CN118059118A - 一种抑制nfkbiz基因表达的药物组合物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物和应用，属于生物医药技术领域。本发明设计得到能够靶向调控NFKBIZ基因表达的双链核酸分子，通过验证核酸分子的基因调控效率，筛选得到多个核酸分子能够抑制NFKBIZ基因的表达，并且在蛋白层面上实现了高效抑制IκB‑ζ蛋白表达的目的。同时本发明验证了上述核酸分子和靶向配体分子偶联形成的药物组合物在眼部疾病中的应用，该药物组合物能够解决现有小分子免疫调节药物递送效率低、治疗效果差的问题，赋予小核酸药物组织靶向递送功能，具有药效作用时间长、副作用小等优势；此外，所述药物组合物成分简单、合成容易，具有较好的转化应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物和应用。
背景技术
IκB-ζ(核因子κB抑制因子ζ)是属于IkappaB蛋白家族中非典型成员。IκB-ζ分布于细胞核内，主要控制核因子κB(NF-κB)信号通路次级响应基因表达，而NF-κB信号通路在多种细胞过程中都起到关键作用，包括细胞生长、分化和凋亡，尤其在免疫应答和炎症反应中发挥核心作用。IκB-ζ由NFKBIZ基因编码，NFKBIZ基因的激活和上调表达能够促进NF-κB信号通路下游一系列细胞炎症因子的表达和分泌，广泛调节单核吞噬细胞系统、NK细胞、T细胞、B细胞以及上皮细胞等多种细胞功能，已被证明是炎症过程和免疫调控的关键调节基因。眼表疾病是眼科最常见的疾病，比如干眼、角膜炎、结膜炎、睑缘炎等，均与炎症相关，可以通过抑制炎症因子的表达起到治疗作用。因此，调节NFKBIZ基因表达是治疗此类疾病的潜在治疗方法。
小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)作为RNA干扰(RNAi)技术的重要效应分子，通过双链RNA(dsRNA)在体内诱导靶基因mRNA产生特异性降解，进而引起不同水平的基因沉默，具有治疗疾病的巨大潜力。相比于小分子药物，siRNA具有靶点丰富、不易耐药、长效、易合成生产等优势；相比于抗体面临的成本高、潜在全身毒性和抗抗体产生等挑战，而siRNA具有更长效更安全的优势。此外，siRNA药物由于成药概率更高，而且研发生产过程更加省时、便捷，近年来受到了越来越多制药公司的青睐。因此，通过小干扰RNA技术靶向炎症反应相关基因，如NFKBIZ基因，实现免疫调控的目的，具有较好的应用前景。而目前靶向NFKBIZ基因的siRNA报道较少，且敲除效率较低，不能满足高效抑制NFKBIZ基因表达的要求。
此外，目前在治疗肝脏相关疾病领域已经有多款siRNA药物获批，然而对于非肝脏类疾病治疗领域仍待研发。眼睛作为人体中最精密的器官之一，由于其独特的解剖学和生理学特点，常见的给药方式是眼部局部给药，其中滴眼液、眼膏以及眼用凝胶为主要剂型。针对免疫相关性疾病，临床现有小分子免疫调节药物存在水溶性差、高频反复给药的毒副作用、生物利用度较低、只有5％～10％的剂量到达目标组织、患者依从性差等药物递送困难问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物，是靶向配体分子和具有基因调控功能的核酸分子形成的偶联物，利用靶向配体分子靶向眼部组织特异性蛋白，提高核酸分子进入眼表细胞效率，高效下调NFKBIZ基因表达，从而在蛋白层面高效抑制IκB-ζ蛋白的表达，最终解决基因药物递送的问题，提高药物的生物利用度，实现相关疾病的有效治疗。
本发明提供了一种抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物，包括抑制NFKBIZ基因表达的核酸分子和靶向眼部组织特异性蛋白的靶向配体分子。
优选的，所述核酸分子包括以下至少一种核苷酸序列：
A.所述核酸分子的正义链选自以下至少一种编号的核苷酸序列：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51～SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93～SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113～SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134～SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：143～SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154～SEQ ID NO：161、SEQID NO：169～SEQ ID NO：185和SEQ ID NO：421；
所述核酸分子的反义链选自以下至少一种编号的核苷酸序列：SEQ ID NO：211～SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：235～SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：261～SEQ ID NO：299、SEQID NO：303～SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：323～SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：344～SEQ IDNO：345、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：353～SEQ ID NO：362、SEQ ID NO：364～SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：379～SEQ ID NO：395和SEQ ID NO：422；
B.在A项的核苷酸序列基础上序列连续或不连续增加、删减或替换2～3个碱基，且具有靶向NFKBIZ基因发挥抑制作用的核苷酸序列。
优选的，所述核酸分子的正义链或反义链末端还设置有悬挂单链。
优选的，所述悬挂单链的长度为1～3nt。
优选的，所述核酸分子包含以下任意一种或几种修饰核苷酸：脱氧-核苷酸、3′端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2′-O-甲基修饰的核苷酸、2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、构象限制的核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2′-氨基修饰的核苷酸、2′-0-烯丙基修饰的核苷酸、2′-C-烷基修饰的核苷酸、2′-羟基修饰的核苷酸、2′-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2′-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1，5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基膦酸酯基的核苷酸、包含5′-磷酸酯的核苷酸和包含5′-磷酸酯模拟物的核苷酸。
优选的，所述靶向眼部组织特异性蛋白的靶向配体分子包括以下至少一种：靶向眼部组织特异性蛋白的核酸适配体、硼酸或其衍生物修饰的化合物、或者苯硼酸或其衍生物修饰的化合物。
优选的，所述眼部组织特异性蛋白包括以下至少一种：黏蛋白、整合素和CD44；
所述黏蛋白包括以下至少一种：MUC-1、MUC-4和MUC-16；
所述整合素包括以下至少一种：αVβ1、αVβ3、αVβ6、α5β1、α6β1、αVβ1、αVβ5、α6β4和α1β1。
优选的，靶向黏蛋白MUC-1的核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：423所示；
靶向黏蛋白MUC-16的核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：424所示；
靶向整合素αvβ3的核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：425所示。
靶向CD44的核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：426所示。
优选的，所述核酸适配体还包括经稳定性增强修饰的核酸适配体；
所述稳定性增强修饰包括以下至少一种：硫代磷酸酯骨架修饰、2′-氧甲基修饰、2′-甲氧乙基修饰、2′-氟代修饰、反向胸苷(Inverted dT)修饰、脱氧胸苷核苷酸和聚乙二醇末端缀合。
优选的，所述硼酸或其衍生物修饰的化合物或者苯硼酸或其衍生物修饰的化合物为末端修饰硼酸或苯硼酸的线性或分枝状化合物；
所述线性或分枝状化合物上修饰的硼酸或其衍生物或者苯硼酸或其衍生物的修饰数量为1～40个；
优选的，所述硼酸或其衍生物修饰的化合物或苯硼酸或其衍生物修饰的化合物的结构式如式1～式10中任意一种所示：
式1～式10中，A、G各自独立地为不存在、-(CH2)h-或-(CH2)h-中的任意一个或多个亚甲基被M基团所取代后的基团；所述h为0～15；所述M基团包括：-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-CH(TC)-、-C(T’)(T”)-、-NH-、-N(TN)-、-S-S-、-C(T’)＝C(T”)-、-C≡C-、和中的一种或几种；
所述M基团中的TC、TN、T’、T”表示指定原子上的任何一个或多个氢原子被L所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物，所述指定原子包括碳原子或氮原子；所述L基团包括以下任意一种：C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氰基、羟基、氧代基、羧基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基或卤素；所述卤素包括F、Cl、Br或I；所述A中(O)代表羰基氧原子；
D、E、H各自独立地为不存在、-O-、-S-、-C(O)-、-NH-、-CH2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-和 中的一种或几种；所述D、E、H基团中(O)代表羰基氧原子；所述表示所在结构式的连接位置；所述A、G、D、E、H不同时不存在；
K表示硼酸或其衍生物或者苯硼酸及其衍生物；m、n、t独立地为1～15。
优选的，所述靶向配体分子直接共价偶联于核酸分子的末端。
优选的，当靶向配体分子为核酸适配体时，所述核酸适配体的磷酸基团与核酸分子的核糖进行共价偶联。
优选的，当靶向配体分子为硼酸或其衍生物修饰的化合物或者苯硼酸或其衍生物修饰的化合物时，所述靶向配体分子与核酸分子末端的磷酸基或碱基共价偶联；
当共价偶联于核酸分子末端的磷酸基时，所述靶向配体分子通过X基团进行偶联；所述X基团表示-O-或-S-。
优选的，所述靶向配体分子通过连接在所述核酸分子末端的延伸序列与核酸分子进行共价偶联。
优选的，所述延伸序列包括仅一端与核酸分子的末端连接的延伸序列和/或一端与核酸分子的一条链的3′端连接同时另一端与核酸分子的互补链5′端连接或不连接形成茎环结构的延伸序列。
优选的，所述延伸序列的长度为1～40nt；所述延伸序列为随机核苷酸序列。
优选的，当靶向配体分子为核酸适配体时，所述核酸适配体的磷酸基团与延伸序列的核糖进行共价偶联。
优选的，当靶向配体分子为硼酸或其衍生物修饰的化合物或者苯硼酸或其衍生物修饰的化合物时，所述靶向配体分子与延伸序列上一个或两个以上的磷酸基或碱基共价偶联；
当共价偶联与延伸序列的磷酸基时，所述靶向配体分子通过X基团进行偶联；所述X基团表示-O-或-S-。
本发明提供了所述药物组合物在制备预防和/或治疗眼部疾病的药物中的应用。
优选的，所述眼部疾病包括以下一种或几种：干眼、角膜炎、结膜炎和睑缘炎。
本发明提供了一种抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物，包括所述核酸分子和靶向配体分子。本发明将核酸分子和靶向配体分子偶联，能够解决现有眼科疾病常用免疫调节药物水溶性差、高频反复给药的顺应性差、毒副作用、生物利用度较低、患者依从性差等问题；同时，本发明根据眼部组织结构特征，筛选了眼表组织特异性识别的靶标分子，能够实现功能核酸的靶向高效递送，从而实现功能核酸高效发挥生物学作用；此外，本发明所提供的用于抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物成分简单、合成容易，具有较好的转化应用前景。
进一步的，本发明具体限定了核酸分子的序列，本发明以NFKBIZ基因(GenBank登录号：NM_031419.4)为模板，通过siRNA设计，得到210对双链核糖糖酸分子，并进一步利用qPCR和Western-blot分别验证siRNA在基因层面及蛋白层面的基因沉默效率，结果表明，本发明筛选得到多条siRNA能够高效抑制NFKBIZ mRNA的表达，并且从蛋白层面上证实具有抑制IκB-ζ表达的特性。可见，本发明提供了一批能够特异性抑制NFKBIZ基因和蛋白IκB-ζ表达的核酸分子，相比于现有的小分子免疫类药物，具有不易耐药、长效等优势，为通过抑制炎症因子的表达，从而为实现炎症相关疾病的防治提供了基础。
进一步的，本发明中涉及的靶向配体分子具体限定了两类，一类为核酸适配体，另一类为硼酸/苯硼酸及其衍生物。其中核酸适配体与核酸分子偶联，基于核酸适配体与眼部特异性组织蛋白的靶向作用，提高核酸分子进入细胞的效率，从而提高眼表细胞中NFKBIZ基因抑制效果，提高基因药物组合物在眼表滞留和黏附能力，增加生物利用度和减少药物的损失，实现眼表疾病的有效治疗。同时本发明通过将不同价态的硼酸/苯硼酸及其衍生物与核酸分子直接或通过延伸序列进行偶联，能有效提高核酸分子入胞，提高NFKBIZ基因抑制效果，从而实现眼表疾病的治疗。
附图说明
图1为本发明提供的核酸分子和靶向配体分子形成的药物组合物示意图；
图2为核酸适配体通过延伸序列与核酸分子偶联示意图，其中代表核酸分子部分，碱基可以为A腺嘌呤，G鸟嘌呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶；代表延伸序列部分，可以为核糖核苷酸分子或脱氧核糖核苷酸分子，碱基可以为A腺嘌呤，G鸟嘌呤，C胞嘧啶，T胸腺嘧啶中任何一个，n为1-40碱基长度；代表核酸适配体部分；
图3为核酸分子形成茎环结构与靶向配体分子共价偶联示意图；
图4为用于抑制NFKBIZ基因的siRNA筛选的qPCR结果图；
图5为用于抑制NFKBIZ基因的siRNA对于IκB-ζ蛋白表达的Wester-blot结果图；
图6为Apt-siNFKBIZ基因药物组合物聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图7为HCEC细胞靶向摄取Apt-siNFKBIZ-Cy3基因药物组合物的结果；其中A为激光共聚焦显微镜检测结果，B为流式细胞仪检测结果；
图8为Apt-siNFKBIZ基因药物组合物对于HCEC细胞NFKBIZ基因沉默效果的qPCR结果图；
图9为Apt-siNFKBIZ基因药物组合物对于HCEC细胞IκBζ蛋白表达抑制的Western-blot结果图；
图10为Apt-siNFKBIZ-M基因药物组合物在小鼠眼表滞留组织切片荧光成像图；
图11为Apt-siNFKBIZ-M基因药物组合物体内干眼治疗结果，其中A为荧光素钠染色图；B为荧光素钠染色评分图；C为泪液分泌量结果图；
图12为PBA-siNFKBIZ基因药物组合物合成路线；
图13为PBA-siNFKBIZ-Cy3基因药物组合物细胞摄取能力验证结果；其中A为激光共聚焦图；B为流式细胞仪定量图；
图14为qPCR验证PBA-siNFKBIZ基因药物组合物细胞基因调控能力；
图15为PBA-siNFKBIZ-M基因药物组合物体内干眼治疗效果评估结果，其中A为在治疗第0、7天、14天小鼠眼表荧光素钠评分数据分析；B为在治疗第0、7天、14天小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图16为2PBA-MAL合成路线图；
图17为化合物3核磁氢谱图；
图18为化合物3核磁碳谱图；
图19为化合物4核磁氢谱图；
图20为化合物4核磁碳谱图；
图21为化合物5核磁氢谱图；
图22为化合物5核磁碳谱图；
图23为2PBA-siNFKBIZ-S偶联物合成路线；
图24为20％非变性聚丙烯凝胶验证2PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的合成；
图25为2PBA-siNFKBIZ-Cy3基因药物组合物细胞摄取能力验证结果，其中A为激光共聚焦图；B为流式细胞仪定量图；
图26为qPCR验证2PBA-siNFKBIZ药物组合物细胞基因调控能力：
图27为2PBA-siNFKBIZ-M基因药物组合物体内干眼治疗效果评估结果，其中A为小鼠眼表荧光素钠染色图；B为在治疗第0天、7天、14天小鼠眼表荧光素钠评分数据分析；C为在治疗第0天、7天、14天小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图28为4PBA-NH2合成路线；
