CN118103749A - 激光成像中快速深度扫描的方法和设备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于激光成像中快速深度扫描的方法和设备。所述方法包括掩蔽入射到贝塞尔光束形成的光学系统上的激光束的选定区域，以生成具有可控深度和长度的线状聚焦。使用数字微镜装置(DMD)作为掩模装置能够快速(以多kHz速率)修改输入掩模，从而快速改变样本中典型贝塞尔光束区域的子部分的长度和轴向位置。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年10月13日提交的美国临时申请63/255,201的优先权，所述临时申请通过引用并入本文。
背景技术
荧光显微镜是用于在生物学和医学研究中的一种主要方法。已经开发了多种方法来将这种方法应用于大量的样本和配置。荧光显微镜的一个主要缺点是光学散射。生物组织强烈地散射光，这限制了可以获取的显微镜图像的深度。因此，传统的光学显微镜通常需要样本的薄片才能正确成像。解决这个问题的最早发明是共焦显微镜(美国专利号3,013,467)，它通过使用一种光学配置来解决散射问题，在所述光学配置中，只有来自感兴趣平面的聚焦光通过针孔并在检测器处被收集，而离焦的荧光被阻挡。自发明以来，共焦显微镜得到了广泛的应用。更新的替代方法是从组织内部成像的非线性显微镜(W.Denk等人，“Two-photon laser scanning fluorescence microscopy,”Science,vol.248,no.4951,pp.73-76,Apr.1990)，其中短脉冲、较长波长的激光仅在焦点体积的最强区域内生成荧光信号。这两种方法都可以通过逐点扫描的方式，从组织内部生成平面图像。因此，收集完整图像所需的时间高度依赖于设备中几个组件的速度。
在典型的点扫描显微镜中，使用振镜控制的反射镜进行横向扫描(图1A中的x-y平面)。共振振镜的扫描速度可以超过10kHz，使其成为快速扫描的首选方式。轴向扫描(图1A和图1B中的z轴)通常需要其自身的方法，并且传统上一直是三维扫描的瓶颈。最简单的轴向扫描方式是机械平移显微镜物镜，通常使用压电载物台进行平移。由于显微镜物镜相对较大的惯性，这种扫描速度相当慢。已经开发了多种光学方法来提高深度扫描的速度。例如，电动可调焦透镜可以在物镜之前引起激光束的会聚和/或发散，从而扩散/收缩z方向上的焦点位置(B.F.Grewe等人，“Fast two-layer two-photon imaging of neuronal cellpopulations using an electrically tunable lens,”Biomed.Opt.Express,vol.2,no.7,pp.2035-2046,Jul.2011)。电动可调焦透镜的响应时间为数毫秒，相应的扫描速率(完整图像)约为20-30Hz。另一种不仅允许访问不同深度，还允许在三维可访问体积中访问任何点的方法，是使用声光透镜(P.A.Kirkby等人，“A compact acousto-optic lens for2D and 3D femtosecond based 2-photon microscopy,”Opt.Express,vol.18,no.13,pp.13720-13744,Jun.2010)。这种随机访问序列的速度可以达到几十kHz。这种方法的主要缺点是成本高和实验复杂。也可以在成像物镜之前使用互补显微镜物镜来生成远程聚焦机制；将聚焦光束回射到自身上，并快速扫描反射镜以控制成像物镜的焦平面(N.J.Sofroniew等人，“Alarge field of view two-photon mesoscope withsubcellular resolution for in vivo imaging,”eLife,vol.5,p.el4472,Jun.2016)。
