KR101964124B1 - 히알유로니데이즈 포함 신규 재조합 엑소좀 및 그의 용도 - Google Patents

히알유로니데이즈 포함 신규 재조합 엑소좀 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알유로니데이즈 포함 재조합 엑소좀 및 그의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 막 표면에 히알유로니데이즈를 제시하는 재조합 엑소좀 및 그의 항암제로의 용도에 관한 것이다.

Description

히알유로니데이즈 포함 신규 재조합 엑소좀 및 그의 용도{A novel recombinant exosome containing hyaluronidase and use thereof}
본 발명은 신규 재조합 엑소좀 및 그의 용도에 관한 것으로서 보다 구체적으로는 표면에 히알유로니데이즈를 제시하는 신규 재조합 엑소좀 및 그의 용도에 관한 것이다.
암 치료를 위한 나노약물에 관한 그동안의 연구성과에도 불구하고, 약물전달에 사용되는 대부분의 나노입자는 종양조직을 깊숙히 침투하지 못하고 고형 종양의 혈관 주변에만 국한되기 때문에 그 치료 효능이 제한되어 왔다( Manzoor et al., Cancer Res. 2012, 72: 5566-5575, 2012; Jain and Stylianopoulos, Nat. Rev. Clin. Oncol. 7: 653-664, 2010; Minchinton and Tannock, Nat. Rev. Cancer 6: 583-592, 2006). 종양 내 나노입자 축적의 정도는 간질액 압력의 상승과 조밀하게 복잡한 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 때문에 심각하게 제한될 수 있다.
ECM은 주로 히알유론산(HA)와 글루코사미노글리칸(gluosaminoglycans) 겔 내에 포매된 조밀 콜라겐 네트워크로 구성되며(Toole, Nat. Rev. Cancer, 4(7): 528-539, 2004; Evanko et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 59(13): 1351-1365, 2007, 종양 미세환경에서 간질 내 압력의 형태로 강력한 물리적 및 유체역학적 장벽을 만들어낸다(Shepard, Front Oncol., 5: 192, 2015; Heldin et al., Nat. Rev. Cancer 4(10): 806-813, 2004; Waite et al., Crit. Rev. Biomed. Eng., 40(1): 21-41, 2012).
종양 미세 환경 내에서의 ECM 파괴에 대한 치료전략(Whatcott et al., Cancer Discov. 1(4): 291-296, 2011; Tong and Kohane, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 56: 41-57, 2016.)은 PEG-PH20(PEGylated rHuPH20 효소, 재조합 인간 히알유로니데이즈 효소)을 포함하는 여러 임상시험을 진행하면서 임상적으로 빠르게 발전하고 있다(Thompson et al., Mol. Cancer Ther., 9(11): 3052-3064, 2011; Zhou et al., Nano Lett., 16(5): 3268-3277, 2016; Hingorani et al., Clin. Cancer Res., 2016, 22(12): 2848-2854, 2016). 또한 종양에서 효소 전달효율과 나노입자의 확산을 향상시키기 위해 고분자 나노입자에서 ECM 분해 효소의 다가제시(multivalent presentation) 전략이 개발된 바 있다(Villegas et al., ACS Appl. Mater. Interfaces. 7(43): 24075-24081; Goodman et al., Int. J. Nanomedicine, 2(2):265-274, 2007; Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(6): 2426-2431. 2011; Zhou et al., Theranostics 6(7): 1012-1022, 2016). 그러나 이러한 나노제형의 가능한 문제점은 효소 고정화를 위한 추가공정으로 인해 효소특성의 비가역적으로 변화될 수 있다는 것이다. 아울러, 막-결합 글리코실 포스파티딜이노시톨(GPI) 도메인이 결여된 절단된 PH20 형태를 갖는 화학적으로 변형된 합성 나노입자의 치료효능에 대한 염려가 여전히 남아있다(Rosengren et al., AAPS J. 17(5): 1144-1156, 2015; Arming et al., Eur. J. Biochem., 247(3): 810-814, 1997). 천연 PH20 hyaluronidase의 GPI 앵커링(anchorage)은 세포 표면에서 단백질의 이동성을 증가시켜 난보호막(egg vestment)로의 성공적인 침투를 위한 최대속도 및 난-정자 막융합을 가능케한다(Hunnicutt et al., Biol. Reprod., 54(6):1343-1349, 1996; Sauber et al., J. Androl., 18(2):151-158, 1997).
본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적인 PH20에 기반한 나노약물 및 이를 이용한 항암치료제 및 췌장세포에서의 인슐린 분비 촉진을 통한 당뇨병 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면 막에 재조합 히알유로니데이즈가 제시된 및 재조합 엑소좀(recombinant exosome)이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 막에 재조합 히알유로니데이즈가 제시되고 내부에 항암 화합물이 봉입된 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 막에 재조합 히알유로니데이즈가 제시된 재조합 엑소좀 및 항암 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀은 종약 조직 주변에 포진하여 면역세포 및 항암 화합물의 근접을 방해하는 세포외기질을 분해시킴으로써 유전자의 전달과 같은 복잡한 기전에 의하지 않고도 암세포를 선택적으로 제거할 수 있어, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1는 HEK293T 세포주로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 PH20 표면 제시 재조합 엑소좀(이하, 'Exo-PH20'로 약칭함)의 제조 및 특성을 나타낸 것으로서, 도 1a는 Exo-PH20에서의 PH20 및 엑소좀 마커로서의 Alix 및 Tsg101의 발현을 검출하기 위한 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타내고, 도 1b는 본 발명의 Exo-PH20의 PH20 발현을 정량하기 위해 표준으로 순차적으로 희석된 재조합 PH20(rHuPH20)을 사용한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타내며, 도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 Exo-PH20의 크기분포를 동적 광산란 분석(DLS)로 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 상기 Exo-PH20을 투과 전자현미경으로 촬영한 사진(그래프 내 우측)이고, 도 1d는 대조군 엑소좀(이하, 'Exo-Con'으로 약칭함)의 크기분포를 동적 광산란 분석(DLS)로 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 상기 Exo-PH20을 투과 전자현미경으로 촬영한 사진(그래프 내 우측)이며, 도 1e는 동일 질량으로 환산된 인간 재조합 PH20과 본 발명의 Exo-PH20의 효소활성을 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 PH20 표면 제시 및 독소루비신 내부 봉입 엑소좀(이하, 'Exo-PH20Dox')의 제조 및 특성을 나타낸 것으로서, 도 2a는 다양한 양의 독소루비신(시료당 반복회수 n=3)과 반응시킨 100 μg의 엑소좀의 독소루비신 적재량을 정량한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 2b는 Exo-PH20Dox를 투과 전자현미경으로 촬영한 결과를 나타내는 사진으로 좌측의 스케일바는 100 nm를 나타내고 우측에서 스케일바는 20 nm를 나타내며, 도 2c는 Exo-PH20Dox의 크기분포를 동적 광산란 분석(DLS)로 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 