图29为化合物7核磁氢谱图；
图30为化合物7核磁碳谱图；
图31为化合物8核磁氢谱图；
图32为化合物8核磁碳谱图；
图33为化合物11的核磁氢谱；
图34为化合物11的核磁碳谱；
图35为4PBA-siNFKBIZ-S偶联物合成路线；
图36为20％的非变性聚丙烯凝胶验证4PBA-siNFKBIZ基因药物组合物合成；
图37为4PBA-siNFKBIZ-FAM基因药物组合物的细胞摄取能力评估；A为激光共聚焦图；B为流式细胞仪定量图；
图38为4PBA-siNFKBIZ基因药物组合物细胞生物学评价结果，A为4PBA-siNFKBIZ基因药物组合物对NFKBIZ基因调控qPCR结果图；B为4PBA-siNFKBIZ基因药物组合物对IκB-ζ蛋白调控的Western-blot结果图
图39为4PBA-siNFKBIZ-M基因药物组合物体内干眼治疗效果评估结果，其中A为小鼠眼表荧光素钠染色图；B为在治疗第0天、7天、14天小鼠眼表荧光素钠评分数据分析；C为在治疗第0天、7天、14天小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图40为6PBA-N3的合成路线；
图41为化合物13的核磁氢谱；
图42为化合物15的核磁氢谱；
图43为化合物15的核磁碳谱；
图44为6PBA-siNFKBIZ-S偶联物合成路线；
图45为20％的非变性聚丙烯凝胶验证6PBA-siNFKBIZ基因药物组合物合成；
图46为6PBA-siNFKBIZ-FAM基因药物组合物的细胞摄取能力评估结果，其中A为激光共聚焦图；B为流式细胞仪定量图；
图47为6PBA-siNFKBIZ基因药物组合物细胞生物学评价结果，A为6PBA-siNFKBIZ基因药物组合物对NFKBIZ基因调控qPCR结果图；B为6PBA-siNFKBIZ基因药物组合物对IκB-ζ蛋白调控的Western-blot结果图；
图48为6PBA-siNFKBIZ-M基因药物组合物体内干眼治疗效果评估结果，其中A为小鼠眼表荧光素钠染色图；B为在治疗第0天、7天、14天小鼠眼表荧光素钠评分数据分析；C为在治疗第0天、7天、14天小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图49为PBA10-siNKKBIZ-S偶联物合成路线图；
图50为10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶验证PBA10-siNFKBIZ基因药物组合物的合成；
图51为流式细胞仪验证PBA10-siNFKBIZ-FAM基因药物组合物的不同时间的细胞摄取能力结果；
图52为qPCR实验验证PBA10-siNFKBIZ基因药物组物的基因调控能力；
图53为PBA10-siNFKBIZ-M基因药物组合物体内干眼治疗效果评估结果，其中A为小鼠眼表荧光素钠染色图；B为在治疗第0天、7天、14天小鼠眼表荧光素钠评分数据分析；C为在治疗第0天、7天、14天小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图54为2PBA-Br合成路线图；
图55为化合物18的核磁氢谱；
图56为化合物18的核磁碳谱；
图57为PBA6-siNKKBIZ-S偶联物合成路线
图58为20％的非变性聚丙烯酰胺验证PBA6-siNFKBIZ基因药物组合物合成图；
图59为PBA6-siNFKBIZ-FAM基因药物组合物细胞摄取能力评价结果，其中A为HCEC细胞对PBA6-siNFKBIZ-FAM基因药物组合物摄取共聚焦图；B为HCEC细胞对PBA6-siNFKBIZ-FAM基因药物组合物流式定量图；
图60为PBA6-siNFKBIZ基因药物组合物细胞生物学评价结果，A为PBA6-siNFKBIZ基因药物组合物对NFKBIZ基因调控qPCR结果图；B为PBA6-siNFKBIZ基因药物组合物对NFKBIZ基因调控Western-blot结果图；
图61为PBA6-siNFKBIZ-M基因药物组合物体内干眼治疗效果评估结果，其中A为小鼠眼表荧光素钠染色图片；B为在治疗第0天、7天、14天小鼠眼表荧光素钠评分数据分析结果；C为在治疗第0天、7天、14天小鼠酚红棉线泪液测试结果。
具体实施方式
本发明提供了一种抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物，包括抑制NFKBIZ基因表达的核酸分子和靶向眼部组织特异性蛋白的靶向配体分子。
在本发明中，所述核酸分子是以NFKBIZ基因(GenBank登录号：NM 031419.4)为模板，根据siRNA设计原则，设计得到的与NFKBIZ基因正义链或反义链中至少连续15个核苷酸存在互补关系的双链结构核酸分子。在本发明中，所述核酸分子包括以下至少一种核苷酸序列：A.所述核酸分子的正义链选自以下至少一种编号的核苷酸序列：SEQ ID NO：1～SEoID NO：18、SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51～SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93～SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113～SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134～SEQ ID NO：135、SEQID NO：138、SEQ ID NO：143～SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154～SEQ ID NO：161、SEQ IDNO：169～SEQ ID NO：185和SEQ ID NO：421；所述核酸分子的反义链选自以下至少一种编号的核苷酸序列：SEQ ID NO：211～SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：235～SEQ ID NO：259、SEQ IDNO：261～SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：303～SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：323～SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：344～SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：353～SEQ ID NO：362、SEQ ID NO：364～SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：379～SEQ ID NO：395和SEQ ID NO：422；B.在A项的核苷酸序列基础上序列连续或不连续增加、删减或替换2～3个碱基，且具有靶向NFKBIZ基因发挥抑制作用的核苷酸序列。实验证明，本发明保护的核酸分子能够高效靶向NFKBIZ基因序列的双链核酸分子，相比于现有的小分子免疫类药物，具有不易耐药、长效等优势。所述核酸分子的长度优选为15～30bp。本发明共设计得到210对核酸分子，通过qPCR技术验证其对NFKBIZ基因抑制效果，Western-blot技术验证其对NFKBIZ基因编码的IκB-ζ蛋白表达的抑制情况，结果表明，本发明方案保护的核酸分子与同批设计的其他核酸分子相比，具有靶基因沉默效率高的特点。所述核酸分子可以通过本领域已知的标准方法合成，例如通过使用自动化核酸合成仪。在具体的实施方案中，NFKBIZ基因的种属来源优选包括人源和/或鼠源。
在本发明中，所述核酸分子的正义链或反义链末端优选还设置有悬挂单链。所述悬挂单链的长度优选为1～3nt，更优选为2nt。本发明对所述悬挂单链的核苷酸序列没有特殊限制，采用本领域所熟知的悬挂单链的序列即可。在本发明实施例中，所述悬挂单链的序列优选为U或T寡聚形成的序列或者为与NFKBIZ基因模板上核酸分子靶向区域的下游序列互补配对的序列。所述悬挂单链的位置优选在核酸分子的一侧末端，当核酸分子连接有延伸序列时，所述悬挂单链和延伸序列优选分别连接于核酸分子的不同末端。
在本发明中，所述核酸分子包含以下任意一种或几种修饰核苷酸：脱氧-核苷酸、3′端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2′-O-甲基修饰的核苷酸、2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、构象限制的核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2′-氨基修饰的核苷酸、2′-O-烯丙基修饰的核苷酸、2′-C-烷基修饰的核苷酸、2′-羟基修饰的核苷酸、2′-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2′-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1，5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基膦酸酯基的核苷酸、包含5′-磷酸酯的核苷酸和包含5′-磷酸酯模拟物的核苷酸所述修饰有利于提高所述核酸分子的稳定性。
在本发明中，所述药物组合物的结构示意图见图1。所述靶向眼部组织特异性蛋白的靶向配体分子优选包括靶向眼部组织特异性蛋白的核酸适配体、硼酸或其衍生物修饰的化合物或者苯硼酸或其衍生物修饰的化合物。所述眼部组织特异性蛋白优选包括以下至少一种：黏蛋白、整合素和CD44。所述黏蛋白优选包括以下至少一种：MUC-1、MUC-4和MUC-16。眼表黏蛋白是一组高分子量糖蛋白，在眼表广泛存在，分为分泌型和膜相关型黏蛋白两大类，在润滑眼表及维持眼表稳态中发挥重要作用。眼表黏蛋白与眼表多种疾病密切相关，包括干眼、感染、过敏以及免疫相关疾病等。黏蛋白能连接水分成胶，防止泪液蒸发；并能与多种炎性因子相互作用，在维持眼表上皮细胞屏障中发挥重要作用。黏蛋白分为分泌型和膜相关型黏蛋白两大类。MUC1、MUC4和MUC16是人眼部主要的膜相关型黏蛋白，在角膜、结膜以及泪腺中均可检测到。MUC1和MUC16 mRNA在结膜和角膜表达的量相同，但MUC4 mRNA在结膜上皮中表达量最高，角膜上皮的表达量较低。同时角膜上皮细胞已被证明表达整合素，并且是干眼炎症细胞因子的来源；此外，炎症性Th17细胞表达大量的αVβ3整合素，这对于维持Th17炎症表型至关重要，例如干眼中IL-17的产生和IL-17诱导的角膜上皮屏障破坏。此外，CD44蛋白是表达于角膜上皮细胞表面的跨膜蛋白，CD44蛋白参与损伤修复的迁移和粘附过程。因此，本发明基于靶向黏蛋白、整合素以及CD44蛋白提高核酸分子沉默效率，设计了眼表组织细胞靶向型核酸适配体以及抑制NFKBIZ基因的基因药物组合物(Apt-siNFKBIZ)。靶向黏蛋白MUC-1的核酸适配体(AptMUC1)的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：423所示。靶向黏蛋白MUC-16的核酸适配体(AptMUC16)的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：424所示。靶向整合素αvβ3的核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：425所示。靶向CD44蛋白的核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：426所示。
在本发明中，所述核酸适配体优选还包括经稳定性增强修饰的核酸适配体。所述稳定性增强修饰优选包括以下至少一种：硫代磷酸酯骨架修饰、2′-氧甲基修饰、2′-甲氧乙基修饰、2′-氟代修饰、反向胸苷修饰、脱氧胸苷核苷酸和聚乙二醇末端缀合。
在本发明中，所述硼酸或其衍生物修饰的化合物或者苯硼酸或其衍生物修饰的化合物为末端修饰硼酸或苯硼酸的线性或分枝状化合物。所述线性或分枝状化合物上修饰的硼酸或其衍生物或者苯硼酸或其衍生物的修饰数量为1～40个，更优选为2～20个，进一步优选为3～10个。所述硼酸或其衍生物修饰的化合物或苯硼酸或其衍生物修饰的化合物的结构式如式1～式10中任意一项所示：
式1～式10中，A、G各自独立地为不存在、-(CH2)h-或-(CH2)h-中的任意一个或多个亚甲基被M基团所取代后的基团；所述h为0～15；所述M基团包括：-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-CH(TC)-、-C(T’)(T”)-、-NH-、-N(TN)-、-S-S-、-C(T’)＝C(T")-、-C≡C-、和中的一种或几种；
所述M基团中的TC、TN、T’、T”表示指定原子上的任何一个或多个氢原子被L所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物，所述指定原子包括碳原子或氮原子；所述L基团包括以下任意一种：C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氰基、羟基、氧代基、羧基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基或卤素；所述卤素包括F、Cl、Br或I；所述A中(O)代表羰基氧原子；
D、E、H各自独立地为不存在、-O-、-S-、-C(O)-、-NH-、-CH2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-和
中的一种或几种；所述D、E、H基团中(O)代表羰基氧原子；所述表示所在结构式的连接位置；所述A、G、D、H不同时不存在；K表示硼酸或其衍生物或者苯硼酸及其衍生物；m、n、t独立地为1～15。
在本发明中，苯硼酸及其衍生物或者硼酸及其衍生物能够与1，2-二羟基化合物或1，3-二羟基化合物发生可逆性共价结合，可以有效地识别唾液酸、糖类等物质。细胞膜表面存在大量糖类及糖蛋白等化合物，苯硼酸能与糖类等多羟基化合物形成环状硼酸酯，从而在糖类及细胞识别上有广泛的应用。眼表上皮细胞中有大量高度糖基化的糖蛋白构成的糖萼屏障，其主要组分为跨膜黏蛋白MUC1、MUC4、MUC16和半乳糖凝集素-3，在眼表起到润滑、湿润、屏障作用。因此，在本发明中，构建了基于苯硼酸与蛋白糖基之间动态共价键或非共价作用，通过siNFKBIZ正义链的末端接枝，设计制备了药物组合物，具有较好的眼表滞留特性，利用苯硼酸与眼表细胞表面表达的MUC蛋白之间的特异性相互作用可有效促进细胞摄取，更高效的发挥生物学效果。
在本发明中，所述靶向配体分子优选直接共价偶联于核酸分子的末端。
当靶向配体分子为核酸适配体时，所述核酸适配体的磷酸基团优选与核酸分子的核糖进行共价偶联。当靶向配体分子为硼酸或其衍生物修饰的化合物或者苯硼酸或其衍生物修饰的化合物时，所述靶向配体分子优选与核酸分子骨架末端的磷酸基或碱基共价偶联。所述靶向配体分子优选与核酸分子末端的磷酸基共价偶联时，所述药物组合物的结构式优选见式11～式20中的至少一种；
在式11～式20中，所述X基团表示-O-或-S-。
在本发明中，当所述靶向配体分子优选与核酸分子末端的碱基共价偶联时，所述药物组合物的结构式优选见式21～式30中至少一种：
在式21～式30中，Q表示碱基，R表示-H或-OH；
在式11～式30中，表示核酸分子。
在本发明中，所述靶向配体分子优选通过连接在所述核酸分子的末端的延伸序列与核酸分子进行共价偶联。所述延伸序列优选包括仅一端与核酸分子的末端连接的延伸序列和/或一端与核酸分子的一条链的3′端连接同时另一端与核酸分子的互补链的5′端连接或不连接形成茎环结构的延伸序列。所述延伸序列的长度优选为1～40nt；所述延伸序列优选为随机核苷酸序列，例如寡聚核苷酸序列，TTTTTT等。
在本发明中，当靶向配体分子优选为核酸适配体时，所述核酸适配体的磷酸基团优选与延伸序列的核糖进行共价偶联。图2为核酸适配体通过延伸序列与核酸分子共价偶联形成的药物组合物示意图，所述延伸序列的长度优选为1～40nt，可用于偶联核酸适配体和硼酸或苯硼酸或其衍生物。靶向配体分子还可以通过具有茎环结构的延伸序列与核酸分子偶联形成的药物组合物，所述延伸序列的长度优选为10～40nt，其中延伸序列的5′端与核酸分子的一条链连接，延伸序列的3′端与核酸分子的互补链的末端连接或不连接方式形成茎环结构，主要用于偶联硼酸或苯硼酸或其衍生物。图3展示了在核酸分子的正义链的3′端形成16个碱基的茎环结构，并在茎环结构的环部位使用3个硫代磷酸酯骨架修饰(phosphorothioate，PS)修饰(3PS-siNFKBIZ-S)，使其能够与修饰在溴代-二苯硼酸(2PBA-Br)上的溴代基团偶联。
在本发明中，核酸适配体与核酸分子偶联得到的药物组合物的制备方法，优选核酸适配体直接或通过延伸序列与核酸分子的一条链连接，通过碱基互补配对与核酸分子的互补链组装，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行验证，得到基因药物组合物。本发明对所述连接的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的连接方法即可，例如核酸固相合成。
