CN118063565A - 一种中长烷基链修饰的超分子表位肽、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中长烷基链修饰的超分子表位肽、其制备方法及应用，属于超分子疫苗技术领域。本发明的超分子表位肽由C₁₂烷基链修饰的B表位肽和C₁₂烷基链修饰的T表位肽组成。在本发明中，中长烷基链可为多肽组装提供足够的疏水相互作用，从而使多肽更容易进行组装，提高了多肽组装体疫苗的稳定性，而且，通过B表位肽和T表位肽的非共价相互作用共组装，提高多肽组装体的稳定性并同时增强表位多肽被抗原递呈细胞的识别与摄取，提高免疫效果。此外，本发明操作简单，稳定性高，安全性好，对于口蹄疫疫苗的发展具有重要意义。

Description

一种中长烷基链修饰的超分子表位肽、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于超分子疫苗技术领域，具体涉及一种中长烷基链修饰的超分子表位肽、其制备方法及应用。

背景技术

口蹄疫可以引起偶蹄动物例如猪、牛、羊的急性传染病，该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内爆发流行，造成巨大经济损失，世界动物卫生组织已将其列为A类传染病之首。口蹄疫病毒属于微核糖病毒科口蹄疫病毒属，目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个血清型，主要包括O、A、C、Asia-1、SAT-1、SAT-2、SAT-3。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型，中国流行的口蹄疫主要为O、A、C三个血清型。

目前，口蹄疫流行地区主要通过使用灭活疫苗对病毒进行控制，灭活疫苗在一定程度上可以有效防止口蹄疫的扩散和传播，尽管灭活疫苗被广泛使用，但是也存在很多缺点，例如：(1)对储存温度要求严格，口蹄疫病毒是一种热敏感病毒，疫苗需要冷链运输来保持病毒的有效性，稳定性差；(2)疫苗生产过程中有病毒泄露的风险，安全性低，因此需要生物安全防护三级实验室生产，以防止疫苗生产过程中活病毒的逃逸；(3)由于灭活过程可能会破坏有用抗原或其他成分，导致免疫效果不理想；(4)灭活疫苗接种剂量较大且需多次免疫，效果较差，维持时间短，常需加入佐剂，成本上升。

亚单位疫苗属于基因工程疫苗的一种，与灭活疫苗不同，亚单位疫苗不包含病毒的整个病原体，而是只包含抗原部分，例如多肽、蛋白质、多糖等，因此基于肽的亚单位疫苗成为优秀的替代品。因为亚单位疫苗缺乏传染源，生产过程中可以确保绝对的生物安全性；序列明确，可以除去相关分子中的有害序列；易于合成和放大；储存和运输简单。多肽纳米组装作为多肽亚单位疫苗的修饰策略之一，能够产生明确的纳米结构。多肽纳米组装体具有结构多样性、生物相容性、疏水性和亲水性的两亲型以及对靶细胞的特异性等优点，这些优点使亚单位疫苗成为传统疫苗的有效替代品。

但是具有明确氨基酸序列的亚单位疫苗在实际应用中常受到线性肽的低免疫原性阻碍，例如线性肽稳定性差，易被蛋白酶分解，缺乏靶向性等缺点，为了克服这一缺点，其中由多个表位肽组成的多聚体呈递系统因其免疫原性高于单体形式从而脱颖而出。多肽之间通过非共价相互作用，自组装或共组装成纳米结构，在没有传统佐剂(例如铝佐剂)的情况下形成超分子组装体，创造出自佐剂疫苗。因此，设计多肽组装的超分子疫苗体系是提高多肽疫苗生物利用度和免疫效果的有效方法。在多肽纳米结构的各种形态中，纳米纤维因其合适长径比、生物相容性高、形状柔性好被认为是有前途的亚单位疫苗之一。

