CN118103056A - 针对感染性动物疾病的免疫性融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

针对感染性动物疾病的免疫原性融合蛋白。揭露的是一种融合蛋白，其包含CD40结合域；病原体的抗原；位于所述CD40结合域与所述抗原之间的易位域，以及位于所述CD40结合域与所述易位域之间的弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点。本发明亦揭露本发明的融合蛋白的药物组合物、表达载体及用途，其用于在有其需要的动物中引起抗原特异性细胞介导的免疫反应或减少、抑制、治疗及/或改善由病原体引起的感染性动物疾病。

Description

针对感染性动物疾病的免疫性融合蛋白
对电子序列表的引用
电子序列表(10040-004PCT_sequence listing_ST26.xml；大小84KB；创建日期2022年10月24日)的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及融合蛋白，且更具体涉及免疫原性融合蛋白，其用于引起针对感染性动物疾病的抗原特异性细胞阶段的免疫反应。
背景技术
后天免疫系统包括体液和细胞介导的免疫，该两者均摧毁入侵的病原体。B-及T-淋巴细胞分别负责抗体和细胞介导的免疫反应。针对病原体的后天免疫会增强对未来遭遇的免疫反应。已经在临床环境中评估了许多后天免疫治疗策略。然而，仍然需要开发用于治疗由病原体引起的感染性动物疾病的新治疗性疫苗。
发明内容
在一方面，本发明涉及一种融合蛋白，其包含：(a)CD40结合域；(b)病原体的抗原；(c)位于所述CD40结合域与所述抗原之间的易位域；以及(d)位于所述CD40结合域与所述易位域之间的弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点，其中所述病原体是选自由下列组成的群组的至少一者：古典猪瘟病毒(CSFV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪环状病毒2(PCV2)、猪生殖及呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪水疱病病毒(SVDV)、假性狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、细小病毒(Parvovirus)、痘病毒(Poxvirus)、轮状病毒(Rotavirus)及流行性感冒病毒(Influenza Virus)。
在另一方面，本发明涉及一种DNA片段或包含DNA片段的表达载体，所述DNA片段编码本发明的融合蛋白。
本发明进一步涉及一种药物组合物或疫苗组合物，其包含本发明的融合蛋白以及药学上可接受的载剂及/或佐剂。
在又一方面，本发明涉及一种本发明的融合蛋白、药物组合物或疫苗组合物在制备用于在有其需要的动物中引起抗原特异性细胞介导的免疫反应或减少、抑制、治疗及/或改善由病原体引起的感染性动物疾病的药物中的用途。
本发明亦涉及一种本发明的融合蛋白、药物组合物或疫苗组合物，其用于在有其需要的动物中引起抗原特异性细胞介导的免疫反应或减少、抑制、治疗及/或改善由病原体引起的感染性动物疾病。
或者，本发明涉及一种在有其需要的动物中引起抗原特异性细胞介导的免疫反应或减少、抑制、治疗及/或改善由病原体引起的感染性动物疾病的方法，所述方法包括向有其需要的动物给药有效量的本发明的融合蛋白、药物组合物或疫苗组合物。
附图说明
图1A至图1E及图2A至图2E是本发明的载体图谱。
图3A至图3H是说明在本发明的各种实施方式中的免疫原性融合蛋白的示意图。
图4至图6是分别说明来自每个动物群组的CD4+记忆型T细胞中的IFN-γ、IL-2和TNF-α的诱导的图。
图7A至图7B是呈现来自每个动物群组的脾细胞中IFN-γ+免疫斑点的图。
图8A至图8B是说明每个动物群组在第21天的血清抗原特异性抗体水平的图。所述抗体水平通过使用CD40L-TPE-E2-NS3p融合蛋白作为包被蛋白(coating protein)的ELISA来测定。
图9A至图9B是说明每个动物群组在第21天的血清抗原特异性抗体水平的图。所述抗体水平通过使用E2-NS3p肽作为包被蛋白的ELISA来测定。
图10A至图10C是分别说明在每个有延长给药时间表的动物群组的CD4+记忆型T细胞中IFN-γ、IL-2和TNF-α的诱导的图。
图11是说明在每个有延长给药时间表的动物群组的脾细胞中IFN-γ+免疫斑点的图。
图12是说明在每个有延长给药时间表的动物群组的血清抗原特异性抗体水平的图。
具体实施方式
定义
专职性抗原呈递细胞(APC)及非专职性APC使用主要组织相容性复合体(MHC)I类分子以在细胞膜上显示内源性肽。相对于通过使用MHC II类分子的专职性APC显示的外源性抗原，这些肽源自细胞本身。细胞毒性CD8+T细胞可以与MHC I类分子呈递的抗原相互作用。
CD40是一种在抗原呈递细胞(例如，树突状细胞、巨噬细胞和B细胞)上表达的共刺激蛋白质。CD40L与CD40的结合活化抗原呈递细胞及诱发多个下游效应。CD40是癌症免疫治疗的药物标靶。
术语“CD40结合域(CD40 bingding domain)”是指可识别并与CD40结合的蛋白质。CD40结合域可选自以下一者：“CD40配体(CD40L)或其功能性片段”、“抗CD40抗体或其功能性片段。”
术语“CD40L”、“CD40配体”及“CD154”可互换。CD40L与抗原呈递细胞(APC)上的CD40(蛋白质)结合，并根据于标靶细胞类型导致许多影响。CD40L藉由T细胞的启动及表现CD40的免疫细胞在免疫反应的共同刺激和调节中扮演显著的角色。US 5,962,406揭露CD40L的核苷酸序列及氨基酸序列。
术语“抗CD40抗体”、“CD40特异性抗体”及“特异性地针对CD40的抗体”可互换。
当术语“实质上由...组成”用于描述多肽的氨基酸序列时，其意指多肽在N端可以具有或可以不具有起始氨基酸“M”(由起始密码子AUG翻译)作为多肽的一部分，取决于蛋白质翻译要求。例如，当第二抗原与第一抗原融合时，第二抗原的起始氨基酸“M”可被省略或保留。
如本文所用，“易位域(translocation domain)”为一具有生物学活性的多肽，其将融合或连接的抗原易位穿越胞内体膜(endosomal membrane)进入到细胞的细胞质中。易位域引导或促进抗原朝向第I类主要组织相容性复合体(MHC-1)途径(亦即，细胞毒性T细胞途径)以进行抗原呈递。
术语“假单胞菌外毒素A(Pseudomonas Exotoxin A，PE)易位肽(TPE)”是指PE域II肽或其功能性片段，其在易位中具有生物学活性。
术语“志贺毒素(Stx)易位肽(TStx)”是指Stx易位域或其功能性片段，其在易位中具有生物学活性。
