CN118063602A - 一种从shiv攻毒的恒河猴体内分离的v3特异性广谱中和抗体 - Google Patents
一种从shiv攻毒的恒河猴体内分离的v3特异性广谱中和抗体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种从SHIV攻毒的恒河猴体内分离的V3特异性广谱中和抗体，涉及生物医学领域。具体涉及从SHIV攻毒的恒河猴体内的特异性记忆B细胞中获得单克隆抗体基因，再在真核细胞中表达候选单克隆抗体，通过功能分析筛选获得具有较高广谱中和活性的抗体。本发明进一步涉及上述猴源单克隆广谱中和抗体用于艾滋病疫苗设计以及HIV‑1感染者治疗等方面的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，涉及一种从SHIV攻毒的恒河猴体内分离的抗HIV-1的V3特异性广谱中和抗体。具体涉及从SHIV攻毒恒河猴体内特异性记忆B细胞中获得的单克隆抗体基因以及真核表达的单克隆抗体。本发明进一步涉及上述猴源单克隆广谱中和抗体用于艾滋病疫苗设计以及HIV-1感染者治疗等方面的用途。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染对全球健康构成巨大威胁，迄今已夺走超过4000万人的生命，但这一流行病仍在世界范围内继续蔓延。目前仍然没有有效的疫苗来预防这种传染病，主要原因之一是病毒的遗传变异水平极高，这需要有效的疫苗诱导足够保护作用的交叉反应性免疫反应。研究表明，大约20％的HIV-1感染者在感染2至4年后会在其血清中检测到交叉中和活性。这些个体的血清中存在的抗体可以通过识别HIV-1包膜糖蛋白(Env)的保守区域来中和多种HIV-1毒株并称为广谱中和抗体(broadly neutralizing antibodies，bnAb)。广谱中和抗体(bnAb)的主要识别表位是Env顶端的V1V2区域、CD4结合位点(CD4bs)、糖基化V3区域、gp120的沉默面、gp120-gp41界面、融合肽(FP)区域以及gp41上的近膜外部区域。开发能够引发强效bnAb的艾滋病(AIDS)疫苗将是预防该疾病的关键，这也是开发基于中和抗体的AIDS疫苗的主要焦点之一。
在动物模型中验证过安全性和有效性的免疫方案，才可能真正进入到人体试验阶段，所以如何证明动物模型体内也可以产生与人类类似的广谱中和抗体是一个非常重要的研究方向。猴类和人类基因具有高度的遗传相似性，是艾滋病疫苗研究的重要动物模型。为了评估通过疫苗接种引发bnAbs的保护效果和能力，通过用HIV-1的基因替换猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)基因组中的env基因，产生了一种介于HIV和SIV之间的嵌合猿猴-人类免疫缺陷病毒(SHIV)，其在动物体内可以产生类似人类AIDS的感染症状。目前针对猴类模型的主要研究方向有两个，通过免疫原对猴类进行免疫，然后用SHIV攻毒，以分析免疫原的保护机制；或者是直接用SHIV感染猴类，从而分析长期感染期间病毒与抗体的共进化或者检验免疫治疗方案的有效性。从这两类研究中的猴类体内分离广谱中和抗体并分析其产生机制，对于阐明上述过程中的宿主免疫学机制具有重要意义。在近期的研究中，在免疫的猴类体内分离到了最大中和广度为59％的FP特异性中和抗体，在攻毒的猴类体内分离到了最大广度为54％的V2特异性中和抗体。同时，大多数针对SHIV感染的恒河猴的抗体反应研究发现，强效中和抗体通常靶向V2顶点或V3区域。尽管如此，目前从恒河猴体内分离抗体的研究仍然较少，抗体的产生机制也未完全阐明，并且动物体内产生的bnAbs与人类产生的bnAbs所识别中和表位的异同仍需进一步分析。在前期研究中，我们发现在SHIV1157ipd3N4感染5-6年后的恒河猴体内可以检测到具有多种特异性(V2、CD4bs和V3)的抗体识别反应，并成功地从G1015R号猴子体内中分离到了V2特异性的广谱中和抗体J038(靶向V2表位，中和广度54％)。然而，G1015R血浆中具有的其他特异性的中和抗体尚未得到表征，它们是否会共同作用以增加G1015R对病毒的更广泛的中和效果仍未可知。