在本发明的一个实施例中，分别设计了具有MUC1、MUC16、整合素αVβ3、CD44蛋白靶向性的核酸适配体，并制备了通过延伸序列连接至抑制NFKBIZ基因的核酸分子形成的药物组合物(AptMUC1-siNFKBIZ、AptMUC16-siNFKBIZ、Aptαvβ3-siNFKBIZ和AptCD44-siNFKBIZ)，所述药物组合物用于干眼的高效靶向治疗。黏蛋白是一组高分子量糖蛋白，在眼表广泛存在，分为分泌型和膜相关型黏蛋白两大类，在润滑眼部及维持眼部稳态中发挥重要作用。眼部黏蛋白与眼部多种疾病密切相关，包括干眼、感染、过敏以及免疫相关疾病等。黏蛋白能连接水分成胶，防止泪液蒸发；并能与多种炎性因子相互作用，在维持眼部上皮细胞屏障中发挥重要作用。角膜上皮细胞已被证明表达整合素，并且是干眼炎症细胞因子的来源；此外，炎症性Th17细胞表达大量的αVβ3整合素，这对于维持Th17炎症表型至关重要，例如干眼中IL-17的产生和IL-17诱导的角膜上皮屏障破坏。CD44是表达于角膜上皮细胞表面的跨膜蛋白，参与损伤修复的迁移和粘附过程。因此，本发明利用基于靶向MUC1、MUC16、整合素αVβ3、CD44的核酸适配体，构建了具有靶向功能的siNFKBIZ基因药物的组合物(AptMUC1-siNFKBIZ、AptMUC16-siNFKBIZ、Aptαvβ3-siNFKBIZ和AptCD44-siNFKBIZ)，Apt-siNFKBIZ通过亲水性的核酸适配体克服了眼表各种屏障，经眼表递送穿透眼表最大的静态屏障角膜，通过受体介导使dsRNA入胞，穿过泪膜的水层到达眼部，被角膜上皮细胞高效摄取、在眼表上皮组织的有效吸附和内吞，实现功能核酸分子siNFKBIZ的高效递送。药物活性成分核酸分子进入细胞后能够更好的发挥免疫调节与抗炎的作用，抑制促炎症细胞因子的生成与释放，减少炎症因子(白介素-1、白介素-17、肿瘤坏死因子α)和基质金属蛋白酶的释放，降低T细胞活性控制免疫炎症反应，调控免疫平衡，有效改善长期炎症所致的干眼症状与体征，进一步抑制干眼的炎症反应，促进干眼患者恢复自身泪液分泌，阻断干眼炎症的恶性循环，并抑制泪腺和杯状细胞凋亡，实现干眼的有效治疗。
在本发明中，当靶向配体分子优选为硼酸或其衍生物修饰的化合物或苯硼酸或其衍生物修饰的化合物时，所述靶向配体分子与延伸序列上的一个或两个以上的磷酸基或碱基共价偶联。当与磷酸基偶联时，硼酸或其衍生物修饰的化合物或苯硼酸或其衍生物修饰的化合物通过X基团与磷酸基偶联。所述X基团表示-O-或-S-。所述硼酸或其衍生物修饰的化合物或苯硼酸或其衍生物修饰的化合物为一价硼酸或一价苯硼酸(式1)时，靶向配体分子与延伸序列上的磷酸基或碱基偶联时，结构式见式31～式36。
在式31～式36中，表示核酸分子。
在本发明中，当靶向配体分子为硼酸或其衍生物修饰的化合物或者苯硼酸或其衍生物修饰的化合物时，所述药物组合物的制备方法优选为将硼酸或其衍生物修饰的化合物或者苯硼酸或其衍生物修饰的化合物通过化学反应偶联于核酸分子或延伸序列中的一条链的磷酸基或碱基上得到的偶联物；将所述偶联物与核酸分子的互补链进行退火杂交，得到基因药物组合物。
在本发明中，所述核酸分子或延伸序列中的一条链的磷酸基或碱基优选进行基团修饰后，通过化学反应与硼酸或苯硼酸或其衍生物修饰的化合物进行共价偶联，得到偶联物。所述修饰用基团包括氨基(3′-NH2，式59)、巯基(3′SH，式60)、醛基(5′-CHO，式61)、二苯并环辛炔(3′-DBCO，式62)等。
在本发明中，所述退火杂交的条件优选为所述偶联物和核酸分子的互补链的摩尔比优选为1∶1。所述杂交退火的温度优选为将反应体系于PCR仪器中，加热至65℃，恒温10min后，以每分钟降温4℃的速度进行退火，降至25℃。
在本发明的一个实施例中，构建了由单个苯硼酸(Phenylboronic acid，PBA)分子与靶向核因子κB抑制因子ζ的(NFKBIZ)基因的核酸分子(siNFKBIZ)共价偶联形成的药物组合物PBA-siNFKBIZ，具体制备方法，优选包括以下步骤：
将4-羧基苯基硼酸和3′端修饰有氨基的核酸分子单链通过酰胺化学反应进行偶联，得到偶联物；
将所述偶联物和核酸分子的互补链进行杂交退火，得到药物组合物PBA-siNFKBIZ。
在本发明中，3′端修饰有氨基的核酸分子单链委托基因合成公司完成即可。所述酰胺化反应缩合剂优选为二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)。优选为EDCI。所述酰胺化反应的活化试剂优选为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。所述酰胺化学反应的温度优选为20～55℃，更优选为25℃。所述酰胺化学反应的时间优选为12～48h，更优选为24h。所述酰胺化学反应优选伴随震荡，震荡的转速优选为200～4000rpm，更优选为1000rpm。所述酰胺化学反应结束后，优选去除过量的4-羧基苯基硼酸和水分。所述4-羧基苯基硼酸的去除方法优选为乙酸乙酯萃取去除。去除水分的方法优选采用浓缩蒸馏的方法完成。所述偶联物的结构式如式55所示。
其中，表示连接的核酸分子，Base表示任意类型的碱基。
在本发明中，所述偶联物和核酸分子的互补链的摩尔比优选为1∶1。所述互补条件优为将反应体系于PCR仪器中，加热至65℃，恒温10min后，以每分钟降温4℃的速度进行退火，降至25℃。
在本发明中，所述PBA-siNFKBIZ能够用于眼部疾病的治疗。本发明通过构建PBA-siNFKBIZ共价偶联物可实现靶向递送用于抑制NFKBIZ基因的核酸药物实现干眼的靶向治疗。本发明构建了基于苯硼酸与蛋白糖基之间动态共价键作用，通过siNFKBIZ正义链的末端接枝，设计制备了siNFKBIZ药物组合物(PBA-siNFKBIZ)，具有较好的眼表滞留特性，利用苯硼酸与眼部细胞表面过表达的MUC糖蛋白上的糖链之间的特异性相互作用可有效促进细胞摄取，更高效的发挥生物学效果。此外，靶向NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ)则能够有效敲低角膜上皮细胞内NFKBIZ基因的表达，从而实现降低IκB-ζ蛋白的表达，降低细胞炎症水平，调控免疫平衡。PBA-siNFKBIZ共价偶联物由于PBA的存在能够增强其与眼表组织细胞的相互作用，相比于未修饰寡核苷酸，PBA-siNFKBIZ偶联物能够更好地被细胞内吞，从而更好地发挥基因调控作用，达到良好的干眼治疗效果。
在本发明的一个实施例中，本发明通过siNFKBIZ正义链末端接枝，构建了由两个PBA分子与siNFKBIZ共价偶联形成的抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物(2PBA-siNFKBIZ)，具体制备方法优选包括以下步骤：
将结构式37的化合物和结构式38的化合物4-羧基苯硼酸频哪醇酯溶解，加入EDCI和DMAP(4-二甲氨基吡啶)，在氮气保护下，进行反应，得到结构式39的化合物；
将所述结构式39的化合物、高碘酸钠和乙酸铵在氮气保护下反应，得到结构式40的化合物；
将所述结构式40的化合物和4-马来酰亚胺丁酸共同溶解于甲醇中，并加入：4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)和N-甲基吗啡啉(NMM)反应，得到结构式41的化合物；
将所述结构式41的化合物和3′端修饰有巯基的核酸分子一条链进行震荡反应，得到2PBA-siNFKBIZ-S偶联物；
将所述2PBA-siNFKBIZ-S偶联物和核酸分子的互补链进行退火杂交，得到药物组合物2PBA-siNFKBIZ。
其中，
在本发明中，结构式如式37的化合物的浓度优选为75.00mg/mL。所述4-羧基苯硼酸频哪醇酯的浓度优选为29.00mg/mL。所述EDCI的浓度优选为22.50mg/mL。所述DMAP的浓度优选为0.75mg/mL。所述反应的温度优选为20～50℃，更优选为25℃。所述反应的时间优选为4～48h，更优选为24h。反应结束后，优选进行减压蒸馏去除溶剂和分离纯化。所述分离纯化的方法优选为析晶。
在本发明中，所述结构式如式39化合物的工作浓度优选为21.40mg/mL。所述高碘酸钠的工作浓度优选为28.25mg/mL。所述乙酸铵的工作浓度优选为10.30mg/mL。所述反应的温度优选为15～50℃，更优选为25℃。所述反应的时间优选为2～24h，更优选为10h。反应结束后，减压蒸馏去除有机溶剂，洗涤后，去除水分，得到结构式如式40的化合物。
在本发明中，所述结构式如式40的化合物的工作浓度优选为14.10mg/mL。所述4-马来酰亚胺丁酸的工作浓度优选为12.20mg/mL。所述DMTMM的工作浓度优选为19.20mg/mL。所述NMM的工作浓度优选为68mg/mL。所述反应的温度优选为15～50℃，更优选为25℃。所述反应的时间优选为1～10h，更优选为2h。反应结束后，减压蒸馏去除有机溶剂，洗涤后，去除水分，得到结构式如式41的化合物。
在本发明中，3′端修饰有巯基的核酸分子单链委托基因合成公司。所述点击化学反应的温度优选为20～55℃，更优选为40℃。所述点击化学反应的时间优选为12～48h，更优选为24h。所述点击化学反应优选伴随震荡，震荡的转速优选为200-4000rpm，更优选为1800rpm。所述点击化学反应结束后，优选去除过量的结构式41的化合物和水分。所述结构式41的化合物的去除方法优选为乙酸乙酯萃取去除。采用浓缩蒸馏的方法去除水分。所述偶联物的结构式如式56所示。
其中，表示连接的核酸分子，Base表示任意类型的碱基。
在本发明中，所述偶联物和核酸分子的互补链的摩尔比优选为1∶1。所述杂交退火条件优选为将反应体系于PCR仪器中，加热至65℃，恒温10min后，以每分钟降温4℃的速度进行退火，降至25℃。
在本发明中，所述2PBA-siNFKBIZ利用PBA的靶向识别作用，2PBA的靶头进一步提高与细胞膜表面膜蛋白的结合能力，实现siNFKBIZ的高效递送，实现2PBA-siNFKBIZ的干眼治疗。本发明采用小分子靶标2PBA与小干扰RNA药物结合用于治疗干眼，一方面，PBA由于其与黏蛋白的结合作用，能够提高核酸药物在眼表的滞留；另一方面，PBA由于其能够与MUC蛋白的识别作用，将siNFKBIZ基因药物解决细胞膜屏障实现细胞高效递送；其次，本发明利用IκB-ζ在免疫调节中的关键作用，设计了siRNA药物，结合PBA的高效递送，能够有效的抑制NFKBIZ的基因表达；再者，相比单个PBA分子与靶向NFKBIZ基因的siRNA偶联制备的PBA-siNFKBIZ共价偶联物，两个PBA分子偶联后形成的2PBA-siNFKBIZ共价偶联物能够更好的与黏蛋白结合，实现siNFKBIZ基因药物的高效共递送，进而达到良好的干眼治疗效果。
在本发明的一个实施例中，本发明通过siNFKBIZ正义链末端接枝，构建了由PBA四聚体分子与siNFKBIZ共价偶联形成的抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物(4PBA-siNFKBIZ)，具体制备方法如下：
将结构式如式42的化合物和4-羧基苯硼酸频哪醇酯溶解，加入DMTMM和NMM，在氮气保护下进行反应，得到结构式如式43的化合物；
将所述结构式如式43的化合物、DIEA、乙酸酐和DMAP混合，在氮气保护下反应，分离结构式如式44的化合物；
将结构式如式44所示的化合物和结构式如式37的化合物溶解，加入EDCI和DMAP，在氮气保护下进行反应，得到结构式如式45所示的化合物；
所述结构式如式45所示的化合物丙酮溶液和含高碘酸钠、乙酸铵的水溶液混合，在氮气保护下反应，得到结构式如式46的化合物；
所述结构式如式46所示的化合物的乙酸乙酯溶液，加入氯化氢-乙酸乙酯，氮气保护下进行，得到结构式如47的化合物。
将如式47的化合物和5′端修饰有醛基的核酸分子单链进行点击化学反应，得到4PBA-siNFKBIZ-S偶联物；
将所述4PBA-siNFKBIZ-S偶联物和核酸分子互补链进行退火杂交，得到药物组合物4PBA-siNFKBIZ；
其中，
在本发明中，如式42的化合物的工作浓度优选为2.50mg/mL。所述4-羧基苯硼酸频哪醇酯的工作浓度优选为20.65mg/mL。所述DMTMM的工作浓度优选为23.03mg/mL。所述NMM的工作浓度优选为8.43mg/mL。所述反应的温度优选为15～45℃，更优选为25℃。所述反应的时间优选为12～48h，更优选为20h。
在本发明中，所述结构式如式43所示的化合物的工作浓度优选为17.07mg/mL。所述丁二酸酐的工作浓度优选为6.30mg/mL。所述DMAP的工作浓度优选为0.33mg/mL。所述反应条件优选同上，不做赘述。
在本发明中，5′端修饰有醛基的核酸分子单链委托基因合成公司。将5′-CHO-siNFKBIZ-S与结构式47的化合物，进行亲电取代反应，形成席夫碱，还原得到4PBA-siNFKBIZ-S偶联物。所述亲电取代反应的温度优选为20～55℃，更优选为40℃。所述亲电取代反应的时间优选为12～48h，更优选为24h。所述亲电取代反应优选伴随震荡，震荡的转速优选为200～4000rpm，更优选为1800rpm。所述点亲电取代反应结束后，优选去除过量的结构式43化合物和水分。所述结构式47的化合物的去除方法优选为乙酸乙酯萃取去除。采用浓缩蒸馏的方法去除水分。所述偶联物的结构式如式57所示：
其中，表示连接的核酸分子，Base表示任意类型的碱基。
在本发明中，药物组合物(4PBA-siNFKBIZ)基于PBA的靶向性实现siNFKBIZ基因药物在干眼靶向治疗中的应用。利用四个苯硼酸分子与1，2-和1，3-二醇糖类反应形成硼酸酯，具有较强的眼部粘附性，能够高效地被细胞摄取，有效地提高了核酸药物在眼表的生物利用度；在本发明中，4PBA做靶头能够有效的靶向和识别眼表组织相关细胞，而siNFKBIZ入胞后可以有效地敲低炎症相关基因NFKBIZ的表达，进一步调控IκB-ζ的蛋白表达，抑制干眼的炎症反应及遏制炎症的恶性循环，实现更好的干眼治疗效果。
在本发明的一个实施例中，本发明首先合成了3-羟基叠氮化合物，并通过酯化反应与2PBA聚合物反应，从而得到6PBA叠氮化修饰的化合物(6PBA-N3)；接下来，通过点击化学反应在siNFKBIZ正义链末端成功接枝，并与siNFKBIZ的反义链退火互补得到PBA六聚体分子与抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物(6PBA-siNFKBIZ)。所述药物组合物(6PBA-siNFKBIZ)的制备方法，优选包括以下步骤：
将结构式如式48所示的化合物和叠氮己酸溶解，加入DMTMM和NMM，在氮气保护下反应，得到结构式如式49所示的化合物；
将所述结构式如式49所示的化合物和结构式如式44所示的化合物溶解，加入EDCI和DMAP，在氮气保护下进行反应，得到结构式如式50所示的化合物；
将结构式如式50所示的化合物丙酮融合和高碘酸钠和碳酸铵水溶液混合，在氮气保护下反应，得到结构式如式51所示的化合物；
将结构式如式51所示的化合物和3′端修饰有二苯并环辛炔核酸分子一条链进行震荡反应，得到6PBA-siNFKBIZ-S偶联物；
将所述6PBA-siNFKBIZ-S偶联物和核酸分子的互补链进行退火杂交，得到药物组合物6PBA-siNFKBIZ；
其中，
在本发明中，所述的如式48所示的化合物的工作浓度优选为10.00mg/mL。所述的叠氮己酸的工作浓度优选为23.35mg/mL。所述的DMTMM的工作浓度优选为34.40mg/mL。所述的NMM的工作浓度优选为12.40mg/mL。所述反应的条件同上，在此不做赘述。所述反应结束，优选去除溶剂和分离纯化。所述去除溶剂的方法优选减压蒸馏。所述分离纯化的方法优选为硅胶柱层析分离纯化。所述分离纯化时，洗脱液优选为乙酸乙酯甲醇溶液。所述乙酸乙酯甲醇溶液中乙酸乙酯和甲醇的体积比优选为30∶1。
在本发明中，如式49所示的化合物的工作浓度优选为3.56mg/mL。所述结构式如式44的化合物的工作浓度优选为35.60mg/mL。所述EDCI的工作浓度优选为8.49mg/mL。所述DMAP的工作浓度优选为1.00mg/mL。所述反应的条件同上，在此不做赘述。
在本发明中，结构式如式51所示的化合物至药物组合物6PBA-siNFKBIZ为点击化学反应。3′端修饰有二苯并环辛炔的核酸分子单链委托基因合成公司。所述点击化学反应的温度优选为25～60℃，更优选为50℃。所述点击化学反应的时间优选为12～48h，更优选为24h。所述点击化学反应优选伴随震荡，震荡的转速优选为200～4000rpm，更优选为1800rpm。所述点击化学反应结束后，优选去除过量的式51所示的化合物和水分。所述的去除方法优选为乙酸乙酯萃取去除。采用浓缩蒸馏的方法去除水分。所述偶联物的结构式如式58所示。
其中，表示连接的核酸分子，Base表示任意类型的碱基。
在本发明中，药物组合物6PBA-siNFKBIZ中具有更多PBA分子，从而能够更大概率增加与细胞膜表面糖基的反应，增强与细胞的粘附作用，并通过受体介导的内吞作用入胞，显著提高了细胞对于siNFKBIZ的摄取效率。进一步在细胞内发挥NFKBIZ基因的沉默作用，下调NFKBIZ基因的表达，实现IκB-ζ下调，抑制细胞的炎症，从而发挥干眼的治疗作用。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了由10个苯硼酸分子通过硫代磷酸酯接枝修饰于靶向NFKBIZ基因的核酸分子正义链3′端延长序列的DNA链(12个T核苷酸聚合得到)上，制备了用于抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物(PBA10-siNFKBIZ)，制备方法优选包括以下步骤：
