CN118059058A

CN118059058A - 一种基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡及其在缺血缺氧性脑损伤中的应用

Info

Publication number: CN118059058A
Application number: CN202410256877.0A
Authority: CN
Inventors: 辛涛; 刘倩; 刘子豪; 夏茜; 王婵月; 许佳灿; 田康茜; 王志海; 李隆基; 李雨辰
Original assignee: First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University
Priority date: 2024-03-07
Filing date: 2024-03-07
Publication date: 2024-05-24

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡及其在缺血缺氧性脑损伤中的应用。具体的，本发明提供一种全新的TRCAM@RAPA@si EDN1纳米囊泡构建方法，显著增强了纳米囊泡通过血脑屏障、病灶归巢、靶向星形胶质细胞给药的能力。同时，本发明提出的雷帕霉素联合si EDN1药物治疗方案能特异性促进保护性自噬，减少内皮素分泌，改善神经血管单元，发挥神经保护作用，因此具有良好的实际应用价值。

Description

一种基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡及其在缺血缺氧性脑损伤中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡及其在缺血缺氧性脑损伤中的应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

缺血缺氧性脑损伤是由脑组织缺血缺氧导致的脑部病变，具有高死亡率和致残率。急性缺血性脑损伤的至今尚无完整统一的治疗方案，仍以支持疗法和对症处理为主。绝大多数药物难以实现对病灶的精准靶向和高效渗透，从而达到有效的生物利用度。因此，寻找有效的治疗策略，开发新的药物递送系统对改善疾病预后十分关键。

近年来，无机纳米材料、金属纳米材料和合成纳米材料等载药体系被广泛应用于颅内疾病。但总体来看，上述绝大多数载药体系均具有不同程度的生物毒性和免疫原性，难以实现体内，尤其是在新生儿体内的进一步应用及转化。从生物相容性和安全性出发，基于细胞膜组分和磷脂的纳米囊泡是针对缺血缺氧性脑损伤药物递送的理想载体。一方面来说，由于保留了细胞膜表面的“自我识别因子”，纳米囊泡实现了在血液及组织内的免疫逃逸和长循环效应。另一方面，磷脂结构的引入能显著提高药物的载药率和包封率，增强载药体系的整体稳定性。然而，纳米囊泡对于病灶难以实现精准靶向和高效渗透，构建方法仍需要进一步优化。

神经血管单元由星形胶质细胞以及提供氧气和营养的微血管组成。缺血缺氧性损伤后星形胶质细胞经历活化、肥大和胶质瘢痕形成等一系列变化，同时伴有自噬水平显著降低。近年来，越来越多证据表明，自噬在星形胶质细胞存活中发挥了重要作用，适当的自噬对缺血后神经血管单元具有保护作用。除此之外，受损的星形胶质细胞能够产生内皮素等分泌因子，并进一步破坏神经血管单元，加剧炎症浸润和细胞凋亡。因此，通过诱导保护性自噬以改善神经血管单元功能，对于缺血缺氧损伤的治疗尤为关键。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡及其在缺血缺氧性脑损伤中的应用。本发明通过研究证明，本发明制备得到的TK-RVG29@CXCR3⁺Astrocyte Membrane@Rapamycin@si EDN1(TRCAM@RAPA@si EDN1)纳米囊泡能够诱导保护性自噬，保护缺血缺氧损伤后的星形胶质细胞，促进神经血管单元修复，改善缺血缺氧性脑损伤的预后。基于上述研究成果，从而完成本发明。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡，所述星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡由纳米囊泡与星形胶质细胞膜融合获得；

其中，所述纳米囊泡至少负载有穿膜肽、自噬激活剂以及EDN1抑制剂；

所述星形胶质细胞膜过表达CXCR3蛋白。

本发明的第二个方面，提供上述基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡的制备方法，所述制备方法包括：

