CN118064357A

CN118064357A - 一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法

Info

Publication number: CN118064357A
Application number: CN202410397800.5A
Authority: CN
Inventors: 周伸奥; 周丽; 张琴; 杨昊; 温孟楠
Original assignee: Zhiyuan Medical Technology Shanghai Co ltd
Current assignee: Zhiyuan Medical Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2024-04-03
Filing date: 2024-04-03
Publication date: 2024-05-24

Abstract

本申请公开了一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，属于成纤维细胞分离培养技术领域。该酶消化分离培养方法，通过在胶原酶溶液中添加HSA或BSA，减少胶原酶酶消化对成纤维细胞的损伤和造成死亡。此外，还提供了添加HSA或BSA作为稳定剂的皮肤组织运输液，延长了组织的保存时间；和以聚维酮碘和乙醇作为消毒剂的消毒方法，避免了抗生素的使用所造成的干扰。

Description

一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法

技术领域

本申请属于成纤维细胞分离培养技术领域，具体涉及一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法。

背景技术

成纤维细胞是一种具有组织异质性的间充质细胞，通过产生复杂的细胞外基质，并通过生物物理和生化线索创造信号生态位，参与组织的动态平衡和疾病。皮肤成纤维细胞是成纤维细胞类群之一，作为细胞生物学与医学研究中的重要细胞系之一，其原代细胞主要来源于捐献者的完整皮肤组织，通过对完整皮肤组织使用胶原酶进行消化，使内皮细胞如成纤维细胞分离，接种于适宜培养基中进行培养，从而得到皮肤成纤维细胞。

现有皮肤成纤维细胞分离主要存在两种方法，一是组织块培养法，主要是将剪碎的皮肤组织直接铺于培养皿底部，或者皮肤组织经消化酶分散后将真皮组织与表皮分离，将真皮碎组织块贴壁后进行培养；二为酶消化培养法，将剪碎的皮肤组织用胶原酶消化直接得到成纤维细胞，或者经过分散酶和胰蛋白酶消化，然后将混合物过滤，对得到的细胞悬液进行培养，分离成纤维细胞。其中，组织块培养法利用组织边缘细胞缓慢迁移的过程，培养分离成纤维细胞时，由于在2D培养平面中接触面积仅限组织的边缘部位，所以整体细胞分离速度较慢；组织中的结缔组织部分并未被分散，限制了更多细胞的快速富集，传统组织块培养法，细胞爬出组织块时间为最快4～6天，最慢1～2周；细胞首次传代时间为21～24天，再次传代时间为3～8天，纯化所需时间久，增殖能力弱；此外，由于表皮及真皮层紧密结合，组织块往往带有表皮部分，分离出的原代成纤维细胞中往往混有表皮细胞团，难以进行后续的分离纯化，对于成纤维细胞株的纯度影响较大，干扰基于细胞的实验进行。在酶消化培养法中，由于消化酶主要对细胞外基质进行剥离、消化，可能会使一般原代细胞的增殖速率降低，而且可能会发生细胞形态的改变，可能是由于酶消化损伤细胞膜上部分蛋白受体，导致如皮肤成纤维细胞的损伤和死亡，以及对于分离细胞的表型和功能造成的改变。

此外，研究表明迁延不愈或愈合缓慢性质的供体的皮肤组织，如中老年等供体组织中含有更多的细胞外基质，较幼儿组织含有更多的Ⅲ型胶原而少Ⅰ型胶原，交联程度和机械强度更高，所以一般胶原酶分离法对于该类组织消化适用性较低。

发明内容

1.拟解决的技术问题

本申请针对胶原酶消化分离皮肤成纤维细胞中，胶原酶酶消化损伤细胞膜上部分蛋白受体，导致皮肤成纤维细胞的损伤和死亡等问题，提供一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，通过在胶原酶溶液中添加HSA或BSA，减少胶原酶酶消化对成纤维细胞的损伤和造成死亡。使用本申请分离制备的成纤维细胞作为细胞系的种子细胞，进行建系，可获得数量多、纯度较高且制备方便的皮肤成纤维细胞系，用于科学实验研究，成活率高。

2.技术方案

为了解决上述问题，本申请所采用的技术方案如下：

本申请提供了一种皮肤组织运输液，该皮肤组织运输液包括磷酸缓冲盐溶液(PBS)，和HSA(人血白蛋白)或BSA(牛血白蛋白)，磷酸缓冲盐溶液(PBS)的渗透压为280～320mOsm/kg·H₂O，pH为7.1～7.4，HSA(人血白蛋白)或BSA(牛血白蛋白)的终浓度为0.2％～1％，其中：磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为溶剂，HSA或BSA在缓冲体系中作为皮肤组织的稳定剂，HSA或BSA的添加提高了组织运输液中蛋白质的浓度，对皮肤组织边缘的各种蛋白可以起到一定的保护作用，延长了组织的保存时间或者提高组织分离后细胞的成活率。

进一步地，上述一种皮肤组织运输液，该皮肤组织运输液包括磷酸缓冲盐溶液(PBS)，和HSA(人血白蛋白)。

进一步地，上述HSA的终浓度为1％。

进一步地，上述一种皮肤组织运输液，该皮肤组织运输液包括磷酸缓冲盐溶液(PBS)，和BSA(牛血白蛋白)。

进一步地，上述BSA的终浓度为1％。

本申请还提供了一种皮肤组织消毒方法，该方法是以聚维酮碘和乙醇作为消毒剂，取代传统的双抗(青霉素-链霉素)消毒方法，操作简单且效果稳定，同时避免了抗生素的使用所造成的干扰，具体包括：