发明内容
本发明提供了一种特异性靶向EnvV3表位的新型猴源抗HIV-1单克隆广谱中和抗体-JT18，其特点是具有和人源广谱中和抗体相似的中和性质以及识别表位。本发明提供的JT18单克隆抗体具有较为广谱的中和活性，对多种亚型的HIV-1毒株均具有一定的中和活性(中和广度为61.9％，13/21种毒株)，可用于艾滋病疫苗的设计和艾滋病的治疗。同时这个抗体分离自中国源恒河猴，相比于其他国际平台通常使用的印度源恒河猴，其遗传背景更接近于中国人的遗传背景，为设计更适合中国高危人群的免疫策略提供了模版。本发明通过分选G1015R号恒河猴感染SHIV1157ipd3N4后第350周的外周血淋巴细胞(PBMC)中与病毒包膜三聚体蛋白特异性结合的记忆B细胞，利用巢式PCR扩增这群细胞中抗体的重、轻链可变区基因，选择配对抗体基因进行真核表达，最后筛选到了具有广谱中和活性的单克隆抗体JT18。利用IMGT/V-QUEST数据库对抗体基因的谱系进行分析比对，发现具有JT18抗体的重链由IGHV5-20*02F、IGHJ5-2*02F和IGHD1-44*02F基因重排形成，轻链则由IGLV1S1*01F和IGLJ3*01F基因重排形成，其重链的体细胞突变率(Somatic hypermutation，SHM)为12.85％，轻链SHM为7.61％。同时JT18抗体与猴源V3特异性单克隆抗体GB40_b1具有高达64％的同源相似性，并且与人源Homsap IGHV5-51*01F和猴源Macmul IGHV5-20*02F谱系基因具有高达85％以上的相似同源性。所述的JT18单克隆抗体基因序列重链的核酸序列为SEQ ID NO:1，轻链的核酸序列为SEQ ID NO:2；重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
附图说明
图1为G1015R号恒河猴的攻毒和采血策略以及从PBMC样本中分选单细胞所选择的时间点示意图。
图2为能够与三聚体抗原蛋白结合的特异性记忆B细胞分选策略。在该门控分选策略中，将CD3-CD14-CD16-IgD-CD27+CD20+BG505UFO-AF647+gp120-BV421+的细胞用于抗体基因扩增。
图3为JT18抗体的基因序列特征(图A)以及与其同源相似的抗体谱系基因的氨基酸比对结果(图B)。
图4为线性抗体表达片段的构建策略和结合能力检测。图A为线性抗体表达载体的构建流程示意图，图B是转染HEK293T细胞表达的抗体上清通过酶联免疫吸附检测(ELISA)方法检测的IgG分泌水平，图C是检测表达的上清抗体与SHIV1157ipd3N4特异性抗原的结合能力。
图5为抗体真核表达质粒的构建与抗体的表达纯化。图A为抗体真核表达质粒的构建流程示意图，图B是构建流程中核酸鉴定凝胶结果以及纯化蛋白的SDS-PAGE鉴定结果。
图6为JT18抗体的结合能力检测。图A为利用自体病毒SHIV1157ipd3N4 gp120单体蛋白和异源毒株BG505 UFO三聚体包膜蛋白通过ELISA方法评价JT18抗体的结合能力；图B为利用生物素化标记的N6(识别CD4bs)和447-52D抗体(识别V3)检测JT18抗体的竞争抑制结合作用；图C为采用生物膜层干涉(BLI)手段检测JT18抗体与BG505 UFO三聚体和V3肽的结合效果。
图7为JT18抗体的中和能力检测。通过假病毒中和实验检测JT18抗体对17种HIV-1tier 2毒株、3种tier 1毒株以及同源假病毒的中和活性，以大鼠白血病病毒(MurineLeukemiaVirus，MLV)的包膜蛋白制备的假病毒作为阴性对照。中和活性的强弱以IC50(μg/ml)值表示。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的实施做进一步地详细说明。下述实施方案中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。主要对JT18抗体分离、基因构建表达和功能验证等所涉及到的所有实施方案进行详细说明：
