CN118076627A - 三聚可活化细胞因子构建体以及相关组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了可活化细胞因子构建体，所述可活化细胞因子构建体包括：第一单体构建体，所述第一单体构建体包含第一细胞因子蛋白(CP1)、第一可裂解部分(CM1)和第一空间掩蔽部分(SMM1)，其中所述CM1位于所述CP1与所述SMM1之间；第二单体构建体，所述第二单体构建体包含第二细胞因子蛋白(CP2)、第二可裂解部分(CM2)和第二空间掩蔽部分(SMM2)，其中所述CM2位于所述CP2与所述SMM2之间；和第三单体构建体，所述第三单体构建体包含第三细胞因子蛋白(CP3)、第三可裂解部分(CM3)和第三空间掩蔽部分(SMM3)，其中所述CM3位于所述CP3与所述SMM3之间，其中：所述CP1、所述CP2和所述CP3彼此结合，从而形成所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体的三聚体；并且所述SMM1、所述SMM2和所述SMM3是球状分子。

Description

三聚可活化细胞因子构建体以及相关组合物和方法
相关申请的交叉引用
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电子序列表的引用
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技术领域
本公开涉及生物技术领域，并且更具体来说，涉及可活化细胞因子构建体。
背景技术
细胞因子是由大多数有核细胞响应于病毒感染和/或其它抗原刺激而产生和分泌的天然存在的小蛋白和糖蛋白家族。LIGHT(与糖蛋白D竞争T细胞上的疱疹病毒进入的淋巴毒素样诱导蛋白)是肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族中的细胞因子，所述细胞因子在活化的T细胞、单核细胞、粒细胞和未成熟树突状细胞上表达。LIGHT也被称为肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)。LIGHT是同三聚体并且以三聚体形式结合至两种已知的细胞受体：疱疹病毒进入介体(HVEM)和淋巴毒素-β受体(LTβR)。经由活化HVEM通路和LT-β受体，LIGHT可以活化T细胞并刺激趋化因子的产生，最终募集T细胞。LIGHT已显示触发多种肿瘤细胞的凋亡。(Rooney,IA等,J.Biol.Chem.275(19):14307-15(2000))。如果在肿瘤微环境中表达，那么LIGHT可以在肿瘤微环境中招募并活化T细胞。因此，LIGHT已被视为癌症的治疗剂。然而，外周系统中的组成性LIGHT活性可以导致淋巴细胞活化、炎症和组织破坏。显著的副作用和脱靶毒性阻碍了LIGHT作为治疗剂的发展。
对于细胞因子疗法对所需靶标的改善的特异性和选择性的需要和期望受到极大关注。细胞因子治疗剂对疾病部位的靶向性增加可以降低基于全身机制的毒性并导致更广泛的治疗效用。
发明内容
本公开提供了三聚可活化细胞因子构建体以及其使用和制备方法。在一个方面，本公开提供了一种可活化细胞因子构建体(ACC)，所述可活化细胞因子构建体包含：第一单体构建体，所述第一单体构建体包含第一细胞因子蛋白(CP1)、第一可裂解部分(CM1)和第一空间掩蔽部分(SMM1)，其中所述CM1位于所述CP1与所述SMM1之间；第二单体构建体，所述第二单体构建体包含第二细胞因子蛋白(CP2)、第二可裂解部分(CM2)和第二空间掩蔽部分(SMM2)，其中所述CM2位于所述CP2与所述SMM2之间；和第三单体构建体，所述第三单体构建体包含第三细胞因子蛋白(CP3)、第三可裂解部分(CM3)和第三空间掩蔽部分(SMM3)，其中所述CM3位于所述CP3与所述SMM3之间，其中：所述CP1、所述CP2和所述CP3彼此结合，从而形成所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体的三聚体；并且所述SMM1、所述SMM2和所述SMM3是球状分子。
在一些实施方案中，CP1、CP2和CP3是相同的细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是肿瘤坏死因子或肿瘤坏死因子超家族的成员。在一些实施方案中，CP1、CP2和CP3是肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14，也被称为LIGHT)。在一些实施方案中，CP1、CP2和CP3中的每一者包含与SEQ ID NO:54至少80％、90％、95％或99％同一的序列。
在一些实施方案中，SMM1、SMM2和SMM3是相同的球状分子。在一些实施方案中，球状分子是白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白包含与人血清白蛋白至少80％、90％、95％或99％同一的序列。
在一些实施方案中，第一单体构建体包含至少一个接头。在一些实施方案中，至少一个接头包含安置在CP1与CM1之间的接头L1和/或在CM1与SMM1之间的接头L2。在一些实施方案中，第二单体构建体包含至少一个接头。在一些实施方案中，至少一个接头包含安置在CP2与CM2之间的接头L3和/或在CM2与SMM2之间的接头L4。在一些实施方案中，第三单体构建体包含至少一个接头。在一些实施方案中，至少一个接头包含安置在CP3与CM3之间的接头L5和/或在CM3与SMM3之间的接头L6。
在一些实施方案中，第一单体构建体还包含第一亲和掩蔽部分(AMM1)和任选的位于AMM1与CP1之间的第四可裂解部分(CM4)，第二单体构建体还包含第二亲和掩蔽部分(AMM2)和任选的位于AMM2与CP2之间的第五可裂解部分(CM5)，并且第三单体构建体还包含第三亲和掩蔽部分(AMM3)和任选的位于AMM3与CP3之间的第六可裂解部分(CM6)。在一些实施方案中，AMM1、AMM2和AMM3是相同的。在一些实施方案中，AMM1、AMM2和AMM3中的每一者包含SEQ ID NO:61的序列。在一些实施方案中，AMM1、AMM2和AMM3中的每一者包含与SEQ IDNO:61至少80％、90％、95％或99％同一的序列。在一些实施方案中，CM1、CM2和CM3包含相同蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM1、CM2和CM3包含不同蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM1、CM2和CM3中的每一者包含与SEQ ID NO:62或63至少95％同一的序列。在一些实施方案中，CM4、CM5和CM6包含相同蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM4、CM5和CM6包含不同蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM4、CM5和CM6中的每一者包含与SEQ ID NO:62或63至少95％同一的序列。
在一些实施方案中，一种或多种蛋白酶由受试者的肿瘤产生。在一些实施方案中，一种或多种蛋白酶选自由以下组成的组：ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、BACE、肾素(Renin)、组织蛋白酶D(CathepsinD)、组织蛋白酶E、半胱天冬酶1(Caspase 1)、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶14、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V/L2、组织蛋白酶X/Z/P、Cruzipain、豆荚蛋白(Legumain)、Otubain-2、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、穿膜肽酶(Meprin)、中性溶酶(Neprilysin)、PSMA、BMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-23、MMP-24、MMP-26、MMP-27、活化蛋白C、组织蛋白酶A、组织蛋白酶G、胃促胰酶(Chymase)、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、弹性蛋白酶(Elastase)、粒酶B(Granzyme B)、胍基苯甲酸酶(Guanidinobenzoatase)、HtrA1、人嗜中性粒细胞裂解酶、乳铁蛋白(lactoferrin)、marapsin、NS3/4A、PACE4、纤溶酶(Plasmin)、PSA、tPA、凝血酶(thrombin)、类胰蛋白酶(tryptase)、uPA、DESC1、DPP-4、FAP、肝丝酶(Hepsin)、基质蛋白酶-2(Matriptase-2)、MT-SP1/基质蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3和TMPRSS4。
在一些实施方案中，第一单体构建体还包含在AMM1与CM4之间的接头L7和/或在CM4与CP1之间的接头L8。在一些实施方案中，第二单体构建体还包含在AMM2与CM5之间的接头L9和/或在CM5与CP2之间的接头L10。在一些实施方案中，第三单体构建体还包含在AMM3与CM6之间的接头L11和/或在CM6与CP3之间的接头L12。在一些实施方案中，接头L1-L12中的每一者具有2至30个氨基酸的总长度。在一些实施方案中，接头L1-L12中的每一者独立地包含SEQ IDNO:64-69、75-77、GGS、SGG、GSG、GS或G中的任一者的序列。
在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上：第一单体构建体包含CP1、CM1和SMM1，第二单体构建体包含CP2、CM2和SMM2，并且第三单体构建体包含CP3、CM3和SMM3。在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上：第一单体构建体包含SMM1、CM1和CP1，第二单体构建体包含SMM2、CM2和CP2，并且第三单体构建体包含SMM3、CM3和CP3。在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上：第一单体构建体包含AMM1、CM4、CP1、CM1和SMM1，第二单体构建体包含AMM2、CM5、CP2、CM2和SMM2，并且第三单体构建体包含AMM3、CM6、CP3、CM3和SMM3。在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上：第一单体构建体包含SMM1、AMM1、CM1和CP1；第二单体构建体包含SMM2、AMM2、CM2和CP2，并且第三单体构建体包含SMM3、AMM3、CM3和CP3。在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上：第一单体构建体包含AMM1、SMM1、CM1和CP1；第二单体构建体包含AMM2、SMM2、CM2和CP2，并且第三单体构建体包含AMM3、SMM3、CM3和CP3。在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上：第一单体构建体包含SMM1、CM1、CP1、CM4和AMM1，第二单体构建体包含SMM2、CM2、CP2、CM5和AMM2，并且第三单体构建体包含SMM3、CM3、CP3、CM6和AMM3。在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上：第一单体构建体包含CP1、CM1、AMM1和SMM1；第二单体构建体包含CP2、CM2、AMM2和SMM2；并且第三单体构建体包含CP3、CM3、AMM3和SMM3。在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上：第一单体构建体包含CP1、CM1、SMM1和AMM1；第二单体构建体包含CP2、CM2、SMM2和AMM2；并且第三单体构建体包含CP3、CM3、SMM3和AMM3。
在一些实施方案中，在非活性状态下，ACC的特征在于相较于CP1、CP2、CP3或其三聚体中的至少一者的活性的对照水平，具有降低的CP1、CP2、CP3或其三聚体中的至少一者的活性的水平。在一些实施方案中，ACC的特征在于相较于不包含空间掩蔽部分或亲和掩蔽部分的CP1、CP2和CP3的对照三聚体的活性，CP1、CP2和CP3的三聚体的活性降低至少2倍、5倍、10倍、500倍、103倍、104倍、105倍或106倍。在一些实施方案中，活性是疱疹病毒进入介体(HVEM)的活化。在一些实施方案中，活性是淋巴毒素β受体的活化。在一些实施方案中，活性是疱疹病毒进入介体(HVEM)的活化和淋巴毒素β受体的活化。在一些实施方案中，CP1、CP2和CP3的对照三聚体由ACC的活化产生。
在一些实施方案中，第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体是相同的。在一些实施方案中，ACC不包含除CP1、CP2和CP3以外的促进三聚体形成的任何结构域。在一些实施方案中，ACC不包含共价连接第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体的除CP1、CP2和CP3以外的任何结构域。在一些实施方案中，ACC不包含卷曲螺旋结构域、Fc结构域，或能够形成二硫键的除CP1、CP2或CP3以外的结构域。在一些实施方案中，ACC不包含肿瘤定向分子(例如ACC不包含识别癌细胞上发现的抗原的Fab或scFv片段)。在一些实施方案中，CP1、CP2和CP3是相同的并且各自包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体是相同的并且每个单体包含：SEQ ID NO:54的氨基酸序列；和包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列的AMM；和包含白蛋白的SMM。
在另一个方面，本公开提供了一种可活化细胞因子构建体(ACC)，所述可活化细胞因子构建体包含：第一单体构建体，所述第一单体构建体包含第一细胞因子蛋白(CP1)、第一可裂解部分(CM1)和第一亲和掩蔽部分(AMM1)，其中所述CM1位于所述CP1与所述AMM1之间；第二单体构建体，所述第二单体构建体包含第二细胞因子蛋白(CP2)、第二可裂解部分(CM2)和第二亲和掩蔽部分(AMM2)，其中所述CM2位于所述CP2与所述AMM2之间；和第三单体构建体，所述第三单体构建体包含第三细胞因子蛋白(CP3)、第三可裂解部分(CM3)和第三亲和空间掩蔽部分(AMM3)，其中所述CM3位于所述CP3与所述AMM3之间，其中所述CP1、所述CP2和所述CP3彼此结合，从而形成所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体的三聚体。
在另一个方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含本文中的ACC。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。
在另一个方面，本公开提供了一种容器、小瓶、注射器、注射笔或药盒，所述容器、小瓶、注射器、注射笔或药盒包括至少一次剂量的本文中的组合物。
在另一个方面，本公开提供了一种编码多肽的核酸，所述多肽包含本文中的ACC的第一单体构建体、第二单体构建体或第三单体构建体中的至少一者。在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:9、11、13、25、31、41、43、45或47中的任一者的序列。
在另一个方面，本公开提供了一种核酸组，所述核酸组一起编码包含本文中的ACC中的第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体的多肽。
在另一个方面，本公开提供了一种载体，所述载体包含本文中的核酸或核酸组。
在另一个方面，本公开提供了一种细胞，所述细胞包含本文中的核酸或载体。在一些方面，细胞是哺乳动物细胞。
在另一个方面，本公开提供了一种有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文中的ACC或组合物。在一些实施方案中，受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在一些实施方案中，所述方法还包括施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
在另一个方面，本公开提供了一种产生ACC的方法，所述方法包括：在足以产生所述ACC的条件下在液体培养基中培养权利要求61所述的细胞；以及从所述细胞或所述液体培养基回收所述ACC。在一些实施方案中，所述方法还包括使用亲和色谱法纯化所回收的ACC。在一些实施方案中，所述方法还包括将所回收的ACC配制成药物组合物。
附图说明
图1A-1H显示了根据本公开的一些实施方案的示例性可活化细胞因子构建体。图1A-1B说明了利用人血清白蛋白(HSA)作为空间掩蔽部分的示例性细胞因子构建体。图1C-1D说明了利用肽掩蔽部分的示例性细胞因子构建体。图1E-1H说明了利用空间掩蔽部分和肽掩蔽部分两者的示例性细胞因子构建体。图1E-1F说明了具有偶联于细胞因子组分的不同侧的空间掩蔽部分和亲和掩蔽部分的示例性细胞因子构建体。图1G-1H说明了具有偶联于细胞因子组分的同一侧的空间掩蔽部分和亲和掩蔽部分的示例性细胞因子构建体。
图2A-2B显示了将HSA空间掩蔽部分添加至LIGHT会降低疱疹病毒进入介体(HVEM)报告体测定和基于淋巴毒素β受体细胞的测定(A375 IL-8ELISA)两者中的LIGHT信号传导活性。
图3A-3B显示了将可裂解肽掩蔽物添加至LIGHT会降低HVEM报告体测定和A375IL-8ELISA两者中的LIGHT信号传导活性。
图4A-4C显示了将可裂解肽掩蔽物添加至LIGHT-HSA的N末端进一步降低HVEM报告体测定和A375 IL-8ELISA两者中的LIGHT信号传导活性。
图5A-5B显示了经单掩蔽和双重掩蔽的LIGHT可活化细胞因子构建体在HVEM报告体测定和A375 IL-8ELISA中的体外活性。
图6A和图6B显示了额外ACC的体外活性。
图7A-7D显示了小鼠-人类交叉反应性LIGHT可活化细胞因子构建体的体外活性。
图8A-8B显示了通过HVEM测定所确定的ProC1486、ProC1487和ProC2076的活性。
图9显示了在LIGHT的C末端最末端部分经可裂解HSA结构域工程改造的人类LIGHTACC ProC1491和在LIGHT的C末端最末端部分经His标签工程改造的人类LIGHT ProC1189的肿瘤生长抑制概况。
图10A-10B显示了ProC1486和ProC1487在MC38同基因小鼠模型中的抗肿瘤活性。
图11A-11B显示了在MC38同基因小鼠模型中在处理开始后第6天，以单剂形式或与抗PD-1抗体组合给药的ProC1487能够增加肿瘤微环境中CD8+T细胞的水平(图11A)以及促进由CD8+T细胞产生Th1细胞因子(IFNγ、TNFα)(图11B)。
具体实施方式
本文提供了三聚可活化细胞因子构建体(ACC)，所述三聚可活化细胞因子构建体包括三个单体构建体的三聚体。单体构建体中的每一者包括细胞因子，所述细胞因子可以彼此结合并且形成三聚体(例如同三聚体或异三聚体)。在活化后，活性细胞因子产物保持三聚形式。
单体构建体中的每一者还可以包含一个或多个掩蔽部分，所述掩蔽部分经由一个或多个可裂解部分与细胞因子偶联。在一些实施方案中，掩蔽部分可以是不结合至细胞因子，但在非活性状态下经由空间位阻减少、抑制或干扰细胞因子与其结合配偶体(例如配体或受体)之间的结合的空间掩蔽部分。在一些实施方案中，掩蔽部分可以是特异性结合至细胞因子，并且在非活性状态下减少、抑制或干扰细胞因子与其结合配偶体之间的结合的亲和掩蔽部分。在一些实施方案中，三聚ACC的每个单体构建体包含空间掩蔽部分。在一些实例中，每个单体构建体可以经双重掩蔽并且包括空间掩蔽部分和亲和掩蔽部分两者。在此类单体构建体中，空间掩蔽部分和亲和掩蔽部分可以偶联于细胞因子的不同侧，其中每个掩蔽部分偶联于具有其自身的可裂解部分的细胞因子。或者，在单体构建体中，空间掩蔽部分和亲和掩蔽部分可以在细胞因子的同一侧上。在此类情况下，掩蔽部分可以经由一个可裂解部分(例如位于细胞因子与更接近细胞因子的掩蔽部分之间)与细胞因子偶联。
在活性状态下(例如当ACC暴露于使可裂解部分裂解的蛋白酶时)，一个或多个掩蔽部分可以从细胞因子中释放，产生具有基本上恢复的活性的细胞因子产物。在活性状态下，细胞因子可以呈三聚形式。ACC可以被设计为在暴露于患病组织后选择性活化，而在正常组织中不活化。举例来说，ACC可以被设计为具有一个或多个由蛋白酶裂解的可裂解部分(CM)。相对于健康组织，裂解一个或多个CM的一种或多种蛋白酶可以在患病组织(例如肿瘤组织)中过度表达。ACC可以在一个或多个CM裂解后活化，以使细胞因子可以在患病组织中(例如在肿瘤微环境中)发挥其活性，而在健康组织的情形下，细胞因子活性减弱。因此，本文所提供的ACC可以提供相对于传统细胞因子治疗剂降低的毒性，使得能够实现细胞因子的更高有效剂量并且/或者增加细胞因子的治疗窗。因此，这些化合物具有赋予基于细胞因子的疗法的益处的潜力，同时与某些基于细胞因子的疗法相关的毒性可能较少。
本文还提供了相关中间体、组合物、药盒、核酸、载体和重组细胞，以及相关方法，包括使用本文所描述的任何可活化细胞因子构建体的方法和产生本文所描述的任何可活化细胞因子构建体的方法。本文提供了通过本文所描述的任一方法产生的ACC。本文还提供了包含本文所描述的任一ACC的组合物。本文还提供了本文所描述的任一组合物的组合物，其中所述组合物是药物组合物。本文还提供了包含至少一次剂量的本文所描述的任一组合物的药盒。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。本文描述了用于本发明中的方法和材料；还可使用本领域中已知的其它适合的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，并且不意图是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目以及其它参考文献都通过引用全部并入本文。在冲突的情况下，将以包括定义的本说明书为准。
根据以下详细描述和附图以及根据权利要求，本发明的其它特征和优势将是显而易见的。
术语“一个(种)(a/an)”是指所述冠词的一个(种)或多个(种)(即至少一个(种))语法对象。举例来说，“一个(种)细胞”涵盖一个(种)或多个(种)细胞。
如本文所用，术语“约”和“近似”在用于修饰以数值或范围指定的量时指示所述数值以及为本领域技术人员所知的与所述值的合理偏差。举例来说，当适当时，±20％、±10％或±5％在所叙述值的预期含义内。
浓度、量和其它数值数据可以范围格式在本文中表示或呈现。应了解，此种范围格式仅为了方便和简洁而使用，因此应灵活解释为不仅包括明确叙述为范围的限值的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单个数值或子范围，就好像每个数值和子范围被明确叙述一样。作为说明，“约0.01至2.0”的数值范围应解释为不仅包括明确叙述的约0.01至约2.0的值，而且还包括所指示范围内的单个值和子范围。因此，这个数值范围内包括单个值诸如0.5、0.7和1.5，以及子范围诸如0.5至1.7、0.7至1.5和1.0至1.5等。此外，无论范围的宽度或所描述的特征如何，此种解释都应适用。另外，应注意，除非另外指定，否则所有百分比都以重量计。
在理解本公开的范围时，如本文所用的术语“包括”或“包含”及其派生词意图是指定所陈述的特征、要素、组分、基团、整数和/或步骤的存在，但不排除其它未陈述的特征、要素、组分、基团、整数和/或步骤的存在的开放式术语。前述内容也适用于具有类似含义的词语，诸如术语“包括”、“具有”及其派生词。如本文所用的术语“由……组成”及其派生词意图是指定所陈述的特征、要素、组分、基团、整数和/或步骤的存在，但排除其它未陈述的特征、要素、组分、基团、整数和/或步骤的存在的封闭式术语。如本文所用的术语“基本上由……组成”意图指定所陈述的特征、要素、组分、基团、整数和/或步骤以及不实质上影响特征、要素、组分、基团、整数和/或步骤的一种或多种基本和新颖特征的那些特征、要素、组分、基团、整数和/或步骤的存在。应了解，提及这些过渡术语(即“包含”、“由……组成”或“基本上由……组成”)中的任一者都为替换成未具体使用的任何其它过渡术语提供直接支持。举例来说，由于这个定义针对在整篇本公开中公开的任何要素，所以将术语从“包含”修改为“基本上由……组成”或“由……组成”将得到直接支持。基于这个定义，本文公开或通过引用并入的任何要素都可包括在要求保护的发明中或从要求保护的发明排除。
如本文所用，为了方便起见，多个化合物、要素或步骤可呈现在共同的清单中。然而，这些清单应解释为好像清单的每个成员被单独地标识为单独和独特成员一样。因此，仅基于它们在共同组中呈现而没有相反指示，这种清单的单个成员不应解释为同一清单的任何其它成员的事实上的等效物。
此外，某些分子、构建体、组合物、要素、部分、赋形剂、病症、疾患、性质、步骤等可在一个具体实施方案或方面的上下文中或在本公开的单独段落或章节中讨论。应了解，这仅是为了方便和简洁，并且任何这种公开内容都可同样适用于在本公开和权利要求中的任何地方所见的任何其它实施方案或方面，并且意图与所述任何其它实施方案或方面组合，其都在申请日形成本申请和要求保护的发明。举例来说，关于构建体、组合物或方法描述的构建体、分子、方法步骤、药盒或组合物的清单意图并且确实为与本公开的任何其它部分中描述的构建体、组合物、制剂和方法相关的实施方案找到直接支持，即使这些方法步骤、活性剂、药盒或组合物未在所述实施方案或方面的上下文或章节中重新列出。
除非另外指定，否则“编码蛋白质的核酸序列”包括是彼此的简并形式，因此编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
当涉及多肽一级氨基酸序列中第一结构域或序列相对于第二结构域或序列的位置时，术语“N末端定位”意指相比于所述第二结构域或序列，所述第一结构域或序列位于更靠近所述多肽一级氨基酸序列的N末端处。在一些实施方案中，在第一结构域或序列与第二结构域或序列之间可存在额外序列和/或结构域。