2d는 생리학적 환경(pH 7.4, -○-) 및 암 미세환경과 유사한 산성조건(pH 6.5, -▼-)에서의 시간의 경과에 따른 독소루비신 방출정도(%)를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 PH20 표면 제시 재조합 엑소좀(Exo-PH20)의 시험관내 조건에서의 항암활성을 분석한 결과를 나타내는 것으로서, 도 3a의 좌측은 다른 양의 Exo-PH20으로 30분 동안 처리한 후 종양 HA를 고갈 정도를 분석하기 위해 위상차 현미경으로 촬영한 결과로, PC3 세포(상단) 및 확대 된 이미지(하단)(스케일바: 50 μm(위쪽) 및 100 μm(아래))에서 PH20에 민감한 HA의 대표 이미지이고, 우측은 대조군 PC3 HA 영역 대비 실험군 PC3 HA 영역의 상대적 길이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 3b는 Exo-PH20으로 1시간 동안 처리한 종양 HA 고갈을 실시간으로 검출한 결과를 나타내는 위상차 현미경 촬영 이미지로 HA 고발현 PC3 암세포 주위의 HA(노란색 화살표)는 고정된 적혈구를 배제함으로써 검출되었다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 PH20 표면 제시 재조합 엑소좀(Exo-PH20)의 종양내 투여 후 생체내 조건에서의 항암활성을 분석한 결과를 나타내는 것으로서, 도 4a는 Exo-PH20(스케일바: 200 μm)을 투여한 PC3 종양 보유 동물에서 적출된 종양조직에 대한 면역 조직화학 결과를 촬영한 사진으로, Exo-PH20(5 mg/kg)의 종양내 투여 후 PC3 이종 이식편을 6, 12, 24, 48 및 96 시간 경과 후 회수하여 종양 박편에 대하여 항-PH20 항체(상단) 및 항-HABP 항체(하단)를 사용하여 염색한 결과이고, 도 4b는 대조군으로서 동일량의 Exo-Con을 종양내 투여한 후 PC3 이종 이식편을 6, 12, 24, 48 및 96 시간 경과 후 회수하여 종양 박편에 대하여 항-HABP 항체를 사용하여 HA에 대해 염색한 결과이며, 도 4c는 PC3 세포 보유 암 모델에 대하여 본 발명의 Exo-PH20 및 대조군으로서 Exo-Con 및 PBS를 각각 종양내 투여 후 시간의 경과에 따른 종양의 부피를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4d는 4T1 세포 보유 암 모델에 대하여 본 발명의 Exo-PH20 및 대조군으로서 Exo-Con 및 PBS를 각각 종양내 투여 후 시간의 경과에 따른 종양의 부피를 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 4e는 종양 절제술을 통해 PC3 보유 마우스 모델에서 실험 종점에서 적출된 종양의 무게를 나타낸 그래프이고, 도 4f는 4T1 종양 보유 마우스 모델에서 실험 종점에서 적출된 종양의 무게를 나타낸 그래프로서, 각 값은 평균ㅁSEM(ANOVA 분석에 의해 * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, 그룹당 마우스 수 n=5)을 나타내며, 도 4g는 Exo-Con과 Exo-PH20을 투여한 동물에서 종양이식 28일 경과 후 적출된 PC3 종양 박편을 항-HABP 항체를 이용하여 염색한 면역 조직화학 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 PH20 표면 제시 재조합 엑소좀(Exo-PH20)의 정맥주사 후 생체내 조건에서의 항암활성을 분석한 결과를 나타내는 것으로서, 도 5a는 PC3 종양세포를 보유한 BALB/c 누드 마우스에서 Exo-PH20 정맥내 투여에 따른 종양 성장을 기록한 그래프로, 각 값은 ANOVA에 의한 평균ㅁSEM(* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, 그룹당 마우스 수 n=5)으로 나타내었고, 도 5b는 종양 절제술을 통해 PC3 보유 마우스 모델에서 실험 종점에서 적출된 종양의 무게를 나타낸 그래프로, 각 값은 평균ㅁSEM(ANOVA 분석에 의해 * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, 그룹당 n=5 마리의 마우스)을 나타내며, 도 5c는 Exo-PH20이 PC3 종양의 미세혈관 영역에 미치는 영향을 나타낸 것으로. 좌측은 PBS(-●-), Exo-Con(-○-, 10 mg/kg) 및 Exo-PH20(-▼-, 10 mg/kg) 투여 후 시간 경과(t=0, 1, 3, 6 및 24 시간)에 따른 상대혈류(혈관화율, %)를 고해상도 초음파 영상에서 20 mm2 당 혈관분포를 이용하여 계산한 결과를 나타내는 그래프이고, 우측은 24시간 경과 후 혈류의 상태를 확인하기 위해 촬영한 초음파 영상이며, 도 5d는 세 그룹에서 시간의 경과(t=0, 1, 3, 6 및 24 시간)에 따라 촬영한 초음파 영상이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 PH20 표면 제시 재조합 엑소좀(Exo-PH20)의 전신투여 후 나노입자의 암조직으로의 침투 증가여부를 분석한 결과로서, Exo-PH20이 PC3 이종이식 모델에서 리포좀의 종양내 분포를 향상시킴을 보여주는 종양조직 박편에 대한 형광이미지로, 스케일바는 100 μm이며, PC3 종양 보유 마우스의 꼬리 정맥주사를 통해 10 mg/kg Exo-PH20을 투여한 후 3 시간 후에 cy5.5-표지된 리포좀(4 mg/kg)을 정맥내 주사하였고, 리포좀 주입 7시간 경과 후 종양조직을 적출하고 OCT 매질에 포매하여 냉동박편화한 후 형광현미경 하에서 분석 하였으며, Hoechst는 핵(파란색)을 염색하는데 사용하였고, 혈관은 항-CD31 항체(녹색)로 염색하였다.
도 7은 면역능력 모델 동물에서의 본 발명의 일 실시예에 따른 PH20 표면 제시 재조합 엑소좀(Exo-PH20)의 4T1 이종이식 모델 면역능력 마우스(BALB/c)에 전신투여 후 항암활성을 분석한 결과를 나타내는 것으로서, 도 7a는 Exo-PH20의 전신투여 후 시간의 경과에 따른 종양성장을 기록한 그래프로 각 값은 평균ㅁSEM(ANOVA 분석에 의해 * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, 그룹당 n=5 마리의 마우스)을 나타내고, 도 7b는 상기 도 7a의 실험종료 후 적출된 종양조직의 중량을 측정한 결과를 나타내는 그래프로 각 값은 평균ㅁSEM(ANOVA 분석에 의해 * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, 그룹당 마우스 수 n=5)을 나타내며, 도 7c는 4T1 종양의 동결박편에서 침윤된 CD8+ T 세포를 나타내는 면역 형광염색 이미지로 스케일바는 100 μm를 나타내고, 종양이식 25일 후, 절제된 종양표본을 항-마우스 CD8 항체로 염색하고 마우스 Alexa-Fluor-488 2차 항체(녹색)로 염색하였으며, Hoechst는 핵 (파란색)을 염색하는데 사용되었다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 PH20 표면 제시 및 독소루비신 내부봉입 엑소좀(Exo-PH20Dox)의 항암활성을 분석한 결과를 나타내는 것으로서, 도 8a는 음성대조군으로서 PBS(-●-), 유리 독소루비신(Free Dox, 1 mg/kg, -○-), PH20 표면 제시 엑소좀(Exo-PH20, 10 mg/kg, -▼-), 독소루비신 봉입 대조 엑소좀(Exo-ConDox, 10 mg/kg, 1 mg/kg dox dose에 상응함, -△-) 및 PH20 표면 제시 및 독소루비신 내부봉입 엑소좀(Exo-PH20Dox, 10 mg/kg, 1 mg/kg dox dose에 상응함, -■-)를 정맥투여한 PC3 보유 이종이식 종양모델 동물의 시간의 경과에 따른 종양성장을 나타낸 그래프이고, 도 8b는 상기 도 8a의 실험 종료 후 종양조직을 적출하여 종양조직의 중량을 측정한 결과를 나타내는 그래프로 도 8a 및 8b에서 데이터는 평균ㅁSEM(ANOVA 분석에 의해 (* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, 각 그룹당 마우스 수 n=5), 도 8c는 도 8b에서 적출된 각 실험군의 종양조직을 촬영한 사진이며, 도 8d는 3 mg/kg 독소루비신을 봉입한 엑소좀을 24 시간 처리한 후 종양조직에서 약물분포에 대한 PC3 종양조직 단면을 공초점 형광현미경으로 촬영한 사진으로(Scale bars: 50 μm) Hoechst는 핵(파란색)을 염색하는 사용되었고 혈관은 항-CD31 항체(녹색)로 염색하였으며, 도 8e는 본 발명의 일 실시예에 따른 PH20 표면 제시 및 독소루비신 내부 봉입 엑소좀의 병용처리 효과를 도식적으로 나타낸 개요도이다.