S1、对星形胶质细胞进行膜表面工程化改造，使之过表达CXCR3，随后提取星形胶质细胞膜；

S2、制备至少负载有穿膜肽、自噬激活剂以及EDN1抑制剂的纳米囊泡；

S3、将步骤S1的星形胶质细胞膜与步骤S2的纳米囊泡混合自融合即得。

其中，步骤S1与S2无先后顺序之分。

本发明的第三个方面，提供上述基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡在制备缺血缺氧性脑损伤药物中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种药物，所述药物至少包含上述基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡。

本发明的第五个方面，提供一种治疗缺血缺氧性脑损伤的方法，所述方法包括：向受试者施用上述基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡或上述药物。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案提供提出了全新的TRCAM@RAPA@si EDN1纳米囊泡构建方法，显著增强了纳米囊泡通过血脑屏障、病灶归巢、靶向星形胶质细胞给药的能力。同时，本发明提出的雷帕霉素联合si EDN1药物治疗方案能特异性促进保护性自噬，减少内皮素分泌，改善神经血管单元，发挥神经保护作用，因此具有良好的实际应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本实施例中TRCAM@RAPA@si EDN1纳米囊泡的材料学表征。(A)考马斯亮蓝染色鉴定CXCR3的转染，其中M代表细胞膜提取蛋白，C代表细胞浆提取蛋白。(B)流式细胞术检测纳米囊泡上膜蛋白CD47的表达。(C)TEM透射电镜下纳米囊泡的形态，标尺＝100nm。(D)纳米囊泡的粒径。(E)纳米囊泡的Zeta电位。(F)荧光光谱扫描检测纳米囊泡表面GFP融合蛋白的表达情况。

图2为本实施例中TRCAM@RAPA@si EDN1纳米囊泡的释放与摄取检测检测。(A)纳米囊泡在H₂O₂中的药物释放。(B)纳米囊泡在PBS中的药物释放。(C)纳米囊泡对体内器官的靶向性。其中左上为脑，左中为肝，左下为脾，右上为心，右中为肺，右下为肾。(D)纳米囊泡与星形胶质细胞的免疫荧光染色。其中蓝色荧光为DAPI核染料，绿色荧光为GFAP，红色荧光为Cy5.5，标尺＝20μm。

图3为本实施例TRCAM@RAPA@si EDN1纳米囊泡对缺血缺氧后星形胶质细胞的治疗效果。(A)CCK-8实验检测星形胶质细胞的活性。(B)EdU实验检测星形胶质细胞的增殖能力，标尺＝20μm。(C)Annexin V-PI检测星形胶质细胞的凋亡情况。(D)染色质损伤指标H2AX的免疫荧光染色。其中蓝色荧光为DAPI核染料，绿色荧光为H2AX，标尺＝20μm。

图4为本实施例中TRCAM@RAPA@si EDN1纳米囊泡在保护性自噬中的作用。(A)检测纳米囊泡处理后星形胶质细胞的ROS水平，标尺＝20μm。(B)检测纳米囊泡处理后星形胶质细胞的自噬流水平，标尺＝5μm。(C)Western Blot实验检测p62、LC3B的蛋白表达水平。(D)透射电镜检测自噬小体的产生，标尺＝1μm。

图5为本实施例中TRCAM@RAPA@si EDN1纳米囊泡对小鼠神经血管单元的作用。(A)透射电镜检测血脑屏障内皮细胞的完整性，上标尺＝1μm，下标尺＝200nm。(B)共培养后检测内皮细胞的跨膜电阻水平。其中棕色为NC组，紫色为OGD+TRCAM@RAPA@si EDN1组，绿色为OGD组。(C)多普勒成像系统检测小鼠颅脑血流情况。其中红色折线为健侧血流通量，蓝色折线为患侧血流通量。(D)小鼠行为学检测。(E)小鼠的体重变化。其中棕色为Sham组，紫色为HIE+TRCAM@RAPA@si EDN1组，绿色为HIE组。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡，所述星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡由纳米囊泡与星形胶质细胞膜融合获得；