由于需要访问大量的点，采用点扫描方法进行的三维成像本质上是速度受限的。此外，虽然振镜可以以千赫频率扫描，但惯性深度扫描方法(例如可调焦透镜和振镜)要慢得多。快速成像在神经科学等应用中至关重要，在这些应用中，细胞通信在毫秒或更短的时间尺度内进行。
最近的一种提高速度的扫描方法是“体积成像”(G.Theriault等人，“Extendeddepth of field microscopy for rapid volumetric two-photon imaging,”Opt.Express,vol.21,no.8,pp.10095-10104,Apr.2013；J.L.Fan等人，“High-speedvolumetric two-photon fluorescence imaging of neurovascular dynamics”，Nat.Commun.,vol.11,no.1,Art.no.1,Nov.2020；R.Lu等人，“Video-rate volumetricfunctional imaging of the brain at synaptic resolution,”Nat.Neurosci.,vol.20,no.4,Art.no.4,Apr.2017)，在这些方法中，激光束被成形为沿着光轴的线状焦点而不是点(图1B)。这些特殊光束被称为无衍射光束或贝塞尔光束(Bessel beams)(J.Durnin等人，“Diffraction-free beams,”Phys Rev Lett,vol.58,no.15,pp.1499-1501,1987；J.Durnin,“Exact solutions for nondiffracting beams.I.the scalar theory,”J OptSocAmA,vol.4,no.4,pp.651-654,1987)。
贝塞尔光束在比传统的聚焦高斯光束大得多的距离(典型的10-100倍)上保持强度。使用贝塞尔光束进行体积成像大大减少了采集时间，因为整个样品深度同时被照亮。然而，这种图像采集速度的提高是以牺牲轴向分辨率为代价的。在给定横向点(x，y)处沿线状焦点的所有特征在z方向上被整合到单一数据点中，因此深度信息丢失。因此，体积成像的现有技术方法局限于低密度样本的成像，以至于平均而言，沿着给定的线大致只有一个细胞。为了解决这个关键问题，本文公开了一种允许在体积成像中恢复轴向信息的方法和设备。
发明内容
本文公开了一种用于激光成像或光刺激中的快速深度扫描的设备。所述方法包括：
激光源，所述激光源被构造和配置为生成输入激光束；
掩模装置，所述掩模装置被构造和配置为对输入激光束上的期望图案进行掩蔽，以生成掩蔽的激光束；
光束整形元件，所述光束整形元件用于将掩蔽的激光束转换成具有受控位置和线状聚焦长度的光束；以及
扫描显微镜，所述扫描显微镜被构造和配置为将光束整形元件生成的光束转移到显微镜物镜的焦平面。
所述设备进一步包括激光束功率控制器和激光束尺寸控制器，所述激光束功率控制器和激光束尺寸控制器能够操作地连接到激光源。
所述设备进一步包括散光控制器，所述散光控制器被构造、配置和定位为用于校正输入激光束的光束椭圆度。
所述设备进一步包括衍射元件，所述衍射元件被构造和配置为校正角色散，所述衍射元件放置在掩模装置之前或之后。
在某些实施例中，掩模装置生成具有多个同步环的掩模，使得每个环在样本平面中生成不同的聚焦区域，从而允许从多个平面进行同时成像。
在某些实施例中，掩模装置在两个环形状之间切换，使得每个环在样本平面中生成不同的聚焦区域，从而允许在两个平面之间进行交错成像。
优选地，掩模装置是数字微镜装置(“DMD”)。DMD使用闪耀光栅以最大化DMD的衍射效率。
所述光束整形元件生成的光束是贝塞尔光束。在某些实施例中，所述光束整形元件是锥透镜、空间光调制器或衍射锥透镜。
所述设备进一步包括光学中继系统，所述光学中继系统被构造和配置为将掩蔽的激光束的图像投影到光束整形元件的入射槽面上。
所述设备的扫描显微镜进一步包括：
转移透镜，所述转移透镜用于将光束整形元件生成的光束中继到成像区域；
共振振镜扫描器；