将人工合成带有延伸序列的核酸分子正义链；所述延伸序列的磷酸骨架上修饰有10个硫代磷酸酯骨架修饰(10PS-siNFKBIZ-S)；
将所述10PS-siNFKBIZ与4-溴甲基-苯硼酸溶液进行反应，得到PBA10-siNFKBIZ-S偶联物；
将所述PBA10-siNFKBIZ-S偶联物和核酸分子的互补链进行退火杂交，得到药物组合物PBA10-siNFKBIZ。
在本发明中，4-溴甲基-苯硼酸的工作浓度优选为60mM。所述10PS-siNFKBIZ的工作浓度优选为200μM。所述10PS-siNFKBIZ和4-溴甲基-苯硼酸溶液的体积比为1∶1。所述药物组合物(PBA10-siNFKBIZ)基于PBA的靶向识别作用，探索其在干眼治疗的效果。本实施例中在siNFKBIZ药物正义链3′端延长12个T碱基，并在末端10个碱基之间使用硫代磷酸酯修饰，并使用核酸合成仪合成。PBA通过硫代磷酸酯接枝后，与siNFKBIZ的反义链退火互补得到PBA10-siNFKBIZ。该组合物中具有10个PBA分子，可以更好的与眼表MUC蛋白结合，提高了与眼表蛋白的相互作用效率，进一步增加眼表的滞留，提高siNFKBIZ的细胞内递送，改善siNFKBIZ的生物学效果，实现干眼的有效治疗。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了一个具有茎环结构的siNFKBIZ药物组合物，并在茎环结构处进行3处硫代磷酸酯修饰，并将2PBA的支化物接枝于茎环结构上，制备了6个苯硼酸分子的siNFKBIZ的药物组合物(PBA6-siNFKBIZ)，制备方法优选包括以下步骤：
将结构式如式44所示的化合物和结构式如式52所示的化合物在EDCI和DMAP缩合下进行酯化反应，得到结构式如式53所示的化合物：
所述结构式如式53所示的化合物丙酮溶液和含高碘酸钠、碳酸铵水溶液混合，在氮气保护下反应，得到结构式如式54所示的化合物(2PBA-Br)；
将结构式如式54所示的化合物溶液和茎环结构部分存在3处硫代磷酸酯修饰的核酸分子一条链进行反应，得到PBA6-siNFKBIZ-S偶联物；
将所述PBA6-siNFKBIZ-S偶联物和核酸分子互补链退火杂交，得到药物组合物PBA6-siNFKBIZ；
其中，
在本发明中，药物组合物PBA6-siNFKBIZ在人源角膜上皮细胞的靶向摄取效果及对NFKBIZ基因调控和对IκB-ζ蛋白调控的能力。结果显示，PBA6-siNFKBIZ能够显著促进siNFKBIZ基因药物的细胞摄取，并能够抑制NFKBIZ基因的表达。进一步通过动物干眼模型验证了PBA6-siNFKBIZ药物组合物在眼表具有较好的粘附作用，并能够较好的提高siNFKBIZ基因药物眼表的生物利用度，有效地抑制了NFKBIZ基因的表达，遏制了炎症在眼表的恶性循环，达到干眼治疗的目的。
本发明提供了所述核酸分子或所述药物组合物在制备预防和/或治疗眼部疾病的药物中的应用。
在本发明中，所述眼部疾病优选包括以下一种或几种：干眼、角膜炎、结膜炎和睑缘炎。
下面结合实施例对本发明提供的一种抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
用于抑制NFKBIZ基因表达的双链核糖核酸筛选
1、以NFKBIZ基因(GenBan登录号：NM_031419.4)为靶基因，通过常规siRNA设计，共设计出210对双链核糖核酸(见表1)，为了初步筛选并验证siRNA的有效性，我们选用商业化Lipofectamine 2000进行转染人源角膜上皮细胞，通过qPCR以及Western-blot实验验证NFKBIZ基因以及IκB-ζ蛋白的表达。
表1靶向NFKBIZ基因的siRNA序列
2、基于qPCR技术筛选抑制NFKBIZ基因表达的双链核糖核酸
将人源角膜上皮细胞(HCEC)以3.5×104个细胞/孔的密度接种在6孔板中，培养过夜后进行转染。按照制造商的方法，使用OptiMEM培养基将Lipofectamine 2000(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，德国)与siRNA进行孵育，然后加入6孔板中，并设置Lipofectamine 2000空白对照组。转染后6h，将Opti-MEM培养基更换为完全培养基。更换培养基后48h，后，使用碧云天RNA提取试剂盒，并用TAKARA逆转录试剂盒(Code No.RR036A)进行RNA反转录，按下列组分配制反转录反应液(反应液配制在冰上进行)。
表2反转录体系
具体反应流程如下：首先37℃进行15min(反转录反应)，接下来，85℃进行5s(反转录酶的失活反应)，降温至4℃，最后取出样品保存在-20℃。根据TAKARA的实时定量PCR试剂盒(Code No.RR820A)进行qPCR反应，以GAPDH作为内参基因，GAPDH正向引物：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG(SEQ ID NO：427)；GAPDH反向引物：AGGGGCCATCCACAGTCTTC(SEQ IDNO：428)。
NKFBIZ正向引物：ACACCCACAAACCAACTCTGG(SEQ ID NO：429)；
NFKBIZ反向引物：GGCAAAACTGTGATTCTGGACC(SEQ ID NO：430)。按下列组份配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行)。
表3 qPCR反应体系
具体反应流程如下：第一阶段：预变性；循环数：1；95℃30s；第二阶段：PCR反应，循环数：40；95℃3s；60℃30s；溶解曲线阶段。
结果如图4所示，其中Mock组为未添加siRNA处理细胞正常NFKBIZ mRNA表达水平，以此为归一化基准，选取与Mock组相比能够显著性地抑制NFKBIZ基因表达的siRNA序列(mRNA表达水平低于或等于图4中虚线的序列)作为优选序列；通过显著性差异定量分析，ID1-18、ID25-49、ID51-89、ID93-108、ID113-132、ID134-135、ID143-152、ID169-185能够显著性地抑制NFKBIZ基因mRNA的表达。
3、基于Western-blot技术验证抑制NFKBIZ基因表达的双链核糖核酸生物学效果
为了更好的验证siRNA抑制NFKBIZ基因的效果，挑选了7条siRNA检测了对IκB-ζ蛋白的表达情况。将人源角膜上皮细胞(HCEC)以3.5×104个细胞/孔的密度接种在6孔板中，培养过夜后进行转染。按照制造商的方法，使用Opti-MEM培养基将Lipofectamine 2000与siRNA进行孵育，然后加入6孔板中，并设置lipofectamine 2000空白对照组。转染后6h，将OptiMEM培养基更换为完全培养基。更换培养基后48h，提取蛋白进行检测，结果如图5所示。结果表明，筛选的siRNAID1、siRNA ID30、siRNA ID70、siRNA ID101、siRNA ID120以及siRNA ID180均能够从蛋白层面抑制IκB-ζ的表达，和qPCR结果一致，不仅能够从基因层面抑制NFKBIZ基因的表达，而且能够抑制IκB-ζ蛋白的表达，从而发挥抗炎作用。
实施例2
核酸适配体靶向递送siNFKBIZ基因药物组合物用于干眼的治疗
核酸适配体是短的单链DNA或RNA分子，可以选择性地结合到特定的靶标上，包括蛋白质、肽、碳水化合物、小分子、毒素等。与其他靶向配体(如抗体)相比，适配体已被证明具有较低的毒性和免疫原性。此外，由于核酸适配体易于合成、化学修饰和缀合等优点，核酸适配体在小核苷酸的递送领域具有广阔的应用前景。粘蛋白是泪膜质量和泪膜稳定性的关键因素。在眼表面，粘蛋白由结膜杯状细胞和泪腺分泌，其中MUC1、MUC4和MUC16是在眼表部位高表达的主要跨膜粘蛋白。角膜上皮细胞已被证明表达整合素，并且是干眼炎症细胞因子的来源；此外，炎症性Th17细胞表达大量的αVβ3整合素，这对于维持Th17炎症表型至关重要，例如干眼中IL-17的产生和IL-17诱导的角膜上皮屏障破坏。为了实现siRNA的高效递送，本实施例基于靶向MUC1、MUC16、整合素αVβ3以及CD44蛋白的核酸适配体开发了递送siNFKBIZ基因药物组合物，用于眼表疾病干眼的治疗。
1、核酸适配体靶向递送siNFKBIZ基因药物组合物的组装
首先，本实施例中选取两条针对MUC蛋白靶向的核酸适配体，分别是针对MUC1蛋白靶向的核酸适配体(AptMUC1核酸适配体)和MUC16蛋白靶向的核酸适配体(AptMUC16)，以及整合素αVβ3靶向的核酸适配体(Aptαvβ3核酸适配体)和CD44蛋白靶向的核酸适配体(AptCD44核酸适配体)，由核酸适配体通过脱氧核糖核酸连接子TTTTT与抑制NFKBIZ基因的siRNA正义链(siNFKBIZ sense，SEQ ID NO：1)连接，并通过碱基互补配对与抑制NFKBIZ基因的siRNA反义链(siNFKBIZ antisense，SEQ ID NO：211)组装，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶进行验证，结果如图6所示，可以看出Apt-siNFKBIZ sense与siNFKBIZ antisense成功互补。
本实施例中使用的siNFKBIZ基因药物序列如下：
其中靶向人源NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ)序列为
Sense：5′-GAGCCGGUGGCGCAGGUGU-3′(SEQ ID NO：1)；
Antisense：5′-ACACCUGCGCCACCGGCUCgc-3′(SEQ ID NO：431)。
其中靶向小鼠NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ-M)序列为
Sense：5′-GCGUCAAUGUACCAGUAUU-3′(SEQ ID NO：421)：
Antisense：5′-AAUACUGGUACAUUGACGCCU-3′(SEQ ID NO：422)。
核酸适配体的序列如下：
MUC1核酸适配体：GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG(SEQ ID NO：423)；
MUC16核酸适配体：CTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA(SEQ ID NO：424)；
αVβ3核酸适配体：GGGAGACAAGAATAAACGCTCAATTCAACGCT
GTGAAGGGCTTATACGAGCGGATTACCCTTCGACAGGAGGCTCACAAAAGGC(SEQ ID NO：425)；
CD44核酸适配体：ACCGGGCGTACACCGTCGCGGCACATGTCTGA(SEQ ID NO：426)。
2、具有适配体靶向功能的siNFKBIZ基因药物组合物的细胞摄取效率验证
为了验证AptMUC1-siNFKBIZ基因药物组合物在细胞层面的摄取效率，使用激光共聚焦显微镜进行验证。具体方法如下：将人源角膜上皮细胞(HCEC)以2×104个细胞/孔的密度接种在共聚焦小皿中，培养过夜后进行给药。使用Opti-MEM培养基分别配置标记Cy3的AptMUC1-siNFKBIZ(AptMUC1-siNFKBIZ-Cy3)基因药物组合物及标记Cy3的siNFKBIZ(siNFKBIZ-Cy3)，其中Cy3等效浓度为0.5μM，并与HCEC细胞孵育。6h后，使用PBS进行清洗，并用4％多聚甲醛进行固定；接下来，使用DAPI进行染色，最后使用激光共聚焦显微镜进行观察。结果如图7中A所示，结果显示AptMUC1-siNFKBIZ药物组合物孵育组细胞荧光亮度明显高于游离siNFKBIZ组，表明靶向MUC1的适配体能够显著提高siNFKBIZ的入胞效率，发挥基因沉默作用。
接下来，使用流式细胞仪对AptMUC16、Aptαvβ3、AptCD44与siNFKBIZ药物组合物在细胞层面的靶向摄取效率进行了验证。具体方法如下：将HCEC细胞以每孔3.0×105个接种于12孔板中，DMEM培养过夜。将Cy3标记的siNFKBIZ(siNFKBIZ-Cy3)与AptMUC16、Aptαvβ3、AptCD44相关适配体药物组合物加入等Cy3浓度(0.5μM)的孔中，在Opti-MEM中37℃孵育6h，最后使用胰蛋白酶收集细胞用于流式细胞仪分析(BD FACSCalibur，美国)。结果如图7中B所示，AptMUC16、Aptαvβ3、AptCD44均能够显著提高siRNA的细胞摄取效率，从而能够高效的递送siRNA入胞，发挥基因沉默作用。
3、具有适配体靶向功能的siNFKBIZ基因药物组合物的生物学验证
为了验证适配体靶向递送siNFKBIZ的生物学效应，通过qPCR和Western-blot实验验证NFKBIZ基因以及IκB-ζ蛋白的表达。将HCEC细胞按照1×105细胞/孔的密度接种于6孔板中贴壁过夜后用100ng/mL LPS刺激12h，去掉上清液后，分别加入含有siNFKBIZ以及AptMUC-1-siNFKBIZ、AptMUC16-siNFKBIZ、Aptαvβ3-siNFKBIZ、AptCD44-siNFKBIZ药物组合物Opti-MEM培养基1mL(siNFKBIZ等效浓度为500nM)，在37℃共孵育6h后更换为DMEM培养基，继续孵育48h后收集细胞并提取RNA进行qPCR实验以评估HCEC细胞中NFKBIZ mRNA的表达以及提取蛋白进行Western-blot实验。qPCR实验结果如图8所示，LPS刺激HCEC细胞的NFKBIZ基因的表达，上调大概1.4倍；单纯的siNFKBIZ基因药物对于NFKBIZ基因可以将NFKBIZ基因下调至1.2左右，AptMUC1-siNFKBIZ、AptMUC16-siNFKBIZ、Aptαvβ3-siNFKBIZ、AptCD44-siNFKBIZ药物均能够显著抑制了NFKBIZ的表达，实现40％～50％的基因抑制效果。Western-blot结果如图9所示，从结果可以看出AptMUC-1-siNFKBIZ、AptMUC16-siNFKBIZ、Aptαvβ3-siNFKBIZ、AptCD44-siNFKBIZ药物组合物对于IκB-ζ蛋白的表达相比于刺激组均具有较好的抑制效果。综上，基于适配体的siNFKBIZ基因药物组合物能够高效递送siNFKBIZ核酸药物，实现了NFKBIZ基因的下调，并进一步抑制了IκB-ζ蛋白的表达，抑制了炎症反应。
4、Apt-siNFKBIZ-M基因药物组合物的眼表滞留效果评估
通过动物实验验证了抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物在眼表的滞留效果。本实施例所有动物实验均符合视觉和眼科研究协会声明。所有动物实验均按照上海交通大学伦理委员会制定的指南进行。选取6～8周龄无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠30只(60只眼)，饲养于有充足鼠粮和水的环境控制室内。将小鼠随机分为6组，每天滴2次苯扎氯铵，建立小鼠干眼模型。C57BL/6小鼠腹腔麻醉后，右眼分别滴注5μL：AptMUC1-siNFKBIZ-Cy5.5、AptMUC16-siNFKBIZ-Cy5.5、Aptαvβ3-siNFKBIZ-Cy5.5、AptCD44-siNFKBIZ-Cy5.5基因药物组合物、游离siRNA-Cy5.5滴眼液。30min后，麻醉小鼠并取下角膜进行冰冻切片成像。结果如图10，相比于siNFKBIZ-Cy5.5给药组，本发明所提供的Apt-siNFKBIZ基因表达的组合物眼表的荧光更强，表明在体内具有更好的眼表滞留和黏附能力，减少药物的损失并提高生物利用度，表明Apt-siNFKBIZ基因药物组合物确实是一种有前景的局部应用药物。
5、Apt-siNFKBIZ基因药物组合物干眼的治疗效果
本实施例所有动物实验均按照视觉与眼科研究协会(ARVO)《眼科和视觉研究中使用动物声明》的指南进行操作，符合相关操作规范。所有动物实验均按照上海交通大学伦理委员会制定的指南进行。本实施例从上海斯莱克实验动物有限责任公司选取6～8周龄无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠40只(80只眼)，饲养于有充足鼠粮和水的环境控制室内。将小鼠随机分为8组，暴露于低湿度环境(RH＝18.5％±5.1％，AF＝15L/min，T＝21～23℃)中适应4天。然后每只眼睛滴5μL的0.2％苯扎氯氨，每日两次，连续14天给药，建立小鼠干眼模型。各组小鼠双眼每日2次局部滴注PBS、环孢素CsA滴眼液(兴齐眼药)、siNFKBIZ-M、AptMUC1-siNFKBIZ-M、AptMUC16-siNFKBIZ-M、Aptαvβ3-siNFKBIZ-M、AptCD44-siNFKBIZ-M药物组合物(等效siRNA剂量为0.05mg/kg)，连续给药14天，一天两次(早晚各一次)，并在给药的第0天、7天、14进行泪液分泌检测以及角膜荧光素钠染色评估，具体操作如下：基础泪液分泌检测(Schirmer’s I Test)：在给药的第0天、7天和第14天，使用Zone-Quick酚红棉线进行基础泪液分泌试验，用1.25％阿氟丁(0.2mL/10g)腹腔麻醉小鼠后，将1mm酚红棉端插入小鼠结膜下外侧穹窿30s。苯酚棉的颜色由黄色变为红色表示分泌的泪液，读取并记录浸湿的长度(mm)。角膜荧光素钠染色评分：眼表滴入0.5％荧光素钠(w/v)2μL，随后手动闭合眼睑3～4次，轻轻去除多余的荧光素钠。在裂隙灯下钴蓝光照射下拍摄荧光素染色图像，由同一名经验丰富的眼科医师进行相应评分。将角膜分为5个象限，每个象限0～3级：0级，缺如：1)点状染色少于30个；2)点状染色30个以上，但不弥漫；3)重度弥漫性染色或斑块阳性。所有象限的总和作为最终得分。每组所有患眼均进行检查和分析。