取皮肤组织，使用PBS清洗，可多次清洗，如两次；

将清洗后的皮肤组织置于有效成分为5％聚维酮碘的消毒液中，涮洗3～5min，时间根据组织块大小进行调节，完成消毒目的即可；

使用PBS清洗皮肤组织，可多次清洗，如两次；

将皮肤组织置于75％乙醇中，浸泡3～5min，过度消毒会损失细胞活率。

进一步地，上述乙醇浸泡时间为4min。

本申请还提供了一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，包括：

S1，将消毒后的皮肤组织浸入胶原酶溶液中，剪碎并消化；

S2，加入DMEM基础培养基中止消化，离心取沉淀，获得皮肤成纤维细胞。

进一步地，上述一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，还包括：

上述S1中，将消毒后的皮肤组织浸入胶原酶溶液中还可以包括前处理，使用中性蛋白酶溶液消化消毒后的皮肤组织，消化后去除表皮组织；将消化后去除表皮组织后的真皮组织浸入胶原酶溶液中。

S3，重悬皮肤成纤维细胞，接种在DMEM完全培养基中培养，获得原代培养的皮肤成纤维细胞。

进一步地，上述S3中，重悬皮肤成纤维细胞包括使用DMEM完全培养基或DMEM高糖基础培养基重悬。

进一步地，上述S3中，原代培养过程添加有成纤维细胞生长因子FGF和/或GlutaMAX。

进一步地，上述S3中，原代培养过程添加有成纤维细胞生长因子FGF和GlutaMAX。

进一步地，上述S3中，FGF的终浓度为40～60ng/mL，GlutaMAX的终浓度为1～3mM。

进一步地，上述S3中，FGF的终浓度为50ng/mL，GlutaMAX的终浓度为2mM。

进一步地，上述S3中，培养的容器可使用亲水镀膜工艺相关细胞容器进行培养，增加细胞贴壁的速度、贴壁程度，有利于细胞成活。

进一步地，上述中性蛋白酶为中性蛋白酶AF。

进一步地，上述中性蛋白酶AF溶液为含钙镁离子的Hank's平衡盐溶液(HBSS)配制的2DMC U/mL中性蛋白酶AF溶液。

进一步地，上述中性蛋白酶AF溶液中含有庆大霉素80U/mL或者1×的双抗(青霉素-链霉素)。

进一步地，上述中性蛋白酶溶液消化的消化条件为2～8℃过夜消化12～20h。

进一步地，上述中性蛋白酶溶液消化的消化条件为4℃消化12～20h。

进一步地，上述S1中，胶原酶溶液含有终体积为0.2％～1％HSA(人血白蛋白)或BSA(牛血白蛋白)。

进一步地，上述S1中，胶原酶溶液含有0.2％～1％HSA。

进一步地，上述S1中，胶原酶溶液含有0.5％HSA。

进一步地，上述S1中，胶原酶溶液包括胶原酶NB6溶液。

进一步地，上述S1中，胶原酶NB6溶液为使用HBSS缓冲液配置成0.1～0.3PZ U/mL胶原酶NB6溶液。

进一步地，上述S1中，胶原酶NB6溶液为使用HBSS缓冲液配置成0.1PZ U/mL胶原酶NB6溶液。

进一步地，上述S1中，胶原酶消化的消化条件为：37℃消化2～4h。

进一步地，上述S1中，胶原酶消化的消化条件为：37℃消化2h。

进一步地，上述S2中，离心取沉淀包括至少两次离心取沉淀。

进一步地，上述S2中，离心取沉淀包括：中止消化后，过滤后悬液300g，5min离心，弃上清取沉淀，再加入培养基重悬，再次300g，5min离心，弃上清取沉淀，二次离心减少胶原酶的残留，降低对细胞的损伤，并且便于后续培养纯化。

进一步地，上述S3中，DMEM完全培养基包括DMEM高糖基础培养基，和5％～10％的人血小板裂解物。

进一步地，上述S3中，DMEM完全培养基还包括庆大霉素80U/mL。

本申请还提供了一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，包括：

将消毒后的皮肤组织剪碎，PBS清洗后接种于细胞培养容器中，加入培养基进行培养，培养基包括含1％～5％的人血小板裂解物的基础培养基，和额外添加高于组织区域浓度的成纤维细胞的趋化因子；当细胞密度达到20％～50％后，更换含5％～10％的人血小板裂解物的基础培养基培养。

进一步地，上述一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法：

将消毒后的皮肤组织剪碎还可以包括前处理，使用中性蛋白酶溶液消化消毒后的皮肤组织，消化后去除表皮组织；将消化后去除表皮组织后的真皮组织剪碎。

进一步地，上述基础培养基包括DMEM高糖基础培养基等基础培养基。

进一步地，上述中性蛋白酶为中性蛋白酶AF。

进一步地，上述细胞培养容器经过亲水处理或者铺设有FNC coating MIX，增加细胞贴附程度并且加快细胞迁移速度。

进一步地，上述成纤维细胞的趋化因子包括PDGF、FGF(如FGF2，7，10和21)。

进一步地，上述成纤维细胞的趋化因子的浓度为1～100ng/mL。

进一步地，上述成纤维细胞的趋化因子包括FGF2。

进一步地，上述FGF2的浓度为50ng/mL。

进一步地，上述一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，皮肤组织包括来源于具有伤口迁延不愈或愈合缓慢性质的供体的皮肤组织。

进一步地，上述迁延不愈或愈合缓慢性质的供体的皮肤组织包括来源于低温烫伤、糖尿病足、褥疮或下肢静脉溃疡等疾病的成年病患供体的皮肤组织。

进一步地，上述迁延不愈或愈合缓慢性质的供体的皮肤组织包括来源于中老年(≥45周岁)供体的皮肤组织。

进一步地，上述一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法或一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，消毒方法为上述以聚维酮碘和乙醇作为消毒剂的一种皮肤组织消毒方法。