光学中继系统，所述光学中继系统用于将共振振镜平面中继到振镜对；以及
点扫描系统，所述点扫描系统包括振镜对、扫描透镜、管透镜和物镜。
所述设备进一步包括检测系统，所述检测系统包括至少一个光电倍增管。
所述设备进一步包括集控单元，所述集控单元被构造和配置为：控制激光源的功率，将期望图案投影到掩模装置上，控制振镜扫描器，从至少一个检测器收集荧光信号，从样本中的至少一个点收集荧光信号，以及将收集的数据显示为二维图像或三维图像。
本文进一步公开了一种用于激光成像或光刺激中的快速深度扫描的方法。所述方法包括：
(a)生成输入激光束；
(b)掩蔽输入激光束上的期望图案，以生成掩蔽的激光束；
(c)将掩蔽的激光束转换成具有受控位置和线状聚焦长度的光束；
(d)将步骤(c)的光束转移到显微镜物镜的焦平面上；并且
(e)从用步骤(d)的光束照射的样本中收集荧光信号。
所述方法进一步包括在步骤(a)之后调整输入激光束的激光功率和/或激光束尺寸。
所述方法进一步包括在步骤(b)之前或之后校正光束椭圆度。
所述方法进一步包括在步骤(b)之前或之后校正角色散。
所述方法进一步包括投影在步骤(b)中生成的掩蔽的激光束的图像，以在步骤(c)中转换掩蔽的激光束。
步骤(c)生成的光束是贝塞尔光束。
从下面结合附图对本发明的优选实施例的详细描述中，本发明的目的和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1A是使用点扫描方法的三维成像的示意图；图1B是使用扩散聚焦线扫描的体积成像的示意图。
图2示出了通过锥透镜将高斯光束转换成贝塞尔光束。
图3示出了根据公式4计算的贝塞尔光束的径向和轴向强度分布。
图4是控制贝塞尔光束的线状聚焦的位置和长度的几何示意图。
图5示出了作为具有成角度的槽面的衍射光栅的DMD的光学行为。
图6显示了特定DMD的输入-输出角度配置。
图7示出了本文描述的快速深度扫描成像方法的工作流程。
图8示出了如本文所述的用于快速深度扫描成像的设备的示例性布局。
图9示出了计算并投影到DMD上的环形图案的示例。
图10显示了通过DMD整形的贝塞尔光束获得的铃兰属样本的双光子图像。DMD掩模和相应的图像平面显示在图像下方。
图11显示了来自荧光染色胶原样本的不同深度的双光子系列图像，其中深度变化通过DMD整形的贝塞尔光束获得。
具体实施方式
本文使用的数值范围旨在包括所述范围内包含的每个数值和数值子集，无论是否具体公开。此外，这些数值范围应被解释为支持针对所述范围内的任何数值或数值子集的权利要求。例如，从1到10的公开应被解释为支持从2到8、从3到7、从5到6、从1到9、从3.6到4.6、从3.5到9.9等等的范围。
如本文所用，除非上下文另有明确规定，单数形式的“一(a)”、“一个(an)”和“所述”包括复数指代物。
如本文所用，除非上下文另有明确规定，术语“或”是包含性的“或”运算符，并且等同于术语“和/或”。
无论是否明确描述，除非在进行所引用的组合的上下文中有相反的说明或明确暗示，本文描述的元件和方法步骤可以以任何组合使用。
除非在进行所引用的组合的上下文中有相反的说明或明确暗示，本文使用的方法步骤的所有组合可以以任何顺序执行。
本文公开的系统可以包括、由或基本上由本文公开的各种步骤和元件组成。
应当理解，本公开不限于本文示出和描述的特定元件和方法步骤，而是包括权利要求范围内的这些修改形式。
贝塞尔光束：
体积成像背后的基本光学概念是线状焦点的生成，这是通过所谓的无衍射光束或贝塞尔光束实现。激光腔通常发射以高斯光束描述的横向强度分布(A.E.Siegman,Lasers.Univ Science Books,1986)。在最常用的情况下，亦即单模或TEM00的情况，强度横截面遵循钟形曲线，而钟形的宽度随传播而变化：
其中I是光强或辐照度，由每单位时间每单位面积的能量定义，r是径向位置，z是轴向位置，w(z)是光束半径，P是光束的总功率。重要的是要注意光束半径对传播距离z的依赖性。这种依赖性由以下公式给出：
其中