용어의 정의
본 문서에서 사용되는 용어 "엑소좀(exosome)"은 많은 어쩌면 혈액, 소변, 및 세포배양의 배양배지를 포함하는 모든 생물학적 액체에 존재할지 모르는 나노 크기의 세포-유래의 소포(vesicle)이다. 엑소좀이 크기는 30 및 100 nm 사이인 것으로 알려지고 있으며, 다소포체(multivesicular body)가 세포막과 융합할 때 세포로부터 분비되거나 세포막을 통해 직접 분비된다. 엑소좀은 응고, 세포간 신호전달, 및 대사폐기물의 관리와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "재조합 엑소좀(recombinant exosome)"은 인위적으로 생산된 엑소좀을 의미하며, 엑소좀을 생산할 수 있는 숙주세포(host cell)에 유전공학(genetic engineering)에 의해 외래 단백질을 암호화하는 유전자를 형질도입하여 형질전환 숙주세포를 제조한 후 상기 형질전환 숙주세포를 배양한 후 그로부터 수득된 엑소좀이다. 상기 재조합 엑소좀에는 형질도입된 외래 단백질이 내부 또는 엑소좀 막에 포함되어 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "히알유로니데이즈(hyaluronidase)"는 히알유론산(HA)의 분해를 촉매하는 효소를 의미한다. 칼 마이어(Karl Meyer)는 1971년 이 효소를 효소 반응 산물에 근거하여 세 가지 그룹으로 분류했다. 상기 세 가지 주요 유형은 두 종류의 진핵세포 엔도글루코시데이즈 가수분해 효소와 원핵세포 라이에으즈(lyase) 유형의 글루코시데이즈이다. 인간에는 HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, HYAL5의 다섯 가지 기능성 히알유로니데이즈와 1종의 의사유전자(pseudogene)인 HYAL6가 있는데 이중 HYAL5는 정자 부착 분자 1(SPAM1) 또는 PH20으로 알려져 있으며, 정자 표면단백질인 PH20은 글리코실 가수분해 효소 56족에 속하며 고환에서 발현된다. PH20은 히알유론산에서 N-아세틸-β-D-글루코사민과 D-글루쿠로네이트 잔기 사이의 (1→4) 결합을 무작위로 가수분해한다. SPAM-1/PH20은 정자-난자 부착에 관여한다. 수정시 정자는 먼저 투명대(zona pellucida)에 도달하기 전에 난자를 둘러싸는 난구세포 층을 관통해야 하는데, 난구세포는 배란 전에 형성되는 히알유론산을 함유하는 매트릭스에 싸여있다. PH20은 히알유론산을 소화시켜서 정자가 난구세포의 층을 관통하는 것을 지원한다.
본 문서에서 사용되는 "면역원성 세포사멸(immunogenic cell death)"은 안트라사이클린(anthracyclines) 계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 보르테조밉(bortezomib)과 같은 세포증식 억제제나 방사선 요법 및 광역학 치료법에 의해 야기되는 일종의 세포사멸을 의미한다. 상기 면역원성 세포사멸은 일반적인 세포사멸과 달리, 암세포의 면역학적 세포사멸은 수지상세포(dendritic cell)의 활성화와 그에 따른 특이적인 T 세포 반응의 활성화를 통해 효과적인 항암 면역반응을 유발할 수 있다. 면역원성 세포사멸을 유발하는 물질을 면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death inducer)라고 한다. 상기 면역원성 세포사멸 및 면역원성 세포사멸 유도제에 대하여는 Kroemer 등(Annu. Rev. Immunol., 31: 51-72, 2013)에 잘 정리되어 있다. 상기 문헌은 전체적으로 본 문서에 참조로 삽입된다.
본 문서에서 사용되는 "비-면역원성 세포사멸 유도제(non-immunogenic cell death inducer)"는 면역원성 세포사멸이 아닌 일반적인 세포사멸을 유도하는 물질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "안트라사이클린 계열 항암제(anthracyclin-type anticancer agent)"는 스트렙토마이세스 속 세균인 Streptomyces peucetius var. caesius 유래의 암 화학요법에 사용되는 세포주기 비특이적인 항암제 계열을 지칭한다. 안트라사이클린 계열 항암제는 백혈병, 림프종, 유방암, 위암, 자궁암, 난소암, 방광암, 및 폐암을 포함한 다양한 암의 치료에 사용되는데, 종래에 개발되어온 화학요법 항암제 중 가장 효과적인 항암제 중의 하나이다. 최초로 발견된 안트라사이클린계열 항암제로는 다우노루비신(daunorubicin)이 있고, 바로 이어 개발된 독소루비신(doxorubicin), 그 뒤로 개발된 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 발루비신(valrubicin) 등이 존재한다. 안트라사이클린 계열 항암제의 작용기전으로는 DNA/RNA 가닥의 염기상 사이에 삽입됨으로써 DNA 및 RNA 합성을 억제하여 신속히 성장하는 암세포의 복제를 방해하는 것, 토포아이소머레이즈 II 효소 활성을 억제하여 슈퍼코일화 DNA의 긴장완화를 억제하여 전사와 복제를 방해하는 것, 철-매개 유리 산소 라디컬의 형성을 통한 DNA, 단백질 및 세포막의 손상 유도 및 DNA 손상 반응, 에피게놈 및 전사체를 탈조절하는 크로마틴으로부터 히스톤 축출 유도 등이 거론되고 있다. 최근 연구에 따르면 독소루비신이 CD4+ 세포를 활성화시킴으로써 Th1 면역반응을 증가시킨다고 보고된 바 있고(Park et al., Int. Immunopharmacol. 9(13-14): 1530-1539, 2009), 수지상세포(dendritic cell)와 독소루비신의 병용투여시 골육종의 면역학적 세포사멸(immunogenic cell death)를 유발함으로써 항암활성을 나타낸다고 보고된 바 있다(Kawano et al., Oncol. Lett. 11:2169-2175, 2016).