1、单细胞流式分选以及抗体基因的扩增；
2、抗体表达线性片段的构建以及ELISA结合能力初步筛选；
3、抗体真核表达质粒的构建；
4、抗体蛋白的表达和纯化；
5、抗体的结合能力检测-ELISA竞争结合实验和BLI实验；
6、抗体功能评价-中和实验；
具体实施如下：
实施例1：单细胞流式分选以及抗体基因的扩增
PBMC样本来自被SHIV1157ipd3N4感染350周的中国恒河猴G1015R，从液氮罐中取出保存的SHIV感染恒河猴PBMC(～1×107)立即放于37℃水浴锅中。随后将复苏的PBMC细胞转移至15ml无菌离心筒中，加入5ml完含有10％FBS的RPMI培养基，室温800rpm，离心5min。倒掉上清，加1ml 5％FBS-PBS重悬细胞转移至无菌的EP管，室温，335×g，离心10min，同时配制多荧光抗体混合体系包含DEAD-Amcyan、CD16-PE CF594、CD14-PE Cy7、CD3-Percp Cy5.5、CD20-BB515、IgD-PE、CD27-APC Cy7、BG505-UFOAF647、HIV-1A244gp120-BV421多种抗体。将细胞悬液与配置好的抗体混合物进行45min摇床孵育，随后加入2ml 5％FBS-PBS漂洗，离心后弃去上清用5％FBS-PBS重悬过滤后即可放入流式细胞仪分选。随后将分选得到DEAD-CD16-CD14-CD3-CD20+IgD-CD27+BG505-UFO AF647+HIV-1A244gp120-BV421+的单个活细胞直接分选到装有RT裂解液(RNase OUT 0.5μl，100mM DTT 1.25μl，5×First-strand Buffer5μl，Igpeal 0.0625μl)的96孔PCR板中，置于-80℃冻存。
通过流式分选的方式获得保存在含有细胞裂解液的单个活细胞，随后通过逆转录以及巢氏PCR的方式放大抗体基因的扩增。简而言之，通过将150ng/μlRandom Hexamers(Qiagen)、4μM高纯dNTP(TransGen Biotech)和200USuperscript III(Invitrogen)添加到RT裂解缓冲液中进行逆转录PCR(反应条件为：42℃10min，25℃与引物结合十分钟，50℃延伸60min，94℃灭活5min)来获得cDNA模板。然后，使用全套引物进行两轮巢式PCR扩增获得的cDNA模板，为了最大限度地降低PCR过程中的错误率，第一轮反应高保真Taq DNA聚合酶(Invitrogen)进行扩增。反应程序为：预变性94℃2min，94℃变性15s、62(Heavy)/64℃(Kappa/Lambda)退火30s和68℃延伸1min，变性、退火和延伸三步共35个循环，最后68℃再延伸10min，4℃保存。第二轮则使用KOD聚合酶(TOYOBO)进行扩增，反应条件：94℃预变性2min，94℃变性15s，55℃(CMV、LC)/60℃(HC、LC)退火30s，68℃延伸1min 30s，变性，退火和延伸三步共35个循环，68℃再延伸5min，通过两轮放大扩增恒河猴抗体的可变区域。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性孔的产物进行测序，测序结果清晰的序列上传国际ImMunoGenetics信息系统(IMGT)V-quest网络服务器(www.IMGT.org)分析扩增的IgG重链和轻链可变区序列的抗体谱系。
实施例2：抗体表达线性片段的构建以及ELISA结合能力初步筛选