当涉及多肽一级氨基酸序列中第一结构域或序列相对于第二结构域或序列的位置时，术语“C末端定位”意指相比于所述第二结构域或序列，所述第一结构域或序列位于更靠近所述多肽一级氨基酸序列的C末端处。在一些实施方案中，在第一结构域或序列与第二结构域或序列之间可存在额外序列和/或结构域。
术语“外源性”是指从细胞、组织或生物体的外部引入或来源于细胞、组织或生物体的外部的任何材料不由它被引入其中的前述细胞、组织或生物体产生或不来源于它被引入其中的前述细胞、组织或生物体。
术语“转导”、“转染”或“转化”是指将外源性核酸引入或转移至细胞中所采用的过程。“经转导”、“经转染”或“经转化”细胞(例如哺乳动物细胞)是已用外源性核酸(例如载体)转导、转染或转化的细胞，所述外源性核酸包括编码本文所描述的任何可活化细胞因子构建体的外源性核酸。
术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或它们的组合。除非具体限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸与参考核苷酸具有类似结合性质。除非另外指示，否则特定核酸序列还隐含地涵盖互补序列以及明确指示的序列。在本文所描述的任何核酸的一些实施方案中，核酸是DNA。在本文所描述的任何核酸的一些实施方案中，核酸是RNA。
修饰可以通过本领域中已知的标准技术诸如定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)介导的诱变来引入核苷酸序列中。保守性氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。本领域中已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括：具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)、不带电荷的极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)、亲水性氨基酸(例如精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)、疏水性氨基酸(例如丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)。其它氨基酸家族包括：脂族-羟基氨基酸(例如丝氨酸和苏氨酸)、酰胺家族(例如天冬酰胺和谷氨酰胺)、脂族家族(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、芳族家族(例如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)。
如本文所用，短语“特异性结合”或“与……免疫反应”意指蛋白质或蛋白质复合物与一个或多个结合配偶体反应，并且不与其它多肽反应，或以低得多的亲和力(例如约或大于10-6M)结合。
术语“治疗”是指改善病症的至少一种症状。在一些实施方案中，所治疗的病症是癌症，并且目的是改善癌症的至少一种症状。
可活化细胞因子构建体
在一个方面，本公开提供了可活化细胞因子构建体(ACC)，所述可活化细胞因子构建体包括三个单体构建体，所述三个单体构建体经由它们的细胞因子组分形成三聚体。单体构建体中的每一者可以包含细胞因子蛋白(CP)、一个或多个掩蔽部分(MM)和一个或多个位于MM与CP之间的可裂解部分(CM)。在一些实施方案中，MM可以是空间掩蔽部分(SMM)。在一些实施方案中，MM可以是亲和掩蔽部分(AMM)。在一些实施方案中，MM可以包括SMM和AMM两者。在一些实施方案中，ACC在形成三聚体的单体单元之间不包括任何共价键。在一些实施方案中，ACC不包括促进三聚体形成的除细胞因子本身以外的任何结构域。在一些实施方案中，ACC不包括增强三聚体形成的除细胞因子本身以外的任何结构域。举例来说，在一些实施方案中，ACC可能不包含共价连接第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体的除CP1、CP2和CP3以外的任何结构域。在一些实例中，ACC不包含卷曲螺旋结构域、Fc结构域，或能够在单独的单体间形成二硫键的除CP1、CP2或CP3以外的结构域。
在活化后，CM可以被裂解并且MM可以从ACC中释放，从而得到活性细胞因子产物。活性细胞因子产物可以保持三聚形式，例如包含由三个CP形成的三聚体。
在一个具体实施方案中，本文提供了一种可活化细胞因子构建体(ACC)，所述可活化细胞因子构建体包括第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体，其中：
所述第一单体构建体包含第一细胞因子蛋白(CP1)、第一可裂解部分(CM1)和第一空间掩蔽部分(SMM1)，其中所述CM1位于所述CP1与所述SMM1之间；
所述第二单体构建体包含第二细胞因子蛋白(CP2)、第二可裂解部分(CM2)和第二空间掩蔽部分(SMM2)，其中所述CM2位于所述CP2与所述SMM2之间；并且
所述第三单体构建体包含第三细胞因子蛋白(CP3)、第三可裂解部分(CM3)和第三空间掩蔽部分(SMM3)，其中所述CM3位于所述CP3与所述SMM3之间。
CP1、CP2和CP3可以彼此结合(例如通过共价或非共价键合)，从而形成第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体的三聚体。在一些实施方案中，SMM1、SMM2和SMM3中的每一者是球状分子。在一个实例中，SMM1、SMM2和SMM3是相同的球状分子(例如人血清白蛋白)。在一些实例中，CP1、CP2和CP3是肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14,，也被称为LIGHT)。
ACC可以包含在本文所描述的两个组分之间的接头。在一些实例中，第一单体构建体包含至少一个接头，例如安置在CP1与CM1之间的接头L1和/或在CM1与SMM1之间的接头L2。在一些实例中，第二单体构建体包含至少一个接头，例如安置在CP2与CM2之间的接头L3和/或在CM2与SMM2之间的接头L4。在一些实例中，第三单体构建体包含至少一个接头，例如安置在CP3与CM3之间的接头L5和/或在CM3与SMM3之间的接头L6。
在一些实施方案中，第一单体构建体还可以包含第一亲和掩蔽部分(AMM1)和位于AMM1与CP1之间的第四可裂解部分(CM4)，第二单体构建体还可以包含第二亲和掩蔽部分(AMM2)和位于AMM2与CP2之间的第五可裂解部分(CM5)，并且第三单体构建体还可以包含第三亲和掩蔽部分(AMM3)和位于AMM3与CP3之间的第六可裂解部分(CM6)。
在一些实例中，第一单体构建体还可以包含在AMM1与CM4之间的接头L7和/或在CM4与CP1之间的接头L8。在一些实例中，第二单体构建体还包含在AMM2与CM5之间的接头L9和/或在CM5与CP2之间的接头L10。在一些实例中，第三单体构建体还可以包含在AMM3与CM6之间的接头L11和/或在CM6与CP3之间的接头L12。
在另一个具体实施方案中，本文提供了一种可活化细胞因子构建体(ACC)，所述可活化细胞因子构建体包括第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体，其中
第一单体构建体包含第一细胞因子蛋白(CP1)、第一可裂解部分(CM1)和第一亲和掩蔽部分(AMM1)，其中所述CM1位于所述CP1与所述AMM1之间；
第二单体构建体包含第二细胞因子蛋白(CP2)、第二可裂解部分(CM2)和第二亲和掩蔽部分(AMM2)，其中所述CM2位于所述CP2与所述AMM2之间；并且
第三单体构建体包含第三细胞因子蛋白(CP3)、第三可裂解部分(CM3)和第三亲和空间掩蔽部分(AMM3)，其中所述CM3位于所述CP3与所述AMM3之间。
CP1、CP2和CP3可以彼此结合，从而形成第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体的三聚体。
ACC还可以包含一个或多个间隔物，所述间隔物是在成熟ACC的游离末端，例如在信号肽与成熟ACC的N末端之间掺入的氨基酸残基或肽。在一些方面，间隔物(或“头部”)可以含有谷氨酰胺(Q)残基。在一些方面，间隔物中的残基使氨基肽酶和/或外肽酶作用最小化以防止N末端氨基酸裂解。说明性和非限制性间隔物氨基酸序列可以包含以下任何示例性氨基酸序列或由以下任何示例性氨基酸序列组成：QGQSGS(SEQ ID NO:76)；GQSGS(SEQID NO:1)；QSGS(SEQ ID NO:70)；SGS；GS；S；QGQSGQG(SEQ ID NO:71)；GQSGQG(SEQ ID NO:72)；QSGQG(SEQ ID NO:73)；SGQG(SEQ ID NO:74)；GQG；QG；G；QGQSGQ(SEQ ID NO:80)；GQSGQ(SEQ ID NO:136)；QSGQ(SEQ ID NO:137)；QGQSG(SEQ ID NO:138)；QGQS(SEQ ID NO:139)；SGQ；GQ；和Q。在一些实施方案中，间隔物序列可以省略。
在关于细胞因子构建体使用时，术语“可活化”是指细胞因子构建体展现一种或多种活性的第一水平，接着暴露于导致至少一个可裂解部分裂解的条件导致产生展现所述一种或多种活性的第二水平的细胞因子构建体，其中所述第二活性水平大于所述第一活性水平。活性的非限制性实例包括本文所描述或本领域中已知的细胞因子(例如TNF或TNF超家族成员)的任何示例性活性。
术语“掩蔽部分”和“MM”在本文中可互换用于指代降低或抑制细胞因子蛋白的一种或多种活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，MM可以是空间掩蔽部分(SMM)，所述空间掩蔽部分并不特异性结合至CP，而是经由空间位阻干扰CP与其结合配偶体的结合。举例来说，SMM可以位于未裂解的ACC中，使得ACC的三级或四级结构经由位于SMM与CP之间和/或基于电荷的相互作用而允许SMM掩蔽CP，从而将SMM保持在适当位置以干扰结合配偶体接近CP。在一些实施方案中，MM可以是亲和掩蔽部分(AMM)，所述亲和掩蔽部分与CP相互作用，由此减少、抑制或干扰CP与其结合配偶体之间的相互作用。在一些实施方案中，AMM可以是肽掩蔽物(“PM”)。
术语“肽掩蔽物”和“PM”在本文中可互换用于指代降低或抑制细胞因子蛋白的一种或多种活性的少于50个氨基酸的氨基酸序列。PM可结合至细胞因子，并且限制细胞因子与其受体的相互作用。在一些实施方案中，PM的长度是至多40个氨基酸。在优选实施方案中，PM的长度是至多20个氨基酸。在一些实施方案中，PM的长度是至多19、18、17、16或15个氨基酸。
如本文所用，术语“掩蔽效率”是指未裂解ACC的活性(例如EC50)除以对照细胞因子的活性，其中所述对照细胞因子可以是ACC的裂解产物或用作ACC的CP的细胞因子。至少一种CP活性的水平降低的ACC具有大于10的掩蔽效率。在一些实施方案中，本文所描述的ACC具有大于10、大于100、大于1000或大于5000的掩蔽效率。用于确定掩蔽效率的说明性测定包括实施例1中所描述的那些测定。
术语“可裂解部分”和“CM”在本文中可互换用于指代其氨基酸序列包含序列特异性蛋白酶的底物的肽。适用于本文中的ACC的可裂解部分包括本领域已知的任何蛋白酶底物。示例性可裂解部分在以下更详细描述。
如本文所用，多肽，诸如细胞因子或空间掩蔽部分(例如白蛋白，诸如人血清白蛋白)，可以是野生型多肽(例如天然存在的多肽)或所述野生型多肽的变体。变体可以是通过对野生型多肽进行一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失和/或添加来修饰的多肽，条件是所述变体保留野生型多肽的基本功能或活性。在一些实例中，与野生型多肽相比，变体可具有改变的(例如增加的或降低的)功能或活性。在一些方面，变体可以是野生型多肽的功能性片段。术语“功能性片段”意指多肽(例如细胞因子)的序列可包括比全长多肽序列少的氨基酸，但具有足够的多肽链长度以赋予活性(例如细胞因子活性)。
如本文所用，术语“接头”是指其氨基酸序列不是蛋白酶的底物的肽。接头可以包含连接ACC中的两个组分的氨基酸序列的链段。示例性接头在以下更详细描述。
第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体中的每一者中的组分的组织可以在每个单体构建体中按相同的顺序排列。在一些实施方案中，第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体中的每一者中的组分的组织可以在每个单体构建体中按不同的顺序排列。在一些实例中，每个单体构建体中的相应组分(例如CP1、CP2和CP3；或SMM1、SMM2和SMM3；CM1、CM2和CM3；AMM1、AMM2和AMM3；或CM4、CM5、CM6)在例如分子量、大小、氨基酸序列等方面可以是相同的。在一些实例中，每个单体构建体中的相应组分(例如CP1、CP2和CP3；或SMM1、SMM2和SMM3；CM1、CM2和CM3；AMM1、AMM2和AMM3；或CM4、CM5、CM6)在例如分子量、大小、氨基酸序列等方面可以是不同的。因此，三聚ACC可以具有对称或不对称单体构建体组分。
在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上，第一单体构建体包含CP1、CM1和SMM1，第二单体构建体包含CP2、CM2和SMM2，并且第三单体构建体包含CP3、CM3和SMM3。此类ACC的一个实例示于图1A中。
在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上，第一单体构建体包含SMM1、CM1和CP1，第二单体构建体包含SMM2、CM2和CP2，并且第三单体构建体包含SMM3、CM3和CP3。此类ACC的一个实例示于图1B中。
在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上，第一单体构建体包含AMM1、CM1和CP1，第二单体构建体包含AMM2、CM2和CP2，并且第三单体构建体包含AMM3、CM3和CP3。此类ACC的一个实例示于图1C中。
在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上，第一单体构建体包含CP1、CM1和AMM1，第二单体构建体包含CP2、CM2和AMM2，并且第三单体构建体包含CP3、CM3和AMM3。此类ACC的一个实例示于图1D中。
在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上，第一单体构建体包含AMM1、CM4、CP1、CM1和SMM1，第二单体构建体包含AMM2、CM5、CP2、CM2和SMM2，并且第三单体构建体包含AMM3、CM6、CP3、CM3和SMM3。此类ACC的一个实例示于图1E中。
在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上，第一单体构建体包含SMM1、CM1、CP1、CM4和AMM1，第二单体构建体包含SMM2、CM2、CP2、CM5和AMM2，并且第三单体构建体包含SMM3、CM3、CP3、CM6和AMM3。此类ACC的一个实例示于图1F中。
在一些实施方案中，在单体构建体中，AMM和SMM相对于CP可以在同一侧上。AMM和SMM可以与CP偶联，其中CM在CP与更接近CP的MM之间。CM的裂解可以从CP中释放AMM和SMM两者，从而得到活性细胞因子产物。
在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上，第一单体构建体包含CP1、CM1、AMM1和SMM1；第二单体构建体包含CP2、CM2、AMM2和SMM2；并且第三单体构建体包含CP3、CM3、AMM3和SMM3。此类ACC的一个实例示于图1H中。
在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上，第一单体构建体包含CP1、CM1、SMM1和AMM1；第一单体构建体包含CP2、CM2、SMM2和AMM2；并且第一单体构建体包含CP3、CM3、SMM3和AMM3。
在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上，第一单体构建体包含SMM1、AMM1、CM1和CP1；第二单体构建体包含SMM2、AMM2、CM2和CP2，并且第三单体构建体包含SMM3、AMM3、CM3和CP3。此类ACC的一个实例示于图1G中。
在一些实施方案中，在N末端至C末端方向上，第一单体构建体包含AMM1、SMM1、CM1和CP1；第二单体构建体包含AMM2、SMM2、CM2和CP2，并且第三单体构建体包含AMM3、SMM3、CM3和CP3。
在一些实施方案中，ACC的特征可在于相较于CP1、CP2、CP3或其三聚体中的至少一者的活性的对照水平，CP1、CP2、CP3或其三聚体中的至少一者的活性降低。在一些实施方案中，对照水平可以是重组CP1、CP2、CP3或其三聚体(例如可商购获得的重组CP1、CP2、CP3或其三聚体，重组野生型CP1、CP2、CP3或其三聚体等)的活性水平。在一些实施方案中，对照水平可以是ACC的经裂解(活化)形式的活性水平。
在一些实施方案中，可以使用表面等离子体共振(例如在25℃下在磷酸盐缓冲盐水中进行)来确定CP1、CP2、CP3或其三聚体对其结合配偶体(例如同源受体)的结合亲和力(KD)。在某些实施方案中，活性可以是疱疹病毒进入介体(HVEM)活化的水平(例如，如使用下文实施例部分中描述的基于HVEM细胞的测定所评价)。在一些实施方案中，活性可以是当啮合A375人类黑素瘤细胞系的表面上的淋巴毒素β受体时刺激IL-8产生的能力(例如，如使用下文实施例部分中描述的基于淋巴毒素β受体细胞的测定所评价)。在一些实例中，ACC显示相较于CP1、CP2和CP3的对照三聚体，疱疹病毒进入介体(HVEM)活化中的活性降低。
在一些实例中，ACC显示相较于CP1、CP2和CP3的对照三聚体，淋巴毒素β受体活化中的活性降低。
在一些实例中，ACC显示相较于CP1、CP2和CP3的对照三聚体，疱疹病毒进入介体(HVEM)活化和淋巴毒素β受体活化中的活性降低。在一些实例中，the CP1、CP2和CP3的对照三聚体由ACC的活化产生。
在一些实施方案中，ACC的特征在于相较于对照水准，CP1、CP2、CP3或其三聚体中的至少一者的活性降低至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、104倍、105倍、106倍、107倍或108倍。
在一些实施方案中，ACC的特征在于相较于对照水准，CP1、CP2、CP3或其三聚体中的至少一者的活性降低1至20倍、降低200至500倍、降低300至500倍、降低400至500倍、降低500至600倍、降低600至700倍、降低150至1000倍、降低100至1500倍、降低200至1500倍、降低300至1500倍、降低400至1500倍、降低500至1500倍、降低1000至1500倍、降低100至1000倍、降低200至1000倍、降低300至1000倍、降低400至1000倍、降低500至1000倍、降低100至500倍、降低20至50倍、降低30至50倍、降低40至50倍、降低100至400倍、降低200至400倍或降低300至400倍、降低100至300倍、降低200至300倍或降低100至200倍。
在一些实施方案中，CP1、CP2、CP3或其三聚体的活性的对照水准是从在由一种或多种蛋白酶裂解CM之后的ACC(“裂解产物”)中释放的CP1、CP2、CP3或其三聚体的活性。在一些实施方案中，CP1、CP2、CP3或其三聚体的至少一种活性的对照水准是相应野生型成熟细胞因子(例如重组野生型成熟细胞因子)或其三聚体的活性。
在一些实施方案中，ACC与蛋白酶一起孵育产生一种或多种活化的细胞因子产物，其中CP1、CP2、CP3或其三聚体的活性大于完整ACC(未裂解)的CP1、CP2、CP3或其三聚体的一种或多种活性。在一些实施方案中，CP1、CP2、CP3或其三聚体的活性比ACC的CP1、CP2、CP3或其三聚体的活性大了至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍或1000倍、104倍、105倍、106倍、107倍或108倍。在一些实施方案中，CP1、CP2、CP3或其三聚体的活性比ACC的CP1、CP2、CP3或其三聚体的活性大1至20倍、大200至500倍、大300至500倍、大400至500倍、大500至600倍、大600至700倍、大150至1000倍、大100至1500倍、大200至1500倍、大300至1500倍、大400至1500倍、大500至1500倍、大1000至1500倍、大100至1000倍、大200至1000倍、大300至1000倍、大400至1000倍、大500至1000倍、大100至500倍、大20至50倍、大30至50倍、大40至50倍、大100至400倍、大200至400倍或大300至400倍、大100至300倍、大200至300倍或大100至200倍。
在一些实施方案中，第一单体构建体、第二单体构建体和/或第三单体构建体中的每一者可以独立地包含总计约150个氨基酸至约850个氨基酸、约150个氨基酸至约800个氨基酸、约150个氨基酸至约750个氨基酸、约150个氨基酸至约700个氨基酸、约150个氨基酸至约650个氨基酸、约150个氨基酸至约600个氨基酸、约150个氨基酸至约550个氨基酸、约150个氨基酸至约500个氨基酸、约150个氨基酸至约450个氨基酸、约150个氨基酸至约400个氨基酸、约150个氨基酸至约350个氨基酸、约150个氨基酸至约300个氨基酸、约150个氨基酸至约250个氨基酸、约150个氨基酸至约200个氨基酸、约200个氨基酸至约850个氨基酸、约200个氨基酸至约800个氨基酸、约200个氨基酸至约750个氨基酸、约200个氨基酸至约700个氨基酸、约200个氨基酸至约650个氨基酸、约200个氨基酸至约600个氨基酸、约200个氨基酸至约550个氨基酸、约200个氨基酸至约500个氨基酸、约200个氨基酸至约450个氨基酸、约200个氨基酸至约400个氨基酸、约200个氨基酸至约350个氨基酸、约200个氨基酸至约300个氨基酸、约200个氨基酸至约250个氨基酸、约250个氨基酸至约800个氨基酸、约250个氨基酸至约750个氨基酸、约250个氨基酸至约700个氨基酸、约250个氨基酸至约650个氨基酸、约250个氨基酸至约600个氨基酸、约250个氨基酸至约550个氨基酸、约250个氨基酸至约500个氨基酸、约250个氨基酸至约450个氨基酸、约250个氨基酸至约400个氨基酸、约250个氨基酸至约350个氨基酸、约250个氨基酸至约300个氨基酸、约300个氨基酸至约800个氨基酸、约300个氨基酸至约750个氨基酸、约300个氨基酸至约700个氨基酸、约300个氨基酸至约650个氨基酸、约300个氨基酸至约600个氨基酸、约300个氨基酸至约550个氨基酸、约300个氨基酸至约500个氨基酸、约300个氨基酸至约450个氨基酸、约300个氨基酸至约400个氨基酸、约300个氨基酸至约350个氨基酸、约350个氨基酸至约800个氨基酸、约350个氨基酸至约750个氨基酸、约350个氨基酸至约700个氨基酸、约350个氨基酸至约650个氨基酸、约350个氨基酸至约600个氨基酸、约350个氨基酸至约550个氨基酸、约350个氨基酸至约500个氨基酸、约350个氨基酸至约450个氨基酸、约350个氨基酸至约400个氨基酸、约400个氨基酸至约800个氨基酸、约400个氨基酸至约750个氨基酸、约400个氨基酸至约700个氨基酸、约400个氨基酸至约650个氨基酸、约400个氨基酸至约600个氨基酸、约400个氨基酸至约550个氨基酸、约400个氨基酸至约500个氨基酸、约400个氨基酸至约450个氨基酸、约450个氨基酸至约800个氨基酸、约450个氨基酸至约750个氨基酸、约450个氨基酸至约700个氨基酸、约450个氨基酸至约650个氨基酸、约450个氨基酸至约600个氨基酸、约450个氨基酸至约550个氨基酸、约450个氨基酸至约500个氨基酸、约500个氨基酸至约850个氨基酸、约500个氨基酸至约800个氨基酸、约500个氨基酸至约750个氨基酸、约500个氨基酸至约700个氨基酸、约500个氨基酸至约650个氨基酸、约500个氨基酸至约600个氨基酸、约500个氨基酸至约550个氨基酸、约550个氨基酸至约850个氨基酸、约550个氨基酸至约800个氨基酸、约550个氨基酸至约750个氨基酸、约550个氨基酸至约700个氨基酸、约550个氨基酸至约650个氨基酸、约550个氨基酸至约600个氨基酸、约600个氨基酸至约850个氨基酸、约600个氨基酸至约800个氨基酸、约600个氨基酸至约750个氨基酸、约600个氨基酸至约700个氨基酸、约600个氨基酸至约650个氨基酸、约650个氨基酸至约850个氨基酸、约650个氨基酸至约800个氨基酸、约650个氨基酸至约750个氨基酸、约650个氨基酸至约700个氨基酸、约700个氨基酸至约850个氨基酸、约700个氨基酸至约800个氨基酸、约700个氨基酸至约750个氨基酸、约750个氨基酸至约800个氨基酸或约800个氨基酸至约850个氨基酸。
在一些实施方案中，ACC中的一个或多个单体构建体可以包含SEQ ID NO:8、10、12、24、30、40、42、44或46中的任一者的序列。在一些实施方案中，ACC中的一个或多个单体构建体可以包含与SEQ ID NO:8、10、12、24、30、40、42、44或46中的任一者至少80％(例如至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)同一的序列。在一些实施方案中，ACC中的三个单体构建体中的每一者是相同的，并且包含与SEQ ID NO.8、10、12、24、30、40、42、44或46中的任一者至少80％(例如至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)同一的序列。
在一些实施方案中，ACC中的一个或多个单体构建体可以由包含SEQ ID NO:9、11、13、25、31、41、43、45或47中的任一者的序列的核酸编码。
在一些实施方案中，ACC中的一个或多个单体构建体可以由包含与SEQ ID NO:9、11、13、25、31、41、43、45或47中的任一者至少80％(例如至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)同一的序列的核酸编码。