实验结果如图11所示，给药组(CsA滴眼液、siNFKBIZ-M、AptMUC1-siNFKBIZ-M、AptMUC16-siNFKBIZ-M、Aptαvβ3-siNFKBIZ-M、AptCD44-siNFKBIZ-M药物组合物)均能够有效的改善角膜的损伤程度，其中经过一周治疗后环孢素滴眼液组小鼠的眼部评分从12分降至8分左右，酚红棉线泪液测试结果由3mm增至3.8mm左右；siNFKBIZ-M给药组的小鼠眼部评分12分降至10分左右，酚红棉线泪液测试结果由3mm增至3.5mm左右；Apt-siNFKBIZ-M给药组的小鼠眼部荧光素钠评分均得到了显著下降，由约12分降至6分，表明Apt-siNFKBIZ-M能够显著改善角膜损伤；酚红棉线泪液测试结果由约3mm增至5mm左右，表明Apt-siNFKBIZ-M能够显著促进泪液的分泌。从以上实验结果可以看出，适配体能够有效的促进siNFKBIZ基因药物的入胞，并发挥siNFKBIZ的生物学功能，实现干眼的有效治疗。
实施例3
单苯硼酸靶向递送核酸分子
1、PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的合成与表征
1.1 4-羧基苯基硼酸(PBA-COOH)与NFKBIZ小干扰RNA组合物(PBA-siNFKBIZ)的合成
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因小干扰RNA均购自苏州贝信生物技术有限公司，在小干扰RNA的3′端引入了氨基(-NH2)修饰，使其能够与PBA-COOH上的羧基基团通过酰胺化学反应高效偶联，3′端氨基基团修饰在以下所有实施例中均以3′-NH2表示，其修饰结构如式59所示：
其中，表示连接的核酸分子，Base表示任意类型的碱基。
本实施例中使用的siNFKBIZ基因药物序列如下：
其中靶向人源NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ)序列为
Sense：5′-AGAACAUUAUCAACAUUAA-3′(SEQ ID NO：43)；
Antisense：5′-UUAAUGUUGAUAAUGUUCUga-3′(SEQ ID NO：432)；
其中靶向小鼠NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ-M)序列为
Sense：5′-GCGUCAAUGUACCAGUAUU-3′(SEQ ID NO：421)；
Antisense：5′-AAUACUGGUACAUUGACGCCU-3′(SEQ ID NO：422)；
PBA-siNFKBIZ的合成路线如图12所示：
具体合成方法为：将0.22mg PBA-COOH(1300nmol)，0.40mg EDCI(2600nmol)，0.30mg NHS(2600nmol)溶于1.3mL DMSO中，取0.13mL，加入5OD(26nmol)3′端氨基修饰的siNFKBIZ正义链(siNFKBIZ-S-3′-NH2)后，放置于25℃下震荡反应24h。加入5mL水后，用二氯甲烷萃取除去反应中的EDCI/NHS和过量的PBA-COOH，然后将水溶液浓缩蒸干后，即得到PBA-siNFKBIZ-S偶联物分子。然后通过定量将PBA-siNFKBIZ-S与siNFKBIZ的反义链(siNFKBIZ-A)摩尔比1∶1的情况下，65℃恒温10分钟，然后退火10min至25℃，得到PBA-siNFKBIZ的药物组合物。
2、PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的细胞摄取能力验证
将HCEC细胞以每孔4×104个细胞的数量接种于24孔培养板中，每孔放入干净的盖玻片，过夜培养，随后分别与PBA-siNFKBIZ-Cy3和siNFKBIZ-Cy3(等效Cy3浓度为0.5μM)培养6h。随后去除培养液，用PBS洗涤3次，室温下4％多聚甲醛固定15min。然后，使用DAPI染细胞核15min，用PBS清洗后，使用激光共聚焦观察。结果如图13中A所示，PBA-siNFKBIZ-Cy3组的细胞绿色荧光高于siNFKBIZ-Cy3给药组。
为了将HCEC细胞以每孔4.0×105个接种于12孔板中，DMEM培养过夜。按照Cy3浓度(0.5μM)每孔的浓度将PBA-siNFKBIZ-Cy3加入细胞中，在Opti-MEM中37℃孵育6h。以siNFKBIZ-Cy3作为对照。使用胰蛋白酶收集细胞并收集用于流式细胞术分析。结果如图13中B所示，PBA-siNFKBIZ-Cy3组的平均荧光强度约为siNFKBIZ组的1.2倍。综上结果表明，PBA的修饰能够增强siNFKBIZ小核酸药物的摄取能力，提高了其入胞效果。
3、PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的基因调控能力评估
按照1×105细胞/孔的标准，将HCEC细胞接种到6孔板中并培养过夜。然后使用IL-1β刺激12h后，用PBS清洗2遍，接下来将细胞用含有siNFKBIZ和PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的Opti-MEM培养基孵育6h后，更换DMEM完全培养基，并继续培养48h。接下来，使用RNAiso试剂裂解细胞并提取mRNA，通过Nanodrop测量mRNA的浓度。根据逆转录试剂盒获得cDNA，并进一步进行qPCR实验。结果如图14所示，IL-1β刺激后，HCEC细胞的NFKBIZ基因的表达明显上调至正常细胞的1.6倍左右，游离siNFKBIZ基因药物能够下调至1.4倍左右。然而PBA-siNFKBIZ基因药物组合物能够抑制NFKBIZ基因的表达，抑制后表达量降至正常未刺激组(Mock组)的1.26左右。以上结果表明，PBA-siNFKBIZ基因药物组合物能够一定程度促进siNFKBIZ基因药物的入胞，实现NFKBIZ基因的调控作用，达到基因抑制效果。
4、PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的干眼治疗效果
本实施例所有动物实验均按照视觉与眼科研究协会(ARVO)《眼科和视觉研究中使用动物声明》的指南进行操作，符合相关操作规范。所有动物实验均按照上海交通大学伦理委员会制定的指南进行。本实施例从上海斯莱克实验动物有限责任公司选取6～8周龄无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠15只(30只眼)，饲养于有充足鼠粮和水的环境控制室内。将小鼠随机分为3组，暴露于低湿度环境(RH＝18.5％±5.1％，AF＝15L/min，T＝21～23℃)中适应4天。然后每只眼睛滴5μL的0.2％苯扎氯氨，每日两次，连续14天给药，建立小鼠干眼模型。各组小鼠双眼每日2次局部滴注PBS、环孢素CsA滴眼液(兴齐眼药)、PBA-siNFKBIZ-M(等效siRNA剂量为0.05mg/kg)，连续给药14天，一天两次(早晚各一次)。并在给药的第0天、7天、14进行泪液分泌检测以及角膜荧光素钠染色评估，具体操作按照实施例2。
结果如图15所示，荧光素钠结果显示，所有给药组的评分均有下降，其中CsA滴眼液治疗组在第7天显著下降，并在第14天由最初的11分降至6分左右，酚红棉线泪液测试的结果由1.8mm增加至3.3mm左右。而PBA-siNFKBIZ-M组小鼠的荧光素钠评分在治疗14天后有所下降(由11分下降至约8.0)，泪液分泌量也有所增加(由1.5mm增加至3mm)。相比于PBS治疗组，CsA给药组、PBA-siNFKBIZ-M给药组均能够改善干眼的体征。
实施例4
双苯硼酸靶向递送siNFKBIZ基因药物组合物用于干眼的治疗
1、2PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的合成与表征
1.1 2PBA-MAL的合成
本实施例中2PBA-MAL合成路线如图16所示。
1.2化合物4的合成
取化合物1(1000mg)和化合物2(1440mg)于100mL烧瓶中，加入40mL二氯甲烷搅拌至溶解。加入EDCI(900mg)和DMAP(30mg)，在氮气保护下，将反应置于室温反应20h。反应完毕后，减压蒸馏除去二氯甲烷，加入30mL水，并用30mL乙酸乙酯萃取2次，收集有机相，接下来用30mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次，然后使用30mL饱和氯化钠溶液洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥。旋干溶剂后，加入10mL乙酸乙酯震荡，在搅拌下缓慢加入正己烷至有大量白色固体析出，抽滤，滤饼用正己烷洗2次，得化合物3(859mg)，产率：约84％。
化合物3的1H NMR谱图如图17所示，核磁波谱测试使用溶剂为CDCl3，各质子峰的归属如下：1H NMR(600MHz，Chloroform-d)δ7.94(d，J＝7.9Hz，4H)，7.79(d，J＝7.9Hz，4H)，4.89(d，J＝6.8Hz，1H)，4.47-4.36(m，5H)，1.35(s，9H)，1.29(s，24H)。化合物3的1H NMR谱图如图18所示，核磁波谱测试使用溶剂为CDCl3，产物所含特征碳的归属如下：13C NMR(151MHz，Chloroform-d)δ166.37，134.75，128.72，84.23，64.11，28.31，24.89。
1.3化合物4的合成
取化合物4(859mg)置于干燥的100mL圆底烧瓶中，加入20mL丙酮搅拌至溶解。取高碘酸钠(1130mg)和乙酸铵(412mg)溶解于20mL水中，并加入丙酮。在氮气保护下，将反应置于室温反应10h。反应完毕后，减压蒸馏除去丙酮，加入20mL水，并用20mL乙酸乙酯洗涤2次，然后有机相用20mL饱和氯化钠溶液洗涤1次，接下来收集有机相后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得无色油状液体。加入20mL乙酸乙酯和2mL甲醇复溶，在冰浴下加入7mL 4M氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌反应4h，有大量白色固体析出，抽滤，并用乙酸乙酯将滤饼洗2次，得白色固体424mg，即制得化合物4，产率：约76％。
化合物4的1H NMR谱图如图19所示，核磁波谱测试使用溶剂为CDCl3，各质子峰的归属如下：1H NMR(700MHz，DMSO-d6)δ8.82(s，2H)，8.35(s，4H)，8.10(d，J＝8.3Hz，4H)，7.94(d，J＝8.2Hz，4H)，4.61(qd，J＝11.9，5.1Hz，4H)，4.05(s，1H)。化合物3的13C NMR谱图如图20所示，核磁波谱测试使用溶剂为CDCl3，产物所含特征碳的归属如下：13C NMR(151MHz，Methanol-d4)δ166.14，133.56，128.41，62.00，49.52。
1.4化合物5的合成
取化合物4(424mg)和4-马来酰亚胺丁酸(366mg)置于干燥的100mL圆底烧瓶中，加入30mL甲醇搅拌至溶解。接下来加入DMTMM(557mg)和NMM(203mg)，将反应置于室温反应2h。反应完毕后，减压蒸馏除去甲醇，加入20mL水，用20mL乙酸乙酯洗涤2次，有机相用20mL饱和氯化钠溶液洗涤1次，收集有机相后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得无色油状液体。反相柱层析纯化得白色固体481mg，即制得化合物7，产率：约87％。
化合物5的1H NMR谱图如图21所示，核磁波谱测试使用溶剂为DMSO-d6，各质子峰的归属如下：1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.25(d，J＝8.3Hz，1H)，7.96(d，J＝8.3Hz，4H)，7.91(d，J＝8.2Hz，4H)，6.97(s，2H)，4.61-4.52(m，1H)，4.45-4.36(m，4H)，3.39(t，J＝7.0Hz，2H)，2.14(t，J＝7.5Hz，2H)，1.73(p，J＝7.2Hz，2H).化合物5的13C NMR谱图如图22所示，核磁波谱测试使用溶剂为DMSO-d6，产物所含特征碳的归属如下：13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δ170.41，165.17，133.83，133.59，130.03，127.58，62.92，38.44，36.17，32.01，23.56.。
1.5 2PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的合成
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因小干扰RNA均购自苏州贝信生物技术有限公司，在小干扰RNA的3′端引入了巯基(-SH)修饰，使其能够与修饰在2PBA-MAL上的马来酰亚胺基团通过点击化学反应高效偶联，3′端巯基基团修饰在以下所有实施例中均以3′-SH表示，其修饰结构如式60所示。
其中，表示连接的核酸分子，Base表示任意类型碱基。
本实施例中使用的siNFKBIZ基因药物序列如下：
其中靶向人源NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ)序列为
Sense：5′-GCCCGAUUCGUUGUCUGAU-3′(SEQ ID NO：35)；
Antisense：5′-AUCAGACAACGAAUCGGGCcc-3′(SEQ ID NO：433)；
其中靶向小鼠NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ-M)序列为
Sense：5′-GCGUCAAUGUACCAGUAUU-3′(SEQ ID NO：421)；
Antisense：5′-AAUACUGGUACAUUGACGCCU-3′(SEQ ID NO：422)；
2PBA-siNFKBIZ-S偶联物的合成路线如图23所示：
合成方法为：将0.72mg实施例4.1中所制备的2PBA-MAL(1300nmol)溶于1.3mLDMSO中，取0.13mL，加入5OD(26nmol)siNFKBIZ-3′-SH的正义链(siNFKBIZ-S)后，放置于50℃下震荡反应24h。加入5mL水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的2PBA-MAL，然后将水溶液浓缩蒸干后，即得到2PBA-siNFKBIZ-S偶联物分子。然后通过定量将2PBA-siNFKBIZ-S与siNFKBIZ的反义链(siNFKBIZ-A)按摩尔比1∶1混合，并置于65℃恒温10min，并退火10min至25℃，得到2PBA-siNFKBIZ的药物组合物。通过20％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证2PBA与siNFKBIZ的成功接枝偶联，见图24。
2、2PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的细胞摄取能力验证
将HCEC细胞以每孔4×104个细胞的数量接种于24孔培养板中，每孔放入干净的盖玻片，过夜培养，随后分别与2PBA-siNFKBIZ-Cy3和siRNA-Cy3(等效Cy3浓度：0.5μM)培养6h。随后去除培养液，用PBS洗涤3次，室温下使用4％多聚甲醛固定15min。然后，使用DAPI染色15min，用PBS清洗后，使用激光共聚焦显微镜进行观察。结果如图25中A所示，2PBA-siNFKBIZ-Cy3组的细胞绿色荧光高于siNFKBIZ-Cy3组。
将HCEC细胞以每孔4.0×105个接种于12孔板中，DMEM培养过夜。按照Cy3浓度(0.5μM)每孔的浓度将PBA-siNFKBIZ-Cy3加入细胞中，在Opti-MEM中37℃孵育6h。以siNFKBIZ-Cy3作为对照。使用胰蛋白酶收集细胞并收集用于流式细胞仪分析。结果如图25中B所示，2PBA-siNFKBIZ-Cy3组的平均荧光强度约为siNFKBIZ-Cy3组的1.5倍。综上结果表明，2PBA的修饰能够进一步增强siNFKBIZ药物的摄取能力，提高了其入胞效果。
3、2PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的基因调控能力评估
按照1×105细胞/孔的标准，将HCEC细胞接种到6孔板中并培养过夜。然后使用IL-1β刺激12h后，用PBS清洗2遍，接下来将细胞用含有siNFKBIZ和2PBA-siNFKBIZ药物组合物的Opti-MEM培养基孵育6h后，更换完全培养基。37℃继续培养48h。接下来，提取mRNA并测量mRNA的浓度，逆转录获得cDNA并进行qPCR实验。结果如图26所示，IL-1β刺激后，HCEC细胞的NFKBIZ基因的表达明显上调至正常细胞的1.5倍左右，单纯siNFKBIZ基因药物能够下调至1.4倍左右，无显著性差异。然而2PBA-siNFKBIZ药物组合物能够有效的抑制NFKBIZ基因的表达，抑制到1.1左右。以上结果表明，2PBA-siNFKBIZ基因药物组合物能够有效地促进siNFKBIZ基因药物的入胞，从而实现NFKBIZ基因的调控作用，达到较好的基因抑制效果。
