CN118085086A - 一种Nectin-4单克隆抗体及其CAR-T细胞 - Google Patents

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CN118085086A CN202311283828.8A CN202311283828A CN118085086A CN 118085086 A CN118085086 A CN 118085086A CN 202311283828 A CN202311283828 A CN 202311283828A CN 118085086 A CN118085086 A CN 118085086A
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黄庆生
窦向雅
马云坤
张明杰
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Abstract

本发明提供了三种抗Nectin‑4的单克隆抗体或其抗原结合片段，本发明还提供了编码上述三种单克隆抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列及其核酸序列，可用于制备Nectin‑4单克隆抗体，进行人源化改造，或进一步制备靶向Nectin‑4与T细胞的双特异性抗体，或CAR‑T细胞，具有开发抗肿瘤新药的潜力。本发明还提供了一种嵌合抗原受体多肽以及靶向Nectin‑4的CAR‑T细胞，与仅有靶向性的N4CAR‑T细胞或仅有淋巴趋化和免疫细胞活化功能的77T细胞相比，77N4CAR‑T细胞同时具有趋化、活化及靶向三重功能，具有更全面的抗三阴乳腺癌活性。

Description

一种Nectin-4单克隆抗体及其CAR-T细胞
技术领域
本发明抗体及CAR细胞技术领域，更具体地，涉及一种Nectin-4单克隆抗体及其CAR-T细胞。
背景技术
Nectin-4是一种I型膜蛋白，在多种肿瘤细胞中过度表达，并与癌症的形成相关。比如，Nectin-4在尿路上皮癌、膀胱癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、食管癌、乳头状甲状腺癌、胆囊癌等癌症中均高表达。Nectin-4通过激活PI3K/Akt途径促进肿瘤细胞增殖、分化、迁移、侵袭等。因此，Nectin-4是一个新的肿瘤免疫治疗靶点。
Nectin-4不仅可作为乳腺癌的有效预后因子，同时可作为三阴性乳腺癌(TNBC)患者的有效治疗靶点。TNBC患者与其他类型乳腺癌相比具有更差的预后。目前仍缺少有效的生物靶向治疗靶点，主要的治疗方法仍为全身化疗。体内外研究证实，Padcev对局部、转移性TNBC具有较好疗效(Ann Oncol.2017年4月1日线上版)。该研究分析了5673例浸润性乳腺患者中Nectin-4/PVRL4 mRNA的表达情况，并寻找其与临床病理特征的关系，包括无转移生存。利用免疫组化方法检测61例TNBC患者和原发性TNBC患者源性异种移植(PDX)样本组织。体内外研究检测抗Nectin-4在局部、转移性TNBC PDX中的疗效。结果显示，Nectin-4mRNA高表达与预后差相关，包括三阴性亚型和基底亚型。Nectin-4蛋白在健康成人组织中(包括乳腺组织中)无表达。Padcev能作用于nectin-4阳性表达的乳腺癌细胞。体外研究显示，Padcev与Nectin-4具有高度的亲和性，能进行特异性结合，Padcev对Nectin-4阳性表达细胞系呈剂量依懒性，剂量越高，细胞毒作用越大。体内研究发现，Padcev对Nectin-4阳性的PDX TNBC具有快速、完全、持久的反应。治疗有效性依赖于Padcev剂量及nectin-4在肿瘤中的表达水平。
近年来，一种新的肿瘤免疫治疗方法——嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)修饰的T细胞(CAR-T)治疗受到了广泛的关注。CAR的结构主要包括抗原结合区、跨膜区、胞内信号活化区三大基本构造，是将细胞外抗原结合域与一个或多个细胞内免疫细胞活化信号域结合的基因工程融合蛋白。CAR-T细胞的构建是利用基因转染技术(如慢病毒或逆转录病毒载体)对T细胞重新编程，使其表达CAR，从而通过一种不依赖主要组织相容性复合物(MHC-I)的机制，重新定向其特异性，靶向特定的肿瘤抗原，增强T/NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。CAR-T选择何种肿瘤抗原作为其靶向识别的位点是本技术的关键。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中靶向Nectin-4的抗体及CAR-T细胞种类较少且治疗效果不佳的技术缺陷，提供一种靶向Nectin-4的单克隆抗体以及具有趋化和活化功能的靶向Nectin-4的CAR-T细胞及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种抗Nectin-4的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链；所述重链的重链可变区中具有3个互补区H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3及L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的组合为以下(Ⅰ)至(Ⅲ)中的任意一种：
(Ⅰ)H-CDR1的氨基酸序列为GFAFDSNA(SEQ ID NO.13)，
H-CDR2的氨基酸序列为ISPRGAT(SEQ ID NO.14)，
H-CDR3的氨基酸序列为PRGVYHTNY(SEQ ID NO.15)，
L-CDR1的氨基酸序列为KASQGVIAGVA(SEQ ID NO.16)，
L-CDR2的氨基酸序列为TPSYRYSG(SEQ ID NO.17)
L-CDR3的氨基酸序列为QQYHGYPLT(SEQ ID NO.18)；
(Ⅱ)H-CDR1的氨基酸序列为GFSFHNYT(SEQ ID NO.19)，
H-CDR2的氨基酸序列为ISAGRTT(SEQ ID NO.20)，