术语“弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L(furin and/or cathepsin L)”或“弗林蛋白酶/组织蛋白酶L”可互换。
术语“弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点(cleavage site)”是指具有至少4个可被弗林蛋白酶或组织蛋白酶L或同时被弗林蛋白酶及组织蛋白酶L两者裂解的短肽序列。所述裂解位点是弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L敏感位点。它可以是包含所述被引入到融合蛋白中的裂解位点的肽连接子。此外，弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点可以是PE或Stx内在蛋白酶裂解位点，其存在于融合蛋白的易位域中或邻近融合蛋白的易位域。
术语“抗原”和“免疫原”可互换。抗原是指源自病原体的抗原性蛋白质或多肽。所述抗原包含至少一个用于诱发所欲免疫反应的表位(epitope)。在一些实施方式中，抗原是至少8个氨基酸长度的多肽，其衍生自选自由以下组成的群组的病原体：猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、古典猪瘟病毒(CSFV)、猪环状病毒2(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪水疱病病毒(SVDV)、假性狂犬病病毒(PRV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪肺炎支原体、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、细小病毒、痘病毒、轮状病毒及流行性感冒病毒。
CD28(分化簇28)是在T细胞上表达的蛋白质之一，其提供T细胞活化和生存所需要的共刺激信号。除T细胞受体(TCR)以外，通过CD28的T细胞刺激可为多种介白素(特别是IL-6)的产生提供强烈信号。CD28是CD80(B7.1)及CD86(B7.2)蛋白的受体。当通过类铎受体(toll-like receptor)配体活化时，抗原呈递细胞(APC)中CD80的表达上调。CD28是唯一一种在初始(naive)T细胞上组成性地表达的B7受体。在没有CD28:B7相互作用的情况下，初始T细胞的TCR与MHC:抗原复合体的联合(association)导致无能的(anergic)T细胞。
术语“有效量”是指于对经治疗的个体赋予治疗效果所需的活性融合蛋白的量。如本领域技术人员所认知的，取决于给药途径、赋形剂的使用及与其他治疗方法共同使用的可能性，有效剂量可能产生改变。
术语“治疗”或“处理”是指将有效量的融合蛋白给药至有其需要的个体，所述个体患有癌症或感染、或有此类疾病的症状或倾向，以治愈、减轻、缓解、补救、改善或减少、抑制所述疾病、疾病的症状或疾病的倾向为目的。这样的个体可以基于通过医疗保健专业人员基于来自任何合适的诊断方法的结果来鉴定。
“0至12个重复”或“2至6个重复”意指“0至12”或“2至6”范围内的全部整数单位量作为本发明的一部分而具体揭露。因此，包括“0、1、2、3、4、...10、11及12”或“2、3、4、5及6”单位量作为本发明的实施方式。
缩写：MCS，多克隆位点(multiple cloning site)；Rap1，Ras-近似蛋白-1(Ras-proximate-1)或Ras-相关蛋白1(Ras-related protein 1)；CD40，分化簇40；CDR，互补决定区；s.c.，皮下；a.a.，氨基酸。
融合蛋白
本发明涉及一种融合蛋白，其包含：(a)CD40结合域；(b)病原体的抗原；(c)位于所述CD40结合域与所述抗原之间的易位域；以及(d)位于所述CD40结合域与所述易位域之间的弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点，其中所述病原体是选自由下列组成的群组的至少一者：古典猪瘟病毒(CSFV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪环状病毒2(PCV2)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪水疱病病毒(SVDV)、假性狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪肺炎支原体、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、细小病毒、痘病毒、轮状病毒及流行性感冒病毒。
本发明的融合蛋白可以经由MHC I类抗原呈递途径引起抗原特异性T细胞免疫反应。它们具有共同作用机制。以CD40L-TPE-Ag(Ag表示任何适合的抗原)为例，作用机制如下：
(1)CD40L-TPE-Ag结合至表达CD40的细胞(例如，树突状细胞或巨噬细胞)并经由CD40介导的胞吞作用被内化；
(2)CD40L-TPE-Ag被胞内体中的弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L蛋白酶裂解，从而分离CD40L片段与TPE-Ag片段；
(3)TPE-Ag片段易位穿越胞内体膜并进入细胞质；
(4)TPE-Ag片段被细胞质蛋白酶体消化以生成包含表位的小抗原；
(5)小抗原通过MHC I类途径被递送以进行抗原呈递；以及
(6)通过T细胞识别这些经呈递的抗原而诱导或增强CD8+T细胞特异性免疫反应。
相同的作用机制适用于Ag-TStx-CD40L，其中弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解将CD40L片段与Ag-TStx片段分离。因此，Ag-TStx片段易位穿越胞内体膜、进入至细胞质、被细胞质蛋白酶体消化以生成包含表位的小抗原。小抗原经由MHC I类途径被递送以进行抗原呈递，以及通过T细胞识别这些经呈递的抗原诱导或增强CD8+T细胞特异免疫反应。
在本发明的融合蛋白中的抗原及易位域之间，没有弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点存在。弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点的存在以及其在融合蛋白中的位置允许在弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解之后，从融合蛋白移除CD40结合域。