λ是激光的波长。在上述的公式2-3中，w0是给定高斯光束的最小半径，通常称为光束腰；以及zR是强度下降一半的传播距离。
上述传播行为是光的波动性质的直接结果，或者更具体地说是衍射的直接结果。基本上规定，聚焦光束的最小半径约为波长的一半。根据公式3，这种聚焦光束的轴向范围也将是波长的量级。这个下限被称为衍射极限。图1A表示聚焦高斯光束的椭球状三维形状。这种强的局部化可能是点扫描的一个优势，因为它提高了轴向和横向分辨率。然而，它也阻碍了体积扫描，或阻碍了其他需要较长焦点区域的应用。
非衍射光束的数学基础由Durnin(j.Durnin等人，“Diffraction-free beams,”Phys Rev Let,vol.58,no.15,pp.1499-1501,1987)提出，他表明如果光的径向轮廓遵循第一类贝塞尔函数，那么光束半径和强度与传播距离无关。虽然贝塞尔光束的这种数学理想化需要无限的能量，因此不切实际，但是近似是可能的。将高斯光束转换成贝塞尔光束的最简单和最常用的方法之一是使用锥透镜或轴棱锥透镜(J.H.McLeod，“The Axicon:Anewtype of optical element,”J Opt Soc Am,vol.44,no.8,pp.592-597,1954)。如图2所示，当高斯光束通过锥透镜时，它分裂成一个角度扩展的锥体，并在光束保持重叠的区域形成贝塞尔区。
J.Arlt和K.Dholakia在“Generation of high-order Bessel beams by use ofan axicon”一文中给出了锥透镜生成的贝塞尔光束的强度分布(J.Arlt and K.Dholakia,“Generation of high-order Bessel beams by use of an axicon,”Opt Commun,vol.177,no.1-6,pp.297-301,2000)：
其中，k是由2π/λ给出的波数，β是通过锥透镜后光束的半锥角，w0是入射高斯光束的半径，Zmax是出现最大强度的轴向位置，并且Jo是第一类零阶贝塞尔函数。
生成贝塞尔光束的其他方法包括但不限于使用窄环和透镜(J.Durnin等人，“Diffraction-free beams,”Phys Rev Lett,vol.58,no.15,pp.1499-1501,1987)，空间光调制器(R.Bowman等人，“Efficient generation of Bessel beam arrays by means ofan SLM,”Eur.Phys.J.Spec.Top.,vol.199,no.1,pp.159—166,Nov.2011)和圆形周期光栅(L.Niggl等人，“Properties of Bessel beams generated by periodic gratings ofcircular symmetry,”J Opt Soc Am A,vol.14,no.1,pp.27-33,1997)。不管生成的方法如何，这些光束都具有共同的传播特性，如下所述。
贝塞尔光束的典型强度分布如图3所示。有一个强度最高的中心点，周围是强度逐渐降低的同心环。在轴向上，光束表现为线状形状。最值得注意的是，光束半径(中心峰值的宽度)与贝塞尔区域内的传播距离无关，这与高斯光束形成鲜明对比。
在以前的发明中已经利用了使用贝塞尔光束的体积成像。例如，Theriault等人在多光子显微镜中使用锥透镜生成的贝塞尔光束来收集扩展景深的体积图像。参见美国专利号9,201,008。在最近的一项发明中，贝塞尔光束是通过空间光调制器(SLM)生成的，所述调制器模拟了锥透镜引起的光学相位。参见美国专利号10,809,510。用于波束整形和掩蔽的方法和设备：
本文描述的是一种允许以非常快速的方式(以快至32kHz或更高的速度)对贝塞尔光束的线状聚焦长度进行精细控制的方法和设备。此外，通过选择足够窄的轴向区域，可以获得接近传统高斯光束成像的径向和轴向分辨率，此外进一步允许以高达32kHz或更高的速率进行深度扫描。本文描述的方法的一些优点是：允许对密度大几倍的样本进行体积成像；具有以快速方式选择要成像的平面的能力；提供了一种在Z方向上比x-y轴更快速地移动焦点区域的方法，这显著减少了整体图像采集时间。