H-CDR3的氨基酸序列为PGGLYNAHYW(SEQ ID NO.21)，
L-CDR1的氨基酸序列为KASKRVVPSVA(SEQ ID NO.22)，
L-CDR2的氨基酸序列为SAPNRYSG(SEQ ID NO.23)
L-CDR3的氨基酸序列为PQYNGNPVT(SEQ ID NO.24)；
(Ⅲ)H-CDR1的氨基酸序列为GTKLLSYG(SEQ ID NO.25)，
H-CDR2的氨基酸序列为KWGGDNS(SEQ ID NO.26)，
H-CDR3的氨基酸序列为NRFTFWNFVV(SEQ ID NO.27)，
L-CDR1的氨基酸序列为KRSQAVRTNDA(SEQ ID NO.28)，
L-CDR2的氨基酸序列为SGFYRTLG(SEQ ID NO.29)
L-CDR3的氨基酸序列为QQKYSGPST(SEQ ID NO.30)。
进一步地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区氨基酸序列为以下(Ⅰ)至(Ⅲ)中的任意一种：
(Ⅰ)轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(Ⅱ)轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(Ⅲ)轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列为以下(Ⅰ)至(Ⅲ)中的任意一种：
(Ⅰ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
(Ⅱ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
(Ⅲ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明的第二个方面，提供编码本发明第一个方面所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
进一步地，编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子的序列如SEQ ID NO.1所示；
编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.3所示；
编码SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；
编码SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.7所示；
编码SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.9所示；
编码SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第三个方面，提供编码本发明第一个方面所述单克隆抗体或其抗原结合片段的所述轻链可变区；
所述重链可变区；
所述轻链可变区互补区；或，
所述重链可变区互补区的核酸分子。
进一步地，编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子的序列如SEQ ID NO.1所示；
编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.3所示；
编码SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；
编码SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.7所示；
编码SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.9所示；
编码SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第四个方面，提供一种表达载体，所述载体中插入有本发明第二个方面或第三个方面所述的核酸分子。
本发明的第五个方面，提供一种细胞，含有本发明第二个方面或第三个方面所述的核酸分子或本发明第四个方面所述的表达载体。
本发明的第六个方面，提供一种嵌合抗原受体多肽，包含：
ⅰ.胞外抗原结合域，所述胞外抗原结合域包含本发明第一个方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，
ⅱ.跨膜结构域，和
ⅲ.胞内信号域。
本发明的第七个方面，提供编码本发明第六个方面所述嵌合抗原受体多肽的核酸分子。
进一步地，编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ IDNO.3所示；
编码SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；
编码SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.7所示；
编码SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.9所示；
编码SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第八个方面，提供一种遗传修饰的T细胞，包含本发明第六个方面所述的嵌合抗原受体多肽或本发明第七个方面所述的核酸分子。
进一步地，根据本发明第八个方面所述的遗传修饰的T细胞，通过将含有本发明第七个方面核酸分子的表达载体转染T细胞制得。
优选地，根据本发明第八个方面所述的遗传修饰的T细胞，所述遗传修饰的T细胞还包含CCR7的表达序列；
更优选地，根据本发明第八个方面所述的遗传修饰的T细胞，所述遗传修饰的T细胞还包含IL-7的表达序列。
具体地，根据本发明第八个方面所述的遗传修饰的T细胞，所述CCR7的表达序列与IL-7的表达序列插入于同一表达载体。
更具体地，所述CCR7的表达序列与IL-7的表达序列之间优选连接有IRES元件。
将含有本发明第七个方面所述核酸分子的表达载体与含有CCR7和IL-7表达序列的表达载体共同转染T细胞，即可制得具有趋化及活化功能的CAR-T细胞；该CAR-T细胞细胞相比仅包含本发明第六个方面所述嵌合抗原受体多肽的CAR-T细胞具有更好的抗癌作用。