4、2PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的干眼治疗效果
本实施例所有动物实验均按照视觉与眼科研究协会(ARVO)《眼科和视觉研究中使用动物声明》的指南进行操作，符合相关操作规范。所有动物实验均按照上海交通大学伦理委员会制定的指南进行。本实施例从上海斯莱克实验动物有限责任公司选取6～8周龄无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠15只(30只眼)，饲养于有充足鼠粮和水的环境控制室内。将小鼠随机分为6组，暴露于低湿度环境(RH＝18.5％±5.1％，AF＝15L/min，T＝21～23℃)中适应4天。然后每只眼睛滴5μL的0.2％苯扎氯氨，每日两次，连续14天给药，建立小鼠干眼模型。各组小鼠双眼每日2次局部滴注PBS、环孢素CsA滴眼液(兴齐眼药)、2PBA-siNFKBIZ(等效siRNA剂量为0.05mg/kg)，连续给药14天，一天两次(早晚各一次)。并在给药的第0天、7天、14进行泪液分泌检测以及角膜荧光素钠染色评估，具体操作按照实施例2。
结果如图27所示，CsA滴眼液给药组的小鼠荧光素钠评分10分降至5分左右，酚红棉线泪液测试结果由2mm增至4mm左右；2PBA-siNFKBIZ-M给药组的小鼠眼部荧光素钠评分降至4.8分左右，酚红棉线泪液测试结果由2mm增至4.5mm左右；从动物实验结果中可以看出，2PBA-siNFKBIZ-M对小鼠干眼具有较好的治疗效果，一是由于PBA可以与眼部蛋白结合，促进了siNFKBIZ-M的入胞；二是siNFKBIZ-M入胞后能够很好发挥NFKBIZ基因的调控作用，抑制炎症，起到良好的干眼治疗效果。
实施例5
四苯硼酸靶向递送siNFKBIZ基因药物组合物用于干眼的治疗
1、4PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的合成与表征
本实施例中4PBA-NH2合成路线如图28所示。
1.1化合物7的合成
取化合物6(100mg)和化合物2(826mg)于100mL烧瓶中，加入40mL甲醇搅拌至溶解。加入DMTMM(921mg)和NMM(337mg)，在氮气保护下，将反应置于室温反应20h。反应完毕后，减压蒸馏除去甲醇，加入10mL乙酸乙酯震荡，静置析出白色固体，抽滤得化合物7(512mg)，产率：约84％。
化合物7的1H NMR谱图如图29所示，核磁波谱测试使用溶剂为CDCl3，各质子峰的归属如下：1H NMR(700MHz，Chloroform-d)δ7.82-7.73(m，8H)，7.30(t，J＝6.4Hz，2H)，3.95(q，J＝5.0Hz，1H)，3.61-3.50(m，4H)，1.29(s，24H)。化合物7的13C NMR谱图如图30所示，核磁波谱测试使用溶剂为CDCl3，产物所含特征碳的归属如下：13C NMR(151MHz，Chloroform-d)δ168.08，134.87，133.98，131.74，125.25，83.09，69.08，41.97，23.85.
1.2化合物8的合成
取化合物7(512mg)于100mL烧瓶中，加入30mL二氯甲烷搅拌至溶解加入DMAP(10mg)和DIEA(240mg)。冰浴下加入乙酸酐(190mg)，在氮气保护下，将反应置于室温反应20h。反应完毕后，减压蒸馏除去二氯甲烷，加入50mL水，依次用20mL乙酸乙酯洗涤2次，有机相用20mL饱和氯化钠溶液洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得无色油状液体。加入10mL乙醚震荡，静置得白色固体，抽滤，滤饼干燥后得白色固体550mg，即制得化合物8，产率：约91％。
化合物8的1H NMR谱图如图31所示，核磁波谱测试使用溶剂为CDCl3，各质子峰的归属如下：1H NMR(700MHz，DMSO-d6)δ12.22(s，1H)，8.67(t，J＝6.0Hz，2H)，7.88-7.69(m，8H)，5.09(tt，J＝6.7，4.9Hz，1H)，3.58(dt，J＝13.9，5.1Hz，2H)，3.43-3.38(m，2H)，2.51(s，2H)，2.48-2.44(m，2H)，1.31(s，22H)。化合物8的13C NMR谱图如图32所示，核磁波谱测试使用溶剂为CDCl3，产物所含特征碳的归属如下：13C NMR(151MHz，Chloroform-d)δ174.55，170.86，167.66，134.79，133.97，131.68，125.34，83.13，70.50，38.17，28.39，28.20，23.83.。
1.3化合物9的合成
取化合物1(100mg)和化合物8(1019mg)于100mL烧瓶中，加入40mL乙酸乙酯搅拌至溶解。加入EDCI(300mg)和DMAP(10mg)，在氮气保护下，将反应置于室温反应20h。反应完毕后，减压蒸馏除去二氯甲烷，加入30mL水(pH＝3)，用30mL乙酸乙酯洗涤2次，收集有机相，依次用30mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤1次，30mL饱和氯化钠溶液洗涤1次，收集有机相后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得白色泡沫固体，直接用于后续反应。
1.4化合物10的合成
取化合物9(647mg)置于干燥的100mL圆底烧瓶中，加入10mL丙酮搅拌至溶解。取高碘酸钠(761mg)和乙酸铵(278mg)溶解于10mL水中，并加入丙酮溶液中。在氮气保护下，将反应置于室温反应10h。反应完毕后，减压蒸馏除去丙酮，加入20mL水，用20mL乙酸乙酯洗涤2次，有机相用20mL饱和氯化钠溶液洗涤1次，收集有机相后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得无色油状液体，即制得化合物10，直接用于后续反应。
1.5化合物11的合成
取化合物10置于干燥的100mL圆底烧瓶中，加入30mL乙酸乙酯搅拌至溶解。冰浴下加入4M氯化氢-乙酸乙酯溶液(10mL)，在氮气保护下反应3h。反应完毕后，减压蒸馏除去氯化氢-乙酸乙酯溶液，反相柱层析纯化得白色固体392mg，即制得化合物11，产率：约83％。
化合物11的1H NMR谱图如图33所示，核磁波谱测试使用溶剂为DMSO-d6，各质子峰的归属如下：1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.76(s，5H)，8.57(d，J＝6.2Hz，3H)，8.24(d，J＝20.8Hz，4H)，7.87(q，J＝6.4，5.1Hz，16H)，5.07(t，J＝6.0Hz，2H)，4.22-4.17(m，4H)，3.84(d，J＝5.0Hz，1H)，3.40-3.28(m，8H)，2.64-2.60(m，8H)。化合物11的13C NMR谱图如图34所示，核磁波谱测试使用溶剂为DMSO-d6，产物所含特征碳的归属如下：13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δ170.82，167.16，167.08，136.19，134.40，134.23，126.59，69.00，60.23，55.38，50.81，49.05，44.06，21.23，14.55。
1.5 4PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的合成
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因小干扰RNA均购自苏州贝信生物技术有限公司，在小干扰RNA的5′端引入了醛基(5′-CHO-)修饰，使其能够与修饰在4PBA-NH2上的羧基基团通过亲电取代反应高效偶联，5′端醛基基团修饰在以下所有实施例中均以5′-CHO-表示，其修饰结构如式61所示。
其中，表示连接的核酸分子，Base表示任意类型碱基。
本实施例中使用的siNFKBIZ基因药物序列如下：
其中靶向人源NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ)序列为
Sense：5′-UUAUCAACAUUAAGAAUGA-3′(SEQ ID NO：44)；
Antisense：5′-UCAUUCUUAAUGUUGAUAA-3′(SEQ ID NO：254)；
为了进一步增加RNA的稳定性，本实施例进行了稳定化修饰，具体序列为：
Sense：5′-UmUmAmUmCfAmAfCfAfUmUmAmAmGmAmAmUmsGmsAm-3′(SEQ ID NO：44)；
Antisense：5′-UmsCfsAmUmUmCfUmUfAfAmUmGmUmUfGmAfUmsAmsAm-3′(SEQ ID NO：254)；
靶向小鼠NFKBIZ基因的稳定化修饰的小干扰RNA(siNFKBIZ-M)序列为
Sense：5′-GmCmGmUmCfAmAfUfGfUmAmCmCmAmGmUmAmsUmsUm-3′(SEQ ID NO：421)；
Antisense：5′-AmsAmsUmAmCmUfGmGfUfAmCmAmUmUfGmAfCmsGmsCm-3′(SEQ ID NO：422)。
其中，m代表核糖糖骨架2′-O-甲基化修饰，s代表骨架硫代磷酸酯修饰，f代表核糖糖骨架2′-氟代修饰。
4PBA-siNFKBIZ-S的合成路线如图35所示。
具体合成方法为：将0.15mg 4PBA-NH2(1300nmol)和0.14mg pic-BH3(1300nmol)溶于0.13mL DMSO中。取0.13mL，加入5OD(26nmol)5′-CHO-siNFKBIZ的正义链(siNFKBIZ-S)和5μL乙酸，在室温下震荡反应2h。反应完成后加入1mL无水乙醇和13μL 10×PBS，在-20℃静置过夜。12000rpm离心15min后，弃去上清，沉淀用水复溶即得到4PBA-siNFKBIZ-S偶联物分子。然后通过定量将PBA-siNFKBIZ-S与siNFKBIZ的反义链(siNFKBIZ-A)按摩尔比1∶1混合，并置于65℃恒温10min，退火10min至25℃，得到4PBA-siNFKBIZ药物组合物。通过20％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证4PBA与siNFKBIZ成功接枝偶联，见图36。从图中可以看出，4PBA接枝DBCO-siNFKBIZ的效率较高，产率90％以上。
2、4PBA-siNFKBIZ药物组合物的细胞摄取能力验证
将HCEC细胞以每孔4×104个细胞的数量接种于12孔培养板中，每孔放入干净的盖玻片，过夜培养，随后分别与4PBA-siNFKBIZ-FAM和siRNA-FAM(等效FAM浓度：0.5μM)培养6h。随后去除培养液，用PBS洗涤3次，室温下4％多聚甲醛固定15min。然后，使用DAPI染细胞核15min，用PBS清洗后，使用激光共聚焦观察。结果如图37中A所示，4PBA-siNFKBIZ-FAM组的细胞绿色荧光显著高于siNFKBIZ-FAM组。
为了将HCEC细胞以每孔4.0×105个接种于12孔板中，DMEM培养过夜。按照FAM浓度(0.5μM)每孔的浓度将4PBA-siNFKBIZ-FAM加入细胞中，在Opti-MEM中37℃孵育6h。以siNFKBIZ-FAM作为对照。使用胰蛋白酶收集细胞并收集用于流式细胞仪分析。结果如图37中B所示，4PBA-siNFKBIZ-FAM组的平均荧光强度约为siNFKBIZ-FAM组的2.3倍。综上结果表明，4PBA的修饰能够进一步增强siNFKBIZ小核酸药物的摄取能力，提高了其入胞效果。
3、4PBA-siNFKBIZ药物组合物的基因调控能力评估
按照1×105细胞/孔的标准，将HCEC细胞接种到6孔板中并培养过夜。然后使用IL-1β刺激12h后，用PBS清洗2遍，接下来将细胞用含有siNFKBIZ和4PBA-siNFKBIZ药物组合物的Opti-MEM培养基孵育6h，更换完全培养基。37摄氏度继续培养48h。接下来，提取mRNA，并测量mRNA的浓度，逆转录获得cDNA，并进行qPCR实验。结果如图38中A所示，IL-1β刺激后，HCEC细胞的NFKBIZ基因表达明显上调至正常细胞的1.8倍左右，单纯siNFKBIZ基因药物能够下调至1.5倍左右。然而4PBA-siNFKBIZ药物组合物能够有效的抑制NFKBIZ基因的表达，抑制到1.0左右。
按照1×105细胞/孔的标准，将HCEC细胞接种到6孔板中并培养过夜。然后使用IL-1β刺激12h后，用PBS清洗2遍，接下来将细胞用含有不同浓度的4PBA-siNFKBIZ药物组合物的Opti-MEM培养基孵育6h，更换完全培养基后，继续培养48h。接下来，使用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液从细胞中提取总蛋白，测定蛋白浓度，并进行Western-blot实验。结果如图38中B所示，以上结果表明，4PBA-siNFKBIZ药物组合物能够有效地促进siNFKBIZ基因药物的入胞，抑制了NFKBIZ基因的表达，并能够有效抑制IκBζ的蛋白表达。
4、4PBA-siNFKBIZ药物组合物的干眼治疗效果
本实施例所有动物实验均按照视觉与眼科研究协会(ARVO)《眼科和视觉研究中使用动物声明》的指南进行操作，符合相关操作规范。所有动物实验均按照上海交通大学伦理委员会制定的指南进行。本实施例从上海斯莱克实验动物有限责任公司选取6～8周龄无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠15只(30只眼)，饲养于有充足鼠粮和水的环境控制室内。将小鼠随机分为3组，暴露于低湿度环境(RH＝18.5％±5.1％，AF＝15L/min，T＝21～23℃)中适应4天。然后每只眼睛滴5μL的0.2％苯扎氯氨，每日两次，连续14天给药，建立小鼠干眼模型。各组小鼠双眼每日2次局部滴注PBS、环孢素CsA滴眼液(兴齐眼药)、4PBA-siNFKBIZ-M(等效siRNA剂量为0.05mg/kg)，连续给药14天，一天两次(早晚各一次)。并在给药的第0天、7天、14进行泪液分泌检测以及角膜荧光素钠染色评估，具体操作按照实施例2。
结果如图39所示，荧光素钠染色可以看出，经过14天的治疗，相比于PBS组，给药组在眼部的染色较少，角膜损伤程度均有较为明显的改善，其中4PBA-siNFKBIZ-M给药组眼部损伤显著减少，由最初的9分降至4分左右，而CsA组评分降至5左右。泪液分泌量结果显示，经过4PBA-siNFKBIZ-M药物组合物的治疗，泪液分泌量由1.5mm左右增加值4mm左右。综上，4PBA-siNFKBIZ-M基因药物能够提高siNFKBIZ-M药物在眼表的滞留，提高药物的生物利用度，促进了细胞对siNFKBIZ基因药物的摄取，从而抑制NFKBIZ基因的表达，遏制了炎症的恶性循环，实现眼表角膜损伤改善，起到干眼的有效治疗。
实施例6
六苯硼酸靶向递送siNFKBIZ基因药物组合物用于干眼的治疗
1、6PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的合成与表征
本实施例中6PBA-N3的合成路线如图40所示。
1.1化合物13的合成
取化合物12(200mg)和叠氮己酸(467mg)于100mL烧瓶中，加入20mL甲醇搅拌至溶解。加入DMTMM(688mg)和NMM(248mg)，在氮气保护下，将反应置于室温反应20h。反应完毕后，减压蒸馏除去甲醇，经硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为乙酸乙酯∶甲醇＝30∶1，最后得白色固体356mg，即制得化合物13，产率：约83％。
化合物13的1H NMR谱图如图41所示，核磁波谱测试使用溶剂为CDCl3，各质子峰的归属如下：1H NMR(700MHz，DMSO-d6)δ7.13(s，1H)，4.76(t，J＝5.8Hz，3H)，3.51(d，J＝5.7Hz，6H)，3.31(t，J＝6.9Hz，2H)，2.14(t，J＝7.4Hz，2H)，1.51(ddt，J＝21.1，15.1，7.3Hz，4H)，1.33-1.26(m，2H)。
1.2化合物14的合成
取化合物13(356mg)和化合物8(3560mg)于250mL烧瓶中，加入100mL二氯甲烷搅拌至溶解。加入EDCI(849mg)和DMAP(100mg)，在氮气保护下，将反应置于室温反应20h。反应完毕后，减压蒸馏除去二氯甲烷，加入100mL乙酸乙酯，依次用100mL水(pH＝3)洗涤2次，100mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，100mL饱和氯化钠溶液洗涤1次，收集有机相后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得白色泡沫固体，直接用于后续反应。
6.1.3化合物15的合成