在一些方面，本公开提供了包含SEQ ID NO；9、11、13、25、31、41、43、45或47中的任一者的序列的核酸。在一些方面，本公开提供了包含与SEQ ID NO:9、11、13、25、31、41、43、45或47中的任一者至少80％(例如至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)同一的序列的核酸。在一些方面，本公开提供了一个或多个包含本文所描述的任何核酸的载体。
在一些方面，ACC中的一个或多个单体构建体可以包括此类序列，但不具有那些序列的信号序列。信号序列不受特定限制。信号序列的一些实例包括SEQ ID NO:78。
掩蔽部分(MM)
本文中的ACC可以包含一个或多个能够干扰CP与其结合配偶体(例如配体或受体)的结合的掩蔽部分(MM)。
MM可以是如本文所描述的空间掩蔽部分(SMM)或亲和掩蔽部分(AMM)。MM可以由CM和任选的一个或多个本文所描述的接头偶联于CP。在一些实施方案中，当ACC未被活化时，MM阻止CP进行靶标结合；但当ACC被活化时(当CM由蛋白酶裂解时)，MM不实质上或显著干扰CP与靶标的结合。
在ACC中，干扰CP的靶标结合的MM可以偶联于CP。或者，干扰CP的靶标结合的MM可以偶联于不是CP的ACC组分。举例来说，MM可以偶联于不同的CP。在任一种情况下，在可活化结构的三级或四级结构中，MM可以在允许MM掩蔽CP的位置中(例如在待掩蔽的CP的近端)。
在一些实施方案中，MM可以与CP相互作用，由此减少或抑制CP与其结合配偶体之间的相互作用。在一些实施方案中，MM可以包含CP的天然存在的结合配偶体的至少部分或全部氨基酸序列。举例来说，MM可以是天然存在的结合配偶体的片段。所述片段可以保留与天然存在的结合配偶体的至多95％、90％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、25％或20％核酸或氨基酸序列同源性。
在一些实施方案中，MM可能不特异性结合至CP，但仍经由非特异性相互作用，诸如空间位阻来干扰CP与其结合配偶体的结合。举例来说，MM可以位于ACC中，使得ACC的三级或四级结构允许MM经由基于电荷的相互作用掩蔽CP，由此将MM保持在适当位置以干扰结合配偶体接近CP。
在一些实施方案中，掩蔽部分(例如空间掩蔽部分，诸如白蛋白(例如HSA))可以将ACC稳定在灭活状态下。
在一些实例中，SMM可以是一种肽，其大小、结构、构象和/或在ACC中的位置阻止、抑制或干扰CP与其结合配偶体的结合。在一些实例中，SMM可以是球状蛋白，例如白蛋白，诸如卵白蛋白、人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)。在一个特定实施中，SMM可以是人血清白蛋白，例如SEQ ID NO:56。在一些实例中，SMM可以包含与SEQ ID NO:56至少80％(例如至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)同一的序列。
在一些实施方案中，AMM可以是CP的同源肽。举例来说，MM可以包含CP的表位、配体或受体或其片段的序列。在CP是TNFSF14的情况下，AMM可以是TNFSF14的受体或其一部分，例如SEQ ID NO:61。
如本文所用，术语“天然存在的”如适用于对象时，是指可以在自然界中发现所述对象的事实。举例来说，可以从自然界的来源中分离出并且未在实验室中由人工或以其它方式有意修饰的存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
在一些实施方案中，MM可以包含不是天然存在的或不含天然存在的结合配偶体或靶标蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，MM不是CP的天然结合配偶体。MM可以是CP的经修饰的结合配偶体，所述结合配偶体含有降低与CP结合的亲和力和/或亲合力的氨基酸变化。在一些实施方案中，MM可能不含或基本上不含与CP的天然结合配偶体的核酸或氨基酸同源性。在其它实施方案中，MM与CP的天然结合配偶体至多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％类似。
在一些实施方案中，MM与CP结合的离解常数至多是CP与靶标的离解常数。在一些实施方案中，MM可能不干扰CP结合至裂解状态下的靶标或与CP竞争结合至裂解状态下的靶标。
可以根据诸如干扰蛋白质与靶标的结合所需的最小氨基酸序列、目标靶标蛋白质-蛋白质结合对、CP的大小、接头的存在或不存在等因素来选择MM的结构性质。
在一些实施方案中，对于偶联的CP来说，MM是独特的。MM的实例包括被特异性筛选以结合CP或其片段的结合结构域的MM(例如亲和掩蔽物)。用于筛选MM以获得对于CP来说独特的MM和特异性和/或选择性结合结合配偶体/靶标的结合结构域的那些MM的方法在本文中提供，并且可以包括蛋白质展示方法。
如本文所用，术语“掩蔽效率”是指处于灭活状态的ACC的活性(例如EC50)除以对照抗体的活性，其中所述对照抗体可以是ACC的裂解产物或用作可活化靶标结合蛋白的CP的抗体或其片段。CP活性水平降低的ACC可以具有大于10的掩蔽效率。在一些实施方案中，本文所描述的可活化靶标结合蛋白可以具有大于10、100、1000或5000的掩蔽效率。
在一些实施方案中，MM可以是长度为约2至50个氨基酸的多肽。举例来说，MM可以是长度为2至40、2至30、2至20、2至10、5至15、10至20、15至25、20至30、25至35、30至40、35至45、40至50个氨基酸的多肽。举例来说，MM可以是长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸的多肽。在一些实例中，MM可以是长度大于50个氨基酸，例如100、200、300、400、500、600、700、800个或更多个氨基酸的多肽。
在一些实施方案中，在具有CP和干扰MM的ACC的非活性状态下，在CP的靶标存在下，当在例如US20200308243A1中所描述的体外免疫吸附测定中测量时，相较于不具有干扰MM的对应抗体的结合，不存在或基本上不存在CP与靶标的结合，或CP与其靶标的结合是至多0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％，持续至少0.1、0.5、1、2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。
CP对具有干扰MM的靶标或结合配偶体的结合亲和力可以比CP对其不具有干扰MM的结合配偶体的结合亲和力低了至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍，或比CP对其不存在干扰MM时的结合配偶体的结合亲和力低了5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍。
MM对其所掩蔽的CP的离解常数可以大于CP对靶标的离解常数。MM对经掩蔽的CP的离解常数可以比CP对靶标的离解常数大了至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。相反地，MM对经掩蔽的CP的结合亲和力可以低于CP对靶标的结合亲和力。MM对CP的结合亲和力可以比CP对靶标的结合亲和力低了至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。
在一些实施方案中，MM可以含有遗传编码氨基酸或遗传非编码氨基酸。遗传非编码氨基酸的实例是但不限于D-氨基酸、β-氨基酸和γ-氨基酸。在具体实施方案中，MM含有至多50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％或1％的遗传非编码氨基酸。
在一些实施方案中，一旦从ACC中释放并处于游离状态，MM可以具有生物活性或治疗作用，诸如结合能力。举例来说，游离肽可以与相同或不同的结合配偶体结合。在某些实施方案中，游离MM可以发挥治疗作用，从而为本文所公开的组合物提供次要功能。在一些实施方案中，一旦与ACC解偶联并处于游离状态，MM可以有利地不展现生物活性。举例来说，在一些实施方案中，处于游离状态的MM不在受试者中引发免疫反应。
适合的MM可以通过筛选程序从具有可变MM的候选可活化靶标结合蛋白的文库鉴定和/或进一步优化。举例来说，可以选择CP和CM以提供所需的酶/靶标组合，并且可以通过用以鉴定提供可活化表型的MM的下述筛选程序鉴定MM的氨基酸序列。举例来说，随机肽文库(例如包含2至40个氨基酸或更多个氨基酸的肽的文库)可以在本文所公开的筛选方法中用于鉴定适合的MM。
在一些实施方案中，对CP具有特异性结合亲和力的MM可以通过筛选程序来鉴定，所述筛选程序包括提供包含候选MM的肽支架的文库，其中每个支架由跨膜蛋白和候选MM组成。然后可以使文库与蛋白质的全部或一部分(诸如全长蛋白质、天然存在的蛋白质片段或含有蛋白质的非天然存在的片段(也能够结合目标结合配偶体))接触，并且鉴定一种或多种具有以可检测方式结合的蛋白质的候选MM。筛选可以通过一轮或多轮磁激活分选(MACS)或荧光激活分选(FACS)，以及确定MM对CP的结合亲和力并后续确定掩蔽效率来进行，例如，如通过引用全部并入本文的WO2009025846和US20200308243A1中所描述。
细胞因子蛋白
ACC可以采用多种细胞因子蛋白中的任一者，所述细胞因子蛋白可以形成三聚体。此类细胞因子蛋白的实例包括肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族的成员，诸如TNF成员或TNF超家族成员。细胞因子蛋白的实例包括肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14，也被称为LIGHT)、肿瘤坏死因子TNF(例如TNF-α、TNF-β或TNF-C)、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF15和TNFSF18。在一个实例中，细胞因子蛋白是LIGHT(也被称为TNFSF14)。在一些实例中，ACC包含不是TNF的细胞因子(例如除TNF以外的TNF超家族成员)。
在一些实施方案中，细胞因子蛋白可以是成熟细胞因子蛋白。术语“成熟细胞因子蛋白”在本文中是指缺乏信号序列的细胞因子蛋白。信号序列在本文中也被称为“信号肽”。成熟细胞因子蛋白还可能缺乏一个或多个细胞内和/或跨膜结构域。细胞因子蛋白(CP)可以是成熟细胞因子蛋白或具有信号肽、细胞内结构域、跨膜结构域或其一部分的细胞因子蛋白。在一些实施方案中，细胞因子蛋白可以包含信号肽。在一些实例中，本公开的ACC可以包括本文所公开的序列，包括或缺乏本文叙述的信号序列。
举例来说，此类蛋白质的序列包括本文例示的那些序列并且额外序列可以从ncbi.nlm.nih.gov/protein获得。适用于本发明的ACC中的截短变体包括保留细胞因子活性的任何N末端或C末端截短的细胞因子。在一些实例中，截短变体可以是保留细胞因子活性的N末端和/或C末端截短1个至约200个氨基酸、1个至约150个氨基酸、1个至约100个氨基酸、1个至约95个氨基酸、1个至约90个氨基酸、1个至约85个氨基酸、1个至约80个氨基酸、1个至约75个氨基酸、1个至约70个氨基酸、1个至约65个氨基酸、1个至约60个氨基酸、1个至约55个氨基酸、1个至约50个氨基酸、1个至约45个氨基酸、1个至约40个氨基酸、1个至约35个氨基酸、1个至约30个氨基酸、1个至约25个氨基酸、1个至约20个氨基酸、1个至约15个氨基酸、1个至约10个氨基酸、1个至约8个氨基酸、1个至约6个氨基酸、1个至约4个氨基酸的细胞因子多肽。在一些前述实施方案中，截短的CP是N末端截短的CP。在其它实施方案中，截短的CP是C末端截短的CP。在某些实施方案中，截短的CP是C末端和N末端截短的CP。在一些实施方案中，CP被截短以去除天然存在的蛋白酶识别序列(即去除可能容易被蛋白酶裂解的位点)。
在一些实例中，CP1、CP2和CP3中的每一者可以独立地包含在多个物种间交叉反应的细胞因子(例如野生型细胞因子的突变体)。交叉反应性细胞因子可以结合至不同物种中的受体并且活化相应信号传导通路。在一些实例中，交叉反应性细胞因子是小鼠-人类交叉反应性的，即，可以结合至人类和小鼠两者中的受体并且活化一个或多个相应信号传导通路。在一些实例中，交叉反应性细胞因子是小鼠-人类交叉反应性TNFSF14。小鼠-人类交叉反应性TNFSF14在人类TNFSF14蛋白上可以包含一个或多个突变。在一个实例中，小鼠-人类交叉反应性TNFSF14包含SEQ ID NO:55的序列。额外交叉反应性细胞因子可以通过使用酵母表现展示筛选细胞因子(例如野生型细胞因子)的随机错误诱变文库来鉴定，例如，如Tang等Cancer Cell.2016年3月14日；29(3):285-296中所描述，所述文献通过引用全部并入。
在一些实施方案中，CP1、CP2和CP3中的每一者可以独立地包含与SEQ ID NO:54或55的细胞因子参考序列至少80％同一(例如至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
序列同一性百分比是指当使用序列比对程序，例如可在互联网上在NCBI网站公开获得的BLAST程序套件进行比对时，两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同一性水平。还参见Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-10,1990。
在一些实施方案中，CP1、CP2和/或CP3展现肿瘤坏死因子或肿瘤坏死因子超家族的成员(例如TNFSF14)的活性并且包括与SEQ ID NO:54或55的序列至少80％同一、至少82％同一、至少84％同一、至少86％同一、至少88％同一、至少90％同一、至少92％同一、至少94％同一、至少96％同一、至少98％同一或至少99％同一或100％同一的氨基酸序列。
视采用的特定细胞因子蛋白而定，采用的细胞因子蛋白的序列中的氨基酸的数目可能有变化。在一些实施方案中，CP1、CP2和/或CP3包括总计约10个氨基酸至约700个氨基酸、约10个氨基酸至约650个氨基酸、约10个氨基酸至约600个氨基酸、约10个氨基酸至约550个氨基酸、约10个氨基酸至约500个氨基酸、约10个氨基酸至约450个氨基酸、约10个氨基酸至约400个氨基酸、约10个氨基酸至约350个氨基酸、约10个氨基酸至约300个氨基酸、约10个氨基酸至约250个氨基酸、约10个氨基酸至约200个氨基酸、约10个氨基酸至约150个氨基酸、约10个氨基酸至约100个氨基酸、约10个氨基酸至约80个氨基酸、约10个氨基酸至约60个氨基酸、约10个氨基酸至约40个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约700个氨基酸、约20个氨基酸至约650个氨基酸、约20个氨基酸至约600个氨基酸、约20个氨基酸至约550个氨基酸、约20个氨基酸至约500个氨基酸、约20个氨基酸至约450个氨基酸、约20个氨基酸至约400个氨基酸、约20个氨基酸至约350个氨基酸、约20个氨基酸至约300个氨基酸、约20个氨基酸至约250个氨基酸、约20个氨基酸至约200个氨基酸、约20个氨基酸至约150个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约80个氨基酸、约20个氨基酸至约60个氨基酸、约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约700个氨基酸、约40个氨基酸至约650个氨基酸、约40个氨基酸至约600个氨基酸、约40个氨基酸至约550个氨基酸、约40个氨基酸至约500个氨基酸、约40个氨基酸至约450个氨基酸、约40个氨基酸至约400个氨基酸、约40个氨基酸至约350个氨基酸、约40个氨基酸至约300个氨基酸、约40个氨基酸至约250个氨基酸、约40个氨基酸至约200个氨基酸、约40个氨基酸至约150个氨基酸、约40个氨基酸至约100个氨基酸、约40个氨基酸至约80个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约700个氨基酸、约60个氨基酸至约650个氨基酸、约60个氨基酸至约600个氨基酸、约60个氨基酸至约550个氨基酸、约60个氨基酸至约500个氨基酸、约60个氨基酸至约450个氨基酸、约60个氨基酸至约400个氨基酸、约60个氨基酸至约350个氨基酸、约60个氨基酸至约300个氨基酸、约60个氨基酸至约250个氨基酸、约60个氨基酸至约200个氨基酸、约60个氨基酸至约150个氨基酸、约60个氨基酸至约100个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约700个氨基酸、约80个氨基酸至约650个氨基酸、约80个氨基酸至约600个氨基酸、约80个氨基酸至约550个氨基酸、约80个氨基酸至约500个氨基酸、约80个氨基酸至约450个氨基酸、约80个氨基酸至约400个氨基酸、约80个氨基酸至约350个氨基酸、约80个氨基酸至约300个氨基酸、约80个氨基酸至约250个氨基酸、约80个氨基酸至约200个氨基酸、约80个氨基酸至约150个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约700个氨基酸、约100个氨基酸至约650个氨基酸、约100个氨基酸至约600个氨基酸、约100个氨基酸至约550个氨基酸、约100个氨基酸至约500个氨基酸、约100个氨基酸至约450个氨基酸、约100个氨基酸至约400个氨基酸、约100个氨基酸至约350个氨基酸、约100个氨基酸至约300个氨基酸、约100个氨基酸至约250个氨基酸、约100个氨基酸至约200个氨基酸、约100个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约700个氨基酸、约150个氨基酸至约650个氨基酸、约150个氨基酸至约600个氨基酸、约150个氨基酸至约550个氨基酸、约150个氨基酸至约500个氨基酸、约150个氨基酸至约450个氨基酸、约150个氨基酸至约400个氨基酸、约150个氨基酸至约350个氨基酸、约150个氨基酸至约300个氨基酸、约150个氨基酸至约250个氨基酸、约150个氨基酸至约200个氨基酸、约200个氨基酸至约700个氨基酸、约200个氨基酸至约650个氨基酸、约200个氨基酸至约600个氨基酸、约200个氨基酸至约550个氨基酸、约200个氨基酸至约500个氨基酸、约200个氨基酸至约450个氨基酸、约200个氨基酸至约400个氨基酸、约200个氨基酸至约350个氨基酸、约200个氨基酸至约300个氨基酸、约200个氨基酸至约250个氨基酸、约250个氨基酸至约700个氨基酸、约250个氨基酸至约650个氨基酸、约250个氨基酸至约600个氨基酸、约250个氨基酸至约550个氨基酸、约250个氨基酸至约500个氨基酸、约250个氨基酸至约450个氨基酸、约250个氨基酸至约400个氨基酸、约250个氨基酸至约350个氨基酸、约250个氨基酸至约300个氨基酸、约300个氨基酸至约700个氨基酸、约300个氨基酸至约650个氨基酸、约300个氨基酸至约600个氨基酸、约300个氨基酸至约550个氨基酸、约300个氨基酸至约500个氨基酸、约300个氨基酸至约450个氨基酸、约300个氨基酸至约400个氨基酸、约300个氨基酸至约350个氨基酸、约350个氨基酸至约700个氨基酸、约350个氨基酸至约650个氨基酸、约350个氨基酸至约600个氨基酸、约350个氨基酸至约550个氨基酸、约350个氨基酸至约500个氨基酸、约350个氨基酸至约450个氨基酸、约350个氨基酸至约400个氨基酸、约400个氨基酸至约700个氨基酸、约400个氨基酸至约650个氨基酸、约400个氨基酸至约600个氨基酸、约400个氨基酸至约550个氨基酸、约400个氨基酸至约500个氨基酸、约400个氨基酸至约450个氨基酸、约450个氨基酸至约700个氨基酸、约450个氨基酸至约650个氨基酸、约450个氨基酸至约600个氨基酸、约450个氨基酸至约550个氨基酸、约450个氨基酸至约500个氨基酸、约500个氨基酸至约700个氨基酸、约500个氨基酸至约650个氨基酸、约500个氨基酸至约600个氨基酸、约500个氨基酸至约550个氨基酸、约550个氨基酸至约700个氨基酸、约550个氨基酸至约650个氨基酸、约550个氨基酸至约600个氨基酸、约600个氨基酸至约700个氨基酸、约600个氨基酸至约650个氨基酸或约650个氨基酸至约700个氨基酸。在一些实施方案中，CP1、CP2和/或CP3是成熟野生型人类细胞因子蛋白。
可裂解部分
在一些方面，直接或间接(例如经由接头)位于ACC中的CP与MM(例如SMM和/或AMM)组分之间的是包含蛋白酶的底物的可裂解部分(CM)。在一些实施方案中，ACC中的每个CM可以独立地包含选自由以下组成的组的蛋白酶的底物：ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADEMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、BACE、肾素、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶14、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶G、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V/L2、组织蛋白酶X/Z/P、胃促胰酶、Cruzipain、DESC1、DPP-4、FAP、豆荚蛋白、Otubain-2、弹性蛋白酶、FVIIa、FiXA、FXa、FXIa、FXIIa、粒酶B、胍基苯甲酸酶、肝丝酶、HtrA1、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、乳铁蛋白、Marapsin、基质蛋白酶-2、穿膜肽酶、MT-SP1/基质蛋白酶、中性溶酶、NS3/4A、PACE4、纤溶酶、PSMA、PSA、BMP-1、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26、MMP27、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、tPA、凝血酶、类胰蛋白酶和uPA。
在一些实施方案中，裂解本文所描述的任何CM的蛋白酶可以是ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、BACE、肾素、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶14、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V/L2、组织蛋白酶X/Z/P、Cruzipain、豆荚蛋白、Otubain-2、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、穿膜肽酶、中性溶酶、PSMA、BMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-23、MMP-24、MMP-26、MMP-27、活化蛋白C、组织蛋白酶A、组织蛋白酶G、胃促胰酶、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、弹性蛋白酶、粒酶B、胍基苯甲酸酶、HtrA1、人嗜中性粒细胞裂解酶、乳铁蛋白、marapsin、NS3/4A、PACE4、纤溶酶、PSA、tPA、凝血酶、类胰蛋白酶、uPA、DESC1、DPP-4、FAP、肝丝酶、基质蛋白酶-2、MT-SP1/基质蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3或TMPRSS4。
在一些实施方案中，蛋白酶选自下组：uPA、豆荚蛋白、MT-SP1、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、MMP-2、MMP-9、MMP-12、MMP-13和MMP-14。
在一些实施方案中，CM被选择与特定蛋白酶一起使用。蛋白酶可以是由肿瘤细胞产生的蛋白酶(例如所述肿瘤细胞可以比健康组织表达更大量的蛋白酶)。在一些实施方案中，CM是至少一种选自下组的蛋白酶的底物：ADAM 17、BMP-1、半胱氨酸蛋白酶(诸如组织蛋白酶)、HtrA1、豆荚蛋白、基质蛋白酶(MT-SP1)、基质金属蛋白酶(MMP)、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TMPRSS(诸如TMPRSS3或TMPRSS4)、凝血酶和u型纤溶酶原激活物(uPA，也被称为尿激酶)。
在一些实施方案中，CM是至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物。MMP的实例包括MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26和MMP27。在一些实施方案中，CM是MMP9、MMP14、MMP1、MMP3、MMP13、MMP17、MMP11和MMP19的底物。在一些实施方案中，CM是MMP7的底物。在一些实施方案中，CM是MMP9的底物。在一些实施方案中，CM是MMP14的底物。在一些实施方案中，CM是两种或更多种MMP的底物。在一些实施方案中，CM是至少MMP9和MMP14的底物。在一些实施方案中，CM包括同一MMP的两种或更多种底物。在一些实施方案中，CM包括至少两种或更多种MMP9底物。在一些实施方案中，CM包括至少两种或更多种MMP14底物。
已报道在许多癌症中，具有已知底物的蛋白酶的水平增加。参见例如La Roca等,British J.Cancer 90(7):1414-1421,2004。适用于本文采用的CM组分中的底物包括更普遍见于癌性细胞和组织中的那些。因此，在某些实施方案中，ACC中的每个CM可以独立地包含更普遍见于与癌症相关的患病组织中的蛋白酶的底物。在一些实施方案中，癌症选自下组：胃癌、乳腺癌、骨肉瘤和食管癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是HER2阳性癌症。在一些实施方案中，癌症是卡波西肉瘤、毛细胞白血病、慢性髓样白血病(CML)、滤泡性淋巴瘤、肾细胞癌(RCC)、黑素瘤、成神经细胞瘤、基底细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、鼻咽腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、BCG抗性非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)、子宫内膜癌、胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌、食管癌、胆囊癌、胶质瘤，头颈癌、子宫癌、子宫颈癌或睾丸癌等。在一些上述实施方案中，CM组分包含一种或多种在肿瘤组织中更普遍的蛋白酶的底物。