所述星形胶质细胞膜过表达CXCR3蛋白。

进一步的，所述纳米囊泡为脂质体结构，所述脂质体的磷脂分子层中包含TK键，其能够在ROS作用下断裂，实现包载药物的ROS响应性释放。

所述穿膜肽可以为嗜神经狂犬病病毒衍生多肽RVG29，其能够增强纳米囊泡的血脑屏障穿透性。

其中，所述自噬激活剂可以为雷帕霉素(Rapamycin)，其能够促进保护性自噬发生，减少星形胶质细胞凋亡。

所述EDN1抑制剂可以为EDN1小干扰RNA(si EDN1)，其能够抑制EDN1基因的转录，减少内皮素的分泌，改善神经血管单元。

本发明的又一具体实施方式中，所述si EDN1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

所述星形胶质细胞膜能够实现同型靶向，实现纳米囊泡向受损星形胶质细胞的药物递送。

本发明的又一具体实施方式中，所述纳米囊泡与星形胶质细胞膜的质量比为1:0.5-5，优选为1:1。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡的制备方法，所述制备方法包括：

其中，步骤S1与S2无先后顺序之分。

所述步骤S1的具体方法包括：构建过表达CXCR3的质粒载体，将其包装成慢病毒后，转染至星形胶质细胞，筛选获得过表达CXCR3的星形胶质细胞。

所述步骤S2中，所述纳米囊泡采用如下方法制得：将氢化大豆磷脂胆碱、RVG包被的DSPE-TK-PEG、胆固醇和雷帕霉素溶于氯仿中，将合成的脂质与含有si EDN1的水混合后形成乳液，随后进行超声处理；蒸发消除氯仿溶剂，超声和挤压处理形成纳米囊泡。

本发明的又一具体实施方式中，所述氢化大豆磷脂胆碱、RVG包被的DSPE-TK-PEG、胆固醇和雷帕霉素的质量比为2-8：0.5-2：1-5：0.5-2，优选为5：1：2：1；

所述氢化大豆磷脂胆碱与si EDN1的比为0.5-2：5-50(mg/OD)，优选为1.5：20。

所述步骤S3中，所述星形胶质细胞膜与纳米囊泡的质量比为1:0.5-5，优选为1:1。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡在制备缺血缺氧性脑损伤药物中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物，所述药物至少包含上述基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料。所述药学上可接受的载体或辅料选自填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、渗透压调节剂或表面活性剂中的一种或几种。

所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。

特别地，本发明所述药物适用于缺血缺氧性脑损伤患者。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗缺血缺氧性脑损伤的方法，所述方法包括：向受试者施用上述基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡或上述药物。

其中，所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。具体的，所述受试者为缺血缺氧性脑损伤患者。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。实施例中使用的si EDN1其正义链：GCGUUCCUUGAAAGACUUA(SEQ ID NO.1)；反义链：UAAGUCUUUCAAGGAACGC(SEQ ID NO.2)。

实施例

1.细胞培养

小鼠星形胶质细胞系C8-D1A和脑血管内皮细胞系bEnd.3来源于普诺赛(中国武汉)，在含有10％胎牛血清(美国Gibco公司)、100Units/mL青霉素和100μg/mL链霉素(美国BI公司)的DMEM培养基(中国中科迈晨公司)中单层培养。细胞计数使用自动细胞计数仪IC1000，并在37℃、5％ CO₂的湿润培养箱中孵育。

为模拟氧糖剥夺模型(OGD)，细胞在37℃下以1％ O₂、5％ CO₂和94％ N₂的低氧条件下使用无糖培养基孵育4小时。随后，使用上述正常的含糖DMEM培养基，将细胞在正常气体条件下恢复12小时。对照组则未接受缺氧缺糖处理。

