CN118063578A - 菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1、基因及其应用 - Google Patents
菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1、基因及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于植物基因靶点技术领域，具体涉及一种菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1、基因及其应用。该菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示序列或包括与SEQ ID NO：2所示序列同源性≥85％的序列。本发明提供的菠萝中的Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1可通过调控细胞中钙离子稳态，在菠萝水心病过程中发挥重要功能；后期可以利用转基因以及基因定点编辑等分子育种技术培育抗水心病的优质菠萝种质，为培育抗水心病品种提供新的思路和研究方向，切实解决菠萝行业面临的重要问题，促进菠萝产业的经济效益以及快速发展。
Description
技术领域
本发明属于植物基因靶点技术领域，具体涉及一种菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1、基因及其应用。
背景技术
菠萝(AnanascomosusL.，Merr.)为凤梨科凤梨属多年生常绿草本果树，与香蕉、椰子、芒果并列为四大热带名果。我国的菠萝种植历史悠久，种植面积及产量分别居世界第四和第六，是特色高效的热带经济作物，也是热作区农民重要的经济来源。近年来，水心病在菠萝主产区大面积发生。水心病是一种采前生理性病害，发病果实内部组织间隙充满细胞液并呈现水渍状，严重时散发出酒糟味和恶臭味，大大降低了果实的食用品质和商品价值。如2018年，水心病流行导致的果实品质降低造成徐闻菠萝鲜果贱卖、滞销烂市的情况给种植户带来大量损失。据统计，此次滞销面积高达10万亩，被影响的菠萝种植户占比超出50％。因此，探究菠萝水心病发病机制、挖掘水心病关键基因、培育抗水心病的优质菠萝品种是解决水心病的根本途径，才能有效地解决菠萝行业面临的瓶颈问题，促进菠萝行业的健康快速发展。
菠萝水心病是一个复杂的生理生化过程，其成因尚未完全解析，已有研究表明，水心病的发病率与外界环境因素、植株生长发育状态、内源激素水平、果实中矿质营养以及糖含量等均密切相关。研究还发现，在菠萝谢花后50天进行38℃高温以及10℃低温处理，可以显著诱发菠萝水心病。此外，菠萝冠芽大小与水心病的发病率呈负相关，冠芽越大发病率越低，植株叶片的大小与水心病的发病率呈正相关，叶片越茂盛水心病发病率越高。早在1999年Chen等人的研究发现，从菠萝采收6周开始，菠萝果实中蔗糖以及细胞壁转化酶的含量逐渐增加，细胞壁转化酶可以将蔗糖分解成葡萄糖和果糖，使得细胞内的渗透压翻倍。而从采前8周开始，果实中钙离子的浓度迅速降低，已知钙离子是构成细胞壁骨架的重要组分，随着钙离子浓度的下降，细胞膜的渗透率逐渐增加，导致胞内渗透压异常，诱发水心病。
钙是植物中非常重要的营养元素，植物体内的钙主要以游离钙和结合钙的形式存在，在细胞核、细胞质、液泡、细胞膜和细胞壁中广泛分布，其中液泡是细胞中的钙库，对于细胞中渗透压的调节至关重要。钙不仅是植物中非常重要的营养元素，钙还在植物细胞膜和细胞壁的稳定、酶的调控、渗透调节等方面也具有重要作用。例如，Ca2+可以作为第二信使参与植物对生物以及非生物胁迫的响应，在植物体内发挥着重要的功能。可以与半乳糖醛酸甲酯裸露的羧基结合形成果胶酸钙，使细胞壁结构更加稳定，也可以与细胞膜上的磷脂和蛋白质进行偶联稳定细胞膜结构。细胞有丝分裂后期，分隔两个子细胞的细胞板主要是由果胶酸钙组成，缺钙影响细胞板和纺锤丝的形成，导致细胞分裂过程中子细胞无法分隔，出现双核现象并最终导致细胞死亡。此外，Ca2+作为二价阳离子可以通过离子通道运输到细胞质以及液泡中，参与胞质渗透压的调节。其中CAXs(Ca2+/H+Exchanger)是植物体内主要定位于液泡膜上的一种Ca2+/H+反向转运蛋白，负责Ca2+由胞质向液泡的运输，对于细胞渗透压的维持至关重要。