在一个实施方式中，弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点包含以下或由以下组成：4至20个氨基酸，优选4至10个氨基酸及更优选4至6个氨基酸。在另一个实施方式中，弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点包含SEQ ID NO：1或2，由SEQ ID NO：1或2组成，或者为SEQ ID NO：1或2。
在另一个实施方式中，本发明的融合蛋白进一步包含位于CD40结合域及易位域之间的肽连接子，其中弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点存在于所述肽连接子中。肽连接子可包含：(a)刚性连接子(EAAAAK)n或(SEQ ID NO：38)n；及(b)包含弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点的可裂解连接子，其中n为0至12的整数，优选2至6，更优选3至4，且所述弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点包含SEQ ID NO：1或2。在一个实施方式中，肽连接子包含(EAAAAK)3及RX1RX2X3R(SEQ ID NO：2；其中X1为A，X2为Y，X3为K)。在另一个实施方式中，肽连接子包含RX1X2R(SEQ ID NO：1；其中X1为V，X2为A)及(EAAAAK)3。
易位域可选自假单胞菌外毒素A(PE)或志贺毒素(Stx)。在一个实施方式中，易位域包含或者为假单胞菌外毒素A(PE)易位肽(TPE)，附带限制条件为CD40结合域位于融合蛋白的N端。在另一个实施方式中，易位域包含或者为志贺毒素(Stx)易位肽(TStx)，附带限制条件为抗原位于融合蛋白的N端。
在一个实施方式中，本发明的融合蛋白依次(从N端到C端)包含：(a)CD40结合域；(b)弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点；(c)包含PE易位肽(TPE)的易位域；及(d)病原体的抗原。
在另一个实施方式中，本发明的融合蛋白依次(从N端到C端)包含：(a)CD40结合域；(b)包含弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点的肽连接子；(c)包含PE易位肽(TPE)的易位域；及(d)病原体的抗原。
在另一个实施方式中，本发明的融合蛋白依次(从N端到C端)包含：(a)病原体的抗原；(b)包含Stx易位肽(TStx)的易位域；(c)弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点；及(d)CD40结合域。
在另一个实施方式中，本发明的融合蛋白依次(从N端到C端)包含：(a)病原体的抗原；(b)包含Stx易位肽(TStx)的易位域；(c)包含弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点的肽连接子；及(d)CD40结合域。
TPE或TStx是在易位中具有生物学活性的功能部分(moiety)。弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点可选自下列的一者：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或在PE或Stx内的固有的弗林蛋白酶裂解位点或衍生自PE或Stx的固有的弗林蛋白酶裂解位点。
在一个实施方式中，PE易位肽(TPE)是假单胞菌外毒素A蛋白(全长PE，SEQ ID NO：4)的域II(a.a.残基253至364；SEQ ID NO：9)或其功能性部分。
在另一个实施方式中，PE易位肽(TPE)由长度为26至112个a.a.残基组成。PE易位肽(TPE)包含GWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSW(SEQ ID NO：5)的最小功能性片段。
在一个实施方式中，PE易位肽(TPE)包含与SEQ ID NO：5、6、7、8或9具有至少95％、97％或99％的同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，TPE包含选自由下列组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、6、7、8及9。在另一个实施方式中，TPE是PE280-305(SEQ ID NO：5)、PE280-313(SEQ ID NO：6)、PE268-313(SEQ ID NO：7)、PE253-313(SEQ ID NO：8)或PE253-364(SEQID NO：9；全长PE域II)。
在一个实施方式中，Stx易位肽(TStx)是志贺毒素(Stx)亚基A(SEQ ID NO：10)或类志贺毒素I(Slt-I)亚基A(SEQ ID NO：11)的功能性片段。Stx易位肽具有易位功能，但没有亚基A的细胞毒性效果。志贺毒素(Stx)亚基A与Slt-I亚基A的序列同一性为99％，而且该两种蛋白质只有一个氨基酸差异。
在另一个实施方式中，Stx易位肽(TStx)由长度为8至84个a.a.残基组成。Stx易位肽(TStx)包含LNCHHHAS(SEQ ID NO：12)的最小功能性片段。
在一个实施方式中，Stx易位肽(TStx)包含与SEQ ID NO：12、13、14、15或16具有至少95％、97％或99％的同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，TStx包含选自由下列组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、13、14、15及16。在另一个实施方式中，TStx是Stx亚基A的Stx240-247(SEQ ID NO：12)、Stx240-251(SEQ ID NO：13)、Stx211-247(SEQ ID NO：14)、Stx211-251(SEQ ID NO：15)或Stx168-251(SEQ ID NO：16)。
CD40结合域允许本发明的融合蛋白结合至在表达CD40的细胞(例如，树突状细胞或巨噬细胞)上的CD40受体。CD40结合域可以是选自由以下组成的群组的一者：(i)CD40配体(CD40L)或其功能性片段；及(ii)CD40特异性抗体或其功能性片段。在一个实施方式中，CD40L的功能性片段是经截短的CD40L，其基本上缺乏全长CD40L1-261蛋白(SEQ ID NO：17)的跨膜及细胞质区。
在另一个实施方式中，CD40L或其功能性片段由长度为154至261个a.a.残基组成。在另一个实施方式中，CD40L包含SEQ ID NO：19的最小功能性片段。进一步在另一个实施方式中，CD40L或其功能性片段由长度为154至261个a.a.残基组成且所述CD40L包含SEQ IDNO：19的最小功能性片段。