本文描述的方法基于掩蔽入射在锥透镜或其他贝塞尔光束形成的光学系统上的激光束的选定区域。根据图2的几何形状，可以看出贝塞尔区(线状聚焦维持的区域)不仅由锥角决定，还由输入光束的大小决定。通过掩蔽输入光束的环形区域，可以从z轴的两个方向限制贝塞尔区域。
图4示出了本文所述方法的光学背景。该图中显示了一个典型的高斯激光束(暗区域)从左侧穿过锥透镜。光锥重叠的区域是线状聚焦或贝塞尔光束区域。该图进一步示出了(较亮的区域)被掩蔽的光束，这又生成了较短的重叠区域。聚焦区域的长度和位置由掩模的内/外半径决定。因此，通过使用相关的输入掩模，可以在可控的深度和可控的长度下生成线状聚焦。
图4所示贝塞尔区域的快速和程序化控制需要一种生成输入掩模的计算机化方法。数字微镜装置(“DMD”)可用于此目的。美国专利号9,348,136中描述了DMD，因此在此不再详细描述。简而言之，DMD是由微米级大小镜子的阵列组成的光电设备。每个镜以二进制模式(打开角度和关闭角度(ON and OFF angles))运行。阵列被光源照明，反射的光图案通过向微镜阵列投影所需的二进制图案来处理。由于单个元素的微型特性，DMD可以以32kHz的图案速率及以上的图案速率来运行。
在激光或其他相干源应用中使用DMD时，必须考虑一些特殊因素。由于其周期性像素化特性，DMD在光学上表现为衍射光栅。当单色光入射到具有间隔为d的周期性凹槽的衍射光栅上时，部分光被镜面反射(入射角等于反射角)，而部分光在一个或多个方向上被衍射。衍射光束的角度由光栅方程给出：
d(sinθin+sinθm)＝mλ 公式5
其中，θin是输入光束与表面法线形成的角度，θm是特定衍射级的衍射光束的角度，m是称为衍射级的正整数或负整数。通常，多个衍射级的存在会降低特定级的总光功率。这一障碍通过使用闪耀光栅得以缓解，闪耀光栅由锯齿状的槽面轮廓组成(图5)。如果每个槽面的角度和入射角被设置成使得槽面的镜面反射与衍射级一致，则大部分入射功率集中在所述级。闪耀光栅配置可直接应用于DMD(图5)。为了获得最高的光通量性能，DMD被配置为使微镜法线的镜面反射与衍射级重合。
多光子成像系统采用通常具有飞秒和皮秒(也称为超短)脉冲持续时间的脉冲激光。当使用DMD时，这些激光源需要另一层面的关注。超短脉冲本质上是宽带的，包含一系列波长。根据光栅方程(公式5)，每个波长的衍射角不同，因此，DMD的反射导致超短脉冲扩散成扇形角度。这种现象被称为角色散(S.Akturk等人，“The general theory of first-order spatio-temporal distortions of Gaussian pulses and beams,”Opt Express,vol.13,no.21,pp.8642-8661,2005)，并且角色散通常是不被期望的，因为它会导致光束椭圆度，增加脉冲持续时间，并因此降低成像应用中的荧光信号。可以在DMD之前或之后以多种方式校正角色散，包括使用另一个具有适当周期性的衍射光栅、具有适当材料和角度的棱镜，以及使用光栅、棱镜和透镜的组合(J.Cheng等人，“High-speed femtosecond laserbeam shaping based on binary holography using a digital micromirror device,”Opt.Lett.,vol.40,no.21,pp.4875-4878,Nov.2015)。
最后，即使对于单色激光束，衍射光栅以及DMD也会引入光束椭圆度。当将光栅方程(公式5)应用于扩散光束时，可以观察到，在衍射平面中，光束对于入射光束和衍射光束可以不同，这与镜面反射情况(零级)不同。如果需要，可以使用椭圆透镜、辅助光栅或棱镜来校正光束椭圆度。通过调整整个DMD表面上的投影微镜开关(ON-OFF)图案，也可以控制椭圆度(图6)。