研究发现，拟南芥中主要存在6个CAXs蛋白，其中AtCAX1的突变可以有效降低液泡中Ca2+含量及Ca2+/H+反向转运蛋白活性，增强植物对冷冻胁迫的耐受性。将拟南芥中AtCAX1过表达至番茄中，会导致番茄果肉细胞中细胞膜的离子渗透率明显增加，质外体以及胞质中Ca2+含量降低，液泡中Ca2+含量升高，导致细胞渗透压异常并出现质壁分离现象，最终导致细胞破裂死亡。苹果中主要包括11个CAXs蛋白，可以参与植物对各种非生物胁迫的响应。例如，当苹果受到冷胁迫侵扰时，会导致胞质中钙离子的含量迅速增加，钙离子依赖的蛋白激酶接收Ca2+信号后，启动一系列级联响应帮助植物抵御胁迫侵扰。但是，胞质中持续的高Ca2+浓度会对植物细胞产生毒性，此时高钙信号会诱导苹果中BHLH4转录因子的表达。BHLH4可以结合在CAXs蛋白的启动子区域激活其表达，促使胞质中的Ca2+运输到液泡中储藏，降低胞质中的Ca2+浓度，负调控冷信号通路。综上所述，钙在植物生长发育过程中发挥重要的作用，CAXs蛋白作为细胞膜上的Ca2+/H+反向转运蛋白，参与植物体内钙离子运输，细胞渗透压维持等多种过程。
CAXs蛋白在拟南芥、水稻、苹果以及番茄等物种中均发挥着不可或缺的功能，而在菠萝中，CAXs蛋白的功能还未进行详细的研究。
发明内容
针对以上问题，本发明目的在于提供一种菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1及编码该菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白的基因AcCAX1，将AcCAX1在菠萝果实中瞬时表达可以显著诱发菠萝水心病，表明该基因在菠萝水心病过程中发挥重要功能。
为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：
本发明一方面提供一种菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1，其氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示序列或包括与SEQ ID NO：2所示序列同源性≥85％的序列。
本发明另一方面提供一种菠萝水心病靶标基因，包括如SEQ ID NO：1所示序列或包括与SEQ ID NO：1所示序列同源性≥85％的序列。
本发明再一方面提供一种本发明中的菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1或本发明中的菠萝水心病靶标基因在菠萝遗传育种中的应用。
在一些具体实施例中，上述应用包括：本发明中的菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1的抑制剂或本发明中的菠萝水心病靶标基因的表达抑制剂在防治菠萝水心病中的应用。
在一些具体实施例中，上述应用包括：本发明中的菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1的抑制剂或本发明中的菠萝水心病靶标基因的表达抑制剂为高浓度CaCl2。
本发明再一方面提供一种控制菠萝细胞中钙离子稳态的方法，包括：通过调控本发明中的菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1含量或调控本发明中的菠萝水心病靶标基因的表达水平。
本发明有益效果至少包括：本发明提供的菠萝中的Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1在菠萝果实中瞬时表达可以显著诱发菠萝水心病，表明其在菠萝水心病过程中发挥重要功能；后期可以利用转基因以及基因定点编辑等分子育种技术培育抗水心病的优质菠萝种质，为培育抗水心病品种提供新的思路和研究方向，切实解决菠萝行业面临的严重问题，促进菠萝产业的经济效益以及快速发展。
附图说明
图1为本发明中AcCAX1基因克隆和功能验证技术路线图；
图2为本发明中菠萝AcCAX1基因编码区序列PCR扩增的凝胶电泳图；
图3为NCBI预测AcCAX1CDS序列与实际克隆AcCAX1CDS序列比对结果；
图4为NCBI预测AcCAX1蛋白序列与实际克隆AcCAX1蛋白序列比对结果；
图5为AcCAX1转录水平受不同浓度CaCl2诱导情况；
图6为MgCl2、MnCl2以及NaCl诱导AcCAX1转录水平情况；
图7为菠萝谢花后不同天数后钙含量情况；
图8为AcCAX1转录水平随内源钙离子含量的降低的变化情况；
图9为AcCAX1在菠萝果实、茎、老叶、幼叶以及花序中的转录水平情况；
图10为通过共聚焦显微镜观察AcCAX1亚细胞定位情况；
图11为本发明AcCAX1基因在菠萝不同程度水心病果实中的情况；