本发明的第九个方面，提供一种制剂，包含以下Ⅰ～Ⅶ中的至少一项：
Ⅰ.本发明第一个方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
Ⅱ.本发明第二或第三个方面所述的核酸分子；
Ⅲ.本发明第四个方面所述的表达载体；
Ⅳ.本发明第五个方面所述的细胞；
Ⅴ.本发明第六个方面所述的嵌合抗原受体多肽；
Ⅵ.本发明第七个方面所述的核酸分子；
Ⅶ.本发明第八个方面所述的遗传修饰的T细胞。
进一步地，所述制剂为生物材料或药物。
更进一步地，所述药物中还含有药学上可接受的辅料。
本发明的第十个方面，提供以下Ⅰ～Ⅶ中的至少一项在制备抗肿瘤药物中的应用：
Ⅰ.本发明第一个方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
Ⅱ.本发明第二或第三个方面所述的核酸分子；
Ⅲ.本发明第四个方面所述的表达载体；
Ⅳ.本发明第五个方面所述的细胞；
Ⅴ.本发明第六个方面所述的嵌合抗原受体多肽；
Ⅵ.本发明第七个方面所述的核酸分子；
Ⅶ.本发明第八个方面所述的遗传修饰的T细胞。
进一步地，根据本发明第十个方面所述的应用，所述肿瘤包括尿路上皮癌、膀胱癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、食管癌、乳头状甲状腺癌、胆囊癌。
本发明的有益效果是：
本发明提供了三种Nectin-4的单克隆抗体，单克隆抗体培养上清的ELISA检测结果显示N4Cx OD值1.864，N4Cy OD值1.397，N4Cz OD值2.036，阳性对照OD值0.912，阴性对照OD值0.095。
本发明还提供了编码上述三种Nectin-4单克隆抗体包括高变区在内的氨基酸序列及其核酸序列，可用于制备Nectin-4单克隆抗体，进行人源化改造，或进一步制备靶向Nectin-4与T细胞的双特异性抗体，或CAR-T细胞，具有开发抗肿瘤新药的潜力。
本发明提供了一种嵌合抗原受体多肽，包含：胞外抗原结合域，跨膜结构域和胞内信号域，其中胞外抗原结合域包含与上述Nectin-4蛋白结合的单克隆抗体或抗体片段。
本发明还提供了一种靶向Nectin-4的CAR-T细胞，通过将靶向Nectin-4的CAR基因表达载体与CCR7-IRES-IL7基因表达载体共同导入T细胞制得77N4CAR-T细胞，与仅有靶向性的N4CAR-T细胞或仅有淋巴趋化和免疫细胞活化功能的77T细胞相比，77N4CAR-T细胞同时具有趋化活化及靶向三重功能，具有更全面的抗三阴乳腺癌活性。77N4CAR-T细胞具有开发抗肿瘤新药的潜力。
附图说明
图1为pMSCV-GFP逆转录病毒表达载体图谱。
图2为三种Nectin-4的单克隆抗体培养上清的ELISA检测结果。其中N4Cx OD值1.864，N4Cy OD值1.397，N4Cz OD值2.036，阳性对照OD值0.912，阴性对照OD值0.095。
具体实施方式
以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
实施例1Nectin-4杂交瘤单克隆抗体的制备
1.1.Nectin-4杂交瘤单抗筛选制备
①以Nectin-4蛋白质为抗原免疫BALB/c小鼠：8周龄BALB/c小鼠4只，每只分3点皮下注射，每点注射含20μg人Nectin-4蛋白与50μl完全佐剂混合的油包水液体；每间隔10日进行第二、第三和第四次加强免疫，每次每只BALB/c小鼠腹腔注射50μg Nectin-4蛋白。第四次免疫后第四天，取小鼠脾脏用于B细胞的制备。
②骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞为SP2/0，在细胞融合一周前用含有10％胎牛血清的1640培养基培养，生长良好，待融合使用。
③饲养细胞：将正常的BALB/c小鼠(未经抗原免疫)脱颈处死，无菌操作取出脾脏。200目不锈钢目筛研磨脾脏组织，1640培养基冲洗收集脾细胞。96孔板中，每孔加入2×105个脾细胞。
④B细胞与骨髓瘤细胞融合：在细胞融合当天，同样使用制备饲养细胞的方法，得到经Nectin-4抗原免疫的BALB/c小鼠脾脏细胞。取含1×107个脾细胞与3×107个SP2/0骨髓瘤细胞融合。融合剂为50％的PEG1500溶液。融合后细胞用HAT培养液重悬浮，加入已含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.1ml，继续培养。
⑤阳性克隆筛选：以包被Nectin-4蛋白的间接ELISA法，检测融合后96孔板中的阳性克隆。筛选到3孔强阳性的杂交瘤孔，随后进行连续2次的克隆化，获得了3株阳性单克隆，分别为N4Cx、N4Cy和N4Cz，三株阳性单克隆抗体培养上清的ELISA检测结果见附图2：N4CxOD值1.864，N4Cy OD值1.397，N4Cz OD值2.036，阳性对照OD值0.912，阴性对照OD值0.095。说明所制备得到的3个单克隆抗体具有相近的效果。
1.2.Nectin-4单克隆抗体重链和轻链可变区基因克隆与测序
Nectin-4特异性N4Cx、N4Cy、N4Cz杂交瘤细胞株的重链及轻链可变区基因的克隆与测序过程如下：
①提取杂交瘤细胞RNA：根据Trizol试剂说明书提供的方案，使用Trizol分别裂解C1和C2两株杂交瘤细胞。将裂解后样本全部转移至1.5ml离心管中，每1ml Trizol试剂添加0.2ml氯仿，抽提，室温下静置10min；4℃，12000rpm，离心15min。小心的从上方水相中吸取RNA，吸出RNA与等量异丙醇混匀；4℃，12000rpm，离心15min，弃上清。75％乙醇洗2次，待乙醇挥发彻底后，每管加入50μl无菌、无RNA酶水溶解沉淀。取10μlRNA用于随后的RT-PCR。
②逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription Polymerase chainreaction，RT-PCR)扩增重及轻链可变区基因：以上述提取的杂交瘤细胞RNA为模板，通过RT-PCR合成cDNA。RT-PCR引物是采用一组通用的小鼠IgG抗体重链及轻链可变区扩增引物。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分析条带大小，随后回收条带测序。