본 문서에서 사용되는 용어 "탁산계열 항암제(taxanoid anticancer agent 또는 taxne anticancer drug)"는 주목속(Taxus sp.) 식물로부터 추출된 디테르페노이드 탁산 유도체(diterpenoid taxane derivatives)로, 세포내의 마이크로튜블의 조립을 증진시키고 해체를 저해하는 기전을 가진 유사분열 억제제이다. 현재 상용화된 약물로는 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel) 등이 존재하며, 이중 파클리탁셀은 Taxus brevifolia의 주피에서 추출한 탁산계열 항암제로 1992년 난치성 난소암 치료제로 미국 FDA의 승인을 받았고, 도세탁셀은 Taxus bacaata에서 유래된 탁산계열 항암제로서 파클리탁셀과 효능이 유사하며, 유방암, 비세포폐암, 림프종, 방광암 등의 치료에 사용되고 있으며, 파클리탁셀에 비해 친수성이 높은 특성을 가지고 있다. 최근에는 탁산계열 항암제 역시 암세포를 세포독성 T 림프구에 대하여 감작시킴으로써 이들 암세포의 면역원성 세포사멸을 촉진시키는 기전을 갖는 것으로 밝혀지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "면역 검문소 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 T 림프구와 같은 특정 유형의 면역계 세포 및 일부 암세포에 의해 생산된 특정 단백질을 차단하는 유형의 약물을 의미하는데 이들 단백질들은 면역반응을 억제하고, T 림프구가 암세포를 살상하는 것을 방지한다. 따라서 이러한 단백질이 차단되면 면역계의 "제동장치"가 풀어지고 T 림프구가 암세포를 더 잘 죽일 수 있다. 상기 "면역 검문소"로 현재까지 잘 알려진 것은 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2 등이 존재한다. PD-1 저해제로는 Pembrolizumab(상표명: Keytruda), Nivolumab(상표명: Opdivo) 등이 존재하고, PD-1의 리간드인 PD-L1 저해제로는 Atezolizumab(상표명: Tecentriq), 및 Avelumab(상표명: Bavencio) 등이 존재한다. 한편 CTLA-4/B7-1/B7-2의 상호작용을 저해하는 CTLA-4 저해제로는 Ipilimumab(상표명: Yervoy) 등이 FDA의 승인을 받은 바 있다. 최근 몇 년 동안 특히 전이성 흑색종(metastatic melanoma) 또는 호지킨 림프종(hodgkin lymphoma) 환자에게서 인상적인 성공을 거두었으며 다른 유형의 암 환자를 대상으로 한 임상시험에서 많은 가능성을 보여주고 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 관점에 따르면 막에 재조합 히알유로니데이즈가 제시된 및 재조합 엑소좀(recombinant exosome)이 제공된다.
상기 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 히알유로니데이즈는 GPI-앵커링된 형태의 막결합 히알유로니데이즈일 수 있고, 상기 GPI-앵커링된 형태의 막결합 히알유로니데이즈는 전장 PH20일 수 있으며, 상기 PH20은 서열번호 1 내지 30으로 기재되는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 상기 서열번호 1 내지 30에 기재된 아미노산 서열은 표 1에 기재된 바와 같이, 인간 PH20의 36-490 a.a에 상응하며 상동성이 적어도 85% 이상인 타종 유래의 PH20 또는 그로 예측이 되는 단백질이다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 막에 재조합 히알유로니데이즈가 제시되고 내부에 항암 화합물이 봉입된 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 막에 재조합 히알유로니데이즈가 제시된 재조합 엑소좀 및 항암 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 항암제는 면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death agent), 면역 검문소 억제제(immune checkpoint inhibitor), 유사분열 억제제, 대사길항제(antimetabolite), 호르몬제, 알킬화제(alkylating agent) 또는 토포이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitors)일 수 있다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 면역원성 세포사멸 유도제는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(Bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 또는 옥살리플라틴일 수 있고 강심성 배당체(cardiac glycoside)는 비-면역원성 세포사멸 유도제와 조합되어 사용될 수 있으며 상기 GADD34/PP1 저해제는 마토마이신(mitomycin)과 조합되어 사용될 수 있으며, 상기 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 또는 발루비신(valrubicin)일 수 있고, 상기 탁산계열 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)일 수 있으며, 상기 면역원성 세포사멸 유도제는 상기 면역 검문소 억제제와 조합되어 사용될 수 있다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 면역검문소 억제제는 PD-1/PDL1 상호작용 저해제 또는 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 저해제일 수 있고, 상기 D-1/PDL1 상호작용 저해제는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)일 수 있으며, 상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 저해제는 이필리무맙(Ipilimumab)일 수 있다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 알킬화제는 사이크로포스마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 클로람부실(chlorambucil), 펠팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine, BCNU), 로무스틴(lomustine, CCNU), 이포스파마이드(ifosfamide), 프로가르바진(procarbazine), 다카르바진(dacarbazine, DTIC), 테모졸로마이드(temozolomide), 알트레타민(altretamine), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin) 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin)일 수 있다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 토포이소머라제 억제제는 토포테칸(topotecan) 또는 이리노테칸(irinotecan, CPT II)일 수 있고, 상기 대사길항제는 디옥시코포르마이신(deoxycoformycin), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 아자티오프린(azathioprine), 2-클로로디옥시아데노신(2-chlorodeoxyadenosine), 하이드록시유레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 카페시타빈(capecitabine), 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside), 아자사이티딘(azacytidine), 젬시타빈(gemcitabine), 플루다라빈 포스페이트(fludarabine phosphate), 아스파라기네이즈(asparaginase) 또는 페메트렉스드(pemetrexed)일 수 있다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 유사분열억제제는 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에스트라무스틴 포스페이트(estramustine phosphate) 또는 NAB-paclitaxel일 수 있다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 호르몬제는 타목시펜(tamoxifen), 아로마테이즈(aromatase) 저해제, 류프롤라이드(leuprolide), 비칼루타마이드(bicalutamide), 플루타마이드(flutamide), 닐루타마이드(nilutamide) 또는 옥트레오타이드(octreotide)일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 비경구를 위한 제형인 것이 바람직하다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주사, 비강내 흡입, 근육내 투여, 복강내 투여, 경피흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 유효물질과 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