图12为本发明AcCAX1基因在菠萝不同程度水心病果实中的转录水平情况；
图13为本发明AcCAX1瞬时转化菠萝果实可以显著诱发菠萝水心病情况；
图14为本发明AcCAX1瞬时转化菠萝果实可以显著诱发菠萝水心病病斑面积。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
本发明中，“AcCAX1”代表基因名称，“AcCAX1”代表蛋白名称。
本发明实施例提供一种菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1，其氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示序列或包括与SEQ ID NO：2所示序列同源性≥85％的序列。
本发明另一实施例提供一种菠萝水心病靶标基因，包括如SEQ ID NO：1所示序列或包括与SEQ ID NO：1所示序列同源性≥85％的序列。
需要说明的是，菠萝水心病是一个复杂的生理生化过程，其成因尚未完全解析，已有研究表明，水心病的发病率与外界环境因素、植株生长发育状态、内源激素水平、果实中矿质营养以及糖含量等均密切相关。但是直到目前为止，菠萝水心病相关的所有研究均集中于生理生化水平，尚未从基因水平进行更深一步的挖掘。然而只有从基因水平入手，深入挖掘影响水心病的关键基因、探究水心病的发病机制、基于基因水平培育抗水心病的优质菠萝品种、才能从根本上解决水心病，切实解决菠萝生产中的重大问题。
还需要说明的是，上述如SEQ ID NO：1所示序列为菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白家族基因AcCAX1的CDS序列；作为菠萝中的Ca2+/H+反向转运蛋白，该基因的转录水平可以受低浓度CaCl2诱导，高浓度CaCl2抑制。并且AcCAX1的转录水平在轻度水心病中显著上调，在中度以及重度水心病中下调。将AcCAX1瞬时转化菠萝果实可以显著诱发菠萝水心病，表明AcCAX1蛋白在菠萝水心病过程中发挥重要功能。
本发明另一实施例提供一种本发明中的菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1或本发明中的菠萝水心病靶标基因在菠萝遗传育种中的应用。
需要说明的是，现有的传统杂交育种耗时耗力、工作量大，育种效率较低，选育抗水心病菠萝新品种需要的周期长，而基于本发明发现的AcCAX1蛋白的基因工程育种具有高效、定向、周期短等特点。
在一些具体实施例中，上述应用包括：本发明中的菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1的抑制剂或本发明中的菠萝水心病靶标基因的表达抑制剂在防治菠萝水心病中的应用。
在一些具体实施例中，上述应用包括：本发明中的菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1的抑制剂或本发明中的菠萝水心病靶标基因的表达抑制剂为高浓度CaCl2。需要说明的是，高浓度CaCl2指的是浓度≥200mM。
本发明再一实施例提供一种控制菠萝细胞中钙离子稳态的方法，包括：通过调控菠萝中的本发明中的菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1含量或调控菠萝中的本发明中的菠萝水心病靶标基因的表达水平。
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
以下实施例中，按照图1所示的技术路线进行AcCAX1基因克隆和功能验证。
一、AcCAX1基因扩增测序
(一)菠萝cDNA文库的构建
取菠萝成熟果肉组织，用北京华越洋生物有限公司的RNA提取试剂盒(货号：0416-100GK型)进行总RNA的提取；以获得的总RNA为模板，用北京全式金生物有限公司的反转录试剂盒(货号：M20105)在反转录酶和聚合酶的作用下合成cDNA双链。
(二)AcCAX1基因扩增
(1)设计4条特异性引物，具体如下：
AcCAX1-TF-ATGGCTTCGGCGGCGCAT；
AcCAX1-TR-GGCATCCAGAACCATCGATCT；
AcCAX1-SmaI-F-CCCGGGATGGCTTCGGCGGCGCAT；
AcCAX1-XbaI-R-TCTAGAGGCATCCAGAACCATCGATCT。
(2)对AcCAX1基因进行扩增
根据上述引物序列对AcCAX1基因进行扩增，具体包括：以cDNA为模板，利用上述设计的引物以及Phusion高保真酶进行扩增，具体扩增体系如下表1所示，扩增程序如下表2所示，引物列表为如上引物(AcCAX1-TF和AcCAX1-TR)。