在一个实施方式中，CD40L包含与SEQ ID NO：17、18或19具有至少95％、97％或99％的同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，CD40选自由下列组成的群组：CD40L1-261(SEQ ID NO：17)、CD40L47-261(SEQ ID NO：18)及CD40L108-261(SEQ ID NO：19)。
在另一个实施方式中，CD40结合域是CD40特异性抗体(或抗CD40抗体)。CD40特异性抗体是特异性地识别并与CD40蛋白结合的抗体。CD40特异性抗体可以结合至表达CD40的细胞上的CD40蛋白。
在一个实施方式中，CD40特异性抗体包含重链可变域(VH)及轻链可变域(VL)，其中VH包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列；且VL包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，CD40特异性抗体选自由以下组成的群组：单链可变片段(scFv)、双链抗体(diabody；dscFv)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、双特异性scFv、scFv-Fc、scFc-CH3、单链抗原结合片段(scFab)、抗原结合片段(Fab)、Fab2、微抗体(minibody)及完整抗体。
在另一个实施方式中，CD40结合域是包含重链可变域(VH)、轻链可变域(VL)及连接VH及VL的柔性连接子(flexible linker；L)的CD40特异性scFv(抗CD40 scFv)。在一个实施方式中，所述CD40特异性scFv包含SEQ ID NO：20或21。
在另一个实施方式中，根据本发明的CD40结合域是(i)CD40特异性抗体或其结合片段；或(ii)CD40特异性单链可变片段(scFv)或其结合片段；所述CD40特异性抗体或所述CD40特异性scFv包含VH及VL，其中：(a)VH包含SEQ ID NO：22；及(b)VL包含SEQ ID NO：23。
在另一个实施方式中，CD40特异性抗体或CD40特异性scFv包含VH及VL，VH包含VHCDR1、VH CDR2及VH CDR3；且VL包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中：(i)VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3分别包含SEQ ID NO：24、25及26；及(ii)VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分别包含SEQID NO：27、28及29。
在另一个实施方式中，CD40结合域是包含VH及VL的CD40特异性scFv，其中：(a)VH包含SEQ ID NO：22；且(b)VL包含SEQ ID NO：23。
在另一个实施方式中，本发明的融合蛋白进一步包含位于抗原的C端的内质网(ER)滞留序列，附带限制条件为易位域包含PE易位肽(TPE)。ER滞留序列可包含SEQ ID NO：30、31、32、33或34。在一个实施方式中，ER滞留序列为SEQ ID NO：30。
在另一个实施方式中，本发明的融合蛋白进一步包含位于CD40结合域以及弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点之间的CD28活化肽。
在另一个实施方式中，CD28活化肽由长度为28至53个a.a.残基组成。在另一个实施方式中，CD28活化肽包含SEQ ID NO：35的最小功能性片段。在另一个实施方式中，CD28活化肽由长度为28至53个a.a.残基组成，且所述CD28活化肽包含SEQ ID NO：35的最小功能性片段。
在另一个实施方式中，CD28活化肽包含与SEQ ID NO：35、36或37具有至少95％、97％或99％的同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，CD28活化肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：35、36及37。在另一个实施方式中，CD28活化肽是SEQID NO：35、36或37。
在一个实施方式中，病原体选自由下列组成的群组：PRRSV、ASFV、CSFV、PCV2、FMDV、PEDV、SVDV、PRV、TGEV、猪肺炎支原体、NDV、IBV、IBDV、细小病毒、痘病毒、轮状病毒及流行性感冒病毒。在另一个实施方式中，病原体选自由下列组成的群组：PRRSV、ASFV、CSFV、PCV2、FMDV及PEDV。
抗原可包含源自或选自以下的一个或多个抗原性多肽：PRRSV、ASFV、CSFV、PCV2、FMDV、PEDV、SVDV、PRV、TGEV、猪肺炎支原体、NDV、IBV、IBDV、细小病毒、痘病毒、轮状病毒及流行性感冒病毒。
在一个实施方式中，抗原选自或源自由以下组成的群组的致病抗原：ASFV CP204L蛋白、ASFV E183L蛋白、CSFV E2蛋白、CSFV NS3p蛋白、PCV2 ORF2蛋白、PEDV S1蛋白、PRRSVORF6蛋白、PRRSV ORF5蛋白、PRRSV ORF7蛋白及其抗原性多肽。所述抗原可为包含至少两个抗原性多肽的融合抗原。例如，ASFV CP204L及E183L的融合抗原、CSFV E2及NS3p的融合抗原、或源自PRRSV及PCV2的融合抗原。
在一个实施方式中，抗原包含与SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或51具有至少80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，抗原是与SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或51具有至少80％、85％、90％、95％或99％的同一性的肽。在另一个实施方式中，抗原是具有SEQ ID No：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或51的氨基酸序列的肽。进一步在另一个实施方式中，抗原是SEQ ID No：39、40、41、42、43或44的肽。
在一个实施方式中，所述抗原包含至少一用于诱导所需的免疫反应的表位，优选含有1至50个表位，更优选含有1至20个表位。
抗原可以是单一抗原或其抗原性片段，或包含至少两个抗原性多肽融合在一起的融合抗原，其两个抗原性多肽之间有或没有连接子。