사용 가능한 포유동물 유래 PH20
서열번호 종 NCBI or GenBank No. 아미노산 위치 서열번호 1과의 상동성
1 Homo sapiens NP_001167515.1 36-490 -
2 Homo sapiens AAC60607.2 36-490 99%
3 Pan troglodytes XP_003318802.2 36-490 99%
4 Pan paniscus XP_003815501 36-490 99%
5 Gorilla gorilla XP_018886147.1 36-490 98%
6 Pan troglodytes BAK62198.1 36-490 98%
7 Gorilla gorilla XP_004046192.1 36-490 98%
8 Pongo abelii XP_003777169.1 36-490 97%
9 Pongo abelii XP_002818442.1 36-490 97%
10 Hylobates lar ACV60218.1 36-490 97%
11 Symphalangus syndactylus AEH95769.1 36-490 97%
12 Nomascus leucogenys XP_003261317.1 36-490 96%
13 Nomascus leucogenys XP_003261319.1 36-490 96%
14 Nasalis larvatus AEX20364.1 36-491 93%
15 Colobus angolensis XP_01187134.1 36-491 93%
16 Colobus guereza AEX20365.1 36-491 93%
17 Semnopithecus entellus ACV60223.1 36-491 92%
18 Colobus angolensis XP_011807133.1 36-491 93%
19 Pygathrix nemaeus ACV60224.1 36-491 92%
20 Rhinopithecus roxellana XP_010366292.1 36-491 92%
21 Saguinus oedipus AEX20362.1 36-491 89%
22 Cercopithecus mitis ACV60221.1 36-491 89%
23 Macaca nemestrina XP_011728213.1 36-491 89%
24 Aotus nancymaae XP_012329390.1 36-491 88%
25 Saguinus fuscicollis ACV60227.1 36-491 89%
26 Callimico goeldii ACV60225.1 36-491 89%
27 Erythrocebus patas ACV60222.1 36-491 90%
28 Chlorocebus aethiops AEX20366.1 36-491 90%
29 Papio hamadryas ACV60219.1 36-491 89%
30 Chlorocebus sabaeus XP_007980982.1 36-491 89%
절단된 재조합 히알유로니데이즈를 갖는 합성 나노제형의 한계를 감안할 때, 본 발명자들은 본질적으로 자연-유래의 나노입자인, 천연 GPI-앵커링된 PH20을 보유하는 엑소좀을 개발하였다. 엑소좀은 작은 RNAs, 지질 및 단백질을 포함하는 대부분의 세포유형에 의해 방출되는 나노크기의 세포외 소포로서, 현재 이용 가능한 합성 약물전달 수단에 비해 여러 가지 이점을 가질 수 있다. 이러한 장점은 자연장벽을 극복할 수 있는 능력, 고유한 세포 타겟팅 특성 및 향상된 투과성 및 유지(EPR) 효과 및 생체 적합성을 포함한다. 생물학적 정보를 전달하는 본래의 기능에 기초하여, 치료제로서의 엑소좀의 채용이 주목을 받고 있다. GPI 고정된 단백질은 그들의 생체내 형성과정에서 엑소좀 표면의 지질 뗏목에 풍부하게 존재한다는 것으로 알려져 있으며 결과적으로 엑소좀에 이러한 단백질을 표시하는 것은 비교적 간단하다. 따라서, 자연 유래의 엑소좀은 어떠한 화학변형 없이도 효소 나노입자 그 자체로서 작용할 것으로 기대된다.
본 발명자들은 자체적으로 종양병소에 침투하여 약물전달을 수행할 수 있는 새로운 엑소좀-기반 플랫폼을 설계했다. 재조합 PH20을 이용한 이전의 연구와 비교하여 본 발명자들은 먼저 암 치료에서 엑소좀 표면에 GPI-앵커링된 히알유로니데이즈의 높은 활성을 입증했다. 따라서, 본 발명은 막 관련 단백질을 제시하기 위한 엑소좀의 필요성에 대한 강력한 증거와 근거를 제공하였다. 본래의 GPI 고정 단백질을 가진 효소-기반의 약물전달 시스템은 의료 및 연구분야 모두에 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실험 방법
본 발명에 사용된 일반적인 실험방법은 하기와 같다:
세포배양: HEK293T 세포를 10% 우태아 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 성장시켰다. 인간 PC3 전립선암 세포 및 쥐의 4T1 유방암 세포를 10% 우태아 혈청 및 1% 항생제를 함유하는 RPMI 배지에서 유지시켰다. 모든 세포주는 37℃에서 5% CO2로 유지되었다.
면역블로팅(Immunoblotting): 총 단백질의 양은 BCA 분석키트에 의해 결정되었고, 동량(10 μg)의 엑소좀 단백질을 웨스턴 블랏 분석에 사용되었다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 1X TBST(Tris-buffered saline, 0.05 % tween20)에서 1시간 동안 5% 탈지 분유로 차단하였다. 상기 블롯을 밤새 4℃에서 1차 항체(항-PH20 항체, 1:500, Abcam, ab196596; 항-Alix 항체, 1:1000, Santacruz, sc99010; 또는 항-Tsg101 항체, 1:500, Santacruz, sc22774)와 반응시켰다. 이어서, 막을 HRP-접합 항-마우스 또는 -토끼 이차항체(Sigma-Aldrich)와 반응시키고, 결과를 화학발광(Bio-Rad)에 의해 시각화하였다. 엑소좀에 대한 PH20의 정량분석을 위해 재조합 PH20을 대조군으로 넣고 image-J 소프트웨어를 사용하여 밴드 부피를 분석했다.
유세포 계측법: 엑소좀 막 표면상의 PH20의 발현을 확인하기 위해 10 μg의 정제된 엑소좀을 하룻밤 동안 20 ㎕ 알데하이드/설페이트 라텍스 비드(크기 4 μm, Invitrogen)과 최종 부피 1 mL의 PBS에서 결합시켰다. 비드상의 임의의 남아있는 자유 결합 부위는 1 M 글리신 완충액 110 ㎕를 30분 동안 첨가함으로써 차단시켰고, 이어서 혼합된 비드는 0.5% BSA/PBS를 사용하여 2회 세척시켰다. Exosome과 결합된 비즈를 1시간 동안 항-PH20 항체(1:200, Abcam, ab196596)와 접합시킨 다음, Alexa-488-표지 2차 항체(1:200, Jackson ImmunoResearch)와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 비드를 0.5% BSA/PBS로 2회 세척한 후, AccuriTM C6 유세포 계측기로 분석하였다.
동적 광산란 분석(DLS): 25°내지 173°의 고정각으로 Zetasizer nano Zs (Malvern Instruments, Malvern, Worcestershire, UK)를 사용하여 제조된 엑소좀의 크기 분포를 분석하였다. 데이터는 장비가 제공하는 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
투과 전자현미경 촬영(TEM): 엑소좀의 크기와 모양을 확인하기 위해 Formvar-carbon으로 코팅된 격자에 4% 포름알데히드로 고정된 10 μg의 엑소좀을 적재하였다. 세척 후, 샘플을 1 w/v%의 우라닐 아세테이트로 1분 동안 염색하였다. 격자를 건조시키고 투과 전자현미경(Tecnai TEM)으로 분석하였다.
효소활성 분석: Exo-PH20의 효소활성을 재조합 인간 PH20의 효소 활성과 비교하기 위해, 제조사(Sigma, USA)의 프로토콜을 이용하였다. 구체적으로, 희석된 효소 시료를 37℃에서 안정화시킨 후, 샘플을 즉시 히알유론산과 혼합하고 37℃에서 45분 동안 반응시켰다. 반응물을 산성 알부민 용액을 함유하는 큐벳으로 옮긴 후 실온에서 10분간 반응시켰다. 그런 다음 시료에서의 600 nm에서의 투과율(UV/vis spectrophotometer, Beckman)을 측정하였다. 제공된 프로토콜에 따라 효소활성을 계산하였다.