进一步地，上述一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法或一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，分离培养前保存在上述一种皮肤组织运输液中。

本申请还提供了一种皮肤成纤维细胞的分离培养方法，包括如下步骤：

判断皮肤组织来源；

如皮肤组织来源于具有伤口迁延不愈或愈合缓慢性质的供体的皮肤组织，则采用上述一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法；

其他则采用酶消化分离培养方法。

进一步地，上述一种皮肤成纤维细胞的分离培养方法，酶消化分离培养方法采用上述皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法。

3.有益效果

本申请与现有技术相比，其有益效果在于：

(1)本申请提供的一种皮肤组织运输液，该皮肤组织运输液包括磷酸缓冲盐溶液(PBS)，和HSA(人血白蛋白)或BSA(牛血白蛋白)，磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为溶剂，HSA或BSA在缓冲体系中作为皮肤组织的稳定剂，提高了组织运输液中蛋白质的浓度，对皮肤组织边缘的各种蛋白可以起到一定的保护作用，延长了组织的保存时间，提高组织分离得到的细胞的成活率。

(2)本申请提供的一种皮肤组织消毒方法，该方法是以聚维酮碘和乙醇作为消毒剂，取代传统的双抗(青霉素-链霉素)消毒方法，在非抗生素条件下进行消毒，操作简单且效果稳定，避免了抗生素的使用所造成的干扰，减少抗生素的使用限制对后续成药以及实验需要的限制。

(3)本申请提供的一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，包括使用中性蛋白酶溶液消化消毒后的皮肤组织，消化后去除表皮组织；将去除表皮组织后的真皮组织浸入胶原酶溶液中，剪碎并消化；加入DMEM基础培养基中止消化，离心取沉淀，获得皮肤成纤维细胞；重悬皮肤成纤维细胞，接种在在DMEM完全培养基中培养，获得原代培养或传代培养的皮肤成纤维细胞，在原代培养过程中添加有成纤维细胞生长因子FGF和/或GlutaMAX，P0代增殖明显加快，原代细胞接种条件优化，可以改善部分供体原代成纤维细胞贴壁不良的问题；缩短细胞原代细胞扩增时间，解决规模培养原代细胞扩增缓慢的限速步骤；在胶原酶溶液中添加HSA(人血白蛋白)，可以缓解NB6胶原酶对细胞的过度消化，减少酶消化对成纤维细胞的损伤和造成死亡；二次离心可以减少胶原酶的残留，降低对细胞的损伤，并且便于后续培养纯化。同时，NB6胶原酶属于GMP级别的胶原酶，对于后续的医药研究更有利，减少申报过程再次变更工艺物料。

(4)本申请提供的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，针对特殊供体(具有伤口迁延不愈或愈合缓慢性质的供体，如于低温烫伤、糖尿病足、褥疮或下肢静脉溃疡等疾病的成年，中老年(≥45周岁))的皮肤组织在成纤维细胞分离培养过程中，消化酶适用性较低、初代细胞培养过程缓慢(因为皮肤细胞受损)的问题，采用基于细胞自身特性的无酶分离方法，将其皮肤组织或真皮组织接种于经过CellBind亲水处理或者铺设有FNCcoating MIX的细胞培养容器，增加细胞贴附程度并且加快细胞迁移速度；同时添加高于组织区域浓度的成纤维细胞的趋化因子，外源趋化因子与组织内部形成浓度梯度，细胞会通过信号调节细胞的定向迁移，从而达到快速从组织分离的效果；趋化因子同时促进细胞增殖信号，促进分离后细胞快速分裂增殖，从而快速形成原代细胞培养体系。

(5)本申请提供的一种皮肤成纤维细胞的分离培养方法，无论是针对一般供体的皮肤组织(小于18周岁的男性患者的包皮环切后的组织)的酶消化培养方法，还是针对特殊供体的皮肤组织(具有伤口迁延不愈或愈合缓慢性质的供体，如于低温烫伤、糖尿病足、褥疮或下肢静脉溃疡等疾病的成年，中老年(≥45周岁)的皮肤组织)的非酶消化培养方法，分离获得的成纤维细胞传代增殖能力强，可稳定增殖，未转染永生化基因即可稳定传代次数超过25代；细胞整体衰老程度极低，工艺开发稳定，适宜大规模培养。且经过RT-qPCR以及流式细胞术检测结果基于此技术开发的成纤维细胞株不同供体之间均无显著差异，说明根据以上实验操作说明分离成纤维细胞结果稳定，符合实验室研究需要，也可作为成纤维细胞大规模成的工业化生产的技术标准，为医疗卫生和化妆产品研究提供参考。

(6)本申请提供的一种皮肤成纤维细胞的分离培养方法，基于样本类型或者生产需要，选择酶消化法或非酶消化法两种方式来分离得到原代皮肤成纤维细胞并快速增殖，使用无动物源成分培养体系快速获得大规模成纤维细胞用于研究或者工业化生产，阳性表达COL1A1、FIBRONECTIN、DESIM、FSP1、HLA-DR/DP/DQ、VIMENTIN、α-SMA、CD11b等，且传代稳定性高，工艺一致性好，有利于快速均一性扩增建立细胞种子库，可用于外泌体提取，皮肤植入物开发，诱导分化作为骨科细胞治疗产品，具有广阔的应用市场前景。