融合抗原可以具有连接两个不同抗原性多肽的刚性连接子(EAAAAK)n，其中n为0至12的整数，优选2至6，更优选3至4。换言之，所述刚性连接子包含序列EAAAAK(SEQ ID NO：38)的0至12个重复、2至6个重复或3至4个重复。
本发明的融合蛋白可进一步包含位于CD40结合域及弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点之间的刚性连接子。刚性连接子包含氨基酸序列EAAAAK(SEQ ID NO：38)的0至12个重复。刚性连接子可为(EAAAAK)n或(SEQ ID NO：38)n，其中n为0至12的整数，优选2至6，更优选3至4。在一个实施方式中，刚性连接子包含SEQ ID NO：38的2至6个重复或3至4个重复。
在另一个实施方式中，本发明的融合蛋白包含以下或基本上由以下组成：与SEQID NO：52、53、54、55、56、57、58或59具有至少90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。进一步在另一个实施方式中，本发明的融合蛋白包含以下或基本上由以下组成：选自由SEQID NO：52、53、54、55、56、57、58或59组成的群组的氨基酸序列。
本发明进一步涉及融合蛋白于制备用于在有其需要的动物中引起抗原特异性细胞介导的免疫反应及/或抗原特异体液免疫反应，或减少、抑制、治疗及/或改善由病原体引起的感染性动物疾病的药物。在一个实施方式中，动物是非人动物。在另一个实施方式中，动物未被病原体感染。
药物组合物/疫苗
本发明进一步涉及药物组合物或疫苗，其包括：
(a)本发明的融合蛋白；以及
(b)药学上可接受的载剂及/或佐剂。
本发明的疫苗是预防性及/或治疗性疫苗。在一个实施方式中，融合蛋白用于在未感染的动物中引起针对感兴趣病原体的抗原特异性细胞介导的免疫反应和抗原特异性体液反应。
术语“载剂”或“药学上可接受的载剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，如本领域技术人员所知(参照例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.MackPrinting Company,1990,pp.1289-1329)。
合适的佐剂包括但不限于，(1)水包油(o/w)佐剂(例如，MONTANIDETMISA 15A VG、MONTANIDETMISA 35 VG及MONTANIDETMISA 28R VG)；(2)油包水(w/o)佐剂(例如，MONTANIDETMISA 61 VG、MONTANIDETMISA 71 VG、MONTANIDETM ISA 71R VG、MONTANIDETM ISA761 VG、MONTANIDETM ISA 78 VG、MONTANIDETM ISA 763B VG、MONTANIDETM ISA 660 VG及弗氏不完全佐剂)；(3)水包油包水(w/o/w)佐剂(例如，MONTANIDETM ISA 201 VG、MONTANIDETMISA 206 VG、及MONTANIDETM ISA 207 VG)；(4)铝盐佐剂(例如，氢氧化铝和磷酸铝)；(5)基于皂苷的佐剂(例如，GPI-0100、Quil A或QS-21)；(6)类铎受体(TLR)激动剂佐剂(例如，Poly I:C、单磷酰脂质A和CpG寡核苷酸)；及(7)上述佐剂的混合物。CpG寡核苷酸佐剂包括但不限于，A类CpG(亦即，CpG1585、CpG2216或CpG2336)、B类CpG(亦即，CpG1668、CpG1826、CpG2006、CpG2007、CpG BW006或CpG D-SL01)及C类CpG(亦即，CpG2395、CpG M362或CpG D-SL03)。另一合适的CpG佐剂是CpG1018。在一个实施方式中，佐剂是CpG寡核苷酸。在另一个实施方式中，佐剂是弗氏不完全佐剂(FIA)。
药物组合物/疫苗可为肠内剂型或肠胃外剂型，适合用于透皮、透黏膜、鼻咽、肺部或直接注射、或用于全身性(例如，肠胃外)或局部(例如，肿瘤内或病灶内注射)给药。肠胃外注射可以通过静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、皮下(s.c.)或皮内(i.d.)途径。药物组合物亦可经口给药，例如，以锭剂、包衣锭剂、糖衣锭、硬和软明胶胶囊的形式。
融合蛋白的剂量可根据于待控制的疾病、患者的年龄及个体情况以及给药方式而变化。可将剂量匹配于在每种情况下的个体需求以获得达成所欲的治疗性反应的本发明的融合蛋白的治疗性有效量。
对于成年患者，考虑约0.1至50mg，尤其是约0.1至5mg的单次剂量。取决于疾病的严重程度及精确的药物代谢动力学曲线，可将融合蛋白以每周、每两周或每月投予一个剂量单位，并且每个周期总计给出1至6个剂量单位，以满足这样的治疗。
在一个实施方式中，本发明提供了一种试剂盒或包装的药物组合物，包含本发明的融合蛋白及使用说明，以用其治疗在有其需要的动物中由病原体引起的感染性疾病的一个或多个症状。
实施例
方法与材料
表1显示SEQ ID NO以及对应的多肽/融合蛋白。
表1
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流式细胞分析术
在37℃下，以抗原刺激物(用于增强针对本发明的融合蛋白中所用的特异性抗原的免疫反应)刺激脾细胞2小时，之后在37℃用50μg/ml的布雷菲德菌素A(Brefeldin A)和莫能菌素(Monensin)处理2小时。收获细胞，用含有0.5％ BSA的PBS洗涤，并且同时用下列抗体染色：APC/Cy7缀合的抗CD3抗体、PerCP/Cy5.5缀合的抗CD4抗体、FITC缀合的抗CD8抗体、PE缀合的抗CD44抗体及APC缀合的抗CD62L抗体。洗涤后，将细胞透化、固定并同时使用下列抗体进行细胞内染色：PE缀合的抗IFN-γ抗体和PE/Cy7缀合的抗IL-2抗体和eFluor450缀合的抗TNF-α抗体。具有CD8+或CD4+记忆T细胞表型(CD3+/CD44hiCD62Llo)的脾细胞的细胞内细胞因子诱导(IFN-γ、IL-2或TNF-α)通过Gallios流式细胞分析仪及Kaluza软件进一步分析。
酶联免疫斑点(ELISpot)测定
在抗原性刺激物(用于增强免疫反应)存在或不存在下，将脾细胞以2×105个细胞/孔的细胞密度三次重复地接种在经预处理的小鼠IFN-γ捕获96孔板(CTL)中。在37℃下孵育24小时后，丢弃细胞。洗涤之后，通过生物素缀合的抗小鼠IFN-γ抗体对所捕获的IFN-γ在室温下进行2小时的检测，并且根据制造商的说明书，将IFN-γ免疫斑点显影。通过/>S5微分析仪(CTL)执行IFN-γ免疫斑点的扫描及计数。结果表示为每百万个脾细胞中的IFN-γ+免疫斑点数。
间接酶联免疫吸附测定(ELISA)