DMD近来在多光子成像应用中被使用。Geng等人使用DMD设备生成二元全息图并将相应的激光束投影到样本上，以创建可快速调整的随机访问多光子成像设备(Q.Geng等人，“Digital micromirror device-based two-photon microscopy for three-dimensionaland randomaccess imaging,”Optica,vol.4,no.6,pp.674-677,Jun.2017)。Ducros等人使用空间光调制器(“SLM”)创建多个光束图案，并使用DMD将这些图案中的一个期望图案投影到待成像的样本上(M.Ducros等人，“Encoded multisite two-photon microscopy,”Proc.Natl.Acad.Sci.,vol.110,no.32,pp.13138-13143,Aug.2013)。DMD允许在期望的输入光束条件之间快速转换，并相应地快速跳转到所研究样本内部的各个区域。Park等人利用DMD引入的角色散来提高双光子成像中的轴向分辨率(J.K.Park等人,“Enhanced AxialResolution of Wide-Field Two-Photon Excitation Microscopy by Line ScanningUsing a Digital Micromirror Device,”Micromachines,vol.8,no.3,Art.no.3,Mar.2017)。
激光成像中快速深度扫描的方法和设备：
本文描述了一种用于激光成像中快速深度扫描的方法和设备。所述设备包括：
-根据成像模态的激光源，所述激光源可操作地连接到激光功率控制元件和激光束尺寸控制元件；
-散光控制元件，所述散光控制元件被构造和配置为预补偿光束椭圆度；
-衍射元件，所述衍射元件被构造和配置为预补偿角色散；
-数字微镜装置(DMD)，所述数字微镜装置被构造和配置为在激光束上赋予期望的掩模图案；
-中继系统，所述中继系统将DMD表面投影到期望平面；
-贝塞尔光束整形元件，所述贝塞尔光束整形元件例如是锥透镜；
-传递透镜，传递透镜用于将贝塞尔区域传递到成像区域；
-共振振镜扫描器；
-光学中继系统，所述光学中继系统用于将共振振镜平面中继到振镜对；
-点扫描系统，所述点扫描系统包括振镜对、扫描透镜、管透镜和物镜；以及
-检测系统，所述检测系统包括至少一个光电倍增管。
在某些实施例中，所述设备进一步包括集控单元，所述集控单元被配置成调节激光源的功率，将期望图案投影到DMD，控制振镜扫描器，从一个或多个检测器收集荧光信号，从样本上的一个或多个点收集荧光信号，以及将收集的数据显示为二维图像或三维图像。
图7示出了本文描述和要求保护的方法的工作流程。激光源用作成像源。激光功率和光束形状经过调节，然后由DMD进行光束掩蔽和整形。掩蔽的光束被中继到贝塞尔光束整形元件的输入端。然后，生成的光束用于对样本进行成像。也就是说，振镜扫描显微镜对样本进行点扫描，其中扫描的图像深度由投影到DMD上的图案控制。为每个扫描点收集来自样本的荧光信号，并构建图像。
图8示出了可用于实施本文所述方法的示例性光学成像系统的示意性布局。
多光子显微镜需要能够生成短脉冲持续时间的强脉冲的激光光源。飞秒激光器通常用于实际应用。激光的波长可以在电磁波谱的可见光、近红外和红外区域。双光子通常使用700nm至1100nm的波长，而在三光子荧光应用中通常使用1300nm至1700nm的波长。下面显示的结果主要是在920nm的波长下生成的结果。激光输出的功率可以通过偏振态(例如，普克尔斯盒(Pockels’cells)等)来控制。
在优选实施例中，使用球面透镜对和柱面透镜对来调节激光输出光束。球面透镜构成圆形对称的扩束器/压缩器，以填充DMD的期望部分。柱面透镜组成椭圆的激光扩束器/激光缩束器，以补偿随后的下游衍射元件引起的椭圆度。这些光束调节元件可以放置在DMD之前或之后。对于本文描述的方法和设备，不强制要求散光补偿。然而，这是人们所希望的。椭圆度也可以通过投影在DMD上的图案进行校正。在DMD之前进行校正提高了功率通量。
