中的1.2小节所述方法构建携带SerpinA1启动子驱动的、表达人源KLKB1(简称hKLKB1)的AAV8病毒载体。
2、表达人源KLKB1小鼠模型构建
利用实施例6中的方法，将如上所述制备的hKLKB1病毒载体按图15所示剂量向8周龄的C57BL/6雄性小鼠注射，每个剂量组随机分配6只小鼠。
3、小鼠血清中人源KLKB1的表达情况
于注射后4周取血样，通过实施例3所述的Western印迹方法检测其中的hKLKB1蛋白。其中，使用的小鼠或正常人血清样本用1×SDS上样缓冲液按图15所示不同比例稀释，使用的抗体为Anti-KLKB1(abcam，ab124938)。结果如图15所示。
图16为图15中注射量分别为3e12和6e12 vg/kg的小鼠血清中hKLKB1蛋白量相对正常人血清的比值。
从图15中可以看出，将AAV8 hKLKB1载体以3e12 vg/kg注射小鼠时，所在体内表达所产生的PK蛋白血清水平与正常人血清相近，作为人源KLKB1模型。
4、PKa活性和HK检测
对C57BL/6小鼠注射不同的病毒载体或载体组合，如单独注射通过本实施例制备的、携带hKLKB1基因的AAV8载体(3e12 vg/kg)，或者同时注射上述剂量的hKLKB1-AAV8载体与携带DX88-HSA(Opt-3)的AAV8载体(5e11 vg/kg)，于注射四周后采血，检测相应指标。
4.1PKa活性检测
分析其PKa活性，方法参见实施例5，此处所用DXS浓度为10μg/mL。结果示于图17。
从图17中可以看出，在添加或未添加DXS的组中，共表达DX88-HSA(Opt-3)融合蛋白均能使相对荧光强度和单位时间荧光变化率的峰值和曲线斜率显著降低，表明携带DX88-HSA(Opt-3)的重组载体能够在体内表达具有DX-88活性的融合蛋白，显著抑制人源KLKB1模型中的PKa活性，该抑制效果在使用DXS激活血浆激肽释放酶后更加明显(见标注DXS组)。
4.2小鼠HK检测
对4.1中的人源KLKB1模型小鼠在转染或未转染携带DX88-HSA(Opt-3)的AAV8载体的不同情况下的血清中的内源性mHK蛋白进行Western印迹检测，方法参见实施例3。所用抗体为Anti-Bradykinin(Thermo，PA5-79571)。结果如图18所示，其中，WT表示正常野生小鼠，hKLKB1表示未转染的人源KLKB1模型小鼠，hKLKB1+DX88-HSA(Opt-3)表示共转染了携带DX88-HSA(Opt-3)的AAV8载体的人源KLKB1模型小鼠。图19为图18对应的灰度分析图。
结果同样显示，使用本发明的DX88-HSA(Opt-3)表达盒制得的重组病毒载体能在体内显著抑制内源性HK的降解，具有治疗由于PKa功能亢进所致疾病或适应症的基因药物的潜力。
5、血管渗透性
对4.2中制备的两组小鼠的结肠和后足进行血管渗透性分析。
血管渗透性采用伊文思蓝法检测。流程如下，小鼠尾静脉缓慢注射含30mg/kg伊文思蓝(Sigma，E2129)和2.5mg/kg Captopril(MCE，HY-B0368)的1x PBS缓冲液。30分钟后，用异氟烷充分麻醉小鼠，用10mL的1x PBS灌流，取结肠和后足分别装入EP管中，充分干燥后，称取组织净重。染料用甲酰胺(生工，A600212-0500)于60℃过夜萃取，用酶标仪在OD 620nm读取吸光值，最后计算单位重量组织中染料的含量。结果如图20所示。
从图20中可以看出，使用本发明的DX88-HSA(Opt-3)表达盒制得的重组病毒载体能在体内显著抑制血管渗透性的增加。

Claims (12)

1.一种融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含直接连接的DX88与HSA，其中，所述HSA的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，所述连接发生在DX88的N端与HSA的C端、或者DX88的C端与HSA的N端，优选地发生在DX88的C端与HSA的N端。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述DX88的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
3.一种核酸分子，其编码如权利要求1或2所述的融合蛋白，所述核酸分子包含如SEQID NO:17至19中任一项所示的核苷酸序列，优选SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列；
优选地，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。
4.一种转基因表达盒，其中，其属于以下的任一种：
a)表达如权利要求1或2所述的融合蛋白；
b)含有权利要求3所述的核酸分子。
5.如权利要求4所述的转基因表达盒，其中，所述转基因表达盒还包含与权利要求3所述的核酸分子可操作地连接地调控元件；
可选地，所述调控元件选自增强子、启动子、内含子或终止子中的任一者或其任意组合；
可选地，所述启动子选自CAG启动子、CMV启动子、SerpinG1基因启动子、ALB基因启动子、SerpinA1基因启动子、HLP基因启动子或LP基因启动子，优选地，所述启动子为SerpinA1基因启动子，更优选地，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；和/或
所述内含子为截短的SerpinA1内含子，优选地，所述截短的SerpinA1内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；和/或，
所述终止子选自BGH polyA、hGH polyA或GH polyA，优选地，所述终止子为BGH polyA，更优选地，所述BGH polyA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；和/或，
所述增强子为ApoE HCR增强子，优选地，所述ApoE HCR增强子的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。
6.如权利要求5所述的转基因表达盒，其中，所述转基因表达盒还包括位于所述内含子和所述核酸分子之间的信号肽，可选地，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:23或SEQID NO:24所示。
7.如权利要求5或6所述的转基因表达盒，其具有如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列。
8.一种重组腺相关病毒，其表达如权利要求1或2所述的融合蛋白、或包含如权利要求3所述的核酸分子、或包含如权利要求5～7中任一项所述的转基因表达盒；
优选地，所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或rhAAV10；
更优选地，所述AAV为AAV8。
9.一种宿主细胞，其表达如权利要求1或2所述的融合蛋白、或包含如权利要求3所述的核酸分子、或包含如权利要求5～7中任一项所述的转基因表达盒、或者包含或感染有如权利要求8所述的重组腺相关病毒。
10.一种组合物，其中，其包括选自如权利要求1或2所述的融合蛋白、如权利要求3所述的核酸分子、如权利要求5～7中任一项所述的转基因表达盒、如权利要求8所述的重组腺相关病毒、或者如权利要求9所述的宿主细胞中的任一者或其任意组合；
优选地，所述组合物为药物组合物；
更优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
11.如权利要求1或2所述的融合蛋白、如权利要求3所述的核酸分子、如权利要求5～7中任一项所述的转基因表达盒、如权利要求8所述的重组腺相关病毒、如权利要求9所述的宿主细胞、或者如权利要求10所述的组合物中的任一者或其任意组合在制备用于治疗与血浆激肽释放酶(PKa)和/或凝血酶因子XIIa的活性亢进相关的疾病或适应症的药物中的应用；
所述与血浆激肽释放酶(PKa)和/或凝血酶因子XIIa的活性亢进相关的疾病或适应症可选自、由环境、激素诱导或药物诱导的非遗传性血管水肿、晚期糖尿病性黄斑水肿、神经炎性疾病如脱髓鞘症，优选选自遗传性血管性水肿。
12.一种编码HSA的核酸分子，其包含如SEQ ID NO:17至19中任一种所示的核苷酸序列，优选包含如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。
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