共制得两批杂交瘤单克隆抗体，测序结果确定的第一批3株杂交瘤单克隆抗体的轻链可变区基因分别是：N4CxL(SEQ ID NO.1)、N4CyL(SEQ ID NO.3)、和N4CzL(SEQ IDNO.5)，对应的氨基酸(aa)序列分别为N4CxLaa(SEQ ID NO.2)、N4CyLaa(SEQ ID NO.4)和N4CzLaa(SEQ ID NO.6)；重链可变区基因分别是：N4CxH(SEQ ID NO.7)、N4CyH(SEQ IDNO.9)和N4CzH(SEQ ID NO.11),对应的氨基酸序列分别为N4CxHaa(SEQ ID NO.8)、N4CyHaa(SEQ ID NO.10)和N4CxHaa(SEQ ID NO.12)，其中下划线对应可变区中的高变区序列，依次为CDR1、CDR2、CDR3。
SEQ ID NO.1:N4CxL
GACATTCTCCTGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCGCCTGCAAGGCCAGTCAGGGTGTGATTGCTGGTGTAGCCTGGTATAAACAGAAATCAGGTCAATCTCCTCAAACACTGATTTACACGCCATCCTACCGGTACAGTGGATTCCCTGATCGCGTCACAGGCCGTGGATCTGGGACAGATAGCACTCTCACCATCTTCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATCACGGCTATCCGCTCACGTTCGGAGGGGGGGCCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT。
SEQ ID NO.2:N4CxLaa
DILLTQSQKFMSTSVGDRVSVACKASQGVIAGVAWYKQKSGQSPQTLIYTPSYRYSGFPDRVTGRGSGTDSTLTIFNVQSEDLAEYFCQQYHGYPLTFGGGAKLEIKRA。
SEQ ID NO.3:N4CyL
GACATTGGGATGACCCCGTCTCAAAAATTTATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCCTCACCTGCAAGGCCAGTAAGCGTGTGGTTCCTAGTGTAGCCTGGTATGAACAGAAATCAGGTCAATCTACTAAAACACTGATTTACTCGGCACCCAACCGGTACAGTGGACTCCCTGATCGCTTCAAAGGCCGTGGATCTCGGACAGATTTCGCTCTCACCATCCGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGCCAGAGTATTTCTGTCCGCAATATAACGGCAATCCGGTCACGATCGGACGGGGGACCAAGCTGGAAATAGAACGGGCT。
SEQ ID NO.4：N4CyLaa
DIGMTPSQKFMSTSVGDRVSLTCKASKRVVPSVAWYEQKSGQSTKTLIYSAPNRYSGLPDRFKGRGSRTDFALTIRNVQSEDLPEYFCPQYNGNPVTIGRGTKLEIERA。
SEQ ID NO.5：N4CzL
GGC ATT ACC ATG ACC CAG TCT CAA AAA TTC ATG TCC ACA TCA AAA GGA GACAGGGTC AGC GTC ACC TGC AAG CGC AGT CAG GCA GTG AGG ACT AAT GAC GCC TGG TATCAACAG AAA CCA GGG CAA TCT CCT AAA GCA CTG ATT TAC TCG GGA TTC TAC CGAACC CTG GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACTCTC ACC ATCAAC AAT GTG CAG TCT GAA GAC TTG GCA GAG TAT TTC TGT CAG CAAAAG TAT AGT GGT CCT AGT ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTGGAG CTG AAA CGGGCT。
SEQ ID NO.6：N4CzLaa
GITMTQSQKFMSTSKGDRVSVTCKRSQAVRTNDAWYQQKPGQSPKALIYSGFYRTLGVPDRFTGSGSGTDFTLTINNVQSEDLAEYFCQQKYSGPSTFGTGTGLELKRA。
SEQ ID NO.7：N4CxH
GAACTGACAGTGGTGGAGGCGGGGGGAAGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAAATCACCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCGATAGCAATGCCATGGCTTGGGTTGGCCAGACTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGCCGCATCCATTAGTCCTCGTGGTGCCACCTATTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAGTCCCCGGAACATCCCGTATCTGCAAATGAACAGTCTGGGGTCTGAAGACACGGCCATGTATTACTGTCCAAGAGGCGT CTACCATACCAACTACTGGGGCCAAGGCGCCACTCTCGCAGTCTCCTCG。
SEQ ID NO.8：N4CxHaa
ELTVVEAGGSLVKPGGSLKITCAASGFAFDSNAMAWVGQTPEKGLEWAASISPRGATYYPDSVKGRFTISRDSPRNIPYLQMNSLGSEDTAMYYCPRGVYHTNYWGQGATLAVSS。
SEQ ID NO.9:N4CyH
GAAGTGACACTGCTGGAGTCGCGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTCGAGGGTCCCTGGAAATCTCCTGTGCACCCTCTGGATTCTCTTTCCATAACTATACCATGTCTTGGGTTCGCGAGACTCCAGAGAAGGGGCTGGAGCGGGTCGCATCCATTAGTGCTGGTCGTACCACCTATTATCCACACAGTGTGGAGGGCCGATTCGCCATCTCCCGAGATAGTCCCAGGAACATCGTGTATCTGCAAATGAACAGTGTGAGGTCTAAAGACACGGCCATGTATTACTGTCCAGGAGGCCT CTACAATGCCCACTACTGGCGCCAACGCACCACTGTCACAGTCTCCTCG。
SEQ ID NO.10:N4CyHaa
EVTLLESRGGLVKPRGSLEISCAPSGFSFHNYTMSWVRETPEKGLERVASISAGRTTYYPHSVEGRFAISRDSPRNIVYLQMNSVRSKDTAMYYCPGGLYNAHYWRQRTTVTVSS。
SEQ ID NO.11:N4CzH
CAGGTGGAGCTCCGCCAGTCATCTCCTCAGCTACTGCAGCCCTCACAGTGGCTGTCCATAACCTGCACAGTCTCTGGTACAAAGTTATTATCATATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGAAGTGGGGAGGTGACAACTCAGACTACAATGCAGCTTTCATGTCCAGACTGAGCATCACCAAGGACAACTCCTTTAGCAAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAAGCTGATGACACTGCCATATACTACTGTAACAGATTCAC GTTCTGGAACTTCGTCGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA。
SEQ ID NO.12:N4CzHaa
QVELRQSSPQLLQPSQWLSITCTVSGTKLLSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVKWGGDNSDYNAAFMSRLSITKDNSFSKVFFKMNSLQADDTAIYYCNRFTFWNFVVWGAGTTVTVSS。
实施例2制备含有Nectin-4单克隆抗体序列的N4CAR表达载体
2.1.本发明获得的Nectin-4单克隆抗体可变区
2.2.构建Nectin-4 CAR(N4CAR)基因逆转录病毒表达载体
①按照下述的基因拼接顺序，形成完整的3个N4CAR基因：Igk前导肽+轻链可变区+Linker+重链可变区+CD8铰链区+CD28跨膜区+CD28 ITAM区+41BB ITAM区+CD3ζITAM区。
②把形成的3个N4CAR双链DNA分别克隆至T载体，测序确认无误。
③把3个N4CAR基因分别克隆至同时表达GFP的逆转录病毒表达载体，获得了3个N4CAR基因表达载体；把用实施例1中制备得到的3株单克隆抗体可变区构建的N4CAR分别命名为N4CARx、N4CARy和N4CARz。
可选用的表达载体包括任何真核表达载体。本实施例中选用的是：pMSCV-GFP逆转录病毒表达载体，所述载体图谱如附图1所示。
实施例3制备靶向Nectin-4的CAR-T细胞
3.1构建Nectin-4 CAR(N4CAR)基因逆转录病毒表达载体
①按照下述的基因拼接顺序，形成完整的3个Nectin-4 CAR基因：Igk前导肽+轻链可变区+Linker+重链可变区+CD8铰链区+CD28跨膜区+CD28 ITAM区+41BB ITAM区+CD3ζITAM区。采用实施例2中制备得到的(N4CxL、N4CyL、N4CzL、N4CxH、N4CyH和N4CzH)单克隆抗体基因序列。
②把形成的3个Nectin-4 CAR双链DNA分别克隆至T载体，测序确认无误。
③把3个Nectin-4 CAR基因分别克隆至同时表达GFP的逆转录病毒表达载体，获得了3个Nectin-4 CAR基因表达载体；把用3株单克隆抗体可变区构建的N4CAR分别命名为N4CARx、N4CARy和N4CARz。
④制备N4CAR逆转录病毒：用3个N4CAR逆转录病毒表达载体分别和VSV-G外膜蛋白质粒共转染GP2-293细胞，获得N4CARx、N4CARy和N4CARz逆转录病毒。
3.2制备靶向Nectin-4的抗癌CAR-T细胞
(1)制备T细胞：①将PBMC按2×106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中,加入1,000U/ml的重组人IFN-γ，37℃，5％ C02培养箱中培养；②24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2,刺激T细胞的生长和增殖；每3天半量换液一次,并补加重组人IL-2 300U/ml；③培养第10天,收获T细胞；流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8等分子的表达:CD3+CD8+细胞的比例在60％以上，即为T细胞；
(2)把T细胞以每孔7×105接种于6孔板中(每孔3mL培养液)；
(3)次日取2孔每孔加入10μl N4CARx、N4CARy和N4CARz逆转录病毒颗粒，继续培养48小时的T细胞即为N4CAR-Tx、N4CAR-Ty和N4CAR-Tz。
实施例4制备具有趋化和活化功能的靶向Nectin-4的CAR-T细胞
4.1制备具有趋化和活化功能的77T细胞
(1)构建NK细胞专用型CCR7-IRES-IL7双顺反子逆转录病毒(77RT)表达载体；优选地，包括以下步骤：
①合成CCR7基因(SEQ ID NO.31),克隆至具有双顺反子元件的逆转录病毒表达载体的IRES上游，成为CCR7-IRES逆转录病毒表达载体；
②合成IL-7基因(SEQ ID NO.32)，克隆至CCR7-IRES逆转录病毒表达载体的IRES下游,成为T细胞专用型CCR7-IRES-IL7逆转录病毒表(77RT)达载体；