衍射光栅可用于预补偿DMD引入的角色散。用于角色散校正的衍射光栅可以是反射型光栅或透射型光栅。衍射光栅的凹槽密度可以设计成使得掩模装置和衍射光栅的角色散大小相等但符号相反。在一个例子中，使用具有600mm-1凹槽密度的衍射光栅。这个间隔基本上消除了DMD的角色散。衍射光栅与DMD保持物理上的紧密接近，以避免由于波长的角色散而导致的显着颜色分离(也称为空间色散)。或者，可以使用衍射光栅，后面再使用一对透镜，以获得衍射光栅和DMD之间的扩散分离，同时获得无空间色散。作为另一种选择，可以使用确定参数的棱镜和光栅的组合来基本上或完全消除DMD后的角色散和空间色散。在另一个例子中，为了获得高透射效率，使用定制的透射型体积相位全息衍射光栅(其具有期望凹槽密度)，以基本上消除DMD的角色散。
在该设备的一个示例性构造中使用的DMD具有以下参数：
-微镜阵列尺寸：1280x 800
-微镜间距：10.8微米
-微镜倾斜角度：12度
-DMD最大图案速率：12kHz
-DMD反射率等级：800nm-2000nm
-DMD取向：正方形，对角放置
为了最大化DMD的衍射效率，使用了使用闪耀光栅的光学配置，如图5所示。对于具有上述参数的DMD，输入角度为41.64度，衍射角度为17.64度，当衍射级数m＝3时，同时满足光栅方程和闪耀条件，因此产生了最高的光功率通量。
DMD由基于现场可编程门阵列(FPGA)的高速电子设备控制。期望图案通过个人计算机预先计算并加载到控制器上。这些图案是由黑白区域组成的图像，DMD控制器将其解释为相应像素(例如微镜)的开关状态。图9示出了在所述设备的实际使用中计算和使用的环形图案的一些示例。DMD可用于生成具有多个同步环的掩模，使得每个环在样本平面中生成不同的聚焦区域，从而允许从多个平面进行同时成像。或者，DMD可以在两种环形状之间切换，使得每个环在样本平面中生成不同的聚焦区域，从而允许在两个平面之间进行交错成像。
在激光束被DMD适当掩蔽后，正在行进的光束被转换成贝塞尔光束。DMD可以非常接近贝塞尔光束整形元件，以便最小化由于施加的掩模导致的衍射扩散。或者，光学中继可以在贝塞尔光束整形元件的入射面创建DMD表面的图像。在一种配置中，使用4f-中继系统，其中使用两个相同的透镜，每个透镜的焦距为f，第一个透镜距离DMD一个f的距离，透镜间距为2f，光束再传播f的距离直到中继平面。
贝塞尔光束整形元件可以在不同的备选方案中选择。一种方法是使用锥透镜(也称为轴棱锥透镜)。在一种配置中，采用基角为2度的锥透镜。进一步可以使用空间光调制器，这是一种像素化的元件，可以通过计算机控制生成期望的光学相位图案。另一种方法是使用具有圆形对称的周期性衍射光栅或衍射锥透镜。在所有这些配置中，投影在DMD上的环状轮廓的尺寸将决定元件后形成的贝塞尔区域的深度。在另一种配置是，将环做得足够窄，以便由于衍射而引起大的光束扩散，环的中继平面之后是传统的透镜，并且在透镜的焦平面处及其周围形成贝塞尔光束(J.Durnin等人，“Diffraction-free beams,”Phys RevLet,vol.58,no.15,pp.1499-1501,1987)。
通过上述多种方法中的任何一种形成的贝塞尔光束需要被传递到用于成像目的的显微镜物镜的焦平面。放置在贝塞尔区域后的传递透镜确保正确映射。光学配置的其余部分包括单轴共振振镜、光学中继、双轴常规振镜，接着是扫描透镜/管透镜，最后是物镜。
图10显示了铃兰属样本的双光子成像，图11显示了胶原蛋白样本的双光子成像，两者都是使用本文公开的设备获得的成像。通过改变投影在DMD上的环状掩模的尺寸，可以根据需要，控制和调整贝塞尔区域的宽度，从而控制和调整成像深度。
多光子成像系统通常配备有用于利用光操纵细胞的辅助激光源(称为光刺激的方法)。本文公开的方法和设备也可以用于光刺激。