为了完成高通量的抗体筛选，我们首先通过构建线性表达抗体的手段进行初步筛选。将用于获得CMV启动子片段和抗体恒定区域的片段基因的质粒pHV00024、pRhIgG_HC_A1、pRhIg_KC_H5、pRhIg_LC_C9用对应的引物组进行PCR， 使用引物如下： CMV-P_F(AGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAG)、 CMV-P_R( CATGGTGCTAGCCAGCTTGGGTC ) 、RhIGC_HF2( GGAGCACCTCCGAGAGCACAGC ) 、 RhIGC_LFV6( CCACACTAGTGTGTCTGATCAGTG )、 BGH R1235(TCCCCAGCATGCCTGCTATTGTC)，将PCR成分准确添加到50μl PCR管中混匀，反应条件为94℃预变性2min，94℃变性15s，55℃(CMV、LC)/60℃(HC、LC)退火30s，68℃延伸1min30s，变性，退火和延伸三步共35个循环，68℃再延伸5min，4℃保存。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果并通过胶回收获得PCR产物片段。分别获得CMV启动子、恒定Heavy区域、恒定Kappa区域、恒定Lamda区域片段基因。然后通过overlap PCR的方式将CMV片段、抗体可变区基因、抗体恒定区域进行搭载，反应条件为94℃预变性2min，94℃变性15s，62℃/64℃退火30s，68℃延伸2min 30s，变性，退火和延伸三步共35个循环，68℃再延伸5min，4℃保存。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，三片段成功连接在一起的产物利用纯化试剂盒进行PCR产物柱纯化，获得线性表达的抗体重链和轻链。
随后可以将抗体的重链和轻链配对共同转染到HEK293T细胞中进行小量表达。利用Effectene转染试剂转染293T细胞中进行片段试表达。通常利用12孔板且细胞数量在70％-80％之间最好。简单来说，准备EP管，加入17.5μl EC buffer/管。在加好EC buffer的EP管中加入17.5μl重链以及对应配对的17.5μl轻链片段，混匀。每种抗体管内加入2.5μlEnhancer，混匀，室温预混5min。每种抗体管内再加入10μl Effectene，混合，室温孵育15min。配制2％FBS完全培养基，弃去孔板细胞上清，取1ml培养基混合转染混合液，缓慢滴加至孔板中进行转染，37℃培养箱中培养72h，收集上清。
将培养上清利用0.22um滤膜过滤细胞碎片后，通过30kD超滤管进行浓缩至250μl，浓缩后的上清用于ELISA检测。对于抗体的结合能力检测来说，首先包被缓冲液将SHIV1157ipd3N4 gp120和山羊抗猴Ig(H+L)二抗稀释至2.5ng/μl并以100μl/孔加入到聚苯乙烯板的反应孔中，4℃孵育过夜。次日，弃去孔内溶液，用200μl/孔PBST洗涤3次。随后用PBS配制3％BSA(牛血清白蛋白，现用现配)封闭液，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加200μl封闭液，37℃孵育2h。PBST洗涤3次，加入100μl分泌的抗体上清液已包被的反应孔中，置37℃孵育1h。然后用PBST洗涤3次，于各反应孔中加入100μl用1％BSA的PBS稀释的HRP山羊抗人IgGFc二抗。37℃孵育1h。PBST洗涤3次之后，加入TMB底物溶液100μl，室温放置10-30分钟。最后加入50μl 2M硫酸终止显色反应。在ELX800酶标仪上，检测450nm波长处的吸光度OD值，大于阴性值2.1倍，即为阳性。
实施例3：抗体真核表达质粒的构建
Overlap PCR的线性抗体表达片段通过PCR的方式在片段的两端引入Hind III和Nhe I两个酶切位点。再通过Hind III和Nhe I对线性片段和载体pcDNA3.1+进行双酶切以及胶回收获得含有粘性末端的两个片段，随后进行T4连接酶体系的连接和转化获得正确测序的抗体表达质粒，用于后续蛋白大量表达。详细来说，本方案以pcDNA3.1(+)质粒作为表达载体。以Overlap PCR产物抗体片段为模板，利用PCR在两端引入Nhe I/Hind III酶切位点。利用Nhe I/Hind III双酶切产生的粘性末端将抗体可变区片段构建入真核表达载体pcDNA3.1(+)中得到单克隆抗体表达质粒。