在一些实施方案中，CM可以是或包含下表1中的任一序列的共有序列所涵盖的序列以及SEQ ID NO:62、63和81。在一些实施方案中，CM与选自由SEQ ID No:62、63和81组成的组的序列至少95％、98％或99％同一。
表1.示例性CM序列
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CM的实例还包括保留相应蛋白酶的识别位点的以上提及的氨基酸序列的截短变体。这些包括保留蛋白酶的识别位点的包含上述氨基酸序列的至少3个连续氨基酸或前述氨基酸序列的至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个氨基酸的C末端和/或N末端截短变体。在某些实施方案中，上述氨基酸序列的截短变体是对应于任何以上氨基酸序列，但C末端和/或N末端截短1至约10个氨基酸、1至约9个氨基酸、1至约8个氨基酸、1至约7个氨基酸、1至约6个氨基酸、1至约5个氨基酸、1至约4个氨基酸或1至约3个氨基酸，并且：(1)具有至少三个氨基酸残基；并且(2)保留蛋白酶的识别位点的氨基酸序列。在一些前述实施方案中，截短的CM是N末端截短的CM。在一些实施方案中，截短的CM是C末端截短的CM。在一些实施方案中，截短的C是C末端和N末端截短的CM。
在一些实施方案中，ACC中的每个CM可以独立地包含总计约3个氨基酸至约25个氨基酸。在一些实施方案中，ACC中的每个CM可以独立地包含总计约3个氨基酸至约25个氨基酸、约3个氨基酸至约20个氨基酸、约3个氨基酸至约15个氨基酸、约3个氨基酸至约10个氨基酸、约3个氨基酸至约5个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约25个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸或约20个氨基酸至约25个氨基酸。
在一些实施方案中，ACC可以包含多个CM，所述多个CM包含不同蛋白酶的底物。在一些实施方案中，ACC中的一些或全部CM包含不同蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM包含相同蛋白酶的底物。
接头
单体构建体可以包含一个或多个在两个组分之间的接头。在一些实施方案中，第一单体可以包括安置在CP1与CM1之间的接头。在一些实施方案中，在第一单体中，CP1和CM1彼此直接邻接。在一些实施方案中，第一单体包含安置在CM1与SMM1之间的接头。在一些实施方案中，在第一单体中，CM1和SMM1彼此直接邻接。在一些实施方案中，第一单体包含安置在CP1与CM4之间的接头(CM偶联CP1和AMM1)。在一些实施方案中，在第一单体中，CP1和CM4彼此直接邻接。在一些实施方案中，第一单体包含安置在CM4与AMM1之间的接头。在一些实施方案中，在第一单体中，CM4和AMM1彼此直接邻接。
在一些实施方案中，第二单体可以包括安置在CP2与CM2之间的接头。在一些实施方案中，在第二单体中，CP2和CM2彼此直接邻接。在一些实施方案中，第二单体包含安置在CM2与SMM2之间的接头。在一些实施方案中，在第二单体中，CM2和SMM2彼此直接邻接。在一些实施方案中，第二单体包含安置在CP2与CM5之间的接头(CM偶联CP2和AMM2)。在一些实施方案中，在第二单体中，CP2和CM5彼此直接邻接。在一些实施方案中，第二单体包含安置在CM5与AMM2之间的接头。在一些实施方案中，在第二单体中，CM5和AMM2彼此直接邻接。
在一些实施方案中，第三单体可以包括安置在CP3和CM3之间的接头。在一些实施方案中，在第三单体中，CP3和CM3彼此直接邻接。在一些实施方案中，第三单体包含安置在CM3与SMM3之间的接头。在一些实施方案中，在第三单体中，CM3和SMM3彼此直接邻接。在一些实施方案中，第三单体包含安置在CP3与CM6之间的接头(CM偶联CP3和AMM3)。在一些实施方案中，在第三单体中，CP3和CM6彼此直接邻接。在一些实施方案中，第三单体包含安置在CM6与AMM3之间的接头。在一些实施方案中，在第三单体中，CM6和AMM3彼此直接邻接。
在一些实施方案中，一个或多个接头(例如柔性接头)可以引入可活化细胞因子构建体中以在一个或多个在结构域之间的接界、在部分之间的接界、在部分与结构域之间的接界处，或在接头将有益的任何其它接界处提供柔性。在一些实施方案中，当ACC以构象受约束构建体形式提供时，可插入柔性接头以有助于未裂解的可活化细胞因子构建体中结构的形成和维持。本文所描述的任何接头都可提供所需柔性以有助于抑制靶标(例如细胞因子的受体)的结合，或有助于蛋白酶对CM的裂解。在一些实施方案中，全部或部分柔性的接头包括在ACC中，使得接头可包括柔性接头以及一个或多个赋予柔性较小的结构的部分以提供所需ACC。一些接头可包括半胱氨酸残基，其可形成二硫键并降低构建体的柔性。接头长度可以通过在N至C方向上对从接头的与先前组分的C末端氨基酸邻接的N末端到接头的与之后组分的N末端氨基酸邻接的C末端的氨基酸数目进行计数来确定(即其中接头长度不包括先前组分的C末端氨基酸或之后组分的N末端氨基酸)。
在一些实施方案中，接头可以包括总计约1个氨基酸至约25个氨基酸(例如约1个氨基酸至约24个氨基酸、约1个氨基酸至约22个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约18个氨基酸、约1个氨基酸至约16个氨基酸、约1个氨基酸至约15个氨基酸、约1个氨基酸至约14个氨基酸、约1个氨基酸至约12个氨基酸、约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约8个氨基酸、约1个氨基酸至约6个氨基酸、约1个氨基酸至约5个氨基酸、约1个氨基酸至约4个氨基酸、约1个氨基酸至约3个氨基酸、约1个氨基酸至约2个氨基酸、约2个氨基酸至约25个氨基酸、约2个氨基酸至约24个氨基酸、约2个氨基酸至约22个氨基酸、约2个氨基酸至约20个氨基酸、约2个氨基酸至约18个氨基酸、约2个氨基酸至约16个氨基酸、约2个氨基酸至约15个氨基酸、约2个氨基酸至约14个氨基酸、约2个氨基酸至约12个氨基酸、约2个氨基酸至约10个氨基酸、约2个氨基酸至约8个氨基酸、约2个氨基酸至约6个氨基酸、约2个氨基酸至约5个氨基酸、约2个氨基酸至约4个氨基酸、约2个氨基酸至约3个氨基酸、约4个氨基酸至约25个氨基酸、约4个氨基酸至约24个氨基酸、约4个氨基酸至约22个氨基酸、约4个氨基酸至约20个氨基酸、约4个氨基酸至约18个氨基酸、约4个氨基酸至约16个氨基酸、约4个氨基酸至约15个氨基酸、约4个氨基酸至约14个氨基酸、约4个氨基酸至约12个氨基酸、约4个氨基酸至约10个氨基酸、约4个氨基酸至约8个氨基酸、约4个氨基酸至约6个氨基酸、约4个氨基酸至约5个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约24个氨基酸、约5个氨基酸至约22个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约18个氨基酸、约5个氨基酸至约16个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约14个氨基酸、约5个氨基酸至约12个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约8个氨基酸、约5个氨基酸至约6个氨基酸、约6个氨基酸至约25个氨基酸、约6个氨基酸至约24个氨基酸、约6个氨基酸至约22个氨基酸、约6个氨基酸至约20个氨基酸、约6个氨基酸至约18个氨基酸、约6个氨基酸至约16个氨基酸、约6个氨基酸至约15个氨基酸、约6个氨基酸至约14个氨基酸、约6个氨基酸至约12个氨基酸、约6个氨基酸至约10个氨基酸、约6个氨基酸至约8个氨基酸、约8个氨基酸至约25个氨基酸、约8个氨基酸至约24个氨基酸、约8个氨基酸至约22个氨基酸、约8个氨基酸至约20个氨基酸、约8个氨基酸至约18个氨基酸、约8个氨基酸至约16个氨基酸、约8个氨基酸至约15个氨基酸、约8个氨基酸至约14个氨基酸、约8个氨基酸至约12个氨基酸、约8个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约24个氨基酸、约10个氨基酸至约22个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约18个氨基酸、约10个氨基酸至约16个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约14个氨基酸、约10个氨基酸至约12个氨基酸、约12个氨基酸至约25个氨基酸、约12个氨基酸至约24个氨基酸、约12个氨基酸至约22个氨基酸、约12个氨基酸至约20个氨基酸、约12个氨基酸至约18个氨基酸、约12个氨基酸至约16个氨基酸、约12个氨基酸至约15个氨基酸、约12个氨基酸至约14个氨基酸、约14个氨基酸至约25个氨基酸、约14个氨基酸至约24个氨基酸、约14个氨基酸至约22个氨基酸、约14个氨基酸至约20个氨基酸、约14个氨基酸至约18个氨基酸、约14个氨基酸至约16个氨基酸、约14个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约25个氨基酸、约15个氨基酸至约24个氨基酸、约15个氨基酸至约22个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约15个氨基酸至约18个氨基酸、约15个氨基酸至约16个氨基酸、约16个氨基酸至约25个氨基酸、约16个氨基酸至约24个氨基酸、约16个氨基酸至约22个氨基酸、约16个氨基酸至约20个氨基酸、约16个氨基酸至约18个氨基酸、约18个氨基酸至约25个氨基酸、约18个氨基酸至约24个氨基酸、约18个氨基酸至约22个氨基酸、约18个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约20个氨基酸至约24个氨基酸、约20个氨基酸至约22个氨基酸、约22个氨基酸至约25个氨基酸、约22个氨基酸至约24个氨基酸或约24个氨基酸至约25个氨基酸)。
在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，接头包括总计约1个氨基酸、约2个氨基酸、约3个氨基酸、约4个氨基酸、约5个氨基酸、约6个氨基酸、约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约19个氨基酸、约20个氨基酸、约21个氨基酸、约22个氨基酸、约23个氨基酸、约24个氨基酸或约25个氨基酸。
在一些实施方案中，接头可以富含甘氨酸(Gly或G)残基。在一些实施方案中，接头可以富含丝氨酸(Ser或S)残基。在一些实施方案中，接头可以富含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施方案中，接头具有一对或多对甘氨酸-丝氨酸残基(GS)(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10对或更多对GS)。在一些实施方案中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Gly-Ser(GGGS)序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGGS序列)。在一些实施方案中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGGGS序列)。在一些实施方案中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Ser-Gly(GGSG)序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGSG序列)。
在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，接头包括以下中的任一者或一者或多者的组合：(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:645)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:646)、(GGGS)n(SEQ ID NO:647)、GGSG(SEQ ID NO:648)、GGSGG(SEQ ID NO:649)、GSGSG(SEQ IDNO:650)、GSGGG(SEQ ID NO:651)、GGGSG(SEQ ID NO:652)、GSSSG(SEQ ID NO:653)、GSSGGSGGSGG(SEQ ID NO:654)、GGGS(SEQ ID NO:655)、GGGSGGGS(SEQ ID NO:656)、GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:657)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:658)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:659)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:660)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:661)、GGGGS(SEQ ID NO:662)、GS、GGGGSGS(SEQ ID NO:663)、GGGGSGGGGSGGGGSGS(SEQ ID NO:664)、GGSLDPKGGGGS(SEQ ID NO:665)、PKSCDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO:666)、SKYGPPCPPCPAPEFLG(SEQ ID NO:667)、GKSSGSGSESKS(SEQ IDNO:668)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:669)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:670)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:671)和GSTSGSGKPGSS EGST(SEQ ID NO:672)，其中n是1或更大的整数。
接头的非限制性实例可以包括与本文所描述的示例性接头序列至少70％同一(例如至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的序列。
在一些实施方案中，ACC可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个接头序列(例如本文所描述或本领域中已知的任何示例性接头序列的相同或不同的接头序列)。在一些实施方案中，接头包含磺基-SIAB、SMPB和磺基-SMPB，其中接头与伯胺氢硫基反应。
下表2中列出额外示例性接头序列：
表2.示例性接头序列
与剂缀合
ACC可以与一种或多种剂缀合，例如用以促进向目标细胞或组织的递送的靶向部分、剂(例如治疗剂、抗赘生剂)、毒素或其片段。
在一些实施方案中，ACC可以缀合于细胞毒性剂，包括但不限于毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)；或放射性同位素。在一些实施方案中，可活化细胞因子构建体可以缀合于细胞毒性剂，包括但不限于毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)；或放射性同位素。
可以缀合于本文所描述的任何ACC的非限制性示例性细胞毒性剂包括：多拉司他汀(dolastatin)及其衍生物(例如澳瑞他汀E(auristatin E)、AFP、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、去甲基澳瑞他汀E(DMAE)、澳瑞他汀F、去甲基澳瑞他汀F(DMAF)、多拉司他汀16(DmJ)、多拉司他汀16(Dpv)、澳瑞他汀衍生物(例如澳瑞他汀酪胺(auristatin tyramine)、澳瑞他汀喹诺酮(auristatinquinolone))、类美登素(maytansinoid)(例如DM-1、DM-4)、类美登素衍生物、倍癌霉素(duocarmycin)、α-鹅膏蕈碱(alpha-amanitin)、涡轮他汀(turbostatin)、芬他汀(phenstatin)、羟基芬他汀(hydroxyphenstatin)、海绵抑制素5(spongistatin 5)、海绵抑制素7、哈利他汀1(halistatin1)、哈利他汀2、哈利他汀3、哈坎他汀(halocomstatin)、吡咯并苯并咪唑(PBI)、西博他汀6(cibrostatin6)、多沙利仿(doxaliform)、西马多丁(cemadotin)类似物(CemCH2-SH)、假单胞菌毒素A(PES8)变体、假单胞菌毒素A(ZZ-PE38)变体、ZJ-101、蒽环霉素(anthracycline)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、苔藓抑素(bryostatin)、喜树碱(camptothecin)、7-取代的喜树碱、10,11-二氟亚甲基二氧基喜树碱、考布他汀(combretastatin)、脱溴海兔毒素(debromoaplysiatoxin)、KahaMide-F、圆皮海绵内酯(discodermolide)和海鞘素(Ecteinascidin)。
可以缀合于本文所描述的任何ACC的非限制性示例性酶活性毒素包括：白喉毒素(diphtheria toxin)、来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A链(exotoxin A chain)、篦麻毒素A链(ricin A chain)、相思子毒素A链(abrin A chain)、蒴莲根毒素A链(modeccin A chain)、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleuriies fordii)蛋白、石竹素(dianfhin)蛋白、美洲商陆(Phytoiaca Americana)蛋白(例如PAPI、PAPII和PAP-8)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素(curcin)、巴豆毒素(crotirs)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(geionin)、米托洁林(mitogeliin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、新霉素(neomycin)和新月毒素(tricothecene)。
可以缀合于本文所描述的任何ACC的非限制性示例性抗赘生剂包括：阿霉素(adriamycin)、司比定(cerubidine)、博莱霉素(bleomycin)、爱克兰(alkeran)、维尔班(velban)、昂可文(oncovin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、甲氨蝶呤(methotrexate)、噻替派(thiotepa)、比生群(bisantrene)、诺凡特龙(novantrone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、丙卡巴肼(procarabizine)和阿糖胞苷(cytarabine)。
可以缀合于本文所描述的任何ACC的非限制性示例性抗病毒剂包括：阿昔洛韦(acyclovir)、阿糖腺苷(vira A)和兴梅屈尔(symmetrel)。
可以缀合于本文所描述的任何ACC的非限制性示例性抗真菌剂包括：制霉菌素(nystatin)。
可以缀合于本文所描述的任何ACC的非限制性示例性可以缀合检测试剂包括：荧光素及其衍生物、异硫氰酸荧光素(FITC)。
可以缀合于本文所描述的任何可活化细胞因子构建体的非限制性示例性抗菌剂包括：氨基糖苷(aminoglycoside)、链霉素(streptomycin)、新霉素(neomycin)、卡那霉素(kanamycin)、阿米卡星(amikacin)、庆大霉素(gentamicin)和妥布霉素(tobramycin)。
可以缀合于本文所描述的任何可活化细胞因子构建体的非限制性示例性3β,16β,17α-三羟基胆甾-5-烯-22-酮16-O-(2-O-4-甲氧基苯甲酰基-β-D-吡喃木糖基)-(1-->3)-(2-O-乙酰基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷)(OSW-1)包括：O6-苯甲基鸟嘌呤的s-硝基苯甲基氧基羰基衍生物、拓扑异构酶抑制剂、哈米特林(hemiasterlin)、三尖杉碱(cephalotaxine)、高三尖杉酯碱(homoharringionine)、吡咯并苯并二氮二聚体(PBD)、官能化吡咯并苯并二氮/>卡奇霉素(calcicheamicin)、鬼臼毒素(podophyiitoxin)、紫杉烷和长春花生物碱。
可以缀合于本文所描述的任何可活化细胞因子构建体的非限制性示例性放射性药物包括：123I、89Zr、125I、131I、99mTc、201T1、62Cu、18F、68Ga、13N、15O、38K、82Rb、111In、133Xe、11C和99mTc(锝)。
可以缀合于本文所描述的任何ACC的非限制性示例性重金属包括：钡、金和铂。
可以缀合于本文所描述的任何ACC的非限制性示例性抗支原体剂包括：泰乐菌素(tylosine)、壮观霉素(spectinomycin)、链霉素B(streptomycin B)、氨苄青霉素(ampicillin)、磺胺(sulfanilamide)、多粘菌素(polymyxin)和氯霉素(chloramphenicol)。
本领域普通技术人员将认识到多种可能的部分可以缀合于本文所描述的任何可活化细胞因子构建体。缀合可以包括将使两个分子结合的任何化学反应，只要ACC和其它部分保留它们的相应活性即可。缀合可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合和络合。在一些实施方案中，优选的结合是共价结合。共价结合可以通过现有侧链的直接缩合或通过掺入外部桥接分子实现。许多二价或多价连接剂可用于缀合本文所描述的任何可活化细胞因子构建体。举例来说，缀合可以包括有机化合物，诸如硫代酸酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。在一些实施方案中，可活化细胞因子构建体可以包括或以其它方式引入一个或多个非天然氨基酸残基以提供适合缀合位点。
在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，剂和/或缀合物通过二硫键(例如半胱氨酸分子上的二硫键)附接于一个或多个细胞因子蛋白。因为许多癌症天然地释放高水平的还原剂谷胱甘肽，所以存在于癌性组织微环境中的谷胱甘肽可还原二硫键，并且随后在递送部位处释放剂和/或缀合物。
在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，当缀合物在靶标部位(例如患病组织(例如癌性组织))内在补体存在下结合至其靶标时，将缀合物和/或剂附接于接头的酰胺键或酯键被裂解，从而导致缀合物和/或剂以其活性形式释放。当施用至受试者时，这些缀合物和/或剂将实现缀合物和/或剂在靶标部位(例如患病组织(例如癌性组织))处的递送和释放。这些缀合物和/或剂对于体内递送本文所描述的任何缀合物和/或剂来说是特别有效的。
在一些实施方案中，接头不可以由补体系统的酶裂解。举例来说，缀合物和/或剂在无补体活化的情况下释放，因为补体活化最终会溶解靶标细胞。在此类实施方案中，缀合物和/或剂将被递送至靶标细胞(例如激素、酶、皮质类固醇、神经递质或基因)。此外，接头轻微地易经受血清蛋白酶的裂解，并且缀合物和/或剂在靶标部位处缓慢释放。
在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，缀合物和/或剂被设计为使得缀合物和/或剂被递送至靶标部位(例如疾病组织(例如癌性组织))，但缀合物和/或剂不被释放。
在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，缀合物和/或剂直接或通过非可裂解接头附接于细胞因子蛋白。示例性非可裂解接头包括氨基酸(例如D-氨基酸)、肽、或可以被修饰以包括可随后用于通过本文所描述的方法附接于细胞因子的官能团的其它有机化合物。
在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，ACC包括至少一个用于剂的缀合点。在一些实施方案中，所有可能的缀合点都可用于与剂的缀合。在一些实施方案中，一个或多个缀合点包括但不限于二硫键中涉及的硫原子、链间二硫键中涉及的硫原子、链间硫键中涉及的硫原子而非链内二硫键中涉及的硫原子、和/或半胱氨酸或含有硫原子的其它氨基酸残基的硫原子。在此类情况下，残基可天然地存在于蛋白质构建体结构中，或可使用包括但不限于定点诱变、化学转化、或非天然氨基酸的错误掺入的方法掺入蛋白质构建体中。
本公开还提供了用于制备用于缀合的ACC的方法和材料。在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，ACC被修饰以包括一个或多个链间二硫键。举例来说，ACC中的二硫键可以在暴露于还原剂诸如但不限于TCEP、DTT或β-巯基乙醇之后经受还原。在一些情况下，二硫键的还原仅是部分的。如本文所用，术语部分还原是指其中使ACC与还原剂接触，并且所有可能的缀合位点的一部分经受还原(例如并非所有二硫键都被还原)的情况。在一些实施方案中，如果所有可能的缀合位点中的少于99％(例如少于98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或少于5％)被还原，那么可活化细胞因子构建体在与还原剂接触之后被部分还原。在一些实施方案中，使具有一个或多个链间二硫键的还原的ACC缀合于与游离硫醇具有反应性的药物。