总之，本文公开的方法和设备包括DMD与贝塞尔光束形成系统的光学组合，以实现快速(以多kHz速率)修改输入掩模，从而快速改变样本中贝塞尔光束区域的子部分的长度和轴向位置。这种方法和设备使得与传统的、现有技术的成像方式相比，实现了显著的改进和灵活性。
Claims (22)
1.一种用于激光成像或光刺激中的快速深度扫描的设备，包括：
激光源，所述激光源被构造和配置为生成输入激光束；
掩模装置，所述掩模装置被构造和配置为对所述输入激光束上的期望图案进行掩蔽，以产生掩蔽的激光束；
光束整形元件，所述光束整形元件用于将所述掩蔽的激光束转换成具有受控位置和线状聚焦长度的光束；
扫描显微镜，所述扫描显微镜被构造和配置为将所述光束整形元件生成的光束转移到显微镜物镜的焦平面。
2.根据权利要求1所述的设备，进一步包括激光束功率控制器和激光束尺寸控制器，所述激光束功率控制器和激光束尺寸控制器可操作地连接到激光源。
3.根据权利要求1所述的设备，进一步包括散光控制器，所述散光控制器被构造、配置和定位为用于校正输入激光束的光束椭圆度。
4.根据权利要求1所述的设备，进一步包括衍射元件，所述衍射元件被构造和配置为用于校正角色散，所述衍射元件放置在所述掩模装置之前或之后。
5.根据权利要求1所述的设备，其中，所述掩模装置生成具有多个同步环的掩模，使得每个环在样本平面中生成不同的聚焦区域，从而允许从多个平面进行同时成像。
6.根据权利要求1所述的设备，其中，所述掩模装置在两个环形状之间切换，使得每个环在样本平面中生成不同的聚焦区域，从而允许在两个平面之间进行交错成像。
7.根据权利要求1所述的设备，其中，所述掩模装置是数字微镜装置(“DMD”)。
8.根据权利要求7所述的设备，其中，所述DMD使用闪耀光栅以最大化DMD的衍射效率。
9.根据权利要求1所述的设备，其中，所述光束整形元件生成的光束是贝塞尔光束。
10.根据权利要求1所述的设备，其中，所述光束整形元件是锥透镜。
11.根据权利要求1所述的设备，其中，所述光束整形元件是空间光调制器。
12.根据权利要求1所述的设备，其中，所述光束整形元件是衍射锥透镜。
13.根据权利要求1所述的设备，进一步包括光学中继系统，所述光学中继系统被构造和配置为将所述掩蔽的激光束的图像投影到光束整形元件的入射槽面。
14.根据权利要求1所述的设备，其中，所述扫描显微镜进一步包括：
传递透镜，所述传递透镜用于将光束整形元件生成的光束中继到成像区域；
共振振镜扫描器；
光学中继系统，所述光学中继系统用于将共振振镜平面中继到振镜对；以及
点扫描系统，所述点扫描系统包括振镜对、扫描透镜、管透镜和物镜。
15.根据权利要求1所述的设备，进一步包括检测系统，所述检测系统包括至少一个光电倍增管。
16.根据权利要求1所述的设备，进一步包括集控单元，所述集控单元被构造和配置为：控制激光源的功率，将期望图案投影到掩模装置上，控制振镜扫描器，从至少一个检测器收集荧光信号，从样本中的至少一个点收集荧光信号，以及将收集的数据显示为二维图像或三维图像。
17.一种用于激光成像或光刺激中的快速深度扫描的方法，包括：
(a)生成输入激光束；
(b)掩蔽所述输入激光束上的期望图案，以生成掩蔽的激光束；
(c)将所述掩蔽的激光束转换成具有受控位置和线状聚焦长度的光束；
(d)将步骤(c)的光束转移到显微镜物镜的焦平面；并且
(e)从用步骤(d)的光束照射的样本中收集荧光信号。
18.根据权利要求17所述的方法，进一步包括在步骤(a)之后调整输入激光束的激光功率和/或激光束尺寸。
19.根据权利要求17所述的方法，进一步包括在步骤(b)之前或之后校正光束椭圆度。
20.根据权利要求17所述的方法，进一步包括在步骤(b)之前或之后校正角色散。
21.根据权利要求17所述的方法，进一步包括投影在步骤(b)中生成的掩蔽的激光束的图像，以在步骤(c)中转换掩蔽的激光束。
22.根据权利要求17所述的方法，其中，从步骤(c)生成的光束是贝塞尔光束。
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