所用的引物为Common Nhe I-F(5’-CCACTGCTTACTGGCTTATCG-3’)、Heavy-Hind III-R(5’-CCCAAGCTTTCATTTACCCGGAGACAGG-3’)、Lambda-Hind III-R(5’-CCCAAGCTTCTATGAACATTCTGCAGGGGC-3’)。反应条件为94℃预变性2min，94℃变性15s，62℃退火30s，68℃延伸2min，变性、退火和延伸三步共35个循环，68℃再延伸5min，4℃保存。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，进行PCR产物柱纯化，最终洗脱体积为50μl。利用Nhe I/Hind III限制性内切酶处理PCR产物和pcDNA3.1(+)载体后，分别通过胶回收获得酶切产物，随后将酶切产物利用T4 DNA连接酶将PCR片段和载体连接成完整质粒，反应条件为25℃，恒温连接30min。然后，将10μl连接产物缓慢加入到复苏的DH5α感受态细胞中，混匀后冰浴30min。在42℃水浴条件下，热激感受态细胞90s，冰浴再次放置2-3min。取500μl不含抗生素的LB液体培养基缓慢加入热激后的细胞中，在摇床中以37℃，180rpm/min的条件培养45-60min。培养复苏后，进行室温3000rpm离心5min，弃去部分上清，留100-200μl上清重悬菌液，涂布含有氨苄抗性的LB固体培养基平板，均匀涂布，一直涂到有阻塞感为止，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。挑取单克隆菌落至含有5mL加入含氨苄的LB液体培养基小试管中，在摇床中以37℃，220rpm/min条件培养过夜后进行质粒小提及后续鉴定。根据质粒大提试剂盒操作说明书进行质粒提取。取1μl质粒直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，同时利用NheI/Hind III双酶切质粒以及测序鉴定抗体质粒。
实施例4：抗体蛋白的表达和纯化
复苏悬浮细胞Expi293F于>80％相对湿度和37℃，8％CO2摇床上，120rpm条件悬浮培养。细胞密度达到1-3×106cells/ml时可传代培养。转染前对细胞进行计数,保证细胞密度在3-5×106cells/mL，取7.5×107cells到25.5mL表达培养基中(2.9×106cells/mL)。取30μg质粒(重链：轻链＝1：2)加入到1.5ml Opti-MEM中，同时取81μL转染试剂ExpiFectamineTM293转染试剂盒加入到1.5ml Opti-MEM中，室温孵育5min，将转染试剂混合液加入到质粒混合液中，轻轻混匀，室温孵育20min。将转染体系缓慢逐渐滴加入细胞中，边加边摇晃。转染孵育18-22h(20h)以后，补加Enhancer 1(150μL)、Enhancer 2(1.5mL)，通常在转染72h后，存活率<60％时，收获上清蛋白。
将收获的细胞上清液使用离心机4℃3500rpm离心30min去除细胞，上清过0.22μm滤膜过滤。将ProteinA/G柱料加到柱子中，加入5ml binding buffer平衡柱料，再加入5mlbinding buffer重悬柱料，4℃800rpm离心10min。柱料离心产物静置15min，弃去上清液，将过滤的上清和柱料混匀，4℃摇床孵育过夜。混合液上柱，二次上柱，收集流穿液。加入15mlbindingbuffer上柱，收集漂洗液。加入5ml elution buffer上柱，收集洗脱前液。用30kD超滤管收集洗脱液，离心浓缩(通过每1mL洗脱液添加100μL中和缓冲液，立即将洗脱级分调整至生理pH值)。用12mL洗脱缓冲液洗涤再生柱。柱料最后用含有0.02％叠氮化钠的5mL水洗涤柱并直立存放在4℃。洗脱液使用30kD超滤管浓缩，使用离心机4℃3500rpm，直至蛋白液剩500μl左右。加入过滤膜PBS置换3-4次，离心条件3500rpm 20min。最后超滤至500μl左右，混匀分装到1.5ml离心管中，用nano测蛋白浓度。将1mg/ml的抗体蛋白用4×loadingbuffer进行蛋白制样并进行变性凝胶电泳，随后将凝胶用考马斯亮蓝染色液进行染色以及脱色液脱色并确定蛋白的分子量大小，并置于-80℃保存。