附图说明

图1是成纤维细胞分离培养流程图。

图2是XI型胶原酶消化后的细胞贴壁状态(23001为供体编号)。

图3是I型胶原酶消化后的细胞贴壁状态(23002为供体编号)。

图4是不同胶原酶最优消化时间消化后的细胞贴壁状态(23003为供体编号)。

图5是NB6型胶原酶消化后的细胞贴壁状态(23004为供体编号)。

图6是不同胶原酶最后消化时间消化后的细胞贴壁状态(23005为供体编号)。

图7是不同浓度胶原酶溶液消化包皮真皮组织的细胞贴壁状态。

图8是添加FGF和GluatMAX分离原代细胞在接种后第五天后的细胞增殖，HDF为成纤维细胞。

图9是细胞分离培养照片，P0是接种后，P1为第一次传代，DAY为天数。

图10是细胞运动轨迹追踪图，图中曲线为单个细胞随时间移动的轨迹路线，显示细胞实际移动的距离。

图11是细胞运动轨迹追踪图，图中曲线为单个细胞随时间移动的轨迹路线，显示细胞实际移动的距离。

图12是HDF-01、HDF-02、HDF-03的总细胞量，每日倍增次数和群体倍增时间曲线，P为代次，P3为第3代。

图13是细胞衰老检测，P23为第23代，红色箭头所指被染成蓝色细胞为β-gal阳性为衰老细胞。

图14是细胞衰老检测，P23为第23代，红色箭头所指被染成蓝色细胞为β-gal阳性为衰老细胞。

图15是细胞衰老检测，P23为第23代，红色箭头所指被染成蓝色细胞为β-gal阳性为衰老细胞。

图16是qPCR检测成纤维细胞的细胞标志物。

图17是流式细胞术检测成纤维细胞生物标志物。

图18是流式细胞术检测成纤维细胞生物标志物。

图19是流式细胞术检测成纤维细胞生物标志物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请进一步进行描述。

需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本申请可实施的范畴。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。

如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。

浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。

如本文所用，建立原代细胞培养，必须考虑不同的方面，如细胞分离方案、细胞在载体表面的附着和培养介质。以最常见的成纤维细胞来源包皮组织为例，包皮环切后的组织作为医疗废弃物样本，具有容易获得，取材安全等优点，兼顾医学伦理与科学研究，一般来源于年龄不超过18周岁的男性患者的手术样本，患者经医学检查无传染性病毒感染。

在本申请中，患者在术前对手术样本的获取目的充分知情，并签署了知情同意书。

实施例1

本实施例提供一种皮肤组织运输液。

作为生物医药公司或者研究者来说，从医学操作间(临床)到皮肤组织分离建立细胞系的过程常常伴随组织样本的运输和保存过程，组织样本保存不当会使得组织样本细胞提取收率低，死亡率高等。

本实施例提供的一种皮肤组织运输液，该皮肤组织运输液包括磷酸缓冲盐溶液(PBS)，和HSA(人血白蛋白)或BSA(牛血白蛋白)，其中：磷酸缓冲盐溶液(PBS)的渗透压为280～320mOsm/kg·H₂O，pH为7.1～7.4，HSA或BSA的终浓度为0.2％～1％，磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为溶剂，HSA或BSA在缓冲体系中作为皮肤组织的稳定剂，HSA或BSA的添加提高了组织运输液中蛋白质的浓度，对皮肤组织边缘的各种蛋白可以起到一定的保护作用，延长了组织的保存时间，提高组织分离后细胞的成活率。

在本实施例中，取到两个供体(供体编号：23008和23009)的皮肤组织后，称重，均分成重量近似相等的两份，分别采用组织运输液1(PBS)与组织运输液2(PBS+1％HSA)保存8h，采用相同工艺进行成纤维细胞分离。

结果如表1所示，添加HAS的组织运输液，其分离的细胞的总细胞数、细胞活率和活细胞数均显著提高。

表1添加HSA与无HSA对比实验结果

实施例2

本实施例提供一种皮肤组织消毒方法，该方法是以聚维酮碘和乙醇作为消毒剂，取代传统的双抗(青霉素-链霉素)消毒方法，操作简单且效果稳定，同时避免了抗生素的使用所造成的干扰，具体包括：

在生物安全柜或者超净工作台中用无菌镊子取皮肤组织于细胞培养皿中，使用灭菌或无菌灌装的PBS清洗，重复两次；若组织过大或者结团，则将组织剪成若干块再进行后续消毒分离过程，组织过大会导致清洗不彻底，易造成培养污染；

更换无菌镊子，将皮肤组织置于有效成分为5％聚维酮碘的消毒液中，于离心管中涮洗3～5min，时间根据组织块大小进行调节；

更换无菌镊子，取皮肤组织于新细胞培养皿中，PBS清洗，并转入含75％乙醇离心管中，浸泡3～5min(过度消毒会损失细胞活率)；PBS清洗，重复两遍。

在本实施例中，取供体(供体编号：23026)的包皮组织，按照上述消毒方法在5％聚维酮碘和75％乙醇中消毒不同的时间，然后用NB6胶原酶(Nordmark，N0002779)进行消化，结果如表2所示，过度消毒会损失细胞活率，细胞数量和细胞直径也会变小。

表2包皮组织不同消毒时间消毒后消化细胞得率

实施例3

本实施例提供一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，分离培养流程参考图1。

本实施例中的皮肤组织来源于小于18周岁的男性患者的包皮环切后的组织，分离培养操作前将环切后的组织保存在实施例1所述的皮肤组织运输液中进行运输和保存。参考实施例2，对保存的包皮组织进行消毒，然后进行成纤维细胞的分离培养，具体分离培养方法包括如下步骤：

1、表皮去除

(1)试剂配制

使用含钙镁离子的Hank's平衡盐溶液(HBSS)将中性蛋白酶AF(Nordmark，货号N0003553)配置成2DMC U/mL的工作体系，细胞解离前可使用不含钙镁离子的HBSS溶液清洗螯合。在实施例中，蛋白酶尽量选择GMP级别。在本实施例中，蛋白酶选择中性蛋白酶AF，其相对于一般胶原酶更温和，作用时间更久但不会过度损失细胞活率，分离表皮效果较好。