本公开还提供了用于使治疗剂缀合于ACC上的特定位置的方法和材料。在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，ACC被修饰以使治疗剂可以在ACC上的特定位置处缀合于ACC。举例来说，ACC可以有助于与ACC的缀合的方式被部分还原。在此类情况下，ACC的部分还原以ACC中的缀合位点不被还原的方式发生。在一些实施方案中，选择ACC上的一个或多个缀合位点以有助于剂在蛋白质构建体上的特定位置处的缀合。各种因素可影响在用还原剂处理后ACC的“还原水平”。不加限制地举例来说，还原剂与ACC的比率、孵育的时长、孵育温度和/或还原反应溶液的pH可需要优化以用本文所描述的方法和材料实现ACC的部分还原。因素(例如还原剂与ACC的比率、与还原剂一起孵育的时长和温度以及/或者还原剂的pH)的任何适当组合可用于实现ACC的部分还原(例如可能的缀合位点的普遍还原或在特定缀合位点处的还原)。
还原剂与ACC的有效比率可以是以允许与剂的缀合的方式至少部分地还原ACC(例如可能的缀合位点的普遍还原或在特定缀合位点处的还原)的任何比率。在一些实施方案中，还原剂与ACC的比率将在约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.5、约9:1至1:1.5、约8:1至1:1.5、约7:1至1:1.5、约6:1至1:1.5、约5:1至1:1.5、约4:1至1:1.5、约3:1至1:1.5、约2:1至1:1.5、约1.5:1至1:1.5或约1:1至1:1.5的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约8:1至约1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约2.5:1至1:1的范围内。
用于用还原剂处理ACC的有效孵育时间和温度可以是以允许剂与ACC的缀合的方式至少部分地还原ACC(例如可能的缀合位点的普遍还原或在特定缀合位点处的还原)的任何时间和温度。在一些实施方案中，用于处理ACC的孵育时间和温度将处于在37℃下约1小时至在37℃下约12小时的范围(或其中的任何子范围)内。
用于用还原剂处理ACC的还原反应的有效pH可以是以允许ACC与剂的缀合的方式至少部分地还原ACC(例如可能的缀合位点的普遍还原或在特定缀合位点处的还原)的任何pH。
当使部分还原的ACC与含有硫醇的剂接触时，所述剂可以缀合于ACC中的链间硫醇。剂可使用含有硫醇的试剂(例如半胱氨酸或N-乙酰基半胱氨酸)以包括硫醇的方式来修饰。举例来说，ACC可以在约37℃下以还原剂与ACC的所需比率与还原剂(例如TEPC)一起孵育约1小时之后被部分还原。还原剂与ACC的有效比率可以是以允许含有硫醇的剂的缀合的方式部分地还原至少两个位于ACC中的链间二硫键(例如可能的缀合位点的普遍还原或在特定缀合位点处的还原)的任何比率。
在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，ACC以避免还原任何链内二硫键的方式被还原剂还原。在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，ACC以避免还原任何链内二硫键并且还原至少一个链间二硫键的方式被还原剂还原。
在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，ACC还可以包括缀合于ACC的剂。在一些实施方案中，缀合的剂是治疗剂。
在一些实施方案中，剂(例如缀合于可活化细胞因子构建体的剂)是可检测部分，诸如像标记或其它标志物。举例来说，剂是或包括经放射性标记氨基酸、一种或多种可以通过标记化亲和素(例如含有可以通过光学或量热方法检测的荧光标志物或酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分、一种或多种放射性同位素或放射性核素、一种或多种荧光标记、一种或多种酶标记和/或一种或多种化学发光剂。在一些实施方案中，可检测部分通过间隔物分子来附接。
在一些实施方案中，剂(例如缀合于可活化细胞因子构建体的细胞毒性剂)使用碳水化合物部分、氢硫基、氨基或羧酸酯基团连接于ACC。
在一些实施方案中，剂(例如缀合于可活化细胞因子构建体的细胞毒性剂)经由缀合部分缀合于ACC。缀合部分可以包含本文所描述的一个或多个接头和一个或多个CM，以及其它类型的分子。在一些实施方案中，剂(例如缀合于可活化细胞因子构建体的细胞毒性剂)缀合于ACC中的半胱氨酸或赖氨酸。在一些实施方案中，剂(例如缀合于可活化细胞因子构建体的细胞毒性剂)缀合于ACC的另一残基，诸如本文所公开的那些残基。在一些实施方案中，缀合部分是含有硫醇的缀合部分。
本领域普通技术人员将认识到多种可能的部分可偶联于本公开的ACC。(参见例如“Conjugate Vaccines”,Contributions to Microbiology and Immunology,J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr(编),Carger Press,New York,(1989)，其全部内容通过引用并入本文)。一般来说，剂(例如细胞毒性剂)与ACC的有效缀合可以通过将使所述剂结合至所述ACC，同时还允许所述剂和所述ACC保留功能性的任何化学反应来实现。
在一些实施方案中，多种双官能蛋白质偶联剂可用于使所述剂缀合于ACC，包括但不限于3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮鎓衍生物(例如双(对重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。举例来说，篦麻毒素免疫毒素可如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所描述来制备。在一些实施方案中，碳-14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)螯合剂可用于使放射性核苷酸缀合于ACC。(参见例如WO94/11026)。
缀合部分的实例描述于文献中。(参见例如Ramakrishnan,S.等,Cancer Res.44:201-208(1984)，其描述MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的使用)。还参见美国专利号5,030,719，其描述经由寡肽接头偶联于ACC的卤化乙酰基酰肼衍生物的使用。在一些实施方案中，适合的缀合部分包括(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)-甲苯(Pierce Chem.Co.，目录(21558G)；(iii)SPDP(6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(Pierce Chem.Co.，目录号21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(6-[3-(2-吡啶基二硫基)-丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯(Pierce Chem.Co.，目录号2165-G)；和(v)缀合于EDC的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺：Pierce Chem.Co.，目录号24510)。额外缀合部分包括SMCC、磺基-SMCC、SPDB或磺基-SPDB。
上述缀合部分含有具有不同属性的组分，因此导致具有不同生理化学性质的缀合物。举例来说，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯比芳族羧酸酯的磺基-NHS酯稳定。含有NHS酯的缀合部分的可溶性小于磺基-NHS酯。此外，缀合部分SMPT含有具有空间位阻的二硫键，并且可形成具有增加的稳定性的缀合物。一般来说，二硫键联的稳定性小于其它键联，因为二硫键联在体外被裂解，从而导致可用的缀合物较少。特别地，磺基-NHS可增强碳二亚胺偶联的稳定性。相比于单独碳二亚胺偶联反应，碳二亚胺偶联(诸如EDC)在与磺基-NHS联合使用时形成对水解更加具有抗性的酯。
在任何ACC的一些实施方案中，剂可使用包括在ACC的氨基酸序列中的经修饰氨基酸序列缀合于ACC。通过在ACC的氨基酸序列内的特定位置处插入使得能够实现缀合的氨基酸，蛋白质构建体可以被设计以达成缀合的剂(例如细胞毒性剂)的受控放置和/或剂量。举例来说，ACC可以被修饰以在第一单体、第二单体和/或第三单体上的位置处包括提供反应性硫醇基团，并且不负面影响蛋白质折叠和/或组装以及不改变细胞因子与其结合配偶体的结合的半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，ACC可以被修饰以在ACC的氨基酸序列内包括一个或多个非天然氨基酸残基以提供适合缀合位点。在一些实施方案中，ACC可以被修饰以在ACC的氨基酸序列内包括可酶促活化的肽序列。
核酸
本文提供了包括编码本文所描述的任何ACC的第一单体构建体(或第一单体构建体的蛋白质部分)(例如本文所描述的任何第一单体构建体)、第二单体构建体(或第二单体构建体的蛋白质部分)(例如本文所描述的任何第二单体构建体)和第三单体构建体(或第三单体构建体的蛋白质部分)(例如本文所描述的任何第三单体构建体)的序列的核酸。在一些实施方案中，一组核酸一起编码第一单体构建体(或第一单体构建体的蛋白质部分)、第二单体构建体(或第二单体构建体的蛋白质部分)和第三单体构建体(或第三单体构建体的蛋白质部分)。在一些实施方案中，编码第一单体构建体(或第一单体构建体的蛋白质部分)的核酸序列与编码第二单体构建体(或第二单体构建体的蛋白质部分)的核酸序列至少70％同一(例如至少72％同一、至少74％同一、至少76％同一、至少78％同一、至少80％同一、至少82％同一、至少84％同一、至少86％同一、至少88％同一、至少90％同一、至少92％同一、至少94％同一、至少96％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一)。在一些实施方案中，编码第一单体构建体(或第一单体构建体的蛋白质部分)的核酸序列与编码第三单体构建体(或第三单体构建体的蛋白质部分)的核酸序列至少70％同一(例如至少72％同一、至少74％同一、至少76％同一、至少78％同一、至少80％同一、至少82％同一、至少84％同一、至少86％同一、至少88％同一、至少90％同一、至少92％同一、至少94％同一、至少96％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一)。在一些实施方案中，编码第二单体构建体(或第二单体构建体的蛋白质部分)的核酸序列与编码第三单体构建体(或第三单体构建体的蛋白质部分)的核酸序列至少70％同一(例如至少72％同一、至少74％同一、至少76％同一、至少78％同一、至少80％同一、至少82％同一、至少84％同一、至少86％同一、至少88％同一、至少90％同一、至少92％同一、至少94％同一、至少96％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一)。
载体
本文提供了包括本文所描述的任何核酸的载体和载体组。本领域技术人员将能够选择用于制备本文所描述的任何ACC的适合载体或载体组(例如表达载体)，并且使用所述载体或载体组表达本文所描述的任何ACC。举例来说，在选择载体或载体组时，必须考虑细胞，因为所述一种或多种载体可需要能够整合至细胞的染色体中并且/或者在所述细胞中复制。可用于产生ACC的示例性载体还在以下描述。
如本文所用，术语“载体”是指能够诱导重组蛋白(例如第一或第二单体)在细胞(例如本文所描述的任何细胞)中的表达的多核苷酸。“载体”能够将核酸及其片段递送至宿主细胞中，并且包括调节序列(例如启动子、增强子、多腺苷酸(poly(A))信号)。外源性多核苷酸可插入至表达载体中以进行表达。术语“载体”还包括人工染色体、质粒、逆转录病毒和杆状病毒载体。
用于构建包括本文所描述的任何核酸并且适于对细胞(例如哺乳动物细胞)进行转化的适合载体的方法在本领域中是熟知的。参见例如Sambrook等编“MolecularCloning:A Laboratory Manual,”第2版,Cold Spring Harbor Press,1989以及Ausubel等编“Current Protocols in Molecular Biology,”Current Protocols,1993。
载体的非限制性实例包括质粒、转座子、粘粒和病毒载体(例如任何腺病毒载体(例如pSV或pCMV载体)、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体)以及任何载体。载体可例如包括足以达成表达的顺式作用性元件；用于表达的其它元件可以由宿主哺乳动物细胞或在体外表达系统中提供。熟练从业者将能够选择用于制备本文所描述的任何ACC的适合载体和哺乳动物细胞。
在本文所描述的任何ACC的一些实施方案中，ACC可使用重组DNA技术以及在真核或原核物种中的表达来以生物合成方式制备。
在一些实施方案中，载体包括编码本文所描述的任何ACC的第一单体和第二单体的核酸。在一些实施方案中，载体是表达载体。
在一些实施方案中，一组载体一起包括一起编码本文所描述的任何ACC的第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体的一组核酸。在一些实施方案中，载体对是表达载体组。
细胞
本文还提供了包括本文所描述的任何载体或载体组的宿主细胞，所述任何载体或载体组包括本文所描述的任何核酸。
本文所描述的任何ACC和抗体可以由任何细胞(例如哺乳动物细胞)产生。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如人细胞)、啮齿动物细胞(例如小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或豚鼠细胞)或非人类灵长类动物细胞。
将核酸和载体(例如本文所描述的任何载体或任何载体组)引入细胞中的方法在本领域中是已知的。可用于将核酸引入细胞中的方法的非限制性实例包括：脂质体转染、转染、磷酸钙转染、阳离子聚合物转染、病毒转导(例如腺病毒转导、慢病毒转导)、纳米颗粒转染和电穿孔。
在一些实施方案中，引入步骤包括向细胞中引入包括编码组成本文所描述的任何ACC和抗体的单体的核酸的载体(例如本文所描述的任何载体或载体组)。
在本文所描述的任何方法的一些实施方案中，细胞可以是真核细胞。如本文所用，术语“真核细胞”是指具有明显的、有膜包围的细胞核的细胞。此类细胞可以包括例如哺乳动物(例如啮齿动物、非人类灵长类动物或人类)、昆虫、真菌或植物细胞。在一些实施方案中，真核细胞是酵母细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方案中，真核细胞是高等真核细胞，诸如哺乳动物、鸟类、植物或昆虫细胞。哺乳动物细胞的非限制性实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人胚肾细胞(例如HEK293细胞)。
在一些实施方案中，细胞含有编码本文所描述的任一ACC和抗体的第一单体和第二单体的核酸。在一些实施方案中，细胞含有一起编码本文所描述的任何ACC和抗体的第一单体和第二单体的核酸对。
产生可活化细胞因子构建体的方法
本文提供了产生本文所描述的任何ACC的方法，所述方法包括：(a)在足以产生所述ACC的条件下在液体培养基中培养本文所描述的任何重组宿主细胞；以及(b)从所述宿主细胞和/或所述液体培养基回收所述ACC。
培养细胞的方法在本领域中是熟知的。可以在有利于细胞增殖、细胞分化和细胞生长的条件下在体外维持细胞。举例来说，可以通过使细胞(例如本文所描述的任何细胞)与包括足以支持细胞活力和生长的必需的生长因子和补充剂的细胞培养基接触来培养细胞。
在本文所描述的任何方法的一些实施方案中，方法还包括分离回收的ACC。分离方法的非限制性实例包括：硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀、尺寸排阻色谱法、配体亲和色谱法、离子交换色谱法(例如阴离子或阳离子)和疏水性相互作用色谱法。
在本文所描述的任何方法的一些实施方案中，方法还包括将分离的ACC配制成药物组合物。各种制剂在本领域中是已知的，并且在本文中描述。本文所描述的任何分离的ACC和/或抗体都可以被配制用于任何施用途径(例如静脉内、肿瘤内、皮下、真皮内、口服(例如吸入)、经皮(例如经表面)、经粘膜或肌肉内)。
本文还提供了通过本文所描述的任何方法产生的ACC。还提供了包括通过本文所描述的任何方法产生的任何ACC的组合物(例如药物组合物)。本文还提供了包括至少一次剂量的本文所描述的任何组合物(例如药物组合物)的药盒。
在一些实施方案中，ACC可以包含一个或多个标签，所述标签可以用于纯化、分离和/或检测ACC。此类标签的实例包括亲和标签，诸如Hi s标签(例如6X-His(六聚组氨酸)标签)、FLAG标签、c-Myc标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、钙调蛋白结合蛋白(CBP)标签和基于链霉亲和素/生物素的标签。在这些情况下，可以使用一个或多个标签分离或纯化ACC。在一些实例中，可以从ACC中去除标签。
在一些实施方案中，用于生产过程的细胞可以产生第一单体构建体、第二单体构建体和第三单体构建体(例如具有一个或多个亲和标签)的蛋白质部分。单体然后可以非共价缔合以形成三聚体。在三种单体相同的情况下，细胞可以产生单体构建体(例如具有一个或多个亲和标签)。单体构建体然后可以非共价缔合以形成同三聚体。
可以纯化本文中的在细胞中表达的ACC。纯化可以使用亲和柱进行，例如HSA亲和柱，或链霉亲和素亲和柱，或与上述标签相容的其它柱。来自亲和柱的样品可以通过其它色谱技术，例如尺寸排阻色谱法(SEC)进一步纯化。纯化的ACC可以具有至少80％、90％、95％或99％的纯度。
治疗方法
本文提供了治疗受试者的疾病(例如癌症(例如本文所描述的任何癌症))的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文所描述的任何ACC、核酸、载体、包含ACC、核酸和/或载体的组合物施用至所述受试者。
如本文所用，术语“受试者”是指任何生物体，诸如哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是猫科动物(例如猫)、犬科动物(例如狗)、马科动物(例如马)、兔、猪、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠或豚鼠)、非人类灵长类动物(例如猿猴(例如猴(例如狒狒、狨猴)或猿(例如黑猩猩、大猩猩、猩猩或长臂猿))或人。在一些实施方案中，受试者是人类。
在一些实施方案中，受试者先前已被鉴定或诊断为患有疾病(例如癌症(例如本文所描述的任何癌症))。
如本文所用，术语“治疗”包括降低受试者(例如本文所描述的任何受试者)的疾病(例如癌症(例如本文所描述的任何癌症))的一种或多种(例如1、2、3、4或5种)症状或体征的严重性、频率或数目。在其中疾病是癌症的一些实施方案中，治疗在患有癌症的受试者中导致降低癌症生长，抑制癌症进展，抑制癌症转移，或降低癌症复发的风险。
在本文所描述的任何方法的一些实施方案中，疾病是癌症。本文还提供了治疗有需要的受试者(例如本文所描述或本领域中已知的任何示例性受试者)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的任何ACC或本文所描述的任何组合物(例如药物组合物)。
在这些方法的一些实施方案中，受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。癌症的非限制性实例包括：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、成神经细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、横纹肌肉瘤、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)、骨肉瘤、B细胞赘生物、多发性骨髓瘤、淋巴瘤(例如B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤)、白血病(例如毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓样白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL))、骨髓增生异常综合征(MDS)、卡波西肉瘤、成视网膜细胞瘤、胃癌、尿路上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃和食管癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌、结肠癌、骨癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、鼻咽腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、鳞状细胞头颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，淋巴瘤是伯基特氏淋巴瘤。在一些方面，受试者已被鉴定或诊断为患有家族性癌症综合征，诸如利-弗劳梅尼综合征(Li FraumeniSyndrome)、家族性乳腺癌-卵巢癌(BRCA1或BRAC2突变)综合征等。所公开方法还可用于治疗非实体癌症。示例性实体肿瘤包括各种器官系统的恶性肿瘤(例如肉瘤、腺癌和上皮癌)，诸如肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如结肠)和泌尿生殖(例如肾、尿路上皮或睾丸肿瘤)道、咽、前列腺和卵巢的那些。示例性腺癌包括结直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌和小肠癌。
美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)描述的示例性癌症包括：成人急性成淋巴细胞白血病；儿童急性成淋巴细胞白血病；成人急性髓样白血病；肾上腺皮质癌；儿童肾上腺皮质癌；AIDS相关淋巴瘤；AIDS相关恶性肿瘤；肛门癌；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤；肝外胆管癌；膀胱癌；儿童膀胱癌；骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤骨癌；儿童脑干胶质瘤；成人脑肿瘤；儿童脑干胶质瘤脑肿瘤；儿童小脑星形细胞瘤脑肿瘤；儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤脑肿瘤；儿童室管膜瘤脑肿瘤；儿童成髓细胞瘤脑肿瘤；儿童幕上原始神经外胚层肿瘤脑肿瘤；儿童视路和下丘脑胶质瘤脑肿瘤；儿童脑肿瘤(其它)；乳腺癌；乳腺癌和妊娠；儿童乳腺癌；男性乳腺癌；儿童支气管腺瘤/类癌；儿童类癌肿瘤；胃肠类癌肿瘤；肾上腺皮质癌；胰岛细胞癌；原发灶不明癌(Carcinoma of UnknownPrimary)；原发性中枢神经系统淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；子宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓性白血病；慢性骨髓增生性病症；腱鞘透明细胞肉瘤；结肠癌；儿童结直肠癌；皮肤T细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；儿童室管膜瘤；卵巢上皮癌；食管癌；儿童食管癌；尤因氏家族肿瘤；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼内黑素瘤眼癌；成视网膜细胞瘤眼癌；胆囊癌；胃(胃部)癌；儿童胃(胃部)癌；胃肠类癌肿瘤；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；卵巢生殖细胞肿瘤；妊娠滋养细胞肿瘤；儿童脑干胶质瘤；儿童视路和下丘脑胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；成人(原发性)肝细胞(肝)癌；儿童(原发性)肝细胞(肝)癌；成人霍奇金氏淋巴瘤；儿童霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期霍奇金氏淋巴瘤；下咽癌；儿童下丘脑和视路胶质瘤；眼内黑素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西氏肉瘤；肾癌；喉癌；儿童喉癌；成人急性成淋巴细胞白血病；儿童急性成淋巴细胞白血病；成人急性髓样白血病；儿童急性髓样白血病；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓性白血病；毛细胞白血病；唇和口腔癌；成人(原发性)肝癌；儿童(原发性)肝癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；成人急性成淋巴细胞白血病；儿童急性成淋巴细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病；AIDS相关淋巴瘤；中枢神经系统(原发性)淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；成人霍奇金氏淋巴瘤；儿童霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期霍奇金氏淋巴瘤；成人非霍奇金氏淋巴瘤；儿童非霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期非霍奇金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Macroglobulinemia,Waldenstrom's)；男性乳腺癌；成人恶性间皮瘤；儿童恶性间皮瘤；恶性胸腺瘤；儿童成髓细胞瘤；黑素瘤；眼内黑素瘤；梅克尔细胞癌(Merkel Cell Carcinoma)；恶性间皮瘤；原发灶隐匿的转移性鳞状颈部癌；儿童多发性内分泌瘤形成综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物；蕈样肉芽肿病；骨髓增生异常综合征；慢性髓性白血病；儿童急性髓样白血病；多发性骨髓瘤；慢性骨髓增生性病症；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；儿童鼻咽癌；成神经细胞瘤；成人非霍奇金氏淋巴瘤；儿童非霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期非霍奇金氏淋巴瘤；非小细胞肺癌；儿童口腔癌；口腔和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/恶性骨纤维组织细胞瘤；儿童卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜能肿瘤；胰腺癌；儿童胰腺癌；胰岛细胞胰腺癌；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体肿瘤；浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤；胸膜肺胚细胞瘤；妊娠和乳腺癌；妊娠和霍奇金氏淋巴瘤；妊娠和非霍奇金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；成人原发性肝癌；儿童原发性肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；儿童肾细胞癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；成视网膜细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤；唾液腺癌；儿童唾液腺癌；尤因氏家族肿瘤肉瘤；卡波西氏肉瘤；肉瘤(骨肉瘤)/恶性骨纤维组织细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤肉瘤；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；塞扎里综合征(SezarySyndrome)；皮肤癌；儿童皮肤癌；皮肤癌(黑素瘤)；梅克尔细胞皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；原发灶隐匿的转移性鳞状颈部癌；胃部(胃)癌；儿童胃部(胃)癌；儿童幕上原始神经外胚层肿瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；睾丸癌；儿童胸腺瘤；恶性胸腺瘤；甲状腺癌；儿童甲状腺癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；妊娠滋养细胞肿瘤；原发部位未知的儿童癌症；不寻常的儿童癌症；输尿管和肾盂移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；儿童视路和下丘脑胶质瘤；外阴癌；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；和维尔姆斯氏肿瘤(Wilms'Tumor)。