表1 Phusion酶扩增体系
表2 Phusion酶扩增程序
| 步骤 | ℃ | 时间 | goto | 循环数 |
| 1 | 98 | 1min | - | - |
| 2 | 98 | 10s | - | - |
| 3 | 退火 | 30s | - | - |
| 4 | 72 | 15-30s/kb | 2 | 34 |
| 5 | 72 | 10min | - | - |
| 6 | 4 | 30min | - | - |
退火温度依引物以及Phusion酶的特性而定，并可以在TmCalculator网站进行预测(https://www.thermofisher.cn/cn/)；延伸时间(Phusion酶扩增速度15-30s/kb)依基因长度而定。扩增完成之后，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的特异性和完整性，具体观察其条带是否单一，条带的亮度等，如果条带单一，则进行PCR产物回收，如果条带不单一，则切取正确大小条带并利用上海生工生物试剂有限公司胶回收试剂盒进行片段回收；PCR扩增的凝胶电泳图如图2所示。
(三)AcCAX1克隆与序列测定
将扩增片段送至金唯智生物有限公司进行测序分析，利用北京全式金生物有限公司的pEASY-T5 Zero Cloning Kit试剂盒(货号：CT501-01)将测序正确的片段克隆进入pEASY-T5Zero载体得连接载体。
(四)大肠杆菌转化
将上述连接产物取5微升加入50微升DH5α感受态中，轻弹混匀；冰浴30分钟，42度水浴60秒，冰浴2分钟，加1mlLB液体培养基，37度摇床150rpm培养1小时，取200微升菌液涂至含有Kana的固体培养基上，37度倒置培养过夜。
(五)目的片段序列测定
挑取单菌落于1ml含Kana抗生素的液体培养基中，37度，150rpm培养12h，送至金唯智公司利用通用引物M13F和M13R进行测序，最终获得AcCAX1基因，其碱基序列信息如SEQID NO：1所示。
AcCAX1基因特征如下表3所示。
表3AcCAX1基因特征
由上表3可以得知，AcCAX1基因ID为Aco015367，位于菠萝第23条染色体59123–64877位置，CDS长度为1428bp，蛋白大小为476个氨基酸，相对分子质量为50801.11，等电点为6.24(CDS长度和蛋白大小为校正后数据)。
(六)序列对比
将NCBI预测AcCAX1CDS序列与实际克隆AcCAX1CDS序列进行比对，结果如图3所示。
另外，将NCBI预测AcCAX1蛋白序列与实际克隆AcCAX1蛋白序列比对进行比对，结果如图4所示。
二、AcCAX1基因功能验证
(一)CaCl2诱导AcCAX1转录水平变化情况
在晴天下采集茎基粗0.5cm以上，发育正常的‘巴厘’吸芽带回实验室，将衰老叶片从基部完全剥除，用自来水将吸芽冲洗干净，离吸芽生长点上方约0.5cm处切断所有叶片。将吸芽先以2％NaClO预消毒10min，无菌水冲洗3次，再以0.1％HgCl消毒8分钟，无菌水冲洗3次；以捎带部分吸芽组织的形式切取每片着生在吸芽上的白色叶基，并将该叶基以0.1％HgCl消毒5分钟，无菌水冲洗3次，接种在愈伤组织诱导培养基(MS+2.0mg/LBA+2.5mg/LNAA)上进行愈伤组织诱导，置于光下培养。
培养四周后切下愈伤组织转移至含有(Mock、100MmCaCl2、200MmCaCl2、400MmCaCl2、200MmMgCl2、200MmNaCl2、400MmMnCl2)的增值培养基中，处理24小时后取材。将愈伤材料在液氮中进行研磨，并用北京华越洋生物有限公司的RNA提取试剂盒(货号：0416-100GK型)进行总RNA的提取；以获得的总RNA为模板，用北京全式金生物有限公司的反转录试剂盒(货号：M20105)在反转录酶和聚合酶的作用下合成cDNA双链。
利用北京全式金公司PerfectStart Green qPCR SuperMix(货号：TG-AQ601-02-V2)以AcCAX1-QF-TCTTCCTGGGGACTAAGCT以及AcCAX1-QR-TGACACGCTCAGCAAGTG为引物，以cDNA为模板进行定量PCR，检测AcCAX1的转录水平。
AcCAX1转录水平受外源CaCl2以及内源CaCl2诱导表达水平情况如图5、图6、图7和图8所示，结果显示，AcCAX1转录水平可以受低浓度CaCl2诱导，高浓度CaCl2抑制(见图5)；AcCAX1转录水平不受MgCl2、MnCl2以及NaCl诱导(见图6)。