发明内容

本发明选择口蹄疫病毒表位分别对应位于衣壳蛋白VP1第141～160位的20个残基组成的带正电荷的B表位免疫优势位点，和位于非结构蛋白3A第21～35位的15个残基组成的带负电荷的T表位免疫优势位点，并对两条多肽进行修饰，使多肽由三个不同的结构域组成：(1)由十二烷基链组成的疏水单元，提供足够的疏水相互作用，使多肽更容易进行组装，提高多肽生物稳定性，而且可以提供与细胞膜最佳的疏水相互作用，使肽转运到细胞内并发挥免疫效果；(2)由表位序列组成的免疫优势位点，提供有效的免疫效果；(3)末端乙酰氨基化增加一个电荷。本发明使表位肽进行自组装，并以相同摩尔比对自组装B表位肽和自组装T表位肽进行共组装，形成共组装纳米纤维。经中长烷基链修饰后，提高了多肽超分子组装体稳定性并同时提高其免疫效果。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种超分子表位肽，由C12-B和C12-T组成；其中，所述C12-B为C₁₂烷基链修饰的B表位肽，所述C12-T为C₁₂烷基链修饰的T表位肽。

在本发明中，所述B表位肽的氨基酸序列为：PVTNVRGDLQVLAQKAARTC；所述T表位肽的氨基酸序列为：AAIEFFEGMVHDSIK。

在本发明中，所述C12-B的链式结构如下：

C₁₂-G-PVTNVRGDLQVLAQKAARTC-NH₂。

在本发明中，所述C12-T的链式结构如下：

C₁₂-G-AAIEFFEGMVHDSIK-NH₂。

本发明提供了上述超分子表位肽的制备方法，步骤如下：

(1)自组装

将C12-B和C12-T分别溶解于缓冲液中，超声使其充分溶解，然后静置，使其充分进行自组装；

(2)共组装

将自组装C12-B溶液和自组装C12-T溶液混合，超声使其充分溶解，然后静置，使其充分进行共组装，获得超分子表位肽。

在上述制备方法中，所述步骤(1)中，缓冲液选自PBS缓冲溶液或Tris HCl缓冲溶液。

在上述制备方法中，所述步骤(1)中，C12-B和C12-T在缓冲液中的浓度均选自0.5～4mM。

在上述制备方法中，所述步骤(2)中，C12-B和C12-T的摩尔比为1:1。

在上述制备方法中，所述步骤(1)和步骤(2)的温度控制在25～37℃。

本发明提供了上述超分子表位肽在制备多肽口蹄疫疫苗中的应用。

本发明提供了一种多肽口蹄疫疫苗，所述疫苗含有上述超分子表位肽。

本发明的有益效果为：

本发明选择在口蹄疫病毒T表位肽和B表位肽N端修饰中长烷基链，然后通过T细胞表位和B细胞表位的表位肽在缓冲液中自组装，调节浓度，使多肽自组装形成纳米结构，再通过非共价相互作用将含有不同表位的T表位肽和B表位肽在溶液中共组装形成纳米结构，以制备获得超分子表位肽。在本发明中，中长烷基链可为多肽组装提供足够的疏水相互作用，从而使多肽更容易进行组装，提高了多肽组装体的稳定性，而且，通过B表位肽和T表位肽的非共价相互作用共组装，提高多肽组装体的稳定性并同时增强表位多肽被抗原递呈细胞的识别与摄取，提高免疫效果。本发明操作简单，稳定性高，安全性好，对口蹄疫疫苗的发展具有重要意义。