입자배제 분석(particle exclusion assay): 시험관 내에서 PC3 세포주의 HA 발현을 시각화하기 위해, 세포를 4-웰 챔버 또는 35 mm 공초점 접시에서 24시간 동안 배양한 다음 37℃에서 1 시간 동안 Exo-PH20을 함유하는 무-혈청 배양배지로 처리하였다. 이어서, 배지를 PBS 중의 1x109 세포/mL의 고정된 마우스 적혈구의 현탁액으로 대체하였다. 세포는 카메라 스캐너 및 영상 프로그램(Diagnostic Instruments, Inc.)과 결합된 위상차 현미경으로 영상화하였다. 길이(세포 당 평균 5 점)는 세포와 고정된 적혈구 사이의 각각의 거리에 의해 결정되었다. 값은 처리되지 않은 PC3 HA 영역(대조군, 100%로 표시)에 대한 상대 길이의 평균±SEM으로 계산하였다.
실시간 실험에서, PC3 세포를 고정된 마우스 적혈구와 함께 배양하고 Exo-PH20을 함유하는 무-혈청 배지로 교체하였다. 이미지는 실시간 세포 영상화 현미경(Biostation-IM, Nikon)에 의해 1시간 동안 5분마다 수득하였다.
마우스 모델에서 항-종양 효과 평가: 웅성 BALB/c nu/nu 마우스(6 주령)와 자성 BALB/c 마우스(7 주령)를 이용하였고, 한국과학기술연구원(KIST)의 시설에서 유지하였다. 본 연구 프로토콜은 KIST 기관 동물관리 및 사용위원회(IACUC)의 승인을 받았다.
BALB/c nu/nu 마우스의 왼쪽 뒷다리에 인간 PC3 전립선 암세포 1x107을 접종하였다. 쥐 4T1 유방암 세포 2x106개를 자성 BALB/c 마우스의 유방 지방패드에 정위적으로(orthotopically) 접종하였다. 종양 체적(mm3)은 (폭)2x(길이)x0.5로 계산되었다. 평균 크기가 75 mm3인 종양이 안정화된 후에, 각 피험체에 시험약물을 3일마다 5회 종양내 또는 정맥내로 주입하였고 종양 크기를 3일마다 측정하였다. 실험이 끝나면 종양을 절개하고 무게를 측정하였다.
생체 내에서 엑소좀의 효소활성을 분석하기 위해, PBS, Exo-Con(5 mg/kg) 및 Exo-PH20(5 mg/kg)을 PC3 보유 마우스의 종양 내 주입을 통해 투여하였다. 6, 12, 24, 48 및 96시간 후, 마우스를 희생시키고 종양조직을 적출하고 분석하였다.
리포좀-cy5.5의 분포: 웅성 BALB/c nu/nu 마우스에게 왼쪽 뒷다리에 인간 PC3 전립선암 세포 1x107개를 접종하였다. 평균 크기가 150 mm3인 종양에서 마우스에 각각 PBS, 10 mg/kg의 Exo-Con 및 10 mg/kg의 Exo-PH20을 정맥 주사하였다. 3시간 후, 4 mg/kg의 리포좀-cy5.5를 정맥 주사하였다. 7시간 후 마우스를 희생시키고 종양조직을 적출하여 리포좀-cy5.5의 분포 정도를 분석하였다.
면역 조직화학 염색: 종양조직을 절제하고, 밤새 10% 중성 포름알데히드로 고정하고 파라핀 봉입처리하였다. 파라핀 봉입된 조직을 박편화하고 항원 인출 후, 박편을 항-PH20 항체(1:200, Abcam, ab196596) 또는 항-HABP 항체(1:200, Abcam, ab181837)와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 박편을 실온에서 2시간 동안 2차 항체(1:200, GBI Labs, D43-18)와 함께 항온 반응시키고 30초 동안 대조 염색시켰다. 이미지는 광학현미경(BX 51, Olympus, USA)을 사용하여 수득하였다.
면역 형광 염색: 절제된 종양조직을 OCT 화합물에 삽입하고 동결시켰다. 조직 박편화 후(10 μm), 3% BSA/PBS로 1시간 차단한 후 anti-CD8 항체(1:200, BD Pharmingen, bd550181) 또는 항-CD31 항체(1:200, BD Pharmingen, bd553370) 4℃ 에서 하룻밤 동안 PBS로 10분 간격으로 세 번 세척하고 실온에서 1시간 동안 Alexa-488-접합 2차 항체(1:400, Jackson ImmunoResearch)와 배양하였다. 핵은 Dapi-Fluoromount-G로 염색하였다. 종양조직에서의 독소루비신에 의한 형광분포를 분석하기 위해, 동결된 종양 박편을 4℃에서 하룻밤 동안 항-CD31 항체(1:200, BD Pharmingen, bd553370)와 함께 항온 배양하였다. 세척 후, Alexa-488-접합 2차 항체(1:400, Jackson ImmunoResearch)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 핵은 Dapi-Fluoromount-G로 염색하였다. 조직 박편의 형광 신호는 Leica 형광현미경을 사용하여 각 실험군마다 별도로 수득하였다.
종양에서 Dox 형광 분포의 조영: 웅성 BALB/c nu/nu 마우스의 왼쪽 뒷다리에 인간 PC3 전립선암 세포 1x107개를 접종하였다. 평균 크기가 150 mm3인 종양에서 정맥주사를 통해 각각 PBS, Exo-ConDox 및 Exo-PH20Dox를 마우스에 투여하였다. 24시간 후, 마우스를 희생시키고 종양조직을 적출하고 분석하였다.
종양 혈류: 종양 혈류의 변화를 감지하기 위해 인간 PC3 전립선암을 보유한 마우스를 사용하였다. 이 초기 측정(t=0) 이후, 실험 동물에게 PBS, Exo-Con(10 mg/kg) 및 Exo-PH20(10 mg/kg)을 주사하였다. 이미지는 적절한 시점(t=1, 3, 6 및 24 시간)에서 얻어졌다. Vevo 770 고분해능 초음파(Vevo 770, Visual Sonics Inc)를 사용하여 종양 혈류의 변화를 측정하였다.
실시예 1: 엑소좀의 제조
HEK293T 세포를 150 mm 접시당 6x106의 농도로 파종하였다. 글루타맥스(최종 농도 1%, Gibco)가 보충된 새로운 무-혈청 DMEM 배지로 배지를 교환한 후, HEK293T 세포를 lipofectamine 3000(Invitrogen)을 사용하여 GPI 앵커 부착부위를 포함하는 전장 PH20(36-490 a.a, 서열번호 1)을 암호화하는 유전자가 포함된 플라스미드(pCMV6-rHuPH20) 18 μg으로 형질감염시켰다. 잔해물 및 미세소낭(microvesicle)을 제거하기 위해 상등액을 수확하고 상이한 RCF로 원심분리하였다. 간략히, 상등액을 먼저 300 g에서 10분 동안 원심분리하고, 이어서 2,000 g에서 10분간, 마지막으로 10,000 g에서 30분간 원심분리하였다. 마지막으로, 0.22 μm 필터를 통한 여과 후, 엑소좀 함유 상등액을 45 Ti 로터(Beckman Instruments)에서 150,000 g으로 3시간 동안 초원심분리하였다. 엑소좀을 단백질 분해효소 억제제(Roche)가 포함된 PBS에 재현탁하고 4℃에서 보관하였다. PH20 유전자로 형질감염되지 않은 세포로부터 엑소좀을 수득하여 대조군으로는 사용하였다.