2.对C8-D1A细胞进行膜表面工程化改造

构建过表达CXCR3的质粒载体(中国科研云公司)。将2ul大肠杆菌及3ml LB培养基摇菌过夜，PCR扩增目的片段CXCR3(NCBI：NM_009910)。150V25分钟点样跑胶后，在紫外灯下切胶并做胶回收(TaKaRa公司DNA纯化回收试剂盒)。验证回收产物后，进行目的片段、载体酶切(37℃酶切过夜)和连接。冰上放置20分钟，42℃90秒热激感受态细胞，加入无抗性LB培养基，180rpm37℃摇床摇45分钟后，将上述转化后的菌涂至抗生素抗性筛选平板上，37℃培养过夜。挑取5个单克隆菌群，摇菌、提取质粒后进行酶切鉴定和测序验证。质粒载体包含pLV3-CMV-MCS-3xFlag-(CopGFP)-Puro。为减少GFP对荧光指标检测的影响，含有GFP的质粒仅用作阳性对照和验证星形胶质细胞膜与脂质囊融合的有效性。将质粒包装慢病毒后，使用10μg/ml聚凝胺(美国Sigma公司)转染剂向C8-D1A细胞转染慢病毒，并使用5μg/ml嘌呤霉素(法国InvivoGen公司)进行筛选稳定株。

3.构建TRCAM@RAPA@si EDN1纳米囊泡

总体来说，纳米囊泡使用改进后的Bangham方法(薄膜重水化法)制备。将1.5毫克HSPC(氢化大豆磷脂胆碱)、0.3毫克RVG包被的DSPE-TK-PEG(西安瑞禧生物公司)、0.6毫克胆固醇和0.3毫克雷帕霉素(比例5：1：2：1)溶解在3毫升氯仿中。将合成的脂质与含有20ODsi EDN1的去离子水混合后形成乳液，随后进行2分钟超声处理。接着，连续旋转蒸发20分钟以消除氯仿溶剂。使用孔径为100纳米的聚碳酸酯膜进行超声和挤压处理形成纳米囊泡。使用膜蛋白提取试剂盒(中国碧云天公司)提取星形胶质细胞膜。然后，将3mg脂质体与3mg星形胶质细胞膜混合，并在冰浴中超声处理2分钟，自融合形成TRCAM@RAPA@si EDN1纳米囊泡。

4.TRCAM@RAPA@si EDN1纳米颗粒的特性分析

纳米囊泡的大小和电位通过NanoBrook 90plus PALS(美国Brookhaven公司)测定，形态特征分析使用TF20透射电子显微镜(美国FEI公司)完成。利用生物发光成像系统(美国PerkinElmer公司)检测纳米颗粒的体外释放和生物分布。

5.流式细胞术

为评估细胞凋亡，我们使用了诺唯赞公司的Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒。将C8-D1A细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度种植在6孔板中。在进行不同处理后，用0.25％无EDTA胰蛋白酶消化细胞，并用4℃的PBS洗涤。随后，细胞在室温下暗处孵育10分钟，用Annexin V-FITC和PI染色。对每组样品进行分析，利用Cytoflex S流式细胞仪(美国Beckman公司)测定FITC/PI的染色比率和凋亡水平。

对纳米颗粒进行膜表面蛋白CD47的免疫荧光染色(美国Invitrogen公司)，在4℃孵育30分钟。然后用PBS含1％ BSA洗涤并重悬纳米颗粒。利用流式细胞仪检测荧光强度。

6.跨内皮电阻(TEER)

为了构建离体血脑屏障模型，我们进行了小鼠脑微血管内皮细胞和星形细胞的共培养。提前将1×10⁴个C8-D1A细胞种植在24孔Transwell小室的下层过夜，随后在纤维连接蛋白预包被的小室上层种1.5×10⁵个bEnd.3细胞。使用ECIS TEER24系统(美国AppliedBiophysics公司)在不同时刻检测测量BBB的屏障完整性。