(2)制备T细胞专用型77RT病毒
①取77RT载体质粒与VSV-G外膜蛋白质粒共转染GP2-293细胞，培养上清中即包含携带相应CCR7-IRES-IL7双顺反子基因的77RT颗粒；
②用数字微滴PCR(ddPCR)绝对定量法测定，把病毒含量为106/μL，备用；
(3)制备77T细胞
①制备T细胞：(1)将PBMC按2×106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中,加入1,000U/ml的重组人IFN-γ,37℃,5％ C02培养箱中培养；(2)24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2,刺激T细胞的生长和增殖；每3天半量换液一次,并补加重组人IL-2 300U/ml；(3)培养第10天,收获T细胞；流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8等分子的表达:CD3+CD8+细胞的比例在60％以上，即为T细胞。
②把T细胞以每孔7×105接种于6孔板中(6孔板体系为3mL培养液)；
③次日取1孔每孔加入10μl 77RT逆转录病毒颗粒，继续培养48小时的T细胞即为77T细胞；用流式细胞计数仪检测发现，GFP阳性的77T细胞为52％左右。
4.2制备具有趋化活化靶向3种功能的抗癌77-N4CAR-T细胞
(1)制备77-N4CAR逆转录病毒
①取77RT表达载体质粒分别与N4CAR1、N4CAR2和N4CAR3载体质粒混合，再与VSV-G外膜蛋白质粒共转染GP2-293细胞，培养上清中即包含携带相应77-N4CAR1、77-N4CAR2和77-N4CAR3基因的逆转录病毒；
②用数字微滴PCR(ddPCR)绝对定量法测定，把每种病毒含量调整为106/μL，备用。
(2)制备T细胞：(1)将PBMC按2×106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中,加入1,000U/ml的重组人IFN-γ,37℃,5％ C02培养箱中培养；(2)24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2,刺激T细胞的生长和增殖；每3天半量换液一次,并补加重组人IL-2
300U/ml；(3)培养第10天,收获T细胞；流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8等分子的表达:CD3+CD8+细胞的比例在60％以上，即为T细胞；
(3)把T细胞以每孔7×105接种于6孔板中(每孔3mL培养液)；
(4)次日加入1mL培养液及10μl 77-N4CAR1或77-N4CAR2或77-N4CAR3逆转录病毒颗粒，继续培养48小时的T即为77-N4CAR-T1或77-N4CAR-T2或77-N4CAR-T3细胞。GFP阳性的77-N4CAR-T细胞高达62％左右。
CCR7基因序列：
ATGAAAAGCGTGCTGGTGGTGGCTCTCCTTGTCATTTTCCAGGTATGCCTGTGTCAAGATGAGGTCACGGACGATTACATCGGAGACAACACCACAGTGGACTACACTTTGTTCGAGTCTTTGTGCTCCAAGAAGGACGTGCGGAACTTTAAAGCCTGGTTCCTCCCTATCATGTACTCCATCATTTGTTTCGTGGGCCTACTGGGCAATGGGCTGGTCGTGTTGACCTATATCTATTTCAAGAGGCTCAAGACCATGACCGATACCTACCTGCTCAACCTGGCGGTGGCAGACATCCTCTTCCTCCTGACCCTTCCCTTCTGGGCCTACAGCGCGGCCAAGTCCTGGGTCTTCGGTGTCCACTTTTGCAAGCTCATCTTTGCCATCTACAAGATGAGCTTCTTCAGTGGCATGCTCCTACTTCTTTGCATCAGCATTGACCGCTACGTGGCCATCGTCCAGGCTGTCTCAGCTCACCGCCACCGTGCCCGCGTCCTTCTCATCAGCAAGCTGTCCTGTGTGGGCATCTGGATACTAGCCACAGTGCTCTCCATCCCAGAGCTCCTGTACAGTGACCTCCAGAGGAGCAGCAGTGAGCAAGCGATGCGATGCTCTCTCATCACAGAGCATGTGGAGGCCTTTATCACCATCCAGGTGGCCCAGATGGTGATCGGCTTTCTGGTCCCCCTGCTGGCCATGAGCTTCTGTTACCTTGTCATCATCCGCACCCTGCTCCAGGCACGCAACTTTGAGCGCAACAAGGCCATCAAGGTGATCATCGCTGTGGTCGTGGTCTTCATAGTCTTCCAGCTGCCCTACAATGGGGTGGTCCTGGCCCAGACGGTGGCCAACTTCAACATCACCAGTAGCACCTGTGAGCTCAGTAAGCAACTCAACATCGCCTACGACGTCACCTACAGCCTGGCCTGCGTCCGCTGCTGCGTCAACCCTTTCTTGTACGCCTTCATCGGCGTCAAGTTCCGCAACGATCTCTTCAAGCTCTTCAAGGACCTGGGCTGCCTCAGCCAGGAGCAGCTCCGGCAGTGGTCTTCCTGTCGGCACATCCGGCGCTCCTCCATGAGTGTGGAGGCCGAGACCACCACCACCTTCTCCCCATAG(SEQ IDNO.31)。
IL-7基因序列：