将所收集的全血样本于4℃下静置30至60分钟，然后以5,000g离心10分钟以沉淀凝块。将血清样本储存于-20℃。为了捕获所欲的抗原特异性抗体，合成了相应的抗原蛋白或肽并用作包被蛋白。包被蛋白在PBS缓冲液中稀释，并以1μg/孔分配至96孔板中。在4℃下孵育过夜之后，在37℃下用具有1％ BSA的PBS将该96孔板封闭1小时。将血清样本解冻，然后在具有1％ BSA的PBS中进行10倍连续稀释。将经包被的蛋白与100μl的经1000倍稀释的血清样本在37℃下孵育2小时。用磷酸盐缓冲盐水-20(PBST)洗涤4次后，结合至包被蛋白的抗原特异性抗体通过辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG(稀释度为1:10,000，Cat#31430，Thermo Fisher Science)在37℃下孵育30分钟而检测。用PBST洗涤4次之后，在100μL的TMB底物存在下催化HRP介导的显色，并用100μL的1N HCl淬灭。通过450nm处的吸光度测定血清样本中抗原特异性抗体的相对效价。
统计分析
使用t检验，当p<0.05时，结果被认为显著。
实施例1
表达载体的构建
CD40L-TPE-CP204L-E183L、CD40L-TPE-CP204L、CD40L-TPE-E183L及CD40L-TPE-E2-NS3p
构建载体CD40L-TPE-CP204L-E183L(图1A)以生成CD40L-TPE-CP204L-E183L(SEQID NO：52；图3A)融合蛋白，其包含：(a)经截短的CD40配体CD40L108-261(SEQ ID NO：19)；(b)包含(EAAAAK)3(SEQ ID NO：3)和RX1RX2X3R(SEQ ID NO：2；其中X1是A，X2是Y，X3是K)的可裂解肽连接子；(c)PE易位肽PE280-305(SEQ ID NO：5)；以及(d)融合抗原ASFV CP204L-E183L(SEQ ID NO：41)，其包含抗原ASFV CP204L(SEQ ID NO：39)和抗原ASFV E183L(SEQ ID NO：40)。
简而言之，包含CD40L108-261、可裂解连接子和PE易位肽(PE280-305)的编码HindIIICD40L-连接子-PENcoI,XhoI,SalI的DNA片段经PCR合成，通过HindIII/SalI消化，然后连接到具有HindIII/XhoI切割位点的质粒pTAC-MAT-Tag-2(目录号E5405，Sigma-Aldrich)以获得质粒P07-His-pNC(图1B)。将另一带有His标签的编码所述抗原ASFV CP204L-E183L的DNA片段，通过NcoI/XhoI位点插入到质粒P07-His-pNC(图1B)中，以生成表达载体CD40L-TPE-CP204L-E183L(图1A)。
可裂解连接子允许弗林蛋白酶和/或组织蛋白酶L蛋白酶切割本发明的融合蛋白，以从融合蛋白释放TPE-CP204L-E183L片段。
使用上述类似的方法，来自病原体的任何其他感兴趣抗原可以替代抗原ASFVCP204L-E183L并插入到图1B的质粒中，以生成用于表达包含感兴趣抗原的融合蛋白的类似图1A的表达载体。
通过以抗原ASFV CP204L(SEQ ID NO：39)取代抗原ASFV CP204L-E183L来构建用于生成CD40L-TPE-CP204L(SEQ ID NO：53；图3B)融合蛋白的表达载体(图1C)。通过以抗原ASFV E183L(SEQ ID NO：40)取代抗原ASFV CP204L-E183L来构建用于生成CD40L-TPE-E183L(SEQ ID NO：54；图3C)融合蛋白的另一表达载体(图1D)。通过以融合抗原CSFV E2-NS3p(SEQ ID NO：44)取代抗原ASFV CP204L-E183L来构建用于生成CD40L-TPE-E2-NS3p(SEQ IDNO：55；图3D)融合蛋白的另一表达载体(图1E)。
载体CP204L-E183L-TStx-CD40L、CP204L-TStx-CD40L、E183L-TStx-CD40L及E2-NS3p-TStx-CD40L
构建载体CP204L-E183L-TStx-CD40L(图2A)以生成CP204L-E183L-TStx-CD40L(SEQID NO：56；图3E)融合蛋白，其包含：(a)融合抗原ASFV CP204L-E183L(SEQ ID NO：41)，所述融合抗原包含抗原ASFV CP204L(SEQ ID NO：39)及抗原ASFV E183L(SEQ ID NO：40)；(b)Stx易位肽Stx211-247(SEQ ID NO：14)；(c)包含RX1X2R(SEQ ID NO：1；其中X1是V，X2是A)及(EAAAAK)3(SEQ ID NO：3)的可裂解肽连接子；以及(d)经截短的CD40配体CD40L108-261(SEQID NO：19)。
简而言之，包含Stx易位肽(Stx211-247)、可裂解连接子及CD40L108-261的编码HindIII,XhoIStx-连接子-CD40LSalI的DNA片段经PCR合成，通过HindIII/SalI限制酶消化，然后连接到具有HindIII/XhoI切割位点的质粒pTAC-MAT-Tag-2骨架，以得到质粒P08(RP)-His-pNC(图2B)。将另一带有His标签的编码所述抗原ASFV CP204L-E183L的DNA片段，通过NcoI/XhoI位点插入到质粒P08(RP)-His-pNC(图2B)中，以生成表达载体CP204L-E183L-TStx-CD40L(图2A)。
可裂解连接子对于本发明的融合蛋白是重要的，因为其允许弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L蛋白酶切割所述融合蛋白，以从融合蛋白释放CP204L-E183L-TStx片段。
使用上述类似的方法，来自病原体的任何其他感兴趣抗原可以替代抗原ASFVCP204L-E183L并插入到图2B的质粒中，以生成用于表达包含感兴趣抗原的融合蛋白的类似图2A的表达载体。
通过以抗原ASFV CP204L(SEQ ID NO：39)取代抗原ASFV CP204L-E183L来构建用于生成CP204L-TStx-CD40L(SEQ ID NO:57；图3F)融合蛋白的表达载体(图2C)。通过以抗原ASFV E183L(SEQ ID NO：40)取代抗原ASFV CP204L-E183L来类似地构建用于生成E183L-TStx-CD40L(SEQ ID NO：58；图3G)融合蛋白的表达载体(图2D)。通过以抗原CSFV E2-NS3p(SEQ ID NO：44)取代抗原ASFV CP204L-E183L来构建用于生成E2-NS3p-TStx-CD40L(SEQ IDNO：59；图3H)融合蛋白的另一表达载体(图2E)。