7.细胞活性/增殖能力检测

为评估细胞活力，我们使用了Cell Counting Kit-8(中国碧云天公司)。C8-D1A细胞以每孔1×10³个细胞的密度种植在96孔板中。在接受不同处理后，将培养基更换为含有10μL CCK-8溶液的100μL新鲜培养基。细胞随后在37℃孵育2小时，然后使用Infinite MNano分光光度计(瑞士Tecan公司)在450nm处测量吸光度值(OD)。

为了评估细胞增殖能力，我们采用了Cell-Light^TMEdU Apollo567 In VitroImaging Kit(中国锐博公司)。在接受不同处理后，细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度种植在96孔板中。进行EdU标记后的24小时，利用Olympus 1X71荧光显微镜观察并记录EdU阳性细胞的百分比。

8.ROS检测

使用ROS检测试剂盒(中国碧云天公司)检测细胞内的活性氧水平。将DCFH-DA探针与无血清DMEM以1:1000比例稀释至最终浓度10μmol/L。细胞用稀释后的DCFH-DA探针在37℃孵育20分钟。随后，用无血清DMEM洗涤细胞三次以去除未结合的探针。最终DCF的荧光强度在荧光显微镜下观察并记录。

9.免疫荧光

对于细胞样本，使用4％甲醛固定15分钟，随后用5％胎牛血清和0.5％ Triton孵育1小时进行封闭和通透；组织样本首先经过脱蜡、脱水、抗原修复等步骤，然后用5％胎牛血清和0.3％ Triton处理1小时。将稀释后的一抗加入样本中，并在4℃下孵育过夜。多次洗涤后，加入稀释后的荧光标记二抗，并在室温下孵育2小时。最后使用DAPI染液进行细胞核染色。免疫荧光的结果在荧光显微镜下观察并记录。

10.免疫蛋白印迹

使用RIPA裂解缓冲液(中国碧云天公司)与蛋白酶/磷酸酶抑制剂(美国Apexbio公司)(1:1000)来提取蛋白质。利用BCA蛋白定量试剂盒(中国诺唯赞公司)确定蛋白质浓度。在凝胶电泳中，将20-40μg的蛋白质与上样缓冲液(美国Epizyme公司)混合，并在7.5％-12.5％的SDS-PAGE凝胶上分离。然后将蛋白转移到PVDF膜(美国Millipore公司)，使用牛奶室温封闭2小时并充分洗涤后，加入稀释后的一抗于4℃下过夜孵育。充分洗涤后，加入稀释后的二抗在室温下孵育2小时。洗涤3次后使用超敏化学发光(ECL)试剂(中国科尤博公司)进行蛋白显影，并使用图像分析系统Tanon 4800(中国天能公司)对蛋白质进行可视化检测。

11.考马斯亮蓝染色

凝胶电泳后，将凝胶浸入足够量的考马斯亮蓝染色溶液(0.25％考马斯亮蓝R250，45％甲醇，10％乙酸)，在室温缓慢摇动4小时。然后，加入漂白溶液(25％甲醇，8％乙酸)覆盖凝胶，在室温条件下处理12小时，期间漂白溶液更换3次，直到蓝色背景基本完全去除。

12.动物实验

KM小鼠购自中国维通利华公司。缺血缺氧性脑损伤疾病模型根据改进后的Rice-Vannucci方法建立。具体而言，在出生后第7天对幼鼠使用2％异氟烷进行诱导麻醉并使用0.8％异氟烷进行维持麻醉。在解剖显微镜下使用8-0的外科丝线永久结扎右颈总动脉。动脉结扎后，将幼鼠放置在37℃的培养箱内恢复1小时。随后，将动物放置于缺氧室(8％ O₂+5％ CO₂+87％ N₂)中缺氧2小时。假手术动物仅接受麻醉和颈总动脉暴露。

13.梗死损伤评估

利用moorFLPI激光散斑成像系统(英国Axminster公司)检测局部脑血流。摄像机被放置在15厘米以上，幼鼠的头皮被切开以完全暴露颅骨和大脑。在血流灌注水平稳定后，记录60秒内的血流灌注变化水平。