另外，于菠萝谢花后20天、30天、40天、50天以及60天对菠萝果实进行取材。将菠萝果实材料送至南亚热带作物研究所分析实验中心进行总钙含量测定，以及将菠萝果实材料在液氮中进行研磨，并用北京华越洋生物有限公司的RNA提取试剂盒(货号：0416-100GK型)进行总RNA的提取；以获得的总RNA为模板，用北京全式金生物有限公司的反转录试剂盒(货号：M20105)在反转录酶和聚合酶的作用下合成cDNA双链。利用北京全式金公司PerfectStart Green qPCR SuperMix(货号：TG-AQ601-02-V2)以AcCAX1-QF-TCTTCCTGGGGACTAAGCT以及AcCAX1-QR-TGACACGCTCAGCAAGTG为引物，以cDNA为模板进行定量PCR，检测AcCAX1的转录水平。
检测结果如图7和图8所示，结果显示，菠萝谢花后20天、30天、40天、50天以及60天，菠萝果实中的钙含量呈现逐渐降低趋势(见图7)；AcCAX1转录水平随内源钙离子含量的降低而逐渐降低(见图8)。
(二)AcCAX1基因的组织定位和亚细胞定位
将菠萝成熟果实果肉、开花前植株的茎、老叶、幼叶以及花序进行取材，并用液氮速冻，将取材在液氮中进行研磨，并用北京华越洋生物有限公司的RNA提取试剂盒(货号：0416-100GK型)进行总RNA的提取；以获得的总RNA为模板，用北京全式金生物有限公司的反转录试剂盒(货号：M20105)在反转录酶和聚合酶的作用下合成cDNA双链。利用北京全式金公司PerfectStartGreenQpcrSuperMix(货号：TG-AQ601-02-V2)以AcCAX1-QF-TCTTCCTGGGGACTAAGCT以及AcCAX1-QR-TGACACGCTCAGCAAGTG为引物，以cDNA为模板进行定量PCR，检测AcCAX1的转录水平。检测结果如图9所示。
另外，以上述测序成功的pEASY-T5-AcCAX1质粒为模板，利用AcCAX1-SmaI-F-CCCGGGATGGCTTCGGCGGCGCAT；AcCAX1-XbaI-R-TCTAGAGGCATCCAGAACCATCGATCT引物以及Phusion高保真酶进行扩增，将扩增得到的PCR产物利用生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(货号：B518141-0050)进行PCR产物回收，将回收的PCR产物(2微克)以及pCOMBIA2300载体(2微克)用SmaI(0.5微升)和XbaI(0.5微升)酶37度酶切30分钟，将酶切产物进行凝胶电泳，切取目的条带，利用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(货号：B518131-0100)进行胶回收。将回收得到的AcCAX1产物以及pCOMBIA2300载体利用赛默飞T4DNA连接酶(货号：EL0011)进行连接；
将上述连接产物取5微升加入50微升DH5α感受态中，轻弹混匀；冰浴30分钟，42℃水浴60秒，冰浴2分钟，加1mlLB液体培养基，37℃摇床150rpm培养1小时，取200微升菌液涂至含有Kana的固体培养基上，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落于1ml含Kana抗生素的液体培养基中，37℃，150rpm培养12h，送至金唯智公司利用CFP-N-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG进行测序，最终获得35s-CAX1-eYFP构建；将上述连构建质粒取100纳克加入50微升(昂羽生物，货号：G6039)GV3101感受态中，轻弹混匀；依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、28℃水浴5分钟、冰浴5分钟。然后加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2–3小时。6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2–3天；挑取单菌落于2ml含Kana抗生素的液体培养基中，30度，150rpm培养12h；
将培养好的菌液4000×g离心10min，倒掉上清。加入1ml转化缓冲液重悬菌体，4000×g离心10min，倒掉上清；最后沉淀用1mL缓冲液重悬，然后再另取一个1.5mL的离心管，取少许菌体调节OD600值约为0.6–0.8。选取生长约4周左右的烟草叶片进行注射。用注射器(除去针头)吸取适量农杆菌悬浮液注射到烟草叶片中，使叶片浸湿；约36h-48h可观察蛋白的亚细胞定位；情况如图10所示。