实施例2
蛋白质表达
将带有蛋白质表达载体CD40L-TPE-E2-NS3p的大肠杆菌BL21细胞在37℃下在含有选择抗生素的ZY培养基(10g/L胰蛋白胨和5g/L酵母萃取物)中生长。当培养物达到早期对数期(OD600＝2至5)时，通过异丙基-1-硫基-β-D-半乳吡喃糖苷(IPTG)(0.5至2mM)诱导融合蛋白的表达。在IPTG诱导4小时后收获细胞，并通过超声处理破碎。将包涵体分离并溶解于溶解化缓冲液(6M盐酸胍、20mM磷酸钾、500mM NaCl、20mM咪唑、1mM DTT，pH 7.4)中，以提取过表达的融合蛋白。纯化之后，通过在4℃下用20倍至50倍体积的透析缓冲液(10mM PBS)透析过夜而执行融合蛋白的再折叠。在还原(使用二硫苏糖醇；+DTT)及非还原(不使用二硫苏糖醇；-DTT)条件下，对经再折叠的融合蛋白进行SDS-PAGE分析以评估它们是否经适当地再折叠。
通过使用如上文所揭示的相同方法，亦表达、纯化、再折叠下列融合蛋白：CD40L-TPE-CP204L-E183L、CD40L-TPE-CP204L、CD40L-TPE-E183L、CP204L-E183L-TStx-CD40L、CP204L-TStx-CD40L、E183L-TStx-CD40L及E2-NS3p-TStx-CD40L。
实施例3
融合蛋白的免疫原性分析
选择CD40L-TPE-E2-NS3p融合蛋白作为本发明融合蛋白的代表，并进行免疫原性分析以评价融合蛋白的生物学活性。表2显示了动物群组、用于疫苗接种的融合蛋白的剂量及给药时间表。“V”：已接种疫苗；“-”：未接种疫苗。
表2
疫苗的制备：溶解在磷酸缓冲生理食盐水的本发明的融合蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂(FIA)混合形成乳剂。最终制剂含有0.5mg融合蛋白/mL和50％(v/v)弗氏不完全佐剂。
C57BL/6NCrlBltw雌性小鼠(5至6周龄)随机分成6个群组(每群组n＝5)：群组A(安慰剂)、群组B(50μg的测试融合蛋白)及群组C至群组E(100μg的测试融合蛋白)。在第0、7及14天时安慰剂群组接受PBS s.c.。根据表2中的给药时间表，疫苗接种组(B至E)中的小鼠s.c.注射佐以弗氏不完全佐剂的融合蛋白。在第0、7、14及21天收集血清以测定抗原特异性体液免疫反应。在第21天时牺牲动物。收获并培养脾细胞以测定抗原特异性细胞介导的免疫反应。
通过使用流式细胞仪，该脾细胞用于分析记忆T细胞中的细胞内细胞因子诱导(IFN-γ、IL-2及TNF-α)。此外，通过使用酶联免疫斑点(ELISpot)测定法分析分泌IFN-γ的脾细胞的频率。通过使用ELISA分析血液样本中血清抗原特异性抗体的水平。
图4至图6分别显示在用或不用抗原刺激物(涵盖抗原CSFV E2序列的短肽池)刺激脾细胞后IFN-γ、IL-2及TNF-α诱导的结果。在第21天时观察来自接受CD40L-TPE-E2-NS3p的不同剂量或不同治疗方案的群组的CD4+记忆T细胞中的IFN-γ、IL-2及TNF-α诱导的水平，并与安慰剂群组比较。
图7A至图7B显示在第21天从动物获得的脾细胞如前述在体外使用或不使用抗原刺激物刺激后的IFN-γ+免疫斑点的结果。图7A显示在第21天时从动物群组B及动物群组C中获得的分泌IFN-γ的脾细胞数量显著增加，其中在第0、7及14天，动物群组B与动物群组C分别接种了50μg和100μg的CD40L-TPE-E2-NS3p。值得注意的是，相较于低剂量群组，高剂量群组在诱导分泌IFN-γ的脾细胞中表现出强烈的活性(p＝0.006)。图7B显示相较于安慰剂群组，在动物群组C、D及E中分泌IFN-γ的脾细胞数量显著增加。动物群组C、D及E均接种100μg的CD40L-TPE-E2-NS3p融合蛋白，但时间表不同(分别为D0-D7-D14、D0-D7及D0-D14)。
本发明的融合蛋白可有效引起抗原特异性抗体反应。图8A至图8B显示第21天时通过ELISA测量的血清抗体水平。CD40L-TPE-E2-NS3p融合蛋白用于包被ELISA板作为捕获抗原。
图8A显示第21天时群组A、B和C的动物的血清抗原特异性抗体水平。群组B和C的动物在第0、7及14天分别接种50μg和100μg的CD40L-TPE-E2-NS3p。接种群组B和C的血清抗原特异性抗体水平均高于安慰剂群组，且高剂量群组引起的抗体反应强于低剂量群组(p＝0.015)。
图8B显示第21天时动物群组A、C、D及E的血清抗原特异性抗体水平。群组C、D及E的动物均接种100μg的CD40L-TPE-E2-NS3p，但采用不同的治疗方案(分别为D0-D7-D14、D0-D7及D0-D14)。接种三剂的群组和接种两剂的群组的血清抗原特异性抗体效价均显著升高。值得注意的是，第三剂可能引起比两剂明显更高的抗原特异性抗体反应。
图9A至图9B显示第21天时动物群组的血清抗体水平。类似于图8A至图8B，除了包被蛋白是E2-NS3p肽(捕获抗原)而不是CD40L-TPE-E2-NS3p融合蛋白之外，通过ELISA测量抗原特异性抗体水平。结果与图8A至图8B中的发现一致。第21天时群组B及C的血清抗原特异性抗体水平高于安慰剂群组，且高剂量群组引起的抗体效价强于低剂量群组。
融合蛋白CD40L-TPE-CP204L-E183L、CD40L-TPE-CP204L、CD40L-TPE-E183L、CP204L-E183L-TStx-CD40L、CP204L-TStx-CD40L、E183L-TStx-CD40L和E2-NS3p-TStx-CD40L接受免疫原性分析。基于相同的作用机制，本发明的携带抗原的融合蛋白有望诱导针对标靶抗原的强烈免疫反应，导致抗原特异性抗体的诱导，T细胞活化和IFN-γ、IL-2和TNF-α的诱导。
实施例4
具有延长给药时间表的融合蛋白的免疫原性分析
还在延长给药时间表下评估了CD40L-TPE-E2-NS3p融合蛋白在诱导免疫反应中的作用。表3显示了动物群组和每群组的给药时间表。“V”：已接种疫苗；“-”：未接种疫苗。
表3
除延长给药时间表和小鼠组别外，疫苗制备、小鼠、给药途径、分析方法同实施例3所述。
简而言之，C57BL/6NCrlBltw雌性小鼠(5至6周龄)随机分成4组(每群组n＝5)：群组A(安慰剂)、群组B、C及D(100μg的融合蛋白)。在第0、21、42天时安慰剂群组接受PBSs.c.。根据表3中群组B至D各别的给药时间表，群组B、C及D中的小鼠s.c接种佐以FIA的测试融合蛋白。每周收集血清以测定抗原特异性体液免疫反应。在第63天时牺牲动物，且收获及培养脾细胞，通过使用实施例3中所述的分析方法来测定抗原特异性细胞介导的免疫反应。
图10A至图10C显示在第63天时使用或不使用抗原刺激物(涵盖抗原CSFV E2序列的短肽池)刺激脾细胞后，从动物身上获得的IFN-γ、IL-2和TNF-α诱导的结果。观察来自接受CD40L-TPE-E2-NS3p的不同治疗方案的群组中的CD4+记忆T细胞中的IFN-γ、IL-2及TNF-α诱导的水平，并与安慰剂群组比较。