使用时，向上取整，以5mL/0.5g皮肤组织的使用体积为准，使用庆大霉素80U/mL或者1×的双抗(青霉素-链霉素)以预防污染，混匀后用0.22μm滤器过滤。如0.7g皮肤组织应配置10mL 2DMC U/mL的中性蛋白酶AF使用体系，40000U/mL庆大霉素应添加20μL或者100×的双抗溶液100μL。

(2)消化分离去除表皮

取15mL离心管，按照5mL/0.5g皮肤组织的体积加入(1)中配制的2DMC U/mL中性蛋白酶AF溶液(含庆大霉素80U/mL)，用长镊子将消毒后的包皮组织放入其中，2～8℃过夜消化12～20h(消化分离)；消化结束后快速震荡摇动离心管，在无菌细胞培养皿中用灭菌的镊子分离表皮层(机械分离)。经中性蛋白酶消化后，表皮会呈现部分脱落，相对于未经消化的组织，极容易被镊子撕扯下，将表皮及绝大部分角质细胞剥离，完成表皮去除。剥离表皮后的真皮组织用无菌PBS漂洗后待用。

2、真皮组织消化及成纤维细胞分离(酶消化法)

胶原酶溶液配制：使用含钙镁离子的HBSS溶液将胶原酶配置成目标浓度的工作体系，钙离子水平维持在5mM左右有利于胶原酶进一步解离的效率，细胞解离前可使用不含钙镁离子的HBSS溶液清洗螯合，以抑制组织内部分蛋白酶的作用。使用庆大霉素80U/mL或者1×的双抗(青霉素-链霉素)以预防污染，混匀后用0.22μm滤器过滤备用。如胶原酶NB6稀释液的配制方法：使用HBSS缓冲液配置成0.1PZ U/mL胶原酶NB6稀释液，加入80U/mL庆大霉素，混匀后用0.22μm滤器过滤备用。

将上述剥离表皮后的真皮组织剪碎(机械破碎，1mm×1mm大小，尽可能剪碎，巴氏滴管可以顺畅吸取包皮真皮组织混合液)，尽可能由移液吸管吸起，将真皮组织悬液转移至胶原酶溶液中(胶原酶溶液12mL)，放在37℃培养箱中轻轻摇晃消化(消化分离，转速70r/min，使得组织悬液均匀摇动，使消化过程更充分均匀)；

待消化液明显浑浊且大块组织消失(约2h)，用与消化液等体积的DMEM基础培养基中止消化；

用70μm滤器过滤，滤液300g离心5min；离心结束，弃掉上清，细胞沉淀用10mL DMEM基础培养基重悬，300g离心5min(二次离心减少胶原酶的残留，降低对细胞的损伤，并且便于后续培养纯化)；

离心结束，弃掉上清，沉淀即为分离的成纤维细胞，可以用1mL DMEM基础培养基重悬保存。

(1)不同胶原酶的消化效果

本申请研究了XI型胶原酶、I型胶原酶和NB6胶原酶对真皮组织的消化效果。

首先，使用XI型胶原酶(Sigma，C7657-500 mg)和I型胶原酶(爱必信，abs47048000)消化包皮真皮组织，比较消化效果。根据试剂的使用建议，XI型胶原酶溶液和I型胶原酶溶液的工作浓度均为2mg/mL，消化时间为1h和4h，使用建议是厂家提供的最优使用条件，本申请均使用其最优条件进行对比。

XI型胶原酶消化后的细胞贴壁结果如图2所示，I型胶原酶消化后的细胞贴壁结果如图3所示，结果显示两种胶原酶消化的细胞都可以贴壁生长，但I型胶原酶消化细胞得率更高，且细胞贴壁状态良好。

XI型胶原酶消化的真皮组织消化得率如表3所示，XI型胶原酶的消化时间为1h时，消化更佳；I型胶原酶消化的真皮组织消化得率如表4所示，I型胶原酶的消化时间为4h时，消化更佳。由此可见，不同消化酶适宜的消化时间并不相同。

取同一供体(供体编号：23003)，分别以XI型胶原酶的消化1h，I型胶原酶消化4h，即各胶原酶的最适条件，细胞贴壁结果如图4所示，真皮组织消化得率如表5所示，结果表明I型胶原酶消化4h优于XI型胶原酶消化1h。由此可见，不同消化酶的消化效果并不相同。

表3包皮组织消化细胞得率

表4包皮组织消化细胞得率

表5包皮组织消化细胞得率

其次，使用上述优选的I型胶原酶和NB6胶原酶(品牌Nordmark，货号N0002779)消化包皮组织，比较消化效果。同样根据试剂建议，选择0.25U/mL为NB6胶原酶溶液的工作浓度，选择2h和4h为消化时间。

NB6胶原酶消化后的细胞贴壁结果如图5所示，NB6胶原酶消化的真皮组织消化得率如表6所示，NB6胶原酶的消化时间为2h时，消化更佳。

取同一供体(23005)，分别以NB6胶原酶消化2h，I型胶原酶消化4h，细胞贴壁结果如图6所示，真皮组织消化得率如表7所示，结果表明NB6胶原酶消化细胞得率虽然不如I型胶原酶，但NB6胶原酶消化可以得到活细胞，且细胞贴壁效果更好，确定NB6胶原酶可以用于包皮真皮组织的消化分离。

表6包皮组织消化细胞得率

表7包皮组织消化细胞得率

最后，本申请研究了NB6胶原酶的使用浓度对消化的影响。分别使用0.1PZ U/mL、0.2PZ U/mL和0.3PZ U/mL的NB6胶原酶消化包皮的真皮组织，比较消化效果，组织消化得率如表8所示，细胞贴壁结果如图7所示。结果显示3种浓度NB6胶原酶消化细胞得率无明显差异，且3种浓度的NB6胶原酶消化细胞都可以贴壁，其中浓度为0.1PZ U/mL的NB6胶原酶消化细胞贴壁数最多，从成本和细胞贴壁效果考虑选择0.1PZ U/mL浓度进行。