附图说明

图1为C12-B的透射电子显微镜图；其中，a为0.5mM，b为2.0mM，c为4.0mM；

图2为C12-T的透射电子显微镜图；其中，a为0.5mM，b为2.0mM，c为4.0mM；

图3为共组装C12-B/T的透射电子显微镜图；其中，a为0.5mM，b为2.0mM，c为4.0mM；

图4为共组装C12-B/T结构(a)、未修饰的B-T混合表位肽(b)的荧光发射光谱；

图5为DC2.4细胞在孵育12h后摄取表位肽的共聚焦显微镜图；其中，a为C₁₂烷基链修饰的表位肽，b为未修饰的表位肽；

图6为DC2.4细胞在孵育24h后摄取表位肽的共聚焦显微镜图；其中，a为C₁₂烷基链修饰的表位肽，b为未修饰的表位肽；

图7为各种表位肽诱导DC2.4细胞成熟的流式细胞仪结果；其中，a为1×PBS对照组，b为自组装C12-T，c为自组装C12-B，d为共组装C12-B/T，e为未修饰的自组装T表位肽，f为未修饰的自组装B表位肽，g为未修饰的混合B-T表位肽，h为未组装的C12-T，i为未组装的C12-B，j为未组装的C12-T和C12-B混合物。

具体实施方式

在本发明中，所用材料如下：

1×PBS缓冲溶液：用电子天平称取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.42g Na₂HPO₄、0.27gKH₂PO₄，加入1000mL去离子水，搅拌20min至完全溶解，用1M的HCl和1M NaOH调节pH至7.4，备用。

50mM Tris HCl缓冲溶液：用电子天平称取0.6304g Tris HCl，加入80mL去离子水，超声搅拌20min至完全溶解，用1M的HCl和1M NaOH调节pH至7.4，备用。

B表位肽：选自口蹄疫病毒表位位于衣壳蛋白VP1第141～160位的20个残基组成的带正电荷的B表位免疫优势位点，其氨基酸序列为：PVTNVRGDLQVLAQKAARTC(SEQ ID NO:1)。

T表位肽：选自口蹄疫病毒表位位于非结构蛋白3A第21～35位的15个残基组成的带负电荷的T表位免疫优势位点，其氨基酸序列为：AAIEFFEGMVHDSIK(SEQ ID NO:2)。

DC2.4细胞：将冻存的DC2.4细胞取出，在37℃水浴锅中解冻后，与3mL RPMI 1640培养基混合，800rpm/min，3min离心，吸出上清丢弃，加入5mL RPMI 1640新鲜培养基重悬混匀细胞，并全部接种到培养瓶中进行细胞复苏培养。细胞密度达到80～90％时，对其进行传代培养，弃去原培养液，用PBS润洗1次。加1mL胰酶轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞。放入37℃培养箱消化2min，在显微镜下观察到细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台。加3mLRPMI 1640培养基终止消化，吹打细胞使之脱壁，在液体里反复吹打，细胞呈单颗悬浮液。收集细胞悬液，800rpm/min，3min离心，吸出上清丢弃。加入1mL RPMI 1640新鲜培养基，吹打混匀细胞，以1:3-1:5的比例接种到培养瓶中继续培养，使DC2.4细胞浓度达到10⁵个/mL。

在本发明中，B表位肽、T表位肽及其C₁₂烷基链修饰是委托上海淘普生物科技有限公司合成的。经C₁₂烷基链修饰后，两种表位肽获得如下链式结构(直链)：

C₁₂-G-PVTNVRGDLQVLAQKAARTC-NH₂(C12-B)

C₁₂-G-AAIEFFEGMVHDSIK-NH₂(C12-T)

经高效液相色谱(HPLC)以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)两种仪器的鉴定，C12-B纯度达到94％以上，C12-T纯度达到90％以上，储存条件为-20℃。

本发明所采用的其它材料，如无特殊声明，均可通过市售渠道获得。本发明所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

制备超分子表位肽疫苗，步骤如下：

(1)自组装

将C12-B和C12-T分别溶解于1×PBS缓冲液中，摩尔浓度设置为0.5～4.0mM(分别为0.5mM、2.0mM、4.0mM)，超声30min使其充分溶解。然后常温静置，使其充分进行自组装。