ATGTTCCATGTTTCTTTTAGGTATATCTTTGGACTTCCTCCCCTGATCCTTGTTCTGTTGCCAGTAGCATCATCTGATTGTGATATTGAAGGTAAAGATGGCAAACAATATGAGAGTGTTCTAATGGTCAGCATCGATCAATTATTGGACAGCATGAAAGAAATTGGTAGCAATTGCCTGAATAATGAATTTAACTTTTTTAAAAGACATATCTGTGATGCTAATAAGGAAGGTATGTTTTTATTCCGTGCTGCTCGCAAGTTGAGGCAATTTCTTAAAATGAATAGCACTGGTGATTTTGATCTCCACTTATTAAAAGTTTCAGAAGGCACAACAATACTGTTGAACTGCACTGGCCAGGTTAAAGGAAGAAAACCAGCTGCCCTGGGTGAAGCCCAACCAACAAAGAGTTTGGAAGAAAATAAATCTTTAAAGGAACAGAAAAAACTGAATGACTTGTGTTTCCTAAAGAGACTATTACAAGAGATAAAAACTTGTTGGAATAAAATTTTGATGGGCACTAAAGAACACTGA(SEQ ID NO.32)。
实施例5几种T细胞对乳腺癌细胞的体外杀伤活性
5.1几种T细胞对乳腺癌细胞的体外杀伤活性
本实施例中选择SK-BR-3乳腺癌细胞作为靶细胞用于检测T细胞、77T细胞、N4CAR-Tx、N4CAR-Ty、N4CAR-Tz、77-N4CAR-Tx、77-N4CAR-Ty、77-N4CAR-Tz细胞等效应细胞的体外杀伤活性，用U型96孔培养板，杀伤实验孔设复孔。
(1)每个效应细胞设复孔，向每孔加入1×105个效应细胞(T、77T、N4CAR-Tx、N4CAR-Ty、N4CAR-Tz、77N4CAR-Tx、77N4CAR-Ty、77-N4CAR-Tz)细胞；
(2)向每孔效应细胞加入2×104个靶细胞(SK-BR-3)；
(3)设只含1×105个效应细胞(T、77T、N4CAR-Tx、N4CAR-Ty、N4CAR-Tz、77-N4CAR-Tx、77-N4CAR-Ty、77-N4CAR-Tz)细胞的复孔；
(4)设只含2×104个SK-BR-3靶细胞的复孔；
(5)每孔补足培养液至200μl。
(6)CO2培养箱37℃培养6h后，每孔加入10μl CCK-8，震荡混匀；
(7)培养箱继续孵育1h，取出96孔板，多功能酶标仪测450mm波长下的OD值。
(8)计算每种效应细胞杀伤SK-BR-3靶细胞的活性；杀伤活性以杀伤率来表示。杀伤率公式为：杀伤率(％)＝1-(A-B)/C×100％，其中A是效应细胞与SK-BR-3靶细胞共培养的吸光度值；B是单独效应细胞的吸光度值，C是SK-BR-3靶细胞的吸光度值。重复上述杀伤实验四次，统计结果见表1。
表1.几种T细胞对乳腺癌细胞的杀伤活性比较
从表1中结果可以发现：
(1)T细胞对SK-BR-3乳腺癌细胞有一定的杀伤活性，为20％±1.7；
(2)77T细胞增强了T细胞的杀伤活性，与T细胞相比，具有非常显著的差别p≤ 0.01)。
(3)N4CAR-T细胞对SK-BR-3乳腺癌细胞的杀伤率较好，为31％至52％；与77T细胞 相比，都具有非常显著的差别(p≤0.01)，表明N4CAR-T细胞具有治疗乳腺癌的潜质。
(4)715N4CAR-T细胞对SK-BR-3乳腺癌细胞的杀伤率最高，为46％至71％；与4CAR-T细胞相比，具有显著差别(p≤0.05)，表明715N4CAR-NK细胞最具治疗乳腺癌的潜质。
5.2CCR7对几种T细胞的趋化作用
本实施例采用表达CCL19的293T工程(CCL19-293T)细胞株作为趋化靶标，采用膜孔径为5μM的Transwell进行细胞移动实验；以体外扩增的原代T细胞为效应细胞，分别制备77T、N4CAR-Tx、N4CAR-Ty、N4CAR-Tz、77-N4CAR-Tx、77-N4CAR-Ty、77-N4CAR-Tz细胞；验证其趋化活性。实施过程如下：
(1)分别准备77T、N4CAR-Tx、N4CAR-Ty、N4CAR-Tz、77-N4CAR-Tx、77-N4CAR-Ty、77-N4CAR-Tz细胞，浓度均为106/ml于RPMI-20％FCS-500U IL-2/ml培养液中。
(2)准备CCL19-293T细胞悬液2×105/ml于RPMI-20％FCS-500U IL-2/ml培养液中，6孔板每孔加入2ml，37℃二氧化碳培养箱放置2h至细胞贴壁；随后transwell inserts小室置于6孔板中。
(3)每个transwell inserts小室加入2ml的77T、N4CAR-Tx、N4CAR-Ty、N4CAR-Tz、77-N4CAR-Tx、77-N4CAR-Ty、77-N4CAR-Tz细胞。
(4)上述细胞在37℃二氧化碳培养箱放置24h后取出inserts小室，收集6孔板中的CCL19-293T细胞和从transwell inserts小室迁移来的T、77T、N4CAR-Tx、N4CAR-Ty、N4CAR-Tz、77-N4CAR-Tx、77-N4CAR-Ty、77-N4CAR-Tz细胞；1000rpm离心,细胞PBS洗3次。
(5)分别用抗CD3-PE抗体对迁移至6孔板中的T、77T、N4CAR-Tx、N4CAR-Ty、N4CAR-Tz、77-N4CAR-Tx、77-N4CAR-Ty、77-N4CAR-Tz细胞进行染色。
(6)流式细胞分析法，分别计算迁移至CCL19-293T细胞上的T、77T、N4CAR-Tx、N4CAR-T2y、N4CAR-Tz、77-N4CAR-Tx、77-N4CAR-Ty、77-N4CAR-Tz细胞数。CCR7对几种T细胞的趋化作用见表2：
表2.CCR7对几种T细胞的趋化结果
从表2中结果可以看出，含有CCR7的T细胞均有非常显著(p≤0.01)的趋化作用，说明加入CCR7后可以显著增强77N4CAR-T细胞在体内的抗癌效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (18)

1.一种抗Nectin-4的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链；所述重链的重链可变区中具有3个互补区H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3及L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的组合为以下(Ⅰ)至(Ⅲ)中的任意一种：
(Ⅰ)H-CDR1的氨基酸序列为GFAFDSNA(SEQ ID NO.13)，
H-CDR2的氨基酸序列为ISPRGAT(SEQ ID NO.14)，
H-CDR3的氨基酸序列为PRGVYHTNY(SEQ ID NO.15)，
L-CDR1的氨基酸序列为KASQGVIAGVA(SEQ ID NO.16)，