表8包皮组织消化细胞得率

(2)胶原酶消化条件优化

为了减少胶原酶消化对成纤维细胞的损伤和死亡，需要优化胶原酶消化的条件，现有中主要是考虑消化酶消化的时间和消化酶的浓度，并将其控制在合适的范围内。细胞解离的速度和效率不同，不同的酶对细胞的影响也不同。选择低毒性的酶，也可以减少酶消化对成纤维细胞的损伤和死亡，且GMP级别的消化酶(胶原酶)对于后续的医药研究更有利，可以减少申报过程再次变更工艺物料。根据上述研究结果，申请人选择GMP产品NB6胶原酶(品牌Nordmark，货号N0002779)，选择0.1PZ U/mL作为工作浓度(使用含钙镁离子的HBSS溶液将NB6胶原酶配置成0.1PZ U/mL胶原酶NB6稀释液的工作体系，钙离子水平维持在5mM左右有利于胶原酶进一步解离的效率，细胞解离前可使用不含钙镁离子的HBSS溶液清洗螯合，以抑制组织内部分蛋白酶的作用)。

同时，申请人发现HSA(人血白蛋白)可以缓解NB6胶原酶对细胞的过度消化。如上使用HBSS缓冲液配置成0.1PZ U/mL胶原酶NB6稀释液，加入80U/mL庆大霉素，加入终体积为0.5％ HSA，混匀后用0.22μm滤器过滤备用。

取同一供体(23012)，分别以NB6胶原酶和添加0.5％ HSA的NB6胶原酶消化2h，真皮组织消化得率如表9所示，结果表明在添加HSA的NB6胶原酶消化过程中，细胞活率较未添加组有明显升高，说明添加剂HSA可以作为保护剂，保护已经被消化的细胞持续存活，可以有效缓解NB6胶原酶对细胞的过度消化，防止过度消化以保证细胞的活率。

表9包皮组织消化细胞得率

3、成纤维细胞接种及培养

使用DMEM完全培养基(DMEM高糖基础培养基添加5％～10％的人血小板裂解物，有效工作浓度为80～160U/mL庆大霉素)重悬细胞沉淀；

吹打细胞悬液至均匀，随后细胞计数(取20μL细胞悬液与20μL的0.4％台盼蓝染色液混合，轻轻吹打均匀后将20μL混悬液打入细胞计数板，用细胞计数仪计数)；

按2.0～5.0×10⁴个活细胞/cm²接种至培养瓶中，放入37℃、5％ CO²细胞培养箱中培养为P0代细胞，培养瓶可使用亲水镀膜工艺相关细胞容器进行培养，增加细胞贴壁的速度、贴壁程度，有利于细胞成活。

在初代培养过程中添加固定成分的细胞因子，如成纤维细胞生长因子FGF和GlutaMAX(Gibco)，结果如图8所示，在组织分离后原代培养过程添加FGF(50ng/mL)和GlutaMAX(2mM)后细胞在P0代增殖明显加快，大大缩短了成纤维细胞的生长时间，在细胞培养基等水溶液中，GlutaMAX较L-谷氨酰胺更稳定，可以稳定产生焦谷氨酸作为副产物并且给细胞快速分裂提供营养物质辅助能源，并参与蛋白质的合成和葡萄糖的产生，。

原代细胞接种后细胞贴壁16～30h，显微镜下观察细胞状态，更换细胞培养液，待生长至80％～90％密度进行正常传代，接种为P1代细胞，可不再添加庆大霉素的使用。观察的细胞如图8所示，成纤维细胞可正常增殖，6天即生长至汇合度80％～90％，可进行细胞传代培养。

实施例4

本实施例提供一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，参考图1和实施例3，其区别在于，本实施例的分离培养方法不包括表皮去除的步骤，即包括如下步骤：

胶原酶溶液配制：使用HBSS缓冲液配置成0.1PZ U/mL胶原酶NB6稀释液，加入80U/mL庆大霉素，混匀后用0.22μm滤器过滤备用。

将保存的包皮组织剪碎(机械破碎，1mm×1mm大小，尽可能剪碎，巴氏滴管可以顺畅吸取包皮真皮组织混合液)，尽可能由移液吸管吸起，将皮肤组织悬液转移至胶原酶溶液中(胶原酶溶液12mL)，放在37℃培养箱中轻轻摇晃消化(消化分离，转速70r/min，使得组织悬液均匀摇动，使消化过程更充分均匀)；

离心结束，弃掉上清，沉淀即为分离的成纤维细胞，可以用1mL DMEM基础培养基重悬保存；

吹打细胞悬液至均匀，随后按2.0～5.0×10⁴个活细胞/cm²接种至培养瓶中，添加FGF(50ng/mL)和GlutaMAX(2mM)，放入37℃、5％ CO²细胞培养箱中培养为P0代细胞，培养瓶可使用亲水镀膜工艺相关细胞容器进行培养，增加细胞贴壁的速度、贴壁程度，有利于细胞成活；

原代细胞接种后细胞贴壁16～30h，显微镜下观察细胞状态，更换细胞培养液，待生长至80％～90％密度进行正常传代，接种为P1代细胞，可不再添加庆大霉素的使用。

实施例5

本实施例提供一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，分离流程参考图1。

具有伤口迁延不愈或愈合缓慢性质的皮肤组织，如来自于糖尿病等疾病的成年病患、中老年(≥45周岁)供体的皮肤组织，在自体培养成纤维细胞时胶原酶适用性较低，初代(原代)细胞的培养过程缓慢，针对此，本申请提供了一种基于细胞自身特性的无酶分离方法。