14.行为学测试

将动物头朝下放置在45度倾斜的斜坡上，进行负趋地性分析。记录了其转过180度并爬上斜坡5厘米所需的时间。

将动物的前肢和面部放在悬崖边缘上，进行悬崖回避测试。记录了其转过180度并离开边缘爬行5厘米所花费的时间。

对于翻正反射测试，将幼鼠背朝向下方放置，记录其四只脚着地翻身所需的时间。

总共对每只动物进行3次的所有测试。如果幼鼠完成测试的时间超过60秒，或者从木斜坡/悬崖上掉落，则视为失败，不纳入统计数据。

15.统计学分析

数据显示为至少三次重复独立实验的平均值±SEM。GraphPad Prism 9用于生成图表并进行统计分析。统计学显著性设定为p值小于0.05(*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001)。

实验结果：

1.TRCAM@RAPA@si EDN1纳米囊泡的材料学表征

CXCR3蛋白表达在细胞膜上，能够与缺血微环境中的配体CXCL10结合，一方面驱动纳米囊泡对缺血缺氧损伤区域的归巢，另一方面可以减少趋化因子CXCL10对下游炎症的影响。考马斯亮蓝结果显示，转染慢病毒后，CXCR3蛋白在细胞膜上过表达，在细胞浆中没有明显表达(图1A)。提取星形胶质细胞膜成分并构建纳米囊泡后，流式细胞术结果显示，TRCAM表面含有CD47(特异性膜蛋白)，对照组脂质体没有检测出CD47的表达，证实星形胶质细胞膜与磷脂的成功杂交(图1B)。透射电镜结果显示，TRCAM具有规则圆形的囊泡形态(图1C)。粒径结果显示，与对照脂质体相比，TRCAM的尺寸大小略有减少(图1D)。Zeta电位结果显示，CXCR3星形胶质细胞膜和TK键、RVG肽的加载使脂质体的表面正电荷转变为负电荷(图1E)。荧光光谱的结果显示，带有GFP的星形胶质细胞膜载入后，TRCAM在507nm处的有明显的荧光波峰(图1F)。

2.TRCAM@RAPA@si EDN1纳米囊泡的释放与摄取

TK基团对于ROS的水平敏感，在高ROS水平下易于断裂并导致整体纳米囊泡的解构，实现内部药物释放。通过在TRCAM中装载Cy5.5荧光染料并与H₂O₂共培养，结果显示TRCAM的释放比普通脂质体更为迅速(图2A)。在PBS共培养中的结果显示，TRCAM与对照脂质体的释放并无显著差异(图2B)。小鼠尾静脉注射TRCAM@Cy5.5后，IVIS结果显示，星形胶质细胞膜的装载减少了肝对于纳米囊泡的清除，使其更多进入脑部；同时，CXCR3的过表达显著增强了纳米囊泡对于缺血灶的靶向能力(图2C)。体内免疫荧光结果显示，TSRCAM与星形胶质细胞存在共定位，证实了星形胶质细胞膜的同型靶向能力(图2D)。

3.TRCAM@RAPA@si EDN1对缺血缺氧后星形胶质细胞的治疗效果

CCK-8实验结果显示，缺血缺氧损伤(OGD)后，星形胶质细胞的活力受到显著抑制，TRCAM@RAPA@si EDN1一定程度上逆转了这一影响(图3A)。同时，EdU结果显示，纳米囊泡能够促进OGD后星形胶质细胞的增殖(图3B)。Annexin V-PI结果显示，OGD处理后细胞凋亡增加，纳米囊泡给药显著抑制了细胞的损伤和凋亡(图3C)。H2AX是DNA损伤的标志物，免疫荧光结果证实，TRCAM@RAPA@si EDN1能够改善OGD后星形胶质细胞的DNA损伤(图3D)。