实施例5：抗体的结合能力检测-ELISA竞争结合实验和BLI实验ELISA竞争结合实验：对于抗体的结合能力检测来说，首先包被缓冲液将抗原(1157gp120和BG505 UFO蛋白)稀释至2.5ng/μl并以100μl/孔加入到聚苯乙烯板的反应孔中，4℃孵育过夜。次日，弃去孔内溶液，用200μl/孔PBST洗涤3次。随后用PBS配制3％BSA(牛血清白蛋白，现用现配)封闭液，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加200μl封闭液，37℃孵育2h。PBST洗涤3次，加入100μl1％BSAPBS稀释的抗体蛋白于已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时。然后用PBST洗涤3次，于各反应孔中加入100μl用1％BSA的PBS稀释的HRP Goat-anti Human IgG Fc二抗。37℃孵育1小时。PBST洗涤3次之后，加入TMB底物溶液100μl，室温放置10-30分钟。最后加入50μl2M硫酸终止显色反应。在ELX800酶标仪上，检测450nm波长处的吸光度OD值，大于阴性值2.1倍，即为阳性。
BLI实验：采用BLI方法检测抗原与抗体之间的动态结合和解离。简而言之，提前配制20μg/ml抗体稀释液(用PBS缓冲液体系)，并以800nM为最高浓度2倍梯度稀释抗原蛋白。在检测黑板中分别加入PBS缓冲液，抗体稀释液，缓冲液，梯度稀释的抗原蛋白。提前30min打开ForteBio Octet机器预热并将检测的抗hIgG-Fc捕获(AHC)生物传感器提前用平衡缓冲液活化10min，设置检测程序和循环并准备好的检测黑板和生物传感器分别放入检测机器中进行分析。一个程序包括：在缓冲体系中运行基线、固定的分子可逆或不可逆的结合到传感器表面、在结合阶段，Analyte结合到传感器表面、在解离阶段，Analyte从传感器表面离开，最后将传感器表面的Analyte或者ligand去除。运行一个程序结束之后，使用OCTET软件数据分析HT 9.0测定结合亲和常数。为了确定V3肽与JT18、447-52D和J038抗体的结合亲和力，合成了SHIV1157ipd3N4 V3肽(305KSISIGPGQAI317)，并如上所述测定其与抗体的结合。
实施例6：抗体功能评价-中和实验
HEK293T细胞于T-75培养瓶培养生长至90％以上，胰蛋白酶消化(含0.25％EDTA)后并计数。取3-5×106个细胞至T-75细胞培养瓶中，培养基12ml，37℃培养过夜(20-24h)，待细胞长到50-80％即可用于转染。将16μg骨架基因质粒pSG3-Δenv和8μg包膜质粒加入到1.5ml的转染Buffer中。涡旋混匀后，以1：2比例加入48μl转染试剂jetPRIME(Polyplus)，室温孵育10min。缓慢滴加到T-75细胞瓶中，37℃孵育培养48-72h。收取病毒上清液，0.45μm微孔滤膜过滤掉细胞碎片，按1ml/支分装，标记好病毒名称和日期于-80℃保存。为了确定病毒的滴度进行后续的操作，将待检测病毒从-80℃取出，在水浴快速融化。96孔板中加入100μl新鲜DMEM培养基，第一列加入25μl/孔原液病毒，并设立4个复孔，分别取25μl至下一孔中，按1：5逐级稀释至11列，第11列充分混匀后吸取25μl/孔弃去。12列作为细胞对照。随后用胰蛋白酶消化并传代TZM-bl细胞，重悬并配制1×105个/ml细胞悬液并将促感染试剂DEAE 1:500稀释(储存浓度15mg/ml)加入到细胞稀释液中。按照100μl/孔细胞体积加入到96孔板中，37℃培养48-72h。从96孔板中吸出100μl培养基，再加入100μl萤火虫荧光素酶底物(Promega)，室温避光反应2min，使用排枪反复吹吸5-10次，吸取150μl至不透明黑板/白板中酶标仪进行检测并计算病毒的滴度TCID50。