细胞迁移是建立和维持多细胞生物适当组织的基础，大多数细胞本身都可以自发进行缓慢的无序迁移过程，成纤维细胞负责结缔组织结构蛋白的合成，在伤口愈合以及组织修复中成纤维细胞的迁移过程具有至关重要的作用。在正常2D培养中延时观察，成纤维细胞呈现随机缓慢迁移过程；在生物体生长发育过程中，细胞存在定向迁移情况下，其迁移形式是有特殊方向的取向迁移称为趋向性，本实施例的皮肤成纤维细胞的分离培养方法基于细胞本身的趋向性迁移，通过外部调节化学刺激或物理条件改善传统组织块培养法的细胞迁移过程，加速成纤维细胞从组织块迁移的速度，从而快速建立皮肤成纤维细胞的快速培养体系。

同时，针对上述特殊皮肤组织，传统的细胞贴壁过程较为困难，本实施例采用亲水处理的细胞培养皿或者将FNC coating MIX铺在待培养表面，增加细胞贴附程度，并且可以加快细胞迁移速度。

本实施例中的皮肤组织来源于患有糖尿病的成年病患，糖尿病皮肤当中胶原蛋白被糖基化，胶原酶的作用效果减弱，胶原酶适用性降低。分离培养操作前将皮肤组织保存在实施例1所述的皮肤组织运输液中进行运输和保存。参考实施例2，对保存的皮肤组织进行消毒，然后进行成纤维细胞的分离培养，该分离培养方法，具体包括如下步骤：

1、表皮去除

(1)、试剂配制

使用含钙镁离子的Hank's平衡盐溶液(HBSS)将中性蛋白酶AF(Nordmark，货号N0003553)配置成2DMC U/mL的工作体系，细胞解离前可使用不含钙镁离子的HBSS溶液清洗螯合。

(2)、消化分离去除表皮

取15mL离心管，按照5mL/0.5g皮肤组织的体积加入(1)中配制的2DMC U/mL中性蛋白酶AF溶液(含庆大霉素80U/mL)，用长镊子将消毒后的皮肤组织放入其中，2～8℃过夜消化12～20h(消化分离)；消化结束后快速震荡摇动离心管，在无菌细胞培养皿中用灭菌的镊子分离表皮层(机械分离)。经中性蛋白酶消化后，表皮会呈现部分脱落，相对于未经消化的组织，极容易被镊子撕扯下，将表皮及绝大部分角质细胞剥离，完成表皮去除。剥离表皮后的真皮组织用无菌PBS漂洗后待用。

2、成纤维细胞分离培养(非酶消化法)

(1)FNC coating MIX配制

纤维连接蛋白10μg/mL胶原蛋白，Ⅰ型胶原35μg/mL，人血清白蛋白1000μg/mL，氯化钾200μg/mL，D-葡萄糖1700μg/mL，Hepes 4800μg/mL，氯化钠7000μg/mL，磷酸氢钠1700μg/mL，pH 7.1～7.4，渗透压280～300mOsM。配制完成过0.22μm滤器；FNC coating均匀铺在细胞培养皿底部，30s～30min孵育即可吸去，不吸干防止过度挥发即可。

(2)皮肤成纤维细胞的分离培养

将剥离表皮后的真皮组织直接用无菌刀剪剪碎(机械破碎)，PBS清洗后接种于铺FNC coating MIX的细胞培养皿中(组织接种)，加入培养基进行培养，培养基采用常规DMEM高糖培养基(含1％～5％的人血小板裂解物)，真皮组织接种后在培养基中额外添加高于组织区域浓度的成纤维细胞的趋化因子，如PDGF，FGF(如FGF2，7，10和21)，浓度在1～100ng/mL之间；当细胞密度达到20％～50％后，更换DMEM完全培养基(包括DMEM高糖基础培养基，5％～10％的人血小板裂解物)培养。低浓度的人血小板裂解物可以使外源趋化因子与组织内部更容易形成浓度梯度，细胞会通过信号调节细胞的定向迁移，从而达到快速从组织分离的效果。趋化因子同时促进细胞增殖信号，促进分离后细胞快速分裂增殖。在本实施例中，细胞培养过程中，添加50ng/mLFGF2后在显微镜下进行延时拍摄5h，采用Image J软件追踪细胞迁移轨迹，结果如图10所示，在外源FGF2作用下细胞快速进行向右侧移动，且运动明显倾向于右侧，细胞快速由组织中向周围爬出，从而建立成纤维细胞2D培养体系。

实施例6

本实施例提供一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，参考图1和实施例5，其区别在于本实施例的分离培养方法不包括表皮去除的步骤，包括如下步骤：

将消毒后的皮肤组织直接用无菌刀剪剪碎(机械破碎)，PBS清洗后接种于铺FNCcoating MIX的细胞培养皿中(组织接种)，加入培养基进行培养，培养基采用常规DMEM高糖培养基(含1％～5％的人血小板裂解物)；皮肤组织接种后在培养基中额外添加高于组织区域浓度的成纤维细胞的趋化因子；当细胞密度达到20％～50％后，更换DMEM完全培养基(包括DMEM高糖基础培养基，5％～10％的人血小板裂解物)培养。观察到在外源FGF2(50ng/mL)作用下细胞快速进行向右侧移动，且运动明显倾向于右侧，细胞快速由组织中向周围爬出，细胞迁移轨迹如图11所示，从而建立成纤维细胞2D培养体系。