取化合物14(1000mg)置于干燥的100mL圆底烧瓶中，加入30mL丙酮搅拌至溶解。取高碘酸钠(2379mg)和碳酸铵(857mg)溶解于30mL水中，加入丙酮溶液中。在氮气保护下，将反应置于室温反应10h。反应完毕后，减压蒸馏除去丙酮，加入100mL乙酸乙酯，依次用100mL水洗涤2次，100mL饱和氯化钠溶液洗涤1次，收集有机相后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得白色固体，溶解于10mL乙酸乙酯中，在搅拌下缓慢加入10mL二氯甲烷，20mL石油醚，抽滤得白色固体，固体用20mL石油醚洗涤，干燥，得白色固体702mg，即制得化合物15，产率：约91％。
化合物15的1H NMR谱图如图42所示，核磁波谱测试使用溶剂为Methanol-d4，各质子峰的归属如下：1H NMR(600MHz，Methanol-d4)δ7.78(t，J＝15.6Hz，24H)，5.22-5.18(m，3H)，4.32(s，6H)，3.71(dd，J＝14.2，4.8Hz，6H)，3.55(dd，J＝14.3，6.5Hz，6H)，3.19(t，J＝6.8Hz，2H)，2.64-2.56(m，13H)，2.15(t，J＝7.4Hz，2H)，1.51(dq，J＝22.3，7.4Hz，4H)，1.29(ddt，J＝8.3，5.9，2.5Hz，2H)。化合物15的13C NMR谱图如图43所示，核磁波谱测试使用溶剂为Methanol-d4，产物所含特征碳的归属如下：13C NMR(151MHz，Methanol-d4)δ175.22，172.27(d，J＝3.1Hz)，169.37，137.37，135.29，133.63，125.97，71.83，62.03，60.16，57.56，53.41，50.85，48.45，40.07，35.74，25.82，24.95，19.47，13.07。
1.4 6PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的合成
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因小干扰RNA均购自苏州贝信生物技术有限公司，在小干扰RNA的3′端引入了二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)修饰，使其能够与修饰在6PBA-N3上的叠氮基团通过点击化学反应高效偶联，3′端DBCO基团修饰在以下所有实施例中均以3′-DBCO表示，其修饰结构如式62所示：
其中，表示连接的核酸分子。Base表示任意类型碱基；
本实施例中使用的siNFKBIZ基因药物序列如下：
其中靶向人源NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ)序列为
Sense：5′-AGUUGUUUCUAUGAAACAA-3′(SEQ ID NO：101)；
Antisense：5′-UUGUUUCAUAGAAACAACUua-3′(SEQ ID NO：434)；
进一步，本实施例对所使用序列进行了稳定化修饰，具体修饰如下：
Sense：5′-AmsGmsUmUmGfUmUfUfCfUmAmUmGmAmAmAmCmAmAm-3′(SEQ ID NO：101)；
Antisense：5′-UmsUfsGmUmUmUfCmAfUfAmGmAmAmAfCmAfAmCmUmsUmsAm-3′(SEQ IDNO：434)；
其中，m代表核糖糖骨架2′-O-甲基化修饰，s代表骨架硫代磷酸酯修饰，f代表核糖糖骨架2′-氟代修饰。
其中靶向小鼠NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ-M)序列为
Sense：5′-GCGUCAAUGUACCAGUAUU-3′(SEQ ID NO：421)；
Antisense：5′-AAUACUGGUACAUUGACGCCU-3′(SEQ ID NO：422)；
6PBA-siNFKBIZ-S的合成路线如图44所示：
具体合成方法为：将0.15mg 6PBA-N3(130nmol)溶于0.13mLDMSO中，加入5OD(26nmol)DBCO-siNFKBIZ的正义链(siNFKBIZ-S)后，放置于50℃下震荡反应24h。加入5mL水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的6PBA-N3，然后将水溶液浓缩蒸干后，即得到PBA-siNFKBIZ-S偶联物分子。然后通过定量将6PBA-siNFKBIZ-S与siNFKBIZ的反义链(siNFKBIZ-A)摩尔比1∶1混合，并置于65℃恒温10min，退火10min至25℃，得到6PBA-siNFKBIZ的药物组合物。如图45所示，通过20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证6PBA与siNFKBIZ的成功接枝偶联，其接枝率大于90％。
2、6PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的细胞摄取能力验证
将HCEC细胞以每孔4×104个细胞的数量接种于24孔培养板中，每孔放入干净的盖玻片，过夜培养，随后分别与6PBA-siNFKBIZ-FAM和siNFKBIZ-FAM(等效FAM浓度：0.5μM)培养6h。随后去除培养液，用PBS洗涤3次，室温下使用4％多聚甲醛固定15min。然后，使用DAPI染色15min，用PBS清洗后，使用激光共聚焦显微镜进行观察。结果如图46中A所示，6PBA-siNFKBIZ-FAM组的细胞绿色荧光显著高于siNFKBIZ-FAM-FAM组。
为了将HCEC细胞以每孔4.0×105个接种于12孔板中，DMEM培养过夜。将6PBA-siNFKBIZ-FMA(FAM等效浓度0.5μM)加入细胞中，在Opti-MEM中37℃孵育6h。以siNFKBIZ-FAM作为对照。使用胰蛋白酶收集细胞并收集用于流式细胞仪分析。结果如图46中B所示，6PBA-siNFKBIZ-FMA组的平均荧光强度约为siNFKBIZ-FAM组的3倍。综上结果表明，6PBA-siNFKBIZ药物组合物具有更多的PBA可以更好的与细胞表面糖基发生作用，从而提高了细胞对siNFKBIZ小核酸药物的摄取能力，显著地提高了其入胞效果。
3、6PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的基因调控能力评估
按照1×105细胞/孔的标准，将HCEC细胞接种到6孔板中并培养过夜。然后使用IL-1β刺激12h后，用PBS清洗2遍，接下来将细胞用含有siNFKBIZ和6PBA-siNFKBIZ药物组合物的Opti-MEM培养基孵育6h后，更换DMEM完全培养基。37℃继续培养48h。接下来，使用RNAiso试剂裂解细胞以提取mRNA，并通过Nanodrop测量mRNA的浓度，逆转录获得cDNA，并进行qPCR实验。结果如图47中A所示，IL-1β刺激后，HCEC细胞的NFKBIZ基因的表达明显上调至正常细胞的1.6倍左右，单纯siNFKBIZ基因药物能够下调至1.5倍左右。然而6PBA-siNFKBIZ药物组合物能够有效的抑制NFKBIZ基因的表达，抑制到0.7左右。
按照1×105细胞/孔的标准，将HCEC细胞接种到6孔板中并培养过夜。然后使用IL-1β刺激12h后，用PBS清洗2遍，接下来将细胞用含有不同浓度的6PBA-siNFKBIZ药物组合物的Opti-MEM培养基孵育6h，更换完全培养基后，继续培养48h。接下来，提取蛋白并测定蛋白浓度，进行Western-blot实验。结果如图47中B所示，6PBA-siNFKBIZ药物组合物能够有效抑制IκBζ的蛋白表达。
4、6PBA-siNFKBIZ基因药物组合物的干眼治疗效果
本实施例所有动物实验均按照视觉与眼科研究协会(ARVO)《眼科和视觉研究中使用动物声明》的指南进行操作，符合相关操作规范。所有动物实验均按照上海交通大学伦理委员会制定的指南进行。本实施例从上海斯莱克实验动物有限责任公司选取6～8周龄无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠15只(30只眼)，饲养于有充足鼠粮和水的环境控制室内。将小鼠随机分为3组，暴露于低湿度环境(RH＝18.5％±5.1％，AF＝15L/min，T＝21～23℃)中适应4天。然后每只眼睛滴5μL的0.2％苯扎氯氨，每日两次，连续14天给药，建立小鼠干眼模型。各组小鼠双眼每日2次局部滴注PBS、环孢素CsA滴眼液(兴齐眼药)、6PBA-siNFKBIZ(等效siRNA剂量为0.05mg/kg)，连续给药14天，一天两次(早晚各一次)。并在给药的第0天、7天、14进行泪液分泌检测以及角膜荧光素钠染色评估，具体操作按照实施例2。
结果如图48所示，荧光素钠染色结果显示，相比于PBS组，给药组在第7天均有好转，第14天CsA滴眼液给药组眼部评分由10分左右降降至5分，酚红棉线泪液测试结果显示泪液也有明显增加；而6PBA-siNFKBIZ-M给药组荧光素钠评分由10分降至3.5分左右，酚红棉线浸润长度由2mm增至5.7mm左右。综上，相比于CsA滴眼液，在两周内6PBA-siNFKBIZ-M给药组治疗效果显著。
实施例7
十苯硼酸靶向递送siNFKBZ基因药物组合物用于干眼的治疗
1、PBA10-siNFKBIZ基因药物组合物的合成与表征
本实施例中所采用的硫代修饰的NFKBIZ基因小干扰RNA购自苏州贝信生物技术有限公司，在小干扰RNA正义链的3′端引入12个T序列，并修饰了10个硫代磷酸酯骨架修饰(phosphorothioate，PS)修饰(10PS-siNFKBIZ-
S)，使其能够与修饰在4-溴甲基-苯硼酸(PBA-Br)上的溴乙酰溴基团偶联，siNFKBIZ正义链3′端延伸的10个T上具有PS修饰在以下所有实施例中均以-10PS表示，PS具体结构如式63所示。
其中，表示连接的核酸分子。
本实施例中使用的siNFKBIZ基因药物序列如下：
其中靶向人源NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ)序列为
Sense：5′-GCCCGAUUCGUUGUCUGAUTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3′(SEQ ID NO：435)；其中*表示硫代磷酸酯修饰；
Antisense：5′-AUCAGACAACGAAUCGGGCcc-3′(SEQ ID NO：433)；
其中靶向小鼠NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ-M)序列为
Sense：5′-GCGUCAAUGUACCAGUAUUTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3′(SEQ ID NO：436)；其中*表示硫代磷酸酯修饰；
Antisense：5′-AAUACUGGUACAUUGACGCCU-3′(SEQ ID NO：422)；
PBA10-siNKKBIZ合成中PS和Br-PBA的合成路线如图49所示：
具体合成步骤：取4-溴甲基-苯硼酸制备60mM的DMSO溶液，然后按照1∶1体积比的比例投料与200μM的10PS-siNFKBIZ在金属浴中反应，温度在50℃下反应3h。然后用乙酸乙酯萃取去除小分子，并通过透析去除二甲基亚砜，得到产物PBA10-siNFKBIZ-S，进行定量并旋干。最后，将PBA10-siNFKBIZ-S与siNFKBIZ-A在1×PBS中碱基互补配对，组装成PBA10-siNKKBIZ。利用非变性10％的聚丙烯酰胺凝胶进行验证，结果如图50所示，结果表明PBA成功修饰于siNFKBIZ-S链上，并成功与siNFKBIZ-A互补。
2、PBA10-siNFKBIZ基因药物组合物的细胞摄取效率
将HCEC细胞以每孔4.0×105个接种于12孔板中，DMEM培养过夜。将PBA10-siNFKBIZ-FAM(FAM等效浓度0.5μM)加入细胞中，在Opti-MEM中37℃孵育1h、3h、6h。以siNFKBIZ-FAM作为对照。使用胰蛋白酶收集细胞并收集用于流式细胞仪分析。结果如图51所示，HCEC细胞对于PBA10-siNFKBIZ-FAM药物组合物在1h和3h具有时间依赖性，在3h是siNFKBIZ-FAM药物的摄取量的约6倍。综上结果表明，在siNFKBIZ基因药物的其中一条链上延长进行PBA修饰，依然能够增强siNFKBIZ小核酸药物的摄取能力，提高了其入胞效果。
3、PBA10-siNFKBIZ基因药物组合物对NFKBIZ基因的调控作用
按照1×105细胞/孔的标准，将HCEC细胞接种到6孔板中并培养过夜。然后使用IL-1β刺激12h后，用PBS清洗2遍，接下来将细胞用含有siNFKBIZ和PBA10-siNFKBIZ药物组合物(siRNA等效浓度为400nM)的Opti-MEM培养基孵育6h，更换完全培养基后，继续培养48h。接下来，提取mRNA，并测量mRNA浓度，逆转录获得cDNA，并进行qPC-R实验。结果如图52所示，LPS刺激后，HCEC细胞的NFKBIZ基因的表达明显上调至正常细胞的1.2倍左右，PBA10-siNFKBIZ药物组合物能够有效的抑制NFKBIZ基因的表达，并具有浓度依赖性。在400nM浓度下，相对于LPS刺激组，NFKBIZ的基因可以抑制到50％左右。以上结果表明，PBA10-siNFKBIZ药物组合物能够有效地促进siNFKBIZ基因药物的入胞，从而实现NFKBIZ基因的调控作用，达到较好的基因抑制效果。
4、PBA10-siNFKBIZ基因药物组合物的干眼治疗效果
本实施例所有动物实验均按照视觉与眼科研究协会(ARVO)《眼科和视觉研究中使用动物声明》的指南进行操作，符合相关操作规范。所有动物实验均按照上海交通大学伦理委员会制定的指南进行。本实施例从上海斯莱克实验动物有限责任公司选取6～8周龄无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠15只(30只眼)，饲养于有充足鼠粮和水的环境控制室内。将小鼠随机分为3组，暴露于低湿度环境(RH＝18.5％±5.1％，AF＝15L/min，T＝21～23℃)中适应4天。然后每只眼睛滴5μL的0.2％苯扎氯氨，每日两次，连续14天给药，建立小鼠干眼模型。各组小鼠双眼每日2次局部滴注PBS、环孢素CsA滴眼液(兴齐眼药)、PBA10-siNFKBIZ-M(等效siRNA剂量为0.05mg/kg)，连续给药14天，一天两次(早晚各一次)。并在给药的第0天、7天、14进行泪液分泌检测以及角膜荧光素钠染色评估，具体操作按照实施例2。
结果如图53所示，经过14天的治疗，CsA滴眼液及PBA10-siNFKBIZ-M药物组合物组眼部损伤均有明显的改变，CsA给药组的小鼠眼部评分12分降至8分左右，酚红棉线泪液测试结果由2.4mm增至3.25mm左右；PBA10-siNFKBIZ-M药物组合物组的小鼠眼部荧光素钠评分由11分降至5.4分左右，酚红棉线浸润长度由2.0mm增至3.35mm左右。从动物实验结果中可以看出，相比于CsA滴眼液组，PBA10-siNFKBIZ-M药物组合物组对小鼠干眼的治疗效果更为明显。
实施例8
六苯硼酸靶向递送颈环siNFKBIZ基因药物组合物用于干眼的治疗
1、PBA6-siNFKBIZ基因药物组合物的合成与表征
本实施例中2PBA-Br的合成路线如图54所示。
1.1化合物17的合成
取化合物8(776mg)和化合物16(200mg)于100mL烧瓶中，加入20mL二氯甲烷搅拌至溶解。加入EDCI(285mg)和DMAP(20mg)，在氮气保护下，将反应置于室温反应20h。反应完毕后，减压蒸馏除去二氯甲烷，加入30mL乙酸乙酯，依次用30mL水(pH＝3)洗涤2次，30mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，30mL饱和氯化钠溶液洗涤1次，收集有机相后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得白色泡沫固体，直接用于后续反应。
1.2化合物18的合成
取化合物17置于干燥的100mL圆底烧瓶中，加入20mL丙酮搅拌至溶解。取高碘酸钠(852mg)和乙酸铵(310mg)溶解于20mL水中，加入丙酮溶液中。在氮气保护下，将反应置于室温反应10h。反应完毕后，减压蒸馏除去丙酮，加入100mL乙酸乙酯，依次用100mL水洗涤2次，100mL饱和氯化钠溶液洗涤1次，收集有机相后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得淡黄色油状液体，反相柱层析纯化得白色固体486mg，即制得化合物18，两步产率：约73％。
化合物18的1H NMR谱图如图55所示，核磁波谱测试使用溶剂为DMSO-d6，各质子峰的归属如下：1H NMR(700MHz，DMSO-d6)δ8.58(t，J＝6.0Hz，2H)，8.22(s，4H)，7.87(d，J＝7.7Hz，4H)，7.81一7.74(m，4H)，7.41(d，J＝7.9Hz，2H)，7.32(d，J＝8.0Hz，2H)，5.09(qd，J＝6.4，3.2Hz，1H)，5.03(s，2H)，4.74(s，2H)，3.58(dt，J＝13.9，5.5Hz，2H)，3.42-3.39(m，2H)，2.63-2.57(m，4H)。化合物18的13C NMR谱图如图56所示，核磁波谱测试使用溶剂为DMSO-D6，产物所含特征碳的归属如下：13C NMR(176MHz，DMSO-d6)δ166.28，136.87，134.96，133.35，128.32，127.50，125.50，71.05，64.57，45.21，39.44，38.63，38.51，28.29，28.00.