取96孔板，于第1列(细胞对照CC)加入DMEM完全培养基150μl/孔，于第2～12列(第2列为病毒对照VV，第3～12列为样品孔)加入DMEM完全培养基100μl/孔，待测纯化抗体以2个复孔梯度稀释加入样品孔。用DMEM完全培养基将假病毒稀释至2000TCID50/ml(按提供的稀释倍数稀释)，于第2～12列每孔加50μl，使每孔含100TCID50假病毒。将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO2)孵育1小时。当孵育时间至半小时，取出培养箱中事先准备好的TZM-bl细胞，以T-75培养瓶为例，吸弃瓶中的培养基并加入胰酶使其浸没细胞消化，吹打混匀后，细胞计数，用DMEM完全培养基将细胞稀释至105个/ml，加入DEAE-dextran(细胞悬液中DEAE终浓度20μg/ml)。向96孔板中每孔加100μl105个/ml的细胞。将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养48小时。48小时后从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃200μl上清，然后加入40μl荧光素酶底物(Promega)，室温避光反应2min。反应结束后，用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸3-5次，使细胞充分裂解，从每孔中吸出50μl液体，加于对应96孔化学发光检测板中。通过在VICTOR2TMD荧光计(PerkinElmer)上测量相对光单位(RLU)来确定病毒复制的抑制作用。50％抑制浓度(IC50)定义为与病毒对照的平均RLU相比，RLU降低50％的抗体浓度。
实验中所用的商品化抗体：
Goat anti-Monkey Ig(H+L)SecondaryAntibody(Novus,Cat#NB7212)
HRP-conjugatedrabbit anti-monkey IgG(Bioss,Cat#bs-0335R-HRP)
HRP-GoatAnti-Human IgG,FcγSecondaryAntibody(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-008)
FixableAqua Dead Cell Stain Kit,for405nm excitation(Life,Cat#L-34965)
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD16(BD,Cat#562293)
PE-CyTM7Mouse Anti-Human CD14(BD,Cat#561385)
PerCP-CyTM5.5MouseAnti-Human CD3(BD,Cat#552852)
BB515 Mouse Anti-Human CD20(BD,Cat#564568)
GoatAnti-Human IgD-PE(Southern Biotech,Cat#2030-09)
APC/Cy7 anti-human CD27 Antibody(Biolegend,Cat#302816)PE-CF594-anti-Human IgM(BD,Cat#562539)
实验所用仪器：
Claims (3)
1.一种从SHIV攻毒的恒河猴体内分离的V3特异性广谱中和抗体，其特点在于，为JT18单克隆抗体，是利用包膜三聚体诱饵蛋白BG505 UFO-AF647在SHIV感染的中国源恒河猴体内分离得到的针对病毒包膜蛋白V3表位的抗HIV单克隆广谱中和抗体。
2.权利要求1所述的一种从SHIV攻毒的恒河猴体内分离的V3特异性广谱中和抗体，其特点在于，JT18单克隆抗体的基因序列，序列表SEQ ID NO:1-4。
3.权利要求1所述的一种从SHIV攻毒的恒河猴体内分离的V3特异性广谱中和抗体，其特点在于，JT18单克隆抗体所识别的包膜蛋白中的关键位点在制备艾滋病疫苗方面的用途。
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