实施例7

本实施例提供本申请的皮肤成纤维细胞的分离培养方法获得的成纤维细胞的生物学稳定性检验。其中：

HDF-01为实施例4所述的肤组织成纤维细胞的酶消化分离培养方法获得的成纤维细胞；

HDF-02为实施例3所述的肤组织成纤维细胞的酶消化分离培养方法获得的成纤维细胞；

HDF-03为实施例5所述的肤组织成纤维细胞的非酶消化分离培养方法获得的成纤维细胞。

(1)细胞增殖稳定性检验

上述获得成纤维细胞，使用无动物源性培养基培养，稳定增殖，未转染永生化基因即可稳定传代次数超过25代，细胞传代收集离心后细胞沉淀计数，计数结果以及其PDL/day，DT值见如图12所示。

(2)细胞衰老程度检验

成纤维细胞稳定传代后，按照15000～20000的密度接种于6孔板，待长合度达到50％以上，PBS清洗一遍，加入染色固定液固定15min，PBS洗三次，加入β-gal染色液，37℃过夜孵育后，通过光学显微镜拍照检测用上述分离方法获得的成纤维细胞正常传代的细胞衰老水平，染色结果如图13-图15所示，结果显示有较少成纤维细胞被染成蓝色，统计细胞衰老程度，在P18代细胞前显示细胞整体衰老程度极低，在P23代次的细胞不高于8％，考虑原代成纤维细胞且未转入永生化基因或者小分子诱导添加剂，所以本方法分离成纤维细胞具有良好的传代稳定性。

(3)成纤维细胞mRNA-qPCR检验

在培养过程中在对不同代次的成纤维细胞进行qPCR检测，与中国科学院购买在FBS条件下培养成纤维细胞系HFF对比成纤维细胞的细胞标志物。细胞破碎后使用RNA抽提试剂盒(PromegaLS1040)抽提RNA，加入逆转录酶MIX混悬液，反转录为cDNA，以cDNA为模板加入引物和sybr green染料qPCR检测DESIM、FIBRONECTIN、VIMENTIN、COL1A1、FAP、DDR2、FSP1、CD26等基因，结果如图16所示，显示在不同供体，不同代次与之相比均无显著差异化，说明根据上述皮肤成纤维细胞的分离培养获得的成纤维细胞结果稳定。

表10引物序列

(4)细胞标志物流式检验

基于上述分离方法后，在培养过程中在不同供体成纤维细胞，用重组蛋白酶消化后离心收集细胞，加入100μL PBS缓冲液和20μL流式抗体孵育30min，PBS洗涤离心后400μL重悬进行流式检测COL1A1、FIBRONECTIN、DESIM、FSP1、HLA-DR/DP/DQ、VIMENTIN、α-SMA、CD11b等基因的表达，结果如图17-图19所示，显示在不同供体之间阳性标志物均在80％以上，说明根据上述皮肤成纤维细胞的分离培养获得的成纤维细胞结果稳定。

上述结果也表明，使用本申请的非酶消化法分离培养胶原酶适用性较低的皮肤组织，能够获得酶消化法分离胶原酶适用性较高的皮肤组织相似的效果。

实施例7

本实施例提供本申请消毒方法的验证，检测成纤维细胞培养上清中微生物。具体包括：

通过上述实验消毒及后续分离方法分离得到的成纤维细胞(实施例3)接种于DMEM+10％hPL(无庆大霉素)培养基中培养，待细胞汇合度为80％～90％，收集培养上清(培养3天)。取三联集菌器用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液浸润滤膜并过滤，接入受试品30mL过滤后，封闭滤筒底部。一头通入约100mL硫乙醇酸盐流体培养基(FTM培养基)，置于25℃培养；一头通入约100mL FTM培养基，置于35℃培养；另一头通入约100mL胰酪大豆胨液体培养基(TSB培养基)，置于25℃培养。根据培养基类别做好标记。设置阳性对照以及阴性对照培养及观察14天，结果如表11所示。

表11消毒方法无菌检测结果

注：“+”有菌生长，“-”无菌生长。

Claims

1.一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1，将消毒后的皮肤组织浸入胶原酶溶液中，剪碎并消化；所述胶原酶溶液含有终体积为0.2％～1％HSA或BSA；

2.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，其特征在于，所述将消毒后的皮肤组织浸入胶原酶溶液中还可以包括前处理，使用中性蛋白酶溶液消化消毒后的皮肤组织，消化后去除表皮组织；将消化后去除表皮组织后的真皮组织浸入胶原酶溶液中。

3.根据权利要求2所述的一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，其特征在于，所述中性蛋白酶溶液为HBSS配制的2DMC U/mL中性蛋白酶AF溶液；所述中性蛋白酶溶液消化的消化条件为2～8℃过夜消化12～20h。

4.根据权利要求1-3任一所述的一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，其特征在于，所述方法还包括：

5.根据权利要求4所述的一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，其特征在于，所述原代培养过程添加有成纤维细胞生长因子FGF和/或GlutaMAX。

6.根据权利要求5所述的一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，其特征在于，所述FGF的终浓度为40～60ng/mL，GlutaMAX的终浓度为1～3mM。

7.根据权利要求6所述的一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，其特征在于，所述S2中离心取沉淀包括至少两次离心取沉淀。

8.据权利要求7所述的一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，其特征在于，所述胶原酶溶液包括使用HBSS缓冲液配置成0.1～0.3PZ U/mL的胶原酶NB6溶液；所述胶原酶消化的消化条件为：37℃消化2～4h。

9.根据权利要求1-8任一所述的一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，其特征在于，所述消毒包括如下步骤：

取皮肤组织，使用PBS清洗；

将清洗后的皮肤组织置于有效成分为5％聚维酮碘的消毒液中，涮洗3～5min；

使用PBS清洗皮肤组织；

将皮肤组织置于75％乙醇中，浸泡3～5min。

10.根据权利要求9所述的一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，其特征在于，

所述皮肤组织在消毒前保存于皮肤组织运输液，所述皮肤组织运输液包括磷酸缓冲盐溶液，

和HSA或BSA。