其它示例性癌症包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和套细胞淋巴瘤(MCL)。
以上提及的癌症的转移也可根据本文所描述的方法来治疗或预防。
在一些实施方案中，这些方法可导致受试者的癌症的一种或多种症状的数目、严重性或频率降低(例如相较于在治疗之前受试者的癌症的一种或多种症状的数目、严重性或频率)。
在一些实施方案中，治疗受试者的疾病(例如癌症)的方法可以包括施用本文中的一种或多种ACC、一种或多种核酸、一种或多种载体、组合物(例如药物组合物)与一种或多种免疫检查点抑制剂(例如PD-1和/或PD-L1)的组合。免疫检查点抑制剂可以是针对PD-1或PD-L1的抗体，例如下表3中的那些抗体。
在本文所描述的任何方法的一些实施方案中，方法还包括向受试者施用额外治疗剂(例如表3中所列的治疗剂中的一者或多者)。
表3.额外治疗剂
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组合物/药盒
本文还提供了组合物(例如药物组合物)，所述组合物包括本文所描述的任何ACC、核酸和/或载体以及一种或多种(例如1、2、3、4或5种)药学上可接受的载体(例如本文所描述的任何药学上可接受的载体)、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，包括本文所描述的任何ACC、核酸和/或载体的组合物(例如药物组合物)可以安置在无菌小瓶或预装载注射器中。
在一些实施方案中，包括本文所描述的任何ACC的组合物(例如药物组合物)可以被配制用于不同施用途径(例如静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内或肿瘤内)。
在一些实施方案中，本文所描述的任何药物组合物都可包括一种或多种缓冲剂(例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、氨基酸(例如甘氨酸)、一种或多种碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、右旋糖酐或甘露糖醇)、一种或多种抗氧化剂、一种或多种螯合剂(例如EDTA或谷胱甘肽)、一种或多种防腐剂和/或药学上可接受的载剂(例如抑菌水、PBS或盐水)。
如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指可与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗微生物剂、等张剂和吸收延迟剂等。适合载体包括但不限于：水、盐水、林格氏溶液(ringer's solution)、右旋糖溶液和约5％人血清白蛋白。
在本文所描述的任何药物组合物的一些实施方案中，本文所描述的任何ACC与防止从身体的快速消除的载体一起制备，所述载体例如是持续和控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用生物可降解的生物可相容聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类药物组合物和制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。
本文还提供了包括本文所描述的任何ACC、包括本文所描述的任何ACC的任何组合物、或包括本文所描述的任何ACC的任何药物组合物的药盒。还提供了除本文所描述的ACC之外还包括一种或多种选自表3的第二治疗剂的药盒。一种或多种第二治疗剂可以与ACC分开的剂量施用形式提供。或者，一种或多种第二治疗剂可与ACC一起配制。
本文所描述的任何药盒都可包括关于使用本文所描述的任何组合物(例如药物组合物)和/或任何ACC的说明书。在一些实施方案中，药盒可包括关于进行本文所描述的任何方法的说明书。在一些实施方案中，药盒可包括至少一次剂量的本文所描述的任何组合物(例如药物组合物)。在一些实施方案中，药盒可提供用于施用本文所描述的任何药物组合物的注射器。
本公开包括以下方面，包括以下任何方面的任何组合：
1.一种可活化细胞因子构建体(ACC)，所述可活化细胞因子构建体包含：
第一单体构建体，所述第一单体构建体包含第一细胞因子蛋白(CP1)、第一可裂解部分(CM1)和第一空间掩蔽部分(SMM1)，其中所述CM1位于所述CP1与所述SMM1之间；
第二单体构建体，所述第二单体构建体包含第二细胞因子蛋白(CP2)、第二可裂解部分(CM2)和第二空间掩蔽部分(SMM2)，其中所述CM2位于所述CP2与所述SMM2之间；和
第三单体构建体，所述第三单体构建体包含第三细胞因子蛋白(CP3)、第三可裂解部分(CM3)和第三空间掩蔽部分(SMM3)，其中所述CM3位于所述CP3与所述SMM3之间，
其中：
所述CP1、所述CP2和所述CP3彼此结合，从而形成所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体的三聚体；并且
所述SMM1、所述SMM2和所述SMM3是球状分子。
2.如方面1所述的ACC，其中所述CP1、所述CP2和所述CP3是相同的细胞因子。
3.如方面2所述的ACC，其中所述细胞因子是肿瘤坏死因子或肿瘤坏死因子超家族的成员。
4.如方面2所述的ACC，其中所述CP1、所述CP2和所述CP3是肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)。
5.如方面2所述的ACC，其中所述CP1、所述CP2和所述CP3中的每一者包含与SEQ IDNO:54至少80％、90％、95％或99％同一的序列。
6.如方面1-5中任一项或组合所述的ACC，其中所述SMM1、所述SMM2和所述SMM3是相同的球状分子。
7.如方面6所述的ACC，其中所述球状分子是白蛋白。
8.如方面7所述的ACC，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
9.如方面7所述的ACC，其中所述白蛋白包含与人血清白蛋白至少80％、90％、95％或99％同一的序列。
10.如方面1-9中任一项或组合所述的ACC，其中所述第一单体构建体包含至少一个接头。
11.如方面10所述的ACC，其中所述至少一个接头包含安置在所述CP1与所述CM1之间的接头L1和/或在所述CM1与所述SMM1之间的接头L2。
12.如方面1-11中任一项或组合所述的ACC，其中所述第二单体构建体包含至少一个接头。
13.如方面12所述的ACC，其中所述至少一个接头包含安置在所述CP2与所述CM2之间的接头L3和/或在所述CM2与所述SMM2之间的接头L4。
14.如方面1-13中任一项或组合所述的ACC，其中所述第三单体构建体包含至少一个接头。
15.如方面14所述的ACC，其中所述至少一个接头包含安置在所述CP3与所述CM3之间的接头L5和/或在所述CM3与所述SMM3之间的接头L6。
16.如方面1-15中任一项或组合所述的ACC，其中：
所述第一单体构建体还包含第一亲和掩蔽部分(AMM1)和任选的位于所述AMM1与所述CP1之间的第四可裂解部分(CM4)，
所述第二单体构建体还包含第二亲和掩蔽部分(AMM2)和任选的位于所述AMM2与所述CP2之间的第五可裂解部分(CM5)，并且
所述第三单体构建体还包含第三亲和掩蔽部分(AMM3)和任选的位于所述AMM3与所述CP3之间的第六可裂解部分(CM6)。
17.如方面16所述的ACC，其中所述AMM1、所述AMM2和所述AMM3是相同的。
18.如方面16所述的ACC，其中所述AMM1、所述AMM2和所述AMM3中的每一者包含SEQID NO:61的序列。
19.如方面16所述的ACC，其中所述AMM1、所述AMM2和所述AMM3中的每一者包含与SEQ ID NO:61至少80％、90％、95％或99％同一的序列。
20.如方面1-19中任一项或组合所述的ACC，其中所述CM1、所述CM2和所述CM3包含相同蛋白酶的底物。
21.如方面1-19中任一项或组合所述的ACC，其中所述CM1、所述CM2和所述CM3包含不同蛋白酶的底物。
22.如方面1-19中任一项或组合所述的ACC，其中所述CM1、所述CM2和所述CM3中的每一者包含与SEQ ID NO:62或63至少95％同一的序列。
23.如方面16-22中任一项或组合所述的ACC，其中所述CM4、所述CM5和所述CM6包含相同蛋白酶的底物。
24.如方面16-22中任一项或组合所述的ACC，其中所述CM4、所述CM5和所述CM6包含不同蛋白酶的底物。
25.如方面16-22中任一项或组合所述的ACC，其中所述CM4、所述CM5和所述CM6中的每一者包含与SEQ ID NO:62或63至少95％同一的序列。
26.如方面20-25中任一项或组合所述的ACC，其中所述一种或多种蛋白酶由受试者的肿瘤产生。
27.如方面20-25中任一项或组合所述的ACC，其中所述一种或多种蛋白酶选自由以下组成的组：ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、BACE、肾素、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶14、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V/L2、组织蛋白酶X/Z/P、Cruzipain、豆荚蛋白、Otubain-2、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、穿膜肽酶、中性溶酶、PSMA、BMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-23、MMP-24、MMP-26、MMP-27、活化蛋白C、组织蛋白酶A、组织蛋白酶G、胃促胰酶、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、弹性蛋白酶、粒酶B、胍基苯甲酸酶、HtrA1、人嗜中性粒细胞裂解酶、乳铁蛋白、marapsin、NS3/4A、PACE4、纤溶酶、PSA、tPA、凝血酶、类胰蛋白酶、uPA、DESC1、DPP-4、FAP、肝丝酶、基质蛋白酶-2、MT-SP1/基质蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3和TMPRSS4。
28.如方面16-27中任一项或组合所述的ACC，其中所述第一单体构建体还包含在所述AMM1与所述CM4之间的接头L7和/或在所述CM4与所述CP1之间的接头L8。
29.如方面16-28中任一方面或组合所述的ACC，其中所述第二单体构建体还包含在所述AMM2与所述CM5之间的接头L9和/或在所述CM5与所述CP2之间的接头L10。
30.如方面16-29中任一项或组合所述的ACC，其中所述第三单体构建体还包含在所述AMM3与所述CM6之间的接头L11和/或在所述CM6与所述CP3之间的接头L12。
31.如方面11-30中任一项或组合所述的ACC，其中所述接头L1-L12中的每一者具有2至30个氨基酸的总长度。
32.如方面11-31中任一项或组合所述的ACC，其中所述接头L1-L12中的每一者独立地包含SEQ ID NO:64-69、75-77、GGS、SGG、GSG、GS或G中的任一者的序列。
33.如方面1-32中任一项或组合所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述CP1、所述CM1和所述SMM1，
所述第二单体构建体包含所述CP2、所述CM2和所述SMM2，并且
所述第三单体构建体包含所述CP3、所述CM3和所述SMM3。
34.如方面1-32中任一项或组合所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述SMM1、所述CM1和所述CP1，
所述第二单体构建体包含所述SMM2、所述CM2和所述CP2，并且
所述第三单体构建体包含所述SMM3、所述CM3和所述CP3。
35.如方面16-34中任一项或组合所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述AMM1、所述CM4、所述CP1、所述CM1和所述SMM1，
所述第二单体构建体包含所述AMM2、所述CM5、所述CP2、所述CM2和所述SMM2，并且
所述第三单体构建体包含所述AMM3、所述CM6、所述CP3、所述CM3和所述SMM3。
36.如方面16-34中任一项或组合所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述SMM1、所述AMM1、所述CM1和所述CP1；
所述第二单体构建体包含所述SMM2、所述AMM2、所述CM2和所述CP2，并且
所述第三单体构建体包含所述SMM3、所述AMM3、所述CM3和所述CP3。
37.如方面16-34中任一项或组合所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述AMM1、所述SMM1、所述CM1和所述CP1；
所述第二单体构建体包含所述AMM2、所述SMM2、所述CM2和所述CP2，并且
所述第三单体构建体包含所述AMM3、所述SMM3、所述CM3和所述CP3。
38.如方面16-34中任一项或组合所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述SMM1、所述CM1、所述CP1、所述CM4和AMM1，
所述第二单体构建体包含所述SMM2、所述CM2、所述CP2、所述CM5和AMM2，并且
所述第三单体构建体包含所述SMM3、所述CM3、所述CP3、所述CM6和所述AMM3。
39.如方面16-34中任一项或组合所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述CP1、所述CM1、所述AMM1和所述SMM1；
所述第二单体构建体包含所述CP2、所述CM2、所述AMM2和所述SMM2；并且
所述第三单体构建体包含所述CP3、所述CM3、所述AMM3和所述SMM3。
40.如方面16-34中任一项或组合所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述CP1、所述CM1、所述SMM1和所述AMM1；
所述第一单体构建体包含所述CP2、所述CM2、所述SMM2和所述AMM2；并且
所述第一单体构建体包含所述CP3、所述CM3、所述SMM3和所述AMM3。
41.如方面1-40中任一项或组合所述的ACC，其中，在非活性状态下，所述ACC的特征在于相较于所述CP1、所述CP2、所述CP3或其三聚体中的至少一者的活性的对照水平，具有降低的所述CP1、所述CP2、所述CP3或其三聚体中的至少一者的所述活性的水平。
42.如方面41所述的ACC，其中所述ACC的特征在于相较于不包含空间掩蔽部分或亲和掩蔽部分的CP1、CP2和CP3的对照三聚体的活性，CP1、CP2和CP3的所述三聚体的活性降低至少2倍、5倍、10倍、500倍、103倍、104倍、105倍或106倍。
43.如方面41或42所述的ACC，其中所述活性是疱疹病毒进入介体(HVEM)的活化。
44.如方面41或42所述的ACC，其中所述活性是淋巴毒素β受体的活化。
45.如方面41或42所述的ACC，其中所述活性是疱疹病毒进入介体(HVEM)的活化和淋巴毒素β受体的活化。
46.如方面41-45中任一项或组合所述的ACC，其中CP1、CP2和CP3的所述对照三聚体由所述ACC的活化产生。
47.一种可活化细胞因子构建体(ACC)，所述可活化细胞因子构建体包含：
第一单体构建体，所述第一单体构建体包含第一细胞因子蛋白(CP1)、第一可裂解部分(CM1)和第一亲和掩蔽部分(AMM1)，其中所述CM1位于所述CP1与所述AMM1之间；
第二单体构建体，所述第二单体构建体包含第二细胞因子蛋白(CP2)、第二可裂解部分(CM2)和第二亲和掩蔽部分(AMM2)，其中所述CM2位于所述CP2与所述AMM2之间；和
第三单体构建体，所述第三单体构建体包含第三细胞因子蛋白(CP3)、第三可裂解部分(CM3)和第三亲和空间掩蔽部分(AMM3)，其中所述CM3位于所述CP3与所述AMM3之间，
其中所述CP1、所述CP2和所述CP3彼此结合，从而形成所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体的三聚体。
48.如方面1-47中任一项或组合所述的ACC，其中所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体是相同的。
49.如方面1-48中任一项或组合所述的ACC，其中所述ACC不包含除CP1、CP2和CP3以外的促进三聚体形成的任何结构域。
50.如方面49所述的ACC，其中所述ACC不包含共价连接所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体的除所述CP1、所述CP2和所述CP3以外的任何结构域。
51.如方面49所述的ACC，其中所述ACC不包含卷曲螺旋结构域、Fc结构域，或能够形成二硫键的除所述CP1、所述CP2或所述CP3以外的结构域。
52.如方面1-51中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1、CP2和CP3是相同的并且各自包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
53.如方面46所述的ACC，其中所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体是相同的并且每个单体包含：
a.SEQ ID NO:54的氨基酸序列；和
b.包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列的AMM；和
c.包含白蛋白的SMM。
54.一种组合物，所述组合物包含方面1-53中任一项或组合所述的ACC。
55.如方面54所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
56.一种容器、小瓶、注射器、注射笔或药盒，所述容器、小瓶、注射器、注射笔或药盒包括至少一次剂量的方面54或55所述的组合物。
57.一种编码多肽的核酸，所述多肽包含方面1-53中任一项或组合所述的ACC的所述第一单体构建体、所述第二单体构建体或所述第三单体构建体中的至少一者。
58.如方面57所述的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:9、11、13、25、31、41、43、45或47中的任一者的序列。
59.一种核酸组，所述核酸组一起编码包含方面1-53中任一项或组合所述的ACC中的所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体的多肽。
60.一种载体，所述载体包含方面57-59中任一项所述的核酸或核酸组。
61.一种细胞，所述细胞包含方面57-59中任一项或组合所述的核酸或方面60的载体。
62.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的方面1-53中任一项或组合所述的ACC或方面54或55所述的组合物。
63.如方面62所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。
64.如方面62或63所述的方法，所述方法还包括施用免疫检查点抑制剂。
65.如方面64所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
66.一种产生ACC的方法，所述方法包括：
在足以产生所述ACC的条件下在液体培养基中培养方面61所述的细胞；以及
从所述细胞或所述液体培养基回收所述ACC。
67.如方面66所述的方法，所述方法还包括使用亲和色谱法纯化所回收的ACC。
68.如方面66或67所述的方法，所述方法还包括将所回收的ACC配制成药物组合物。
实施例
本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求中所述的本发明的范围。
实施例1：经非可裂解HSA空间掩蔽物工程改造的LIGHT细胞因子构建体的活性
通过重组方法制备细胞因子构建体LIGHT-21接头_HSA_Myc_cMyc(ProC1184)。这种构建体的第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体是相同的，各自是具有图2A(SEQ ID NO:102)中所示的氨基酸序列的多肽。第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体中的每一者从N末端至C末端包含来自小鼠IgGκ信号序列(SEQ ID NO:78)的经修饰信号序列、对应于截短人类LIGHT多肽(SEQ ID NO:54)(即人类LIGHT的胞外域结构域，对应于SEQ ID NO:79的残基85-240)的成熟细胞因子蛋白、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的非可裂解接头、人血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO:56)、具有SGG的非可裂解接头和具有SEQ ID NO:59的Myc标签序列。通过用具有SEQ ID NO:103的序列的多核苷酸对宿主细胞进行转化，随后培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得到的所表达多肽的三聚化产生细胞因子构建体LIGHT-21接头_HSA_cMyc。使用HSA亲和柱(例如POROS CaptureSelect HSA树脂)，必要时随后使用尺寸排阻色谱法(SEC)纯化所表达的三聚多肽，以获得至少95％纯度的三聚蛋白。所测定的最终细胞因子构建体不包括信号序列。
通过重组方法还制备细胞因子构建体LIGHT-10GS-Strep(Proc1188)。这种CC的第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体是相同的，各自是具有图2A(SEQ ID NO:86)中所示的氨基酸序列的多肽。第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体中的每一者从N末端至C末端包含来自小鼠IgGκ信号序列(SEQ ID NO:78)的经修饰信号序列、对应于截短人类LIGHT多肽(SEQ ID NO:54)的成熟细胞因子蛋白、具有SEQ ID NO:66的序列的非可裂解接头和Strep标签序列(SEQ ID NO:60)。通过用具有SEQ ID NO:87的序列的多核苷酸对宿主细胞进行转化，随后培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得到的所表达多肽的三聚化产生细胞因子构建体LIGHT-10GS-Strep。使用链霉亲和素亲和柱(例如链霉亲和素琼脂糖树脂)，必要时随后使用尺寸排阻色谱法(SEC)纯化所表达的三聚多肽，以获得至少95％纯度的三聚蛋白。所测定的最终细胞因子构建体不具有信号序列。