(三)AcCAX1基因在菠萝不同程度水心病果实中的转录水平
选取正常菠萝果肉(果实无病斑)、轻度水心病菠萝果肉(水心部分在果眼或果心，分散，不连片，病斑面积占整果面积比值≤30％)、中度水心病菠萝果肉(水心部分在果眼及其周围，连片，水心部分未延伸到果皮及果心，30％≤病斑面积占整果面积比值≤60％)和重度水心病菠萝果肉(水心部分大面积连片分布，水心症状延伸到果皮和果心，病斑面积占整果面积比值＞60％)于液氮速冻，将菠萝果实材料在液氮中进行研磨，并用北京华越洋生物有限公司的RNA提取试剂盒(货号：0416-100GK型)进行总RNA的提取；以获得的总RNA为模板，用北京全式金生物有限公司的反转录试剂盒(货号：M20105)在反转录酶和聚合酶的作用下合成cDNA双链。利用北京全式金公司PerfectStartGreenQpcrSuperMix(货号：TG-AQ601-02-V2)以AcCAX1-QF-TCTTCCTGGGGACTAAGCT以及AcCAX1-QR-TGACACGCTCAGCAAGTG为引物，以cDNA为模板进行定量PCR，检测AcCAX1的转录水平。
AcCAX1基因在菠萝不同程度水心病果实中的转录水平如图11和图12所示，AcCAX1的转录水平在轻度水心病中显著上调，在中度以及中度水心病中下调。
(四)AcCAX1瞬时转化菠萝果实可以显著诱发菠萝水心病情况
分别挑取转化有pCOMBIA2300以及35s-CAX1-eYFP农杆菌单菌落于10ml含Kana抗生素的液体培养基中，30℃，150rpm培养12h–24h。将培养好的菌液4000×g离心10min，倒掉上清。加入2ml转化缓冲液(见表4)重悬菌体，4000×g离心10min，倒掉上清。最后沉淀用2mL转化缓冲液重悬，然后再另取一个15ml的离心管，管中加入10ml转化缓冲液，取少许菌体于15ml管中，调节OD600值为0.6–0.8。将上述调整好的菌液取200微升，用1ml注射器于成熟菠萝的果眼间隙进行注射，注射后50小时切开菠萝，并拍摄照片，并利用imageJ软件统计病斑面积。
表4转化缓冲液
| 1M MgCl2 | 0.5mL |
| 0.1M MES pH5.6 | 5mL |
| 0.1M AS | 7.5μL |
| 超纯水 | 定容指50mL |
检测结果如图13和图14所示，结果显示，与瞬时表达空载体对照相比(EV)，AcCAX1瞬时转化菠萝果实可以显著诱发菠萝水心病。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。
Claims (6)
1.菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1，其特征在于，其氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示序列或包括与SEQ ID NO：2所示序列同源性≥85％的序列。
2.菠萝水心病靶标基因，其特征在于，包括如SEQ ID NO：1所示序列或包括与SEQ IDNO：1所示序列同源性≥85％的序列。
3.权利要求1所述的菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1或权利要求2所述的菠萝水心病靶标基因在菠萝遗传育种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用包括：权利要求1所述菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1的抑制剂或权利要求2所述的菠萝水心病靶标基因的表达抑制剂在防治菠萝水心病中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用包括：权利要求1所述菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1的抑制剂或权利要求2所述的菠萝水心病靶标基因的表达抑制剂为高浓度CaCl2。
6.一种控制菠萝细胞中钙离子稳态的方法，其特征在于，包括：通过调控菠萝中权利要求1所述的菠萝Ca2+/H+反向转运蛋白AcCAX1含量或调控菠萝中权利要求2所述的菠萝水心病靶标基因的表达水平。
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