多肽组装体的形貌结构如图1和图2所示：

当组装体的摩尔浓度在0.5mM及以上时，表位多肽表现为溶液，并形成大量纤维组装体。由图1可知，C12-B自组装形成纤维状结构，平均直径约7nm，长度约500nm，高度约6nm。由图2可知，C12-T自组装形成纤维状结构，直径在8nm左右，长度约500nm，高度在6-8nm之间。

(2)共组装

将自组装C12-B溶液和自组装C12-T溶液按摩尔比1:1混合，超声30min使其充分溶解，然后常温静置，使其充分进行共组装，获得超分子表位肽，即共组装C12-B/T。

多肽组装体的形貌结构如图3所示：

C12-B和C12-T通过静电相互作用、范德华力、疏水作用等非共价相互作用自发性共组装形成超分子表位肽疫苗。由图3可知，当组装体的摩尔浓度在0.5mM及以上时，超分子表位肽疫苗表现为溶液，并形成了大量短纤维组装体。其中，共组装C12-B/T短纤维直径在9nm，长度在100nm左右，高度在6nm左右。

一、共组装证明试验

用异硫氰酸荧光素(FITC)标记C12-T和未修饰的T表位肽，并将标记好的T表位肽与B表位肽通过1:1摩尔比混合，通过共组装前后荧光强度来证明C12-B和C12-T是否进行了共组装。以未修饰的T表位肽和未修饰的B表位肽作为对照。

具体操作如下：

首先，将未修饰的T表位肽和C12-T分别置于0.1M的NaHCO₃溶液中，超声一段时间使多肽充分溶解，一边搅拌一边向多肽溶液中间隔缓慢加入FITC，每1mL多肽溶液加入50μLFITC，之后室温搅拌混合4h后并在4℃冰箱过夜，此过程FITC的硫碳胺键与多肽的赖氨酸(Lys)R氨基结合，形成荧光结合物。进一步，加入适量NH₄Cl溶液使其终浓度为50mM，室温搅拌2h终止反应。进一步，12000×g，10min进行离心，去掉未反应的FITC。继续将标记了FITC的T表位肽重悬，并在相同摩尔浓度的基础上分别与未修饰的B表位肽和C12-B以1:1摩尔比混合，测定荧光发射光谱。

在相同T表位肽浓度的情况下，与T表位肽相比，若T表位肽与B表位肽共组装溶液的荧光强度增加，这表明T表位肽与B表位肽形成共组装，并被B表位肽“稀释”用以降低荧光自猝灭效应。

试验结果如图4所示：

连接FITC的C12-T的荧光强度为1.9×10⁶，连接FITC的共组装C12-B/T的荧光强度为2.0×10⁶，在相同C12-T浓度下，因为和C12-B发生共组装，从而降低了荧光自猝灭效应，荧光强度的增强说明形成了共组装。而未修饰的T表位肽的荧光强度为2.0×10⁶，连接FITC的未修饰的混合B-T表位肽的荧光强度为1.3×10⁶，混合溶液的荧光强度下降，说明未修饰的B表位肽和未修饰的T表位肽没有形成共组装。

二、树突细胞摄取试验

通过上述方法用FITC标记未修饰的表位肽和C₁₂烷基链修饰的表位肽，根据实施例1所述方法将C₁₂烷基链修饰的表位肽进行自组装和共组装，以未修饰的表位肽作为对照。将制备好的自组装表位肽和共组装表位肽加入到DC2.4细胞培养基(DC2.4细胞浓度为10⁵个/mL)中，与DC2.4细胞分别共孵育12h和24h，通过共聚焦显微镜拍摄DC2.4细胞的摄取情况。