L-CDR2的氨基酸序列为TPSYRYSG(SEQ ID NO.17)
L-CDR3的氨基酸序列为QQYHGYPLT(SEQ ID NO.18)；
(Ⅱ)H-CDR1的氨基酸序列为GFSFHNYT(SEQ ID NO.19)，
H-CDR2的氨基酸序列为ISAGRTT(SEQ ID NO.20)，
H-CDR3的氨基酸序列为PGGLYNAHYW(SEQ ID NO.21)，
L-CDR1的氨基酸序列为KASKRVVPSVA(SEQ ID NO.22)，
L-CDR2的氨基酸序列为SAPNRYSG(SEQ ID NO.23)
L-CDR3的氨基酸序列为PQYNGNPVT(SEQ ID NO.24)；
(Ⅲ)H-CDR1的氨基酸序列为GTKLLSYG(SEQ ID NO.25)，
H-CDR2的氨基酸序列为KWGGDNS(SEQ ID NO.26)，
H-CDR3的氨基酸序列为NRFTFWNFVV(SEQ ID NO.27)，
L-CDR1的氨基酸序列为KRSQAVRTNDA(SEQ ID NO.28)，
L-CDR2的氨基酸序列为SGFYRTLG(SEQ ID NO.29)
L-CDR3的氨基酸序列为QQKYSGPST(SEQ ID NO.30)。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区氨基酸序列为以下(Ⅰ)至(Ⅲ)中的任意一种：
(Ⅰ)轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(Ⅱ)轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(Ⅲ)轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列为以下(Ⅰ)至(Ⅲ)中的任意一种：
(Ⅰ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
(Ⅱ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
(Ⅲ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
4.编码权利要求1至3任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
5.编码权利要求1至3任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段的所述轻链可变区；
所述重链可变区；
所述轻链可变区互补区；或，
所述重链可变区互补区的核酸分子。
6.根据权利要求4或5所述的核酸分子，其特征在于，
编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子的序列如SEQ ID NO.1所示；
编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.3所示；
编码SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；
编码SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.7所示；
编码SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.9所示；
编码SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如SEQ ID NO.11所示。
7.一种表达载体，所述载体中插入有权利要求4至6任一项所述的核酸分子。
8.一种细胞，含有权利要求4至6任一项所述的核酸分子或权利要求7所述的表达载体。
9.一种嵌合抗原受体多肽，包含：
ⅰ.胞外抗原结合域，所述胞外抗原结合域包含权利要求1至3任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，
ⅱ.跨膜结构域，和
ⅲ.胞内信号域。
10.编码权利要求9所述嵌合抗原受体多肽的核酸分子。
11.一种遗传修饰的T细胞，包含权利要求9所述的嵌合抗原受体多肽或权利要求10所述的核酸分子。
12.根据权利要求11所述的遗传修饰的T细胞，其特征在于，所述遗传修饰的T细胞通过将含有权利要求10所述核酸分子的表达载体转染T细胞制得。
13.根据权利要求11或12所述的遗传修饰的T细胞，其特征在于，所述遗传修饰的T细胞还包含CCR7的表达序列。
14.根据权利要求13所述的遗传修饰的T细胞，其特征在于，所述遗传修饰的T细胞还包含IL-7的表达序列。
15.根据权利要求14所述的遗传修饰的T细胞，其特征在于，所述CCR7的表达序列与IL-7的表达序列插入于同一表达载体；
所述CCR7的表达序列与IL-7的表达序列之间优选连接有IRES元件。
16.一种制剂，包含以下Ⅰ～Ⅶ中的至少一项：
Ⅰ.权利要求1至3任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
Ⅱ.权利要求4至6任一项所述的核酸分子；
Ⅲ.权利要求7所述的表达载体；
Ⅳ.权利要求8所述的细胞；
Ⅴ.权利要求9所述的嵌合抗原受体多肽；
Ⅵ.权利要求10所述的核酸分子；
Ⅶ.权利要求11至15任一项所述的遗传修饰的T细胞。
17.以下Ⅰ～Ⅶ中的至少一项在制备抗肿瘤药物中的应用：
Ⅰ.权利要求1至3任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
Ⅱ.权利要求4至6任一项所述的核酸分子；
Ⅲ.权利要求7所述的表达载体；
Ⅳ.权利要求8所述的细胞；
Ⅴ.权利要求9所述的嵌合抗原受体多肽；
Ⅵ.权利要求10所述的核酸分子；
Ⅶ.权利要求11至15任一项所述的遗传修饰的T细胞。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括尿路上皮癌、膀胱癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、食管癌、乳头状甲状腺癌、胆囊癌。
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