4.TRCAM@RAPA@si EDN1在保护性自噬中的作用

针对活性氧的检测结果显示，OGD处理后，星形胶质细胞ROS水平增加，TRCAM@RAPA@si EDN1能够降低ROS的升高(图4A)。同时免疫荧光结果显示，纳米囊泡处理后星形胶质细胞的自噬体的产生显著增加，其中黄色斑点提示自噬的发生(图4B)。免疫蛋白印迹结果显示，OGD处理后，p62的表达水平明显升高，在TRCAM@RAPA@si EDN1组中，p62的水平降低，同时LC3B II/I的比值的增高也提示保护性自噬的增强(图4C)。透射电镜结果显示，OGD后细胞的内的自噬体(黑色箭头所指)数量明显减少，纳米囊泡治疗后自噬体数量显著增加(图4D)。

5.TRCAM@RAPA@si EDN1纳米囊泡对小鼠神经血管单元的作用

透射电镜结果显示，HIE组的内皮细胞内膜有明显损伤，Sham组和TRCAM@RAPA@siEDN1处理组的血脑屏障未观察到明显的破坏(图5A)。TEER实验结果显示，OGD刺激破坏了内皮细胞的紧密连接，跨膜电阻水平显著下降，纳米囊泡治疗在一定程度上逆转了OGD的影响(图5B)。多普勒血流成像的结果显示，HIE处理后，患侧脑血流的水平显著降低，TRCAM@RAPA@si EDN1促进血流灌注恢复(图5C)。行为学实验结果表明，与HIE组相比，治疗后小鼠在负趋地性、悬崖回避、翻正反射等测试中具有更好的表现(图5D)。同时，体重结果显示，治疗后小鼠体重增长明显改善(图5E)。

本发明未尽事宜为公知技术。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡，其特征在于，所述星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡由纳米囊泡与星形胶质细胞膜融合获得；

所述星形胶质细胞膜过表达CXCR3蛋白。

2.如权利要求1所述的复合纳米囊泡，其特征在于，所述纳米囊泡为脂质体结构，所述脂质体的磷脂分子层中包含TK键；

所述穿膜肽为嗜神经狂犬病病毒衍生多肽RVG29；

所述自噬激活剂为雷帕霉素；

所述EDN1抑制剂为si EDN1；进一步的，所述si EDN1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

3.如权利要求1所述的复合纳米囊泡，其特征在于，所述纳米囊泡与星形胶质细胞膜的质量比为1:0.5-5，进一步为1:1。

4.权利要求1-3任一项所述基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

S3、将步骤S1的星形胶质细胞膜与步骤S2的纳米囊泡混合自融合即得；

其中，步骤S1与S2无先后顺序之分。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的具体方法包括：构建过表达CXCR3的质粒载体，将其包装成慢病毒后，转染至星形胶质细胞，筛选获得过表达CXCR3的星形胶质细胞。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述纳米囊泡采用如下方法制得：将氢化大豆磷脂胆碱、RVG包被的DSPE-TK-PEG、胆固醇和雷帕霉素溶于氯仿中，将合成的脂质与含有si EDN1的水混合后形成乳液，随后进行超声处理；蒸发消除氯仿溶剂，超声和挤压处理形成纳米囊泡。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述氢化大豆磷脂胆碱、RVG包被的DSPE-TK-PEG、胆固醇和雷帕霉素的质量比为2-8：0.5-2：1-5：0.5-2，进一步为5：1：2：1；

所述氢化大豆磷脂胆碱与si EDN1的比为0.5-2：5-50(mg/OD)，进一步为1.5：20。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述星形胶质细胞膜与纳米囊泡的质量比为1:0.5-5，进一步为1:1。

9.权利要求1-4任一项所述基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡或权利要求5-8任一项所述制备方法制得的复合纳米囊泡在制备缺血缺氧性脑损伤药物中的应用。

10.一种药物，其特征在于，所述药物至少包含权利要求1-4任一项所述基于星形胶质细胞膜的复合纳米囊泡或权利要求5-8任一项所述制备方法制得的复合纳米囊泡。