1.3 PBA6-siNFKBIZ基因药物组合物的制备
本实施例中所采用的硫代修饰的NFKBIZ基因小干扰RNA购自苏州贝信生物技术有限公司，在小干扰RNA正义链的3′端16个碱基形成颈环结构，并在环结构部位使用个硫代磷酸酯骨架修饰(phosphorothioate，PS)修饰(3PS-siNFKBIZ-S)，使其能够与修饰在溴代-二苯硼酸(2PBA-Br)上的溴代基团偶联。
本实施例中使用的siNFKBIZ基因药物序列如下：
其中靶向人源NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ)序列为
Sense：5′-GCCCGAUUCGUUGUCUGAUGCAGCCG*A*A*AGGCUGC-3′(SEQ ID NO：437)；
Antisense：5′-AUCAGACAACGAAUCGGGCcc-3′(SEQ ID NO：433)；
其中靶向小鼠NFKBIZ基因的小干扰RNA(siNFKBIZ-M)序列为
Sense：5′-GCGUCAAUGUACCAGUAUUGCAGCCG*A*A*AGGCUGC-3′(SEQ ID NO：438)：
Antisense：5′-AAUACUGGUACAUUGACGCCU-3′(SEQ ID NO：422)；
PBA6-siNKKBIZ合成路线如图57所示。
具体合成步骤：取化合物18制备20mM的DMSO溶液，然后按照1∶1体积比的比例投料与200μM的3PS-siNFKBIZ在金属浴中反应，温度在50℃下反应3h。然后用乙酸乙酯萃取去除小分子，并通过透析去除二甲基亚砜得到产物PBA6-siNFKBIZ-S，接下来定量并旋干。最后，将PBA6-siNFKBIZ-S与siNFKBIZ-A在1×PBS中碱基互补配对，组装成PBA6-siNKKBIZ。利用非变性20％的聚丙烯酰胺凝胶进行验证，结果如图58所示，结果表明PBA成功修饰于siNFKBIZ-S链上，并成功与siNFKBIZ-A互补。
2、PBA6-siNFKBIZ基因药物组合物的细胞摄取效率
将HCEC细胞以每孔4×104个细胞的数量接种于24孔培养板中，每孔放入干净的盖玻片，过夜培养，随后分别与PBA6-siNFKBIZ-FAM和siRNA-FAM(等效FAM浓度：0.5μM)共培养4h。随后去除培养液，用PBS洗涤3次，室温下4％多聚甲醛固定15min。然后，使用DAPI染色15min，用PBS清洗后，使用激光共聚焦显微镜进行观察。结果如图59中A所示，PBA6-siNFKBIZ-FAM组的细胞绿色荧光显著高于FAM修饰的siNFKBIZ-FAM组。
将HCEC细胞以每孔4.0×105个接种于12孔板中，DMEM培养过夜。按照FAM浓度(0.5μM)每孔的浓度将PBA6-siNFKBIZ-FAM加入细胞中，在Opti-MEM中37℃孵育6h。以siNFKBIZ-FAM作为对照。使用胰蛋白酶收集细胞并收集用于流式细胞仪分析。结果如图59中B所示，HCEC细胞对于PBA6-siNFKBIZ-FAM的摄取约是siNFKBIZ-FAM药物摄取量的3.2倍。综上结果表明，在siNFKBIZ基因药物的茎环结构上进行PBA修饰，能够增强siNFKBIZ小核酸药物的摄取能力，提高了其入胞效果。
3、PBA6-siNFKBIZ基因药物组合物对NFKBIZ基因的调控作用
按照1×105细胞/孔的标准，将HCEC细胞接种到6孔板中并培养过夜。然后使用IL-1β刺激12h后，用PBS清洗2遍，接下来将细胞用含有siNFKBIZ和PBA6-siNFKBIZ药物组合物的Opti-MEM培养基孵育6h，更换完全培养基后，继续培养48h。接下来，提取mRNA，并测量mRNA浓度，逆转录获得cDNA，并进行qPCR实验。结果如图60中A所示，IL-1β刺激后，HCEC细胞的NFKBIZ基因的表达明显上调至正常细胞的1.5倍左右，PBA6-siNFKBIZ基因药物组合物能够有效的抑制NFKBIZ基因的表达，可以有效地抑制到50％左右。
按照1×105细胞/孔的标准，将HCEC细胞接种到6孔板中并培养过夜。然后使用IL-1β刺激12h后，用PBS清洗2遍，接下来将细胞用含有不同浓度的PBA6-siNFKBIZ药物组合物的Opti-MEM培养基孵育6h，更换完全培养基后，继续培养48h。使用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液从细胞中提取总蛋白，测定蛋白浓度进行Western-blot实验。结果如图60中B所示，PBA6-siNFKBIZ基因药物组合物对于IκBζ蛋白的抑制能力具有浓度依赖性，在500nM浓度下可以有效地抑制蛋白的表达。以上结果表明，PBA在茎环结构的末端修饰能够有效地促进siNFKBIZ基因药物的入胞，从而实现NFKBIZ基因的调控作用，并抑制了IκBζ蛋白表达，实现较好的炎症抑制。
4、PBA6-siNFKBIZ基因药物组合物的干眼治疗效果
本实施例所有动物实验均按照视觉与眼科研究协会(ARVO)《眼科和视觉研究中使用动物声明》的指南进行操作，符合相关操作规范。所有动物实验均按照上海交通大学伦理委员会制定的指南进行。本实施例从上海斯莱克实验动物有限责任公司选取6～8周龄无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠15只(30只眼)，饲养于有充足鼠粮和水的环境控制室内。将小鼠随机分为3组，暴露于低湿度环境(RH＝18.5％±5.1％，AF＝15L/min，T＝21～23℃)中适应4天。然后每只眼睛滴5μL的0.2％苯扎氯氨，每日两次，连续14天给药，建立小鼠干眼模型。各组小鼠双眼每日2次局部滴注PBS、环孢素CsA滴眼液(兴齐眼药)、PBA6-siNFKBIZ(等效siRNA剂量为0.05mg/kg)，连续给药14天，一天两次(早晚各一次)。并在给药的第0天、7天、14进行泪液分泌检测以及角膜荧光素钠染色评估，具体操作按照实施例2。
结果如图61所示，经过14天的治疗，CsA滴眼液及PBA6-siNFKBIZ药物组合物组眼部损伤均有明显的改变，CsA给药组的小鼠眼部评分11分降至6分左右，酚红棉线泪液测试结果由2.1mm增至4.5mm左右；PBA6-siNFKBIZ药物组合物组的小鼠眼部荧光素钠评分由11分降至4分左右，酚红棉线浸润长度由2.6mm增至5.6mm左右。从动物实验结果中可以看出，相比于病例组与CsA滴眼液组，PBA6-siNFKBIZ药物组合物组对小鼠干眼的治疗效果更为明显。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (22)
1.一种抑制NFKBIZ基因表达的药物组合物，其特征在于，包括抑制NFKBIZ基因表达的核酸分子和靶向眼部组织特异性蛋白的靶向配体分子。
2.根据权利要求1所述药物组合物，其特征在于，所述核酸分子是由正义链和反义链组成的双链核酸分子；
所述核酸分子包括以下至少一种核苷酸序列：
A.所述核酸分子的正义链选自以下至少一种编号的核苷酸序列：SEQ ID NO：1～SEQID NO：18、SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51～SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93～SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113～SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134～SEQ ID NO：135、SEQID NO：138、SEQ ID NO：143～SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154～SEQ ID NO：161、SEQ IDNO：169～SEQ ID NO：185和SEQ ID NO：421；
所述核酸分子的反义链选自以下至少一种编号的核苷酸序列：SEQ ID NO：211～SEQID NO：228、SEQ ID NO：235～SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：261～SEQ ID NO：299、SEQ IDNO：303～SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：323～SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：344～SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：353～SEQ ID NO：362、SEQ ID NO：364～SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：379～SEQ ID NO：395和SEQ ID NO：422；
B.在A项的核苷酸序列基础上序列连续或不连续增加、删减或替换2～3个碱基，且具有靶向NFKBIZ基因发挥抑制作用的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述药物组合物，其特征在于，所述核酸分子的正义链或反义链的末端还设置有悬挂单链。
4.根据权利要求3所述药物组合物，其特征在于，所述悬挂单链的长度为1～3nt。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述药物组合物，其特征在于，所述核酸分子包含以下任意一种或几种修饰核苷酸：脱氧-核苷酸、3'端脱氧-胸腺嘧啶核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、构象限制的核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基膦酸酯基的核苷酸、包含5'-磷酸酯的核苷酸和包含5'-磷酸酯模拟物的核苷酸。
6.根据权利要求1所述药物组合物，其特征在于，所述靶向配体分子包括靶向眼部组织特异性蛋白的核酸适配体、硼酸或其衍生物修饰的化合物、或苯硼酸或其衍生物修饰的化合物。
7.根据权利要求6所述药物组合物，其特征在于，所述眼部组织特异性蛋白包括以下至少一种：黏蛋白、整合素和CD44。
8.根据权利要求7所述药物组合物，其特征在于，所述黏蛋白包括以下至少一种：MUC-1、MUC-4和MUC-16；
所述整合素包括以下至少一种：αVβ1、αVβ3、αVβ6、α5β1、α6β1、αVβ1、αVβ5、α6β4和α1β1。
9.根据权利要求8所述药物组合物，其特征在于，靶向黏蛋白MUC-1核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：423所示；
靶向黏蛋白MUC-16核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：424所示；
靶向整合素αVβ3核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：425所示；
靶向CD44的核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：426所示。
10.根据权利要求1和6～9中任意一项所述药物组合物，其特征在于，所述核酸适配体还包括经稳定性增强修饰的核酸适配体；
所述稳定性增强修饰包括以下至少一种：硫代磷酸酯骨架修饰、2'-氧甲基修饰、2'-甲氧乙基修饰、2'-氟代修饰、反向胸苷修饰、脱氧胸苷核苷酸和聚乙二醇末端缀合。
11.根据权利要求6所述药物组合物，其特征在于，所述硼酸或其衍生物修饰的化合物或苯硼酸或其衍生物修饰的化合物为末端修饰硼酸或苯硼酸的线性或分枝状化合物；
所述线性或分枝状化合物上修饰的硼酸或其衍生物或者苯硼酸或其衍生物的修饰数量为1～40个。
12.根据权利要求11所述药物组合物，其特征在于，所述硼酸或其衍生物修饰的化合物或者苯硼酸或其衍生物修饰的化合物结构式如式1～式10中任意一种所示：
式1～式10中，A、G各自独立地为不存在、-(CH2)h-或-(CH2)h-中的任意一个或多个亚甲基被M基团所取代后的基团；所述h为0～15；所述M基团包括：-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-CH(TC)-、-C(T’)(T”)-、-NH-、-N(TN)-、-S-S-、-C(T’)＝C(T”)-、-C≡C-、和中的一种或几种；所述M基团中的TC、TN、T’、T”表示指定原子上的任何一个或多个氢原子被L基团所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物，所述指定原子包括碳原子或氮原子；所述L基团包括以下任意一种：C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氰基、羟基、羧基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基或卤素；所述卤素包括F、Cl、Br或I；所述A中(O)代表羰基氧原子；
D、E、H各自独立地为不存在、-O-、-S-、-C(O)-、-NH-、-CH2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-和 中的一种或几种；所述D、E、H基团中(O)代表羰基氧原子；所述表示所在结构式的连接位置；所述A、G、D、E、H不同时不存在；
K表示硼酸或其衍生物或者苯硼酸及其衍生物；m、n、t独立地为1～15。
13.根据权利要求6～12中任意一项所述药物组合物，其特征在于，所述靶向配体分子直接共价偶联于核酸分子的末端。
14.根据权利要求13所述药物组合物，其特征在于，当靶向配体分子为核酸适配体时，所述核酸适配体的磷酸基团与核酸分子的核糖进行共价偶联。
15.根据权利要求13所述药物组合物，其特征在于，当靶向配体分子为硼酸或其衍生物修饰的化合物或苯硼酸或其衍生物修饰的化合物时，所述靶向配体分子与核酸分子末端的磷酸基或碱基共价偶联；
当共价偶联于核酸分子末端的磷酸基时，所述靶向配体分子通过X基团进行偶联；所述X基团表示-O-或-S-。
16.根据权利要求6～12中任意一项所述药物组合物，其特征在于，所述靶向配体分子通过连接在所述核酸分子的末端的延伸序列与核酸分子进行共价偶联。
17.根据权利要求16所述药物组合物，其特征在于，所述延伸序列包括仅一端与核酸分子的末端连接的延伸序列和/或一端与核酸分子的一条链的3'端连接同时另一端与核酸分子的互补链的5'端连接或不连接的形式形成茎环结构的延伸序列。
18.根据权利要求17所述药物组合物，其特征在于，所述延伸序列的长度为1～40nt；所述延伸序列为随机核苷酸序列。
19.根据权利要求18所述药物组合物，其特征在于，当靶向配体分子为核酸适配体时，所述核酸适配体的磷酸基团与延伸序列的核糖进行共价偶联。
20.根据权利要求18所述药物组合物，其特征在于，当靶向配体分子为硼酸或其衍生物修饰的化合物或者苯硼酸或其衍生物修饰的化合物时，所述靶向配体分子与延伸序列上一个或两个以上的磷酸基或碱基共价偶联；
当共价偶联于延伸序列的磷酸基时，所述靶向配体分子通过X基团进行偶联；所述X基团表示O或S。
21.权利要求1～20中任意一项所述药物组合物在制备预防和/或治疗眼部疾病的药物中的应用。
22.根据权利要求21所述应用，其特征在于，所述眼部疾病包括以下一种或几种：干眼、角膜炎、结膜炎和睑缘炎。
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