试验结果如图5和图6所示：

在12h时观察到C12-T自组装、C12-B自组装和共组装C12-B/T都被DC2.4细胞少量摄取。在24h时，DC2.4细胞摄取多肽组装体的量显著增加。图中的表现即为绿色荧光强度变大，这也说明，DC2.4细胞对上述多肽的摄取均存在时间依赖性，且在24h后荧光强度依旧很稳定，而未修饰的表位肽组合在12h和24h后都只有极少量的表位肽被DC2.4细胞少量摄取，这可能是因为，表位肽经过C₁₂烷基链修饰后，能够更稳定地组装为纳米结构，且长度中等的十二烷基链，能够提供与细胞膜足够的疏水作用，使肽纳米组装体转运到细胞内。

综上，DC2.4细胞成功摄取自组装C12-T、自组装C12-B和共组装C12-B/T，且摄取均存在时间依赖性，在24h后组装结构依旧稳定。

三、刺激树突状细胞成熟试验

根据实施例1所述方法将C₁₂烷基链修饰的表位肽进行自组装和共组装。将表位肽加入到DC2.4细胞培养基中进行培养，DC2.4细胞浓度为10⁵个/mL，在培养过程中，未成熟的DC2.4细胞向成熟的DC2.4细胞分化，培养24小时后，用流式细胞仪(FACS)检测成熟DC2.4细胞主要表面标志物(CD86)的表达情况。以未修饰的自组装表位肽和未组装的C₁₂烷基链修饰的表位肽作为对照进行比较。

试验结果如图7所示：

C12-T、C12-B、共组装C12-B/T能更好地刺激DC2.4细胞上调CD86，成熟DC2.4细胞所占比例分别达到69.1％、71.0％、66.3％，三组在刺激DC2.4细胞熟化的能力上差别不大，而未修饰的自组装T表位肽、未修饰的自组装B表位肽、未修饰的混合B-T表位肽刺激DC2.4细胞成熟的比例为69.4％、58.5％、54.8％，从中推测，C₁₂烷基链的修饰能够更好的刺激DC2.4细胞成熟，使其能更好的发挥免疫效果，并且C₁₂烷基链修饰的表位肽组装后克服了线性肽低免疫原性的缺点，其细胞免疫效果大大提高。

此外，未组装的C12-T、未组装的C12-B、未组装的C12-T和C12-B混合物刺激DC2.4细胞成熟的比例只有59.6％、51.9％、47.2％，从中推测，C₁₂烷基链修饰的表位肽在组装后更易被DC2.4细胞摄取并且刺激DC2.4细胞成熟。

综上所述，C₁₂烷基链的修饰以及表位肽的组装(自组装和共组装)能有效刺激DC2.4细胞成熟，从而进一步进行机体免疫应答。因此，可将本发明所述超分子表位肽作为疫苗应用在口蹄疫疾病的预防当中。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种超分子表位肽，其特征在于，由C12-B和C12-T组成；其中，所述C12-B为C₁₂烷基链修饰的B表位肽，所述C12-T为C₁₂烷基链修饰的T表位肽。

2.根据权利要求1所述的超分子表位肽，其特征在于，所述C12-B的链式结构为C₁₂-G-PVTNVRGDLQVLAQKAARTC-NH₂；所述C12-T的链式结构为C₁₂-G-AAIEFFEGMVHDSIK-NH₂。

3.权利要求1或2任一项所述超分子表位肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)自组装

将C12-B和C12-T分别溶解于缓冲液中，超声使其充分溶解，然后静置，使其充分进行自组装；

(2)共组装

将自组装C12-B溶液和自组装C12-T溶液混合，超声使其充分溶解，然后静置，使其充分进行共组装，获得超分子表位肽。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，缓冲液选自PBS缓冲溶液或Tris HCl缓冲溶液。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，C12-B和C12-T在缓冲液中的浓度均选自0.5～4mM。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，C12-B和C12-T的摩尔比为1:1。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)的温度控制在25～37℃。

8.权利要求1或2所述超分子表位肽在制备多肽口蹄疫疫苗中的应用。

9.一种多肽口蹄疫疫苗，其特征在于，所述疫苗含有权利要求1或2所述的超分子表位肽。