如下文所描述，使用基于HVEM细胞的测定和基于淋巴毒素β受体细胞的测定(A375IL-8ELISA)来评价LIGHT细胞因子的活性。
使用表达萤火虫荧光素酶基因(BPS Biosciences#79310)的重组人类HVEM/NF-kB报告体Jurkat细胞系在体外测试每个细胞因子构建体的活性。在补充有10％ HI FBS(热灭活胎牛血清)和1％ Pen/Strep(青霉素-链霉素)的RPMI 1640培养基中培养细胞。将LIGHT添加至这些细胞中会活化HVEM受体并且随后向NF-kB转录因子传导信号以结合至诱导荧光素酶报告基因转录所需的DNA元件。可以使用ONE-Glo荧光素酶测定系统(可从Promega商购获得)来定量荧光素酶报告基因的表达。
以390,000个细胞/毫升的浓度在补充有10％ HI FBS的RPMI 1640培养基(ThermoFisher Scientific，例如目录号11875093)中制备LIGHT响应性Jurkat HVEM/NF-kB荧光素酶报告体细胞，并且将90μL等分试样吸移至白色平底96孔板的孔中(35,000个细胞/孔)。在补充有10％ HI FBS的RPMI 1640培养基中将测试的细胞因子稀释至450nM的起始浓度。制备一式两份的四倍连续稀释液，从中将10μL添加至每个孔中。将板以250rpm振荡1-2分钟，然后放置于37℃孵育箱中持续4小时。孵育4小时后，将板从孵育箱中移出并且平衡至室温。通过将ONE-Glo测定缓冲液的内含物转移至冻干的ONE-Glo测定底物并倒置直到底物完全溶解来制备ONE-Glo荧光素酶试剂。将试剂的15mL等分试样储存在-20℃下并且在测定当天避免直接光照解冻至室温。一旦试剂和板平衡至室温，将ONE-Glo荧光素酶试剂的100μL等分试样吸移至板的每个孔中。将板放置于经封盖以避免直接光照的250rpm板振荡器上持续1-2分钟。充分混合后，使用Tecan Infinite M Plex多模式板读取器测量荧光素酶表达。使用GraphPad Prism软件，通过S形拟合非线性回归产生剂量-反应曲线并获得EC50值。
使用A375细胞，一种具有淋巴毒素β受体(LTbR)的高表达的人类黑素瘤细胞系，在体外测试每个细胞因子构建体的活性。在补充有10％ HI FBS和1％ Pen/Strep的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)培养基中培养细胞。将LIGHT添加至这些细胞中会活化LTbR，此调节多种炎症信号，包括IL-8的分泌。可以使用人类IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA试剂盒(R&DSystems，目录号DY208)测量由LTbR活化的A375细胞进行的IL-8分泌。
以400,000个细胞/毫升的浓度在补充有10％ HI FBS的DMEM培养基中制备A375细胞，并且将100μL等分试样吸移至透明平底96孔板的孔中(40,000个细胞/孔)。在37℃下将板孵育3-5小时。孵育之后，在补充有10％ HI FBS的DMEM培养基中将测试的细胞因子稀释至5nM或400nM的起始浓度。制备一式两份的四倍连续稀释液，从中将100μL添加至每个孔中。将板轻扣以进行混合，然后放置于37℃孵育箱中过夜。同一天，用R&D Systems IL-8ELISA试剂盒中提供的IL-8捕获抗体的100μL推荐稀释液涂布另一个透明平底96孔板。然后将板封盖并且在室温下孵育过夜。第二天，通过遵循R&D IL-8ELISA试剂盒中提供的方案分析IL-8产生。一旦完成，使用分光光度计在450nm下测量IL-8水平。使用GraphPad Prism软件，通过S形拟合非线性回归产生剂量-反应曲线并获得EC50值。
图2A和图2B中的数据显示，相较于LIGHT构建体ProC1188(经短的非可裂解Strep标签工程改造)，构建体ProC1184(在其C末端最末端部分经非可裂解HSA部分工程改造)的LIGHT活性有所降低。这个数据指示，非可裂解HSA部分提供空间位阻，从而阻断LIGHT与其受体的啮合和下游信号传导的活化。从HVEM测定结果和淋巴毒素β受体测定来计算ProC1184和ProC1188的EC50值，并且分别提供于下表4和表5中。
表4.EC50[nM]：HVEM报告体测定
ProC1184 ProC1188
EC50 >10e6 0.8433
表5.EC50[pM]：淋巴毒素β受体报告体测定
ProC1184 ProC1188
EC50 79.3 5.3
上表4中的数据指示，如通过在HVEM报告体测定中比较对照ProC1188三聚体的EC50与经掩蔽的ProC1184的EC50所计算，ProC1184的掩蔽效率极高(例如大于106倍(一百万倍))。
实施例2：经可裂解亲和肽掩蔽物工程改造的LIGHT细胞因子构建体的活性
通过重组方法制备细胞因子构建体ProC_mLm16_1490_LIGHT-10GS-Strep(ProC1192)。这种ACC的第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体是相同的，各自是具有图3A(SEQ ID NO:88)中所示的氨基酸序列的多肽。第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体中的每一者从N末端至C末端包含来自经修饰的小鼠IgGκ信号序列(SEQ IDNO:78)的信号序列、头部序列(SEQ ID NO:76)、具有SEQ ID NO:61的序列的亲和掩蔽肽、具有SEQ ID NO:68的序列的接头、具有SEQ ID NO:62的序列的可裂解部分、具有GGS的序列的接头、对应于截短人类LIGHT多肽(SEQ ID NO:54)(即人类LIGHT的胞外域结构域，对应于SEQ ID NO:79的残基85-240)的成熟细胞因子蛋白、具有SEQ ID NO:66的序列的非可裂解接头和Strep标签序列(SEQ ID NO:60)。通过用具有SEQ ID NO:89的序列的多核苷酸对宿主细胞进行转化，随后培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得到的所表达多肽的三聚化产生细胞因子构建体ProC_mLm16_1490_LIGHT-10GS-Strep。所测定的最终细胞因子构建体不具有信号序列。
图3A和图3B中的数据显示，相较于经短的非可裂解Strep标签工程改造的LIGHT构建体ProC1188，在其N末端最末端部分经可裂解亲和肽掩蔽物工程改造的ACC ProC1192的LIGHT活性有所降低。这个数据指示，可裂解亲和肽掩蔽物通过阻断LIGHT与其受体的啮合和下游信号传导的活化来提供有效掩蔽。
为了裂解亲和肽掩蔽物，在37℃下用重组人类蛋白酶，诸如尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)处理含有LIGHT的ACC过夜。来自这些测定的结果(图3A和图3B)指示，用蛋白酶处理含有LIGHT的ACC可以将活性恢复至与未经掩蔽部分(未经亲和肽掩蔽物或HSA部分)工程改造的LIGHT细胞因子相当的水平。
从HVEM测定结果和淋巴毒素β受体测定来计算ProC1192和ProC1188的EC50值，并且分别提供于下表6和表7中。
表6.EC50[nM]：HVEM报告体测定
ProC1192 ProC1192+uPa ProC1188
EC50 25.6 0.999 1.0
表7.EC50[pM]：淋巴毒素β受体报告体测定
ProC1192 ProC1192+uPa ProC1188
EC50 31.3 2.0 5.3
上表6中的数据指示，如通过在HVEM报告体测定中比较对照ProC1188三聚体或蛋白酶活化的ProC1192的EC50与经掩蔽的ProC1184的EC50所计算，ProC1192的掩蔽效率大于20倍。
实施例3：经可裂解亲和肽掩蔽物和非可裂解HSA空间掩蔽部分工程改造的LIGHT细胞因子构建体的活性
通过重组方法制备细胞因子构建体ProC_mLm-16_1490_LIGHT_21接头_HSA-cMyc(ProC1163)。这种CC的第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体是相同的，各自是具有SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列的多肽。第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体中的每一者从N末端至C末端包含来自经修饰的小鼠IgGκ信号序列(SEQ ID NO:78)的信号序列、头部序列(SEQ ID NO:76)、具有SEQ ID NO:61的序列的掩蔽肽、具有SEQ IDNO:68的序列的接头、具有SEQ ID NO:62的序列的可裂解部分、具有GGS的序列的接头、对应于截短人类LIGHT多肽(SEQ ID NO:54)(即人类LIGHT的胞外域结构域，对应于SEQ ID NO:79的残基85-240)的成熟细胞因子蛋白、具有SEQ ID NO:65的非可裂解接头、人血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO:56)、具有SGG的序列的非可裂解接头和Myc标签序列(SE ID NO:59)。通过用具有SEQ ID NO:131的序列的多核苷酸对宿主细胞进行转化，随后培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得到的所表达多肽的三聚化产生细胞因子构建体ProC_mLm-16_1490_LIGHT-21接头_HSA_cMyc。使用HSA亲和柱(例如POROS CaptureSelect HSA树脂)，必要时随后使用尺寸排阻色谱法(SEC)纯化所表达的三聚多肽，以获得至少95％纯度的三聚蛋白。所测定的最终细胞因子构建体不具有信号序列。
图4A和图4B中的数据显示，相较于经非可裂解HSA部分工程改造的LIGHT构建体ProC1184，在其C末端最末端部分经非可裂解HSA部分工程改造并且在其N末端最末端部分经可裂解亲和肽工程改造的ACC ProC1163的LIGHT的活性有所降低。这个数据指示，非可裂解HSA部分和可裂解亲和肽可以各自独立地降低LIGHT活性。还指示两种方法可以组合以进一步降低LIGHT信号传导活性。图4C类似地显示，相较于LIGHT构建体ProC1184(非可裂解HSA部分)，ACC ProC1163(除非可裂解HSA部分以外还具有肽掩蔽物)的LIGHT活性有所降低，并且uPa蛋白酶活化的ProC1163 ACC的
实施例4：经可裂解亲和肽掩蔽物和可裂解HSA空间掩蔽部分工程改造的LIGHT可活化细胞因子构建体的活性
通过重组方法制备细胞因子构建体ProC_LIGHT-1204DNI-HSA-His(ProC1491)。这种ACC的第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体是相同的，各自是具有图5A(SEQID NO:90)中所示的氨基酸序列的多肽。第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体中的每一者从N末端至C末端包含来自小鼠IgGκ信号序列(SEQ ID NO:78)的经修饰信号序列、对应于截短人类LIGHT多肽(SEQ ID NO:54)(即人类LIGHT的胞外域结构域，对应于SEQID NO:79的残基85-240)的成熟细胞因子蛋白、具有SEQ ID NO:64的接头、具有SEQ ID NO:63的可裂解部分、具有GS的序列的接头、人血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO:56)、具有S的序列的接头和具有SEQ ID NO:58的His标签。通过用具有SEQ ID NO:91的序列的多核苷酸对宿主细胞进行转化，随后培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得到的所表达多肽的三聚化产生细胞因子构建体ProC_LIGHT-1204DNI-HSA-His。所测定的最终细胞因子构建体不具有信号序列。
通过重组方法制备细胞因子构建体ProC_mLm16-LIGHT-1204DNI-HSA-His(ProC1492)。这种ACC的第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体是相同的，各自是具有图5A(SEQ ID NO:92)中所示的氨基酸序列的多肽。第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体中的每一者从N末端至C末端包含来自小鼠IgGκ信号序列(SEQ ID NO:78)的经修饰信号序列、SEQ ID NO:76的头部序列、具有SEQ ID NO:61的序列的掩蔽肽、具有SEQID NO:68的序列的接头、具有SEQ ID NO:81的序列的可裂解部分、具有GGS的序列的接头、对应于截短人类LIGHT多肽(SEQ ID NO:54)(即人类LIGHT的胞外域结构域，对应于SEQ IDNO:79的残基85-240)的成熟细胞因子蛋白、具有SEQ ID NO:64的接头、具有SEQ ID NO:63的可裂解部分、具有序列GS的接头、人血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO:56)、具有序列S的接头和具有SEQ ID NO:58的序列的His标签。通过用具有SEQ ID NO:93的序列的多核苷酸对宿主细胞进行转化，随后培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得到的所表达多肽的三聚化产生细胞因子构建体ProC_mLm16-LIGHT-1204DNI-HSA-His。所测定的最终细胞因子构建体不具有信号序列。
图5A中的数据显示，在HVEM报告体测定中，相较于在其C末端最末端部分仅含有可裂解HSA部分(单掩蔽)的LIGHT ProC1491的活性，在其N末端最末端部分含有可裂解肽掩蔽物并且在其C末端最末端部分含有可裂解HSA部分(双重掩蔽)的LIGHT ProC1492的活性进一步降低。在由uPa进行蛋白酶活化后，ProC1491和ProC1492损失其掩蔽潜力并且恢复LIGHT细胞因子活性。
图5B中的数据显示，在淋巴毒素β受体测定(A375 IL-8ELISA)中，相较于未掩蔽的LIGHT ProC1189，ProC1491和ProC1492两者均具有降低的活性。在由uPa进行蛋白酶活化后，类似于LIGHT ProC1189，ProC1491和ProC1492均恢复活性。
从HVEM测定结果和淋巴毒素β受体测定来计算ProC1491和ProC1492的EC50值，并且分别提供于下表8和表9中。
表8.EC50[nM]：HVEM报告体测定
ProC1491 ProC1491+uPa ProC1492 ProC1492+uPa
EC50 10.51 1.3 67.5 7.7
表9.EC50[pM]：淋巴毒素β受体报告体测定
ProC1491 ProC1491+uPa ProC1492 ProC1492+uPa
EC50 437.2 3.2 671.3 不明确
总之，这些数据指示，HVEM和淋巴毒素β受体通路两者的LIGHT活化可以通过将可裂解肽亲和掩蔽物(亲和掩蔽部分)和可裂解HSA部分(空间掩蔽部分)中的任一者或组合添加至LIGHT蛋白质中来降低。在蛋白酶活化后，LIGHT恢复其完全信号传导潜力。
实施例6.额外细胞因子构建体的体外表征
通过重组方法还制备额外可活化细胞因子构建体。这些ACC的第1单体构建体、第2单体构建体和第3单体构建体是相同的。
在一些ACC中，在LIGHT的N末端最末端部分对HSA部分进行工程改造，并且在LIGHT的C末端最末端部分对亲和肽掩蔽物进行工程改造。
细胞因子构建体ProC_cMyc-HSA-21GS-1204DNI-LIGHT(ProC1497)(SEQ ID NO:120)从N末端至C末端包含来自小鼠IgGκ信号序列(SEQ ID NO:78)的经修饰信号序列、具有GSG的序列的接头、具有SEQ ID NO:59的序列的Myc标签、具有G的序列的接头、人血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO:56)、具有SEQ ID NO:64的接头、具有SEQ ID NO:63的可裂解部分、具有GS的接头和对应于截短人类LIGHT多肽(SEQ ID NO:54)(即人类LIGHT的胞外域结构域，对应于SEQ ID NO:79的残基85-240)的成熟细胞因子蛋白。通过用具有SEQ ID NO:121的序列的多核苷酸对宿主细胞进行转化，随后培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得到的所表达多肽的三聚化产生细胞因子构建体ProC_cMyc-HSA-21GS-1204DNI-LIGHT。所测定的最终细胞因子构建体不具有信号序列。
细胞因子构建体ProC_cMyc-HSA-21GS-1204DNI-LIGHT-mLm16(ProC1498)(SEQ IDNO:126)从N末端至C末端包含来自经修饰的小鼠IgGκ信号序列(SEQ ID NO:78)的信号序列、具有GSG的序列的接头、具有SEQ ID NO:59的Myc标签、具有G的序列的接头、人血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO:56)、具有SEQ ID NO:64的接头、具有SEQ ID NO:63的可裂解部分、具有GS的接头、对应于截短人类LIGHT多肽(SEQ ID NO:54)(即人类LIGHT的胞外域结构域，对应于SEQ ID NO:79的残基85-240)的成熟细胞因子蛋白、具有SEQ ID NO:75的接头、具有SEQ ID NO:62的可裂解部分、具有SEQ ID NO:68的接头和具有SEQ ID NO:61的序列的掩蔽肽。通过用具有SEQ ID NO:127的序列的多核苷酸对宿主细胞进行转化，随后培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得到的所表达多肽的三聚化产生细胞因子构建体ProC_cMyc-HSA-21GS-1204DNI-LIGHT-mLm16。所测定的最终细胞因子构建体不具有信号序列。
图6A中的数据显示，在HVEM报告体测定中，相较于未经掩蔽物工程改造的LIGHTProC1189，在其N末端最末端部分经可裂解HSA部分工程改造的ACC ProC1497的活性或在其N末端最末端部分经可裂解HSA部分工程改造并且在其C末端最末端部分经可裂解亲和肽掩蔽物工程改造的ACC ProC1498的活性显著降低。相较于ProC1497的活性，ProC1498的活性进一步降低。还指示可以将在LIGHT的C末端或N末端最末端部分添加肽亲和掩蔽物和HSA部分组合以进一步降低LIGHT信号传导活性。在由uPa进行蛋白酶活化后，类似于LIGHTProC1189，ProC1497和ProC1498两者均恢复活性。
从HVEM测定结果来计算ProC1497和ProC1498的EC50值，提供于下表10中。
表10.EC50[nM]：HVEM报告体测定
上表10中的数据指示，如通过在HVEM报告体测定中比较完整ProC1497 ACC的EC50与uPa蛋白酶裂解的(活化的)ProC1497 ACC的EC50所计算，ProC1497的掩蔽效率是22倍(22X)。表10中的数据指示，如通过在HVEM报告体测定中比较完整ProC1498 ACC的EC50与uPa蛋白酶裂解的(活化的)ProC1498 ACC的EC50所计算，ProC1498的掩蔽效率极高(例如大于106倍(一百万倍))。经掩蔽的ACC ProC1498的EC50值不可检测(n.d.)，这是因为在HVEM报告体测定中测试的浓度下检测不到细胞因子活性。
在一些ACC中，在LIGHT的同一最末端部分(N末端或C末端)对HSA部分和亲和肽掩蔽物进行工程改造，使得单一可裂解部分(CM)可以被裂解以去除HSA部分和亲和肽掩蔽物两者。
细胞因子构建体ProC_cMyc-HSA-mLm16-1490DNI-LIGHT(ProC1488)(SEQ ID NO:124)从N末端至C末端包含来自经修饰的小鼠IgGκ信号序列(SEQ ID NO:78)的信号序列、具有GSG的序列的接头、具有SEQ ID NO:59的Myc标签、具有G的序列的接头、人血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO:56)、具有SEQ ID NO:67的接头、具有序列(SEQ ID NO:76)的头部、具有SEQ ID NO:61的序列的亲和掩蔽肽、具有SEQ ID NO:68的接头、具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的可裂解部分、具有GGS的接头和对应于截短人类LIGHT多肽(SEQ ID NO:54)的成熟细胞因子蛋白。通过用具有SEQ ID NO:125的序列的多核苷酸对宿主细胞进行转化，随后培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得到的所表达多肽的三聚化产生细胞因子构建体ProC_cMyc-HSA-mLm16-1490DNI-LIGHT。所测定的最终细胞因子构建体不具有信号序列。
细胞因子构建体ProC_LIGHT-1490DNI-mLm16-HSA-cMyc(ProC1489)从N末端至C末端包含来自小鼠IgGκ信号序列(SEQ ID NO:122)的经修饰信号序列、对应于截短人类LIGHT多肽(SEQ ID NO:54)(即人类LIGHT的胞外域结构域，对应于SEQ ID NO:79的残基85-240)的成熟细胞因子蛋白、具有SEQ ID NO:75的接头、具有SEQ ID NO:62的可裂解部分、具有SEQ ID NO:68的接头、具有SEQ ID NO:61的序列的掩蔽肽、具有SEQ ID NO:66的接头、人血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO:56)、具有S的序列的接头和具有SEQ ID NO:59的Myc标签。通过用具有SEQ ID NO:123的序列的多核苷酸对宿主细胞进行转化，随后培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得到的所表达多肽的三聚化产生细胞因子构建体ProC_LIGHT-1490DNI-mLm16-HSA-cMyc。所测定的最终细胞因子构建体不具有信号序列。
在HVEM测定中评价ACC ProC1488和ProC1489的活性。图6B中的数据显示，当在LIGHT的同一最末端部分(N末端或C末端)对HSA部分和亲和肽掩蔽物进行工程改造时，相较于未掩蔽的LIGHT ProC1189，LIGHT活性显著降低。在由uPa进行蛋白酶活化后，类似于LIGHT ProC1189，ProC1488和ProC1489均恢复活性。
从HVEM测定结果来计算ProC1488和ProC1489的EC50值，提供于下表11中。
表11.EC50[nM]：HVEM报告体测定
经掩蔽的ACC ProC1488和ProC1489的EC50值不可检测(n.d.)，这是因为在HVEM报告体测定中测试的浓度下检测不到细胞因子活性。这指示LIGHT细胞因子的掩蔽很有效。上表11中的数据指示，如通过在HVEM报告体测定中比较完整ProC1488 ACC的EC50与uPa蛋白酶裂解的(活化的)ProC1488 ACC的EC50所计算，ProC1488的掩蔽效率极高(例如大于106倍(一百万倍))。表11中的数据指示，如通过在HVEM报告体测定中比较完整ProC1489 ACC的EC50与uPa蛋白酶裂解的(活化的)ProC1489 ACC的EC50所计算，大于106(一百万倍)的ProC1489的掩蔽效率极高(例如大于106倍(一百万倍))。
实施例7.人类-小鼠交叉反应性LIGHT ACC的体外表征
Tang等(Cancer Cell.2016年3月14日；29(3):285-296)先前已报导，人类LIGHT(SEQ ID No:55)中的4点突变保留与人类HVEM和淋巴毒素β受体的结合，但赋予与小鼠HVEM和淋巴毒素β受体的结合。
已分别类似于ProC1491和ProC1492对ACC ProC1486(ProC_mhLIGHT_1204DNI_HSA-cMyc)和ProC1487(ProC_mLm-16_mhLIGHT_1204DNI_HSA-cMyc)进行工程改造，不同之处在于ProC1486和ProC1487含有对应于具有四点突变的人类LIGHT的胞外域的成熟细胞因子蛋白(Tang等)并且C末端接头(SGG)和cMyc标签(SEQ ID NO:59)代替ProC1491和1492上存在的接头和His标签。ProC1491和1492含有对应于人类LIGHT的胞外域的非突变成熟细胞因子蛋白。
通过流式细胞计量术评价ProC1486和ProC1487与小鼠和人类淋巴毒素β受体的结合。使用MC38细胞系评价与小鼠受体的结合。使用A375细胞系评价与人类受体的结合。用PE缀合的抗人CD258(LIGHT)抗体[Biolegend目录号：318706克隆体：T5-39]检测ProC1486或ProC1487与小鼠或人类受体的啮合。图7A中的数据显示，ProC1486和ProC1487不结合至A375或MC38。在用uPa进行蛋白酶处理后，ProC1486和ProC1487两者均恢复与人类和小鼠淋巴毒素β受体的结合。这指示经可裂解HSA部分和/或可裂解肽亲和掩蔽物工程改造的人类/小鼠LIGHT ACC与小鼠或人类淋巴毒素β受体的结合减少或没有结合。在蛋白酶活化后，结合恢复。
在如先前所描述的HVEM报告体测定和A375-IL8报告体测定中评价ACC ProC1486和ProC1487的活性。
图7B和图7C中的数据显示，ProC1486和ProC1487的活性在HVEM测定中几乎消除并且在淋巴毒素β受体测定中有所降低。在淋巴毒素β受体测定中，相较于仅用HSA部分工程改造的ProC1486，经肽亲和掩蔽物和HSA部分两者工程改造的ProC1487的活性进一步降低。这个数据指示，用以降低人类LIGHT活性的相同肽亲和掩蔽物和HSA部分可以用于降低人类-小鼠交叉反应性LIGHT ACC的活性。在用uPa进行蛋白酶活化后，ProC1486和ProC1487的活性显著增加。