정제된 Exo-PH20은 엑소좀 마커 단백질(Alix와 Tsg101)을 함유하고 있으며 막 표면에 PH20도 포함하고 있다(도 1a 및 도 1b). Exo-PH20 및 대조군 엑소좀(Exo-con)의 투과 전자현미경(TEM) 이미지와 동적 광산란(DLS) 분석 결과, 이들 엑소좀 모두 100 nm의 평균 크기를 갖는 완전한 원형을 가짐을 나타내, 형태상 이들 두 엑소좀이 차이가 없음을 알 수 있었다(그림 1c 및 그림 1d).
정량적 웨스턴 블럿팅을 위한 표준으로 순차적으로 희석된 농도의 재조합 인간 PH20(rHuPH20)를 사용하여, 엑소좀 내의 PH20 단백질 농도는 1검정곡선을 이용하여 계산하였으며, 엑소좀 mg 당 5.3 μg으로 확인되었다(도 1b). PH20 히알유로니데이즈 활성은 탁도분석에 의해 정량화되었으며, 엑소좀 1 mg 당 1,954 U(엑소좀 PH20 mg 당 > 360,000 U)인 것으로 확인되었다. 이는 대조군(rHuPH20 110,000 U/mg)에 비해 3배 증가한 것이다(도 1e 및 표 1). 상기 결과를 통해 엑소좀의 지질 뗏목 도메인에 존재할 것으로 예상되는 GPI 고정 PH20은 절단된 형태보다 높은 효소 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 엑소좀 막의 지질 뗏목(lipid raft) 상에 존재하는 GPI 앵커링된 단백질의 측면 이동이 단백질의 활성을 증가시킨다는 것을 감안할 때, 마이크로 도메인-강화된(microdomain-enriched) 엑소좀은 막-결합된 단백질을 제시하기 위한 적절한 플랫폼이 될 수 있다.
재조합 인간 PH20 및 엑소좀 표면제시 PH20의 효소 활성 비교
PH20 활성
(U/mg)		 참고문헌
rHuPH20 110,000 Thompson et al., Mol. Cancer Ther. 9(11): 3052-3064, 2010
Zhou et al., Nano Lett., 9(9): 3268-3274, 2009
Exo-PH20 361,852
실시예 2: 독소루비신 적재 엑소좀의 제조
본 발명자들은 고형종양 치료에 광범위하게 사용되는 독소루비신(doxorubicin, Dox)과 같은 화학요법 약물이 동시에 PH20과 함께 전달되면 항-종양 효능이 강화 될 것이라는 가설을 세웠다. 독소루비신은 10.2±0.3%의 최종 적재량으로 간단한 인큐베이션 방법을 통해 엑소좀에 캡슐화되었다.
엑소좀에 독소루비신(Dox)를 봉입하기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 총 100 μg의 엑소좀을 독소루비신 하이드로클로라이드(50, 100, 200, 300 및 400 μg)와 4℃에서 밤새 혼합하였다. 미적재 약물은 air-fuge로 제거하고 약물이 적재된 엑소좀은 PBS 완충액으로 희석하였다. 약물의 적재량은 Dox(480 nm에서 여기 및 590 nm에서 방사)의 형광강도를 측정하여 결정하였다. 엑소좀에 약물을 넣은 후 부드럽게 혼합하고 37℃에서 PBS(pH 7.4) 또는 초산염 용액(pH 6.4)에 담갔다. 미리 정의된 시점(30 분, 1, 2, 3, 6 및 24 시간)에, 형광분석을 위해 완충액을 회수하고 새로운 완충액으로 대체하였다. 방출된 Dox의 양은 480 nm에서의 여기 및 590 nm에서의 방사로 형광분석에 의해 결정되었다. 그 결과 혼합 독소루비신 농도와 엑소좀 100 μg 당 적재된 약물량(μg)는 혼합된 독소루비신 농도에 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다(도 2a).
독소루비신을 봉입한 Exo-PH20(Exo-PH20Dox)의 TEM 및 DLS 분석은 Exo-PH20과 비교하여 크기와 모양면에서 큰 차이가 없음을 보여 주었고 약물 적재가 엑소좀의 물리적 특성을 변화시키지 않음을 확인하였다(도 2b 및 2c). 본 발명자들은 또한 생리 조건(pH 7.4)보다는 종양 미세환경과 같은 산성 pH(pH 6.4) 하에서 Exo-PH20Dox로부터의 독소루비신의 방출을 조사하였는데, 산성조건에서 독소루비신의 방출이 가속화됨을 확인하였다(도 2d).
실험예 1: PH20 표면 제시 엑소좀의 항암 활성
1-1: in vitro 분석
본 발명자들은 상기 PH20 표면 제시 엑소좀이 항암활성을 갖는지 확인하기 위해, 히알유론산(HA)-의존성 세포외 기질을 생성 할 수 있는 인간 전립선암 세포 PC3의 고갈에 대한 Exo-PH20 효소활성을 조사하였다. 구체적으로 시험관 내에서 HA 세포외 기질을 시각화하기 위해, 고정된 적혈구를 이용하여 상술한 바와 같이 입자 배제 분석을 수행하였다. PC3의 HA-high 세포외 기질은 Exo-PH20 처리 후 농도 의존적으로 고갈되었지만 대조 엑소좀(Exo-Con)에서는 그러한 효과가 나타나지 않았다(도 3a). PC3 세포를 이용한 시간경과 실험은 HA가 Exo-PH20 처리 후 60분 이내에 거의 감소함을 보여주었다(도 3b).
1-2: 종양내 투여 in vivo 분석
HA를 고갈시키는 Exo-PH20의 효소활성 또한 PC3(HA-high)-보유 이종 정위이식 마우스 모델에서 평가하였다. Exo-PH20(PH20 단백질: 26.5 μg/kg, 엑소좀: 5 mg/kg)의 단일 종양내 투여시 투여 후 6시간 이내에 종양 ECM에서 HA가 효과적으로 제거되었다(도 4a 및 4b). Exo-PH20-매개 HA 고갈은 HA의 점진적 재구축과 함께 48 시간 이상 동안 유지되었다.