图11显示在63天时从动物获得的脾细胞在体外如前述使用或不使用抗原刺激物刺激后的IFN-γ+免疫斑点的结果。相较于安慰剂群组，接受CD40L-TPE-E2-NS3p的不同治疗方案的动物群组中，观察到分泌IFN-γ的脾细胞数量显著增加。本发明的融合蛋白的一次注射足以诱导分泌IFN-γ的脾细胞数量显著增加(图11，群组D)。
图12显示在动物群组A、B、C、D的个别血清抗原特异性抗体水平。依据不同治疗方案(分别为D0-D21-D42、D21-D42和D42)群组B、C、D的动物接种CD40L-TPE-E2-NS3p。ELISA中使用的包被蛋白(捕获抗原)是抗原肽E2-NS3p。结果与上述发现一致。融合蛋白CD40L-TPE-E2-NS3p的一剂足以诱导抗原特异性抗体反应。值得注意的是，在第42天时的第三剂之后，在三剂量组中观察到持续至少21天的延长抗体反应期。
综上所述，本发明的融合蛋白可引起强烈的T细胞免疫反应、增加IFN-γ、IL-2和TNF-α的表达及产生抗原特异性抗体反应。
本说明书中引用和讨论的所有参考文献均通过引用整体并入本文，其程度与每篇参考文献各自通过引用而并入的程度相同。

Claims (15)

1.一种融合蛋白，其包含：
(a)CD40结合域；
(b)病原体的抗原；
(c)位于所述CD40结合域与所述抗原之间的易位域；以及
(d)位于所述CD40结合域与所述易位域之间的弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点，
其中，所述病原体是选自由下列组成的群组的至少一者：古典猪瘟病毒(CSFV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪环状病毒2(PCV2)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪水疱病病毒(SVDV)、假性狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、细小病毒、痘病毒、轮状病毒及流行性感冒病毒。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述易位域是假单胞菌外毒素A(PE)易位肽，且所述CD40结合域位于所述融合蛋白的N端。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述易位域是由长度为26至112个氨基酸残基组成的PE易位肽，且包含与SEQ ID NO：5、6、7、8或9具有至少95％的同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述易位域是志贺毒素(Stx)易位肽，且所述抗原位于所述融合蛋白的N端。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述易位域是由长度为8至84个氨基酸残基组成的Stx易位肽，且包含与SEQ ID NO：12、13、14、15或16具有至少95％的同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的融合蛋白，进一步包含肽连接子，且所述弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点存在于所述肽连接子中。
8.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述CD40结合域是CD40配体(CD40L)或其功能性片段或是特异性针对CD40的抗体(CD40特异性抗体)或其功能性片段。
9.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述CD40结合域是由长度为154至261个氨基酸残基组成的CD40L，且包含与SEQ ID NO：17、18或19具有至少95％的同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述CD40结合域是CD40特异性抗体或其结合片段，或是单链可变片段(scFv)，且所述CD40特异性抗体或所述scFv包含：
(a)包含SEQ ID NO：22的重链可变区(VH)；以及
(b)包含SEQ ID NO：23的轻链可变区(VL)。
11.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述CD40结合域是CD40特异性抗体或其结合片段，所述CD40特异性抗体包含VH和VL，所述VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；以及所述VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，进一步其中：
(i)所述VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3分别包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ IDNO：26的氨基酸序列；以及
(ii)所述VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分别包含SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28及SEQ IDNO：29的氨基酸序列。
12.如权利要求2所述的融合蛋白，进一步包含位于所述抗原的C端的内质网(ER)滞留序列。
13.如权利要求1所述的融合蛋白，进一步包含位于所述CD40结合域与所述弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点之间的CD28活化肽，其中，所述CD28活化肽具有28至53个氨基酸残基的长度且包含选自由下列组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：35、36及37。
14.一种药物组合物，其包含：
(a)如权利要求1所述的融合蛋白；以及
(b)药学上可接受的载剂及/或佐剂。
15.一种如权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白或如权利要求14所述的药物组合物在制备用于在有其需要的动物中引起抗原特异性细胞介导的免疫反应或减少、抑制、治疗及/或改善由病原体引起的感染性动物疾病的药物中的用途。
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