已类似于ProC1488对ACC ProC2076(ProC_cMyc-HSA-mLm16-1490-mhLIGHT)进行工程改造，不同之处在于ProC2076含有对应于具有四点突变的人类LIGHT的胞外域的成熟细胞因子蛋白(Tang等,Cancer Cell.2016年3月14日；29(3):285-296)。
在小鼠HVEM报告体测定中评价ACC ProC1486、ProC1487和ProC2076的活性。通过用小鼠HVEM质粒(Origene,#MC212911)转染NF-kB luc-报告体HEK-293s(BPSBioscience,#60650)来产生小鼠HVEM报告体细胞系。使用LipofectamineTM2000转染试剂(ThermoFisher,#11668019)转染细胞。使用0.8mg/mL遗传霉素(Geneticin)(ThermoFisher,#10131035)选择表达小鼠HVEM的细胞。
在补充有10％ HI FBS(热灭活胎牛血清)、1％ Pen/Strep(青霉素-链霉素)、非必需氨基酸(ThermoFisher,#11140050)、丙酮酸钠(ThermoFisher,#J61840.18)、50ug/mL潮霉素B(Hygromycin B)(Thermofisher,#10687010)和0.8mg/mL遗传霉素(ThermoFisher,#10131035)的MEM培养基中培养细胞。将人类-小鼠交叉反应性LIGHT添加至这些细胞中会活化小鼠HVEM受体并且随后向NF-kB转录因子传导信号以结合至诱导荧光素酶报告基因转录所需的DNA元件。使用ONE-Glo荧光素酶测定系统(可从Promega商购获得)来定量荧光素酶报告基因的表达。
将LIGHT响应性Jurkat HVEM/NF-kB荧光素酶报告体细胞在补充有10％ HI FBS的DMEM培养基(ThermoFisher Scientific，例如目录号10564011)以每孔20,000个细胞铺于白色平底96孔板中。孵育过夜后，抽吸出培养基。在补充有10％ HI FBS的DMEM培养基中将测试的细胞因子稀释至25nM的起始浓度。制备一式两份的五倍连续稀释液，从中将100μL添加至每个孔中。将板以250rpm振荡1-2分钟，然后放置于37℃孵育箱中4小时。孵育5小时后，将板从孵育箱中移出并且平衡至室温。通过将ONE-Glo测定缓冲液的内含物转移至冻干的ONE-Glo测定底物并倒置直到底物完全溶解来制备ONE-Glo荧光素酶试剂。将试剂的15mL等分试样储存在-20℃下并且在测定当天避免直接光照解冻至室温。一旦试剂和板平衡至室温，将ONE-Glo荧光素酶试剂的100μL等分试样吸移至板的每个孔中。将板放置于经封盖以避免直接光照的250rpm板振荡器上持续1-2分钟。充分混合后，使用Tecan Infinite MPlex多模式板读取器测量荧光素酶表达。使用GraphPad Prism软件，通过S形拟合非线性回归产生剂量-反应曲线并获得EC50值。
图8A和图8B中的数据显示，在HVEM测定中，ProC1486、ProC1487和ProC2076的活性显著降低。相较于在其N末端最末端部分经可裂解HSA部分和肽亲和掩蔽物工程改造的ProC2076，在其C末端最末端部分经可裂解HSA部分工程改造的ProC2076的活性(图8A)和在其C末端最末端部分经可裂解HSA部分工程改造并且在其N末端最末端部分经可裂解亲和肽掩蔽物工程改造的ProC1487的活性(图8.B)进一步降低。在用uPa进行蛋白酶活化后，ProC1486、ProC1487和ProC2076的活性显著增加(图8A和图8B)。
实施例8.人类LIGHT ACC在HT-29异种移植小鼠中的体内表征。
在HT-29异种移植模型中评价在LIGHT的C末端最末端部分经可裂解HSA结构域工程改造的人类LIGHT ACC ProC1491的抗肿瘤体内活性和在LIGHT的C末端最末端部分经His标签工程改造的人类LIGHT ProC1189的抗肿瘤活性。在HT29和WiDr结肠癌模型中，由其配体淋巴毒素-α/β、LIGHT或激动性mAb诱导的LTβR活化在体外和体内均触发IFNg依赖性肿瘤生长抑制(Lukashev等,Cancer Research,2006)。
为了评价ProC1491和ProC1189的体内抗肿瘤活性，在第0天，将含2x106个HT29-Luc2肿瘤细胞的100μL无血清RPMI皮下注射于7-8周雌性nu/nu小鼠的侧腹中。当肿瘤达到约60-100mm3时，小鼠接受以1mg/kg给药的每个测试物品的腹膜内注射。每只动物在第1天、第5天、第8天、第12天、第15天、第19天和第22天接受测试物品的给药。在整个研究期间每周两次记录体重和肿瘤测量结果。根据IACUC方案AP303(使用皮下小鼠肿瘤模型评价抗肿瘤活性和IACUC指南G01：肿瘤模型的管理)进行小鼠实验。
肿瘤生长抑制百分比(％TGI)用以下公式计算：TGI(％)＝[1-(处理组的RTV)/(对照组的RTV)]×100(％)，RTW＝(测量当天的肿瘤体积)/(第0天的肿瘤体积)。图9中的数据显示，在HT-29异种移植小鼠模型中，相较于在LIGHT的C末端最末端部分经His标签工程改造的人类LIGHT ProC1189，在LIGHT的C末端最末端部分经可裂解HSA结构域工程改造的人类LIGHT ACC ProC1491在促进肿瘤生长抑制方面更强效。表12中指示相对TGI百分比。这指示人类LIGHT ACC ProC1491比人类LIGHT ProC1189在诱导肿瘤局限性抗肿瘤活性方面更强效。
表12.HT-29异种移植小鼠模型中的肿瘤生长抑制百分比
ProC1491 ProC1189
％TGI 52.5％ 21.1％
实施例9.人类-小鼠交叉反应性LIGHT ACC在MC38同基因小鼠中的体内表征
使用MC38结肠腺癌同基因小鼠模型评价人类-小鼠交叉反应性LIGHT ACCProC1486、ProC1487和ProC2076的抗肿瘤活性。
根据IACUC方案AP303(使用皮下小鼠肿瘤模型评价抗肿瘤活性和IACUC指南G01：肿瘤模型的管理)进行小鼠实验。
向七至九周龄的雌性C57BL/6小鼠植入含MC38肿瘤细胞的无血清培养基。用作为单剂或与小鼠抗PD-1抗体(克隆体RPMI1-14；BioXCell，目录号BP0146)组合的LIGHT ACC对动物腹膜内给药，并且在整个研究期间每周两次记录肿瘤测量结果。肿瘤生长抑制百分比(％TGI)用以下公式计算：TGI(％)＝[1-(处理组的RTV)/(对照组的RTV)]×100(％)，RTW＝(测量当天的肿瘤体积)/(第0天的肿瘤体积)。
在一些实验中，收集肿瘤和脾以评价LIGHT ACC活性的药效学(PD)生物标志物。根据Miltenyi肿瘤离解试剂盒(Miltenyi，目录号130-096-730)处理肿瘤样品。使用注射器柱塞机械处理脾并且用ACK裂解缓冲液(ThermoFisher，目录号A1049201)处理以去除红血细胞。通过流式细胞计量术，使用Attune NxT流式细胞仪(ThermoFisher)分析免疫细胞。将流式细胞计量数据制图并且使用Prism软件进行分析。
图10A和图10B中的数据显示，ProC1486和ProC1487在MC38同基因小鼠模型中具有单剂抗肿瘤活性。当与抗PD-1组合给药时，ProC1486和ProC1487的抗肿瘤活性进一步增强。ProC2076具有极小单剂活性(图10B)。在MC38同基因小鼠模型中，在与抗PD-1抗体组合时，ProC2076的抗肿瘤活性也增加(图10B)。
图11A-11B中的数据显示，在MC38同基因小鼠模型中，在处理开始后第6天，作为单剂或与抗PD-1抗体组合给药的ProC1487能够增加肿瘤微环境中CD8+T细胞的水平(图11A)以及促进由CD8+T细胞产生Th1细胞因子(IFNγ、TNFα)(图11B)。ProC1487在脾中不具有或具有有限的活性，指示ProC1487的活性仅局限于肿瘤中。在一些情况下，在Prism软件中，使用统计t检验来分析数据。检验的显著性在图11A和图11B中以星形记号说明。
表12.实例序列
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其它实施方案
应了解，尽管已结合本发明的详细描述对本发明进行描述，但先前描述意图说明而非限制由随附权利要求的范围限定的本发明的范围。其它方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。

Claims (68)

1.一种可活化细胞因子构建体(ACC)，所述可活化细胞因子构建体包含：
第一单体构建体，所述第一单体构建体包含第一细胞因子蛋白(CP1)、第一可裂解部分(CM1)和第一空间掩蔽部分(SMM1)，其中所述CM1位于所述CP1与所述SMM1之间；
第二单体构建体，所述第二单体构建体包含第二细胞因子蛋白(CP2)、第二可裂解部分(CM2)和第二空间掩蔽部分(SMM2)，其中所述CM2位于所述CP2与所述SMM2之间；和
第三单体构建体，所述第三单体构建体包含第三细胞因子蛋白(CP3)、第三可裂解部分(CM3)和第三空间掩蔽部分(SMM3)，其中所述CM3位于所述CP3与所述SMM3之间，
其中：
所述CP1、所述CP2和所述CP3彼此结合，从而形成所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体的三聚体；并且
所述SMM1、所述SMM2和所述SMM3是球状分子。
2.如权利要求1所述的ACC，其中所述CP1、所述CP2和所述CP3是相同的细胞因子。
3.如权利要求2所述的ACC，其中所述细胞因子是肿瘤坏死因子或肿瘤坏死因子超家族的成员。
4.如权利要求2所述的ACC，其中所述CP1、所述CP2和所述CP3是肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)。
5.如权利要求2所述的ACC，其中所述CP1、所述CP2和所述CP3中的每一者包含与SEQ IDNO:54至少80％、90％、95％或99％同一的序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的ACC，其中所述SMM1、所述SMM2和所述SMM3是相同的球状分子。
7.如权利要求6所述的ACC，其中所述球状分子是白蛋白。
8.如权利要求7所述的ACC，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
9.如权利要求7所述的ACC，其中所述白蛋白包含与人血清白蛋白至少80％、90％、95％或99％同一的序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的ACC，其中所述第一单体构建体包含至少一个接头。
11.如权利要求10所述的ACC，其中所述至少一个接头包含安置在所述CP1与所述CM1之间的接头L1和/或在所述CM1与所述SMM1之间的接头L2。
12.如权利要求1-11中任一项所述的ACC，其中所述第二单体构建体包含至少一个接头。
13.如权利要求12所述的ACC，其中所述至少一个接头包含安置在所述CP2与所述CM2之间的接头L3和/或在所述CM2与所述SMM2之间的接头L4。
14.如权利要求1-13中任一项所述的ACC，其中所述第三单体构建体包含至少一个接头。
15.如权利要求14所述的ACC，其中所述至少一个接头包含安置在所述CP3与所述CM3之间的接头L5和/或在所述CM3与所述SMM3之间的接头L6。
16.如权利要求1-15中任一项所述的ACC，其中：
所述第一单体构建体还包含第一亲和掩蔽部分(AMM1)和任选的位于所述AMM1与所述CP1之间的第四可裂解部分(CM4)，
所述第二单体构建体还包含第二亲和掩蔽部分(AMM2)和任选的位于所述AMM2与所述CP2之间的第五可裂解部分(CM5)，并且
所述第三单体构建体还包含第三亲和掩蔽部分(AMM3)和任选的位于所述AMM3与所述CP3之间的第六可裂解部分(CM6)。
17.如权利要求16所述的ACC，其中所述AMM1、所述AMM2和所述AMM3是相同的。
18.如权利要求16所述的ACC，其中所述AMM1、所述AMM2和所述AMM3中的每一者包含SEQID NO:61的序列。
19.如权利要求16所述的ACC，其中所述AMM1、所述AMM2和所述AMM3中的每一者包含与SEQ ID NO:61至少80％、90％、95％或99％同一的序列。
20.如权利要求1-19中任一项所述的ACC，其中所述CM1、所述CM2和所述CM3包含相同蛋白酶的底物。
21.如权利要求1-19中任一项所述的ACC，其中所述CM1、所述CM2和所述CM3包含不同蛋白酶的底物。
22.如权利要求1-19中任一项所述的ACC，其中所述CM1、所述CM2和所述CM3中的每一者包含与SEQ ID NO:62或63至少95％同一的序列。
23.如权利要求16-22中任一项所述的ACC，其中所述CM4、所述CM5和所述CM6包含相同蛋白酶的底物。
24.如权利要求16-22中任一项所述的ACC，其中所述CM4、所述CM5和所述CM6包含不同蛋白酶的底物。
25.如权利要求16-22中任一项所述的ACC，其中所述CM4、所述CM5和所述CM6中的每一者包含与SEQ ID NO:62或63至少95％同一的序列。
26.如权利要求20-25中任一项所述的ACC，其中所述一种或多种蛋白酶由受试者的肿瘤产生。
27.如权利要求20-25中任一项所述的ACC，其中所述一种或多种蛋白酶选自由以下组成的组：ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、BACE、肾素、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶14、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V/L2、组织蛋白酶X/Z/P、Cruzipain、豆荚蛋白、Otubain-2、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、穿膜肽酶、中性溶酶、PSMA、BMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-23、MMP-24、MMP-26、MMP-27、活化蛋白C、组织蛋白酶A、组织蛋白酶G、胃促胰酶、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、弹性蛋白酶、粒酶B、胍基苯甲酸酶、HtrA1、人嗜中性粒细胞裂解酶、乳铁蛋白、marapsin、NS3/4A、PACE4、纤溶酶、PSA、tPA、凝血酶、类胰蛋白酶、uPA、DESC1、DPP-4、FAP、肝丝酶、基质蛋白酶-2、MT-SP1/基质蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3和TMPRSS4。
28.如权利要求16-27中任一项所述的ACC，其中所述第一单体构建体还包含在所述AMM1与所述CM4之间的接头L7和/或在所述CM4与所述CP1之间的接头L8。
29.如权利要求16-28中任一项所述的ACC，其中所述第二单体构建体还包含在所述AMM2与所述CM5之间的接头L9和/或在所述CM5与所述CP2之间的接头L10。
30.如权利要求16-29中任一项所述的ACC，其中所述第三单体构建体还包含在所述AMM3与所述CM6之间的接头L11和/或在所述CM6与所述CP3之间的接头L12。
31.如权利要求11-30中任一项所述的ACC，其中所述接头L1-L12中的每一者具有2至30个氨基酸的总长度。
32.如权利要求11-31中任一项所述的ACC，其中所述接头L1-L12中的每一者独立地包含SEQ ID NO:64-69、75-77、GGS、SGG、GSG、GS或G中的任一者的序列。
33.如权利要求1-32中任一项所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述CP1、所述CM1和所述SMM1，
所述第二单体构建体包含所述CP2、所述CM2和所述SMM2，并且
所述第三单体构建体包含所述CP3、所述CM3和所述SMM3。
34.如权利要求1-32中任一项所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述SMM1、所述CM1和所述CP1，
所述第二单体构建体包含所述SMM2、所述CM2和所述CP2，并且
所述第三单体构建体包含所述SMM3、所述CM3和所述CP3。
35.如权利要求16-34中任一项所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述AMM1、所述CM4、所述CP1、所述CM1和所述SMM1，
所述第二单体构建体包含所述AMM2、所述CM5、所述CP2、所述CM2和所述SMM2，并且
所述第三单体构建体包含所述AMM3、所述CM6、所述CP3、所述CM3和所述SMM3。
36.如权利要求16-34中任一项所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述SMM1、所述AMM1、所述CM1和所述CP1；
所述第二单体构建体包含所述SMM2、所述AMM2、所述CM2和所述CP2，并且
所述第三单体构建体包含所述SMM3、所述AMM3、所述CM3和所述CP3。
37.如权利要求16-34中任一项所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述AMM1、所述SMM1、所述CM1和所述CP1；
所述第二单体构建体包含所述AMM2、所述SMM2、所述CM2和所述CP2，并且
所述第三单体构建体包含所述AMM3、所述SMM3、所述CM3和所述CP3。
38.如权利要求16-34中任一项所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述SMM1、所述CM1、所述CP1、所述CM4和AMM1，
所述第二单体构建体包含所述SMM2、所述CM2、所述CP2、所述CM5和AMM2，并且
所述第三单体构建体包含所述SMM3、所述CM3、所述CP3、所述CM6和所述AMM3。
39.如权利要求16-34中任一项所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述CP1、所述CM1、所述AMM1和所述SMM1；
所述第二单体构建体包含所述CP2、所述CM2、所述AMM2和所述SMM2；并且
所述第三单体构建体包含所述CP3、所述CM3、所述AMM3和所述SMM3。
40.如权利要求16-34中任一项所述的ACC，其中在N末端至C末端方向上：
所述第一单体构建体包含所述CP1、所述CM1、所述SMM1和所述AMM1；
所述第一单体构建体包含所述CP2、所述CM2、所述SMM2和所述AMM2；并且
所述第一单体构建体包含所述CP3、所述CM3、所述SMM3和所述AMM3。
41.如权利要求1-40中任一项所述的ACC，其中，在非活性状态下，所述ACC的特征在于相较于所述CP1、所述CP2、所述CP3或其三聚体中的至少一者的活性的对照水平，具有降低的所述CP1、所述CP2、所述CP3或其三聚体中的至少一者的所述活性的水平。
42.如权利要求41所述的ACC，其中所述ACC的特征在于相较于不包含空间掩蔽部分或亲和掩蔽部分的CP1、CP2和CP3的对照三聚体的活性，CP1、CP2和CP3的所述三聚体的活性降低至少2倍、5倍、10倍、500倍、103倍、104倍、105倍或106倍。
43.如权利要求41或42所述的ACC，其中所述活性是疱疹病毒进入介体(HVEM)的活化。
44.如权利要求41或42所述的ACC，其中所述活性是淋巴毒素β受体的活化。
45.如权利要求41或42所述的ACC，其中所述活性是疱疹病毒进入介体(HVEM)的活化和淋巴毒素β受体的活化。
46.如权利要求41-45中任一项所述的ACC，其中CP1、CP2和CP3的所述对照三聚体由所述ACC的活化产生。
47.一种可活化细胞因子构建体(ACC)，所述可活化细胞因子构建体包含：
第一单体构建体，所述第一单体构建体包含第一细胞因子蛋白(CP1)、第一可裂解部分(CM1)和第一亲和掩蔽部分(AMM1)，其中所述CM1位于所述CP1与所述AMM1之间；
第二单体构建体，所述第二单体构建体包含第二细胞因子蛋白(CP2)、第二可裂解部分(CM2)和第二亲和掩蔽部分(AMM2)，其中所述CM2位于所述CP2与所述AMM2之间；和
第三单体构建体，所述第三单体构建体包含第三细胞因子蛋白(CP3)、第三可裂解部分(CM3)和第三亲和空间掩蔽部分(AMM3)，其中所述CM3位于所述CP3与所述AMM3之间，
其中所述CP1、所述CP2和所述CP3彼此结合，从而形成所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体的三聚体。
48.如权利要求1-47中任一项所述的ACC，其中所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体是相同的。
49.如权利要求1-48中任一项所述的ACC，其中所述ACC不包含除CP1、CP2和CP3以外的促进三聚体形成的任何结构域。
50.如权利要求49所述的ACC，其中所述ACC不包含共价连接所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体的除所述CP1、所述CP2和所述CP3以外的任何结构域。
51.如权利要求49所述的ACC，其中所述ACC不包含卷曲螺旋结构域、Fc结构域，或能够形成二硫键的除所述CP1、所述CP2或所述CP3以外的结构域。
52.如权利要求1-51中任一项所述的ACC，其中所述CP1、CP2和CP3是相同的并且各自包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
53.如权利要求46所述的ACC，其中所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体是相同的并且每个单体包含：
a.SEQ ID NO:54的氨基酸序列；和
b.包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列的AMM；和
c.包含白蛋白的SMM。
54.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-53中任一项所述的ACC。
55.如权利要求54所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
56.一种容器、小瓶、注射器、注射笔或药盒，所述容器、小瓶、注射器、注射笔或药盒包括至少一次剂量的权利要求54或55所述的组合物。
57.一种编码多肽的核酸，所述多肽包含权利要求1-53中任一项所述的ACC的所述第一单体构建体、所述第二单体构建体或所述第三单体构建体中的至少一者。
58.如权利要求57所述的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:9、11、13、25、31、41、43、45或47中的任一者的序列。
59.一种核酸组，所述核酸组一起编码包含权利要求1-53中任一项所述的ACC中的所述第一单体构建体、所述第二单体构建体和所述第三单体构建体的多肽。
60.一种载体，所述载体包含权利要求57-59中任一项所述的核酸或核酸组。
61.一种细胞，所述细胞包含权利要求57-59中任一项所述的核酸或权利要求60所述的载体。
62.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-53中任一项所述的ACC或权利要求54或55所述的组合物。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。
64.如权利要求62或63所述的方法，所述方法还包括施用免疫检查点抑制剂。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
66.一种产生ACC的方法，所述方法包括：
在足以产生所述ACC的条件下在液体培养基中培养权利要求61所述的细胞；以及
从所述细胞或所述液体培养基回收所述ACC。
67.如权利要求66所述的方法，所述方法还包括使用亲和色谱法纯化所回收的ACC。
68.如权利要求66或67所述的方法，所述方法还包括将所回收的ACC配制成药物组合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5030719A (en) 1986-08-28 1991-07-09 Teijin Limited Cytotoxic antibody conjugates and a process for preparation thereof
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
JP6035009B2 (ja) 2007-08-22 2016-11-30 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 活性化可能な結合ポリペプチドおよびその同定方法ならびに使用
RU2011138951A (ru) 2009-02-23 2013-03-27 Сайтомкс Терапьютикс, Инк. Пропротеины и способы их применения
CN113166220A (zh) * 2018-03-09 2021-07-23 奥美药业有限公司 创新细胞因子前药
FI3794024T3 (fi) * 2018-05-14 2023-08-10 Werewolf Therapeutics Inc Aktivoitavia interleukiini-2-polypeptidejä ja niiden käyttömenetelmiä
MX2020012252A (es) * 2018-05-14 2021-04-28 Werewolf Therapeutics Inc Polipeptidos de interleucina 12 activables y metodos de uso de los mismos.
JP2023503258A (ja) * 2019-11-14 2023-01-27 ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド 活性化可能サイトカインポリペプチド及びその使用方法

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