한편, Exo-PH20-매개 ECM 리모델링이 생체 내 종양성장의 저해와 관련될 수 있으므로, 본 발명자들은 PC3 이종이식 또는 4T1(HA high) 정위 정성 마우스 모델을 사용하여 Exo-PH20의 항-종양 활성을 평가하였다. 엑소좀을 3 일마다 마우스에 종양 내 주사하여 총 5회 주사로 HA 재합성 및 순환을 상쇄시켰다. Exo-PH20 처리에 의해 종양성장을 둔화된 반면, 대조군 엑소좀(Exo-Con)의 처리시에는 실질적인 억제가 관찰되지 않았다(도 4c 및 4d). 적출된 종양의 평균 중량은 대조군보다 Exo-PH20-처리군에서 유의하게 낮게 나타났으며 관찰된 종양성장의 저해와 일치했다(그림 4e 및 4f). HABP 염색 결과는 Exo-PH20으로 처리한 마우스에서 적출된 종양에서 PC3 이종 이식편의 HA 수준이 고갈되었음을 보여주었다(그림 4g). 이 결과는 HA 고발현 종양 보유 쥐에서 HA가 고갈되면 종양의 ECM에 영향을 주어 종양의 성장이나 확장을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
1-3: 정맥 투여 in vivo 분석
이어서, 본 발명자들은 PC3 종양 보유 마우스에 정맥내 투여된 Exo-PH20의 항-종양효능을 조사하였다. 결과는 Exo-PH20-처리된 그룹의 마우스가 대조그룹(도 5a 및 도 5b)과 비교하여 현저하게 감소 된 종양성장(약 83% 억제)을 나타내었다. 본 발명자들은 또한 종양에서 HA의 감소가 고해상도 초음파 영상을 이용한 생체내 실험에서 종양 혈관 재관류의 변화와 관련이 있는지 조사했다. 도 5c에 나타난 바와 같이, Exo-PH20 처리에 의해 PC3 종양 보유 마우스(도 5d)에 대한 엑소좀 투여 3시간 후 상대적 혈관 형성에서 3배 증가하였다.
1-4: 나노입자 침투 분석
이러한 결과에 따라, 본 발명자들은 Exo-PH20-매개 종양 ECM 재구축이 HA- 고갈된 종양조직에서 나노입자 침투를 향상시킬 수 있는지 여부를 더 조사하였다. HA가 고갈된 후의 나노입자의 침투를 평가하기 위해, Exo-PH20 전처리의 부재 또는 존재 하에서 형광단-접합 PEG-리포좀을 PC3 종양 보유 마우스에 정맥내 주사하였다. 리포좀 축적은 처리되지 않은 종양조직에서는 최소였지만 Exo-PH20 처리 후에 극적으로 증가했다(도 6). 이러한 결과는 Exo-PH20가 혈액 관류를 증가시켰을뿐만 아니라 HA 고갈에 의한 종양 미세환경의 간질 내압을 감소시켜 종양에서의 나노 입자 확산을 향상시켰음을 입증하는 것이다.
1-5: 면역능력 모델 동물을 이용한 분석
이어, 본 발명자들은 면역능력 마우스에서 전신 투여된 Exo-PH20의 효능을 조사하였다. 대조군과 비교하여, 종양성장은 4T1 세포로 이식된 BALB/c 면역능력 마우스에서 Exo-PH20에 의해 유의하게 감소되었다(도 7a 및 7b). 이어 본 발명자들은 종양조직의 면역 형광 염색을 수행하여 국소 종양침윤 CD8+ T 세포의 존재를 분석하였다. 4T1 종양 보유 면역능력 마우스 모델에서, 대조군과 비교하여 Exo-PH20 투여시 종양에서 광범위한 T 세포 침윤이 관찰되었다(도 7c). 종합적으로 볼 때, 이러한 결과는 Exo-PH20이 종양 미세환경에서 HA를 성공적으로 분해하고 종양조직에서 나노입자 및 면역세포의 침투를 향상시킨다는 것을 나타낸다.
실험예 2: PH20 표면 제시 독소루비신 봉입 엑소좀의 항암 활성
상기 실시예 2에서 제조된 Exo-PH20Dox의 치료 가능성은 PC3 이종 이식편을 사용하여 생체내에서 분석하였다. 시험결과 Exo-PH20Dox의 처리는 상승적으로 종양성장을 억제했는데, 이는 조합치료가 항-종양 효능을 현저히 향상 시킨다는 것을 의미한다(그림 8a 내지 8c). 특히, Exo-PH20의 강화된 침투는 종양조직에서 효과적인 약물방출을 확실하게 보장하였다. Exo-PH20Dox를 투여한 종양 보유 마우스의 종양조직 박편에서 대조군과 비교하여 유의하게 높고 균일하게 분포된 Dox 형광신호가 혈관에서 관찰되었다(도 8d). 종합하면, Exo-PH20은 화학요법의 효능을 향상시킬 수 있으며,이 효과는 PH20에 의한 HA의 고갈, 후속 종양의 ECM 재구축 및 증가된 혈관 관류를 통한 독소루비신의 종양침투의 결과일 수 있다(그림 8e).
본 발명의 일 실시예에 따른 PH20 표면 제시 엑소좀은 암을 둘러싼 미세환경의 구성요소인 ECM의 히알유론산 네트워크를 분해시키고 면역세포 및 항암 화합물의 암조직으로의 접근성을 향상시킴으로써 종양 치료 가능성을 획기적으로 제고시켰다.
본 발명은 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허 청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> A novel recombinant exosome containing hyaluronidase and use thereof <130> PD16-5384 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 455 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15 Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30 Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 65 70 75 80 Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 85 90 95 Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 100 105 110 Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125 Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 130 135 140 Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175 Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190 His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205 Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220 Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 245 250 255 Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 260 265 270 Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300 Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu 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Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300 Gly Ser Leu Gly Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Val Leu Leu Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Met Glu Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asp Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Val Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val His Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Val Glu Asp Leu Glu Glu Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Ser Leu Lys Pro Pro Val Glu Thr Glu Gly Ser Pro Pro Ile Phe Tyr 435 440 445 Asn Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser 450 455 <210> 29 <211> 456 <212> PRT <213> Papio hamadryas <400> 29 Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Ile Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15 Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30 Leu 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Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Ser Leu Lys Pro Pro Val Glu Thr Glu Gly Ser Pro Pro Ile Phe Tyr 435 440 445 Asn Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser 450 455

Claims (16)

  1. 막에 GPI-앵커링된 형태의 히알유로니데이즈가 제시된 재조합 엑소좀(recombinant exosome)을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 GPI-앵커링된 형태의 막결합 히알유로니데이즈는 전장 PH20인, 암 치료용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 PH20은 서열번호 1 내지 30으로 기재되는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는, 암 치료용 조성물.
  5. 삭제
  6. 막에 GPI-앵커링된 형태의 재조합 히알유로니데이즈가 제시되고 내부에 항암 화합물이 봉입된 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  7. 막에 GPI-앵커링된 형태의 재조합 히알유로니데이즈가 제시된 재조합 엑소좀 및 항암 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 항암 화합물은 면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death agent), 면역 검문소 억제제(immune checkpoint inhibitor), 유사분열 억제제, 대사길항제(antimetabolite), 호르몬제, 알킬화제(alkylating agent), 및 토포이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitors)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 조합인, 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 면역원성 세포사멸 유도제는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(Bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 또는 옥살리플라틴인, 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 또는 발루비신(valrubicin)인, 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 강심성 배당체는 비-면역원성 세포사멸 유도제와 조합되어 사용되는, 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 GADD34/PP1 저해제는 마이토마이신과 조합되어 사용되는, 약학적 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 탁산계열 항암제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀인, 약학적 조성물.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 면역 검문소 억제제는 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제 또는 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제인, 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)인, 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제는 이필리무맙(Ipilimumab)인, 약학적 조성물.
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