CN118058464A - 一种负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：（1）豌豆球蛋白（7S）和低聚木糖（XOS）湿法糖基化复合物的制备；（2）负载姜黄素纳米复合物的制备：将糖基化后的豌豆球蛋白负载姜黄素得到复合物溶液。本发明方法以豌豆球蛋白为姜黄素载体，再通过pH循环方法构建纳米复合物，通过豌豆球蛋白独特的空间结构实现对姜黄素的有效包埋，但稳定性差的问题仍有待解决，但通过糖基化修饰后，豌豆球蛋白对姜黄素的负载量得到进一步的提高，并且还提升了姜黄素的热稳定性和离子稳定性。综合两者的优越性实现了豌豆球蛋白作为载体在多酚类物质高效稳定负载中的应用，扩宽了豌豆球蛋白的利用范围，改善了姜黄素水溶性差，稳定性差的问题。
Description
技术领域
本发明属于食品科学与工程技术领域，涉及一种负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物的制备方法。
背景技术
姜黄素（Cur）是从姜黄中提取出的多酚类化合物，具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗肿瘤等功效。因此经常被用作膳食添加剂应用于植物性食品和饮料中。然而，姜黄素水溶性差，对光、盐、热、强酸、强碱等环境因素敏感的问题限制了其在功能食品中的应用。
许多研究表明，多酚通过非共价键和（或）共价键对蛋白质具有高结合亲和力，特别是基于蛋白质的纳米载体，蛋白质纳米载体是一种具有纳米尺寸的蛋白质结构，具有较大的比表面积和良好的生物相容性，是运载姜黄素的有效策略。豌豆蛋白富含必需氨基酸，包括赖氨酸，被认为是一种完整的蛋白质来源，同时，低致敏性、可持续性及良好的耐受性在作为一种蛋白质补充剂和各种食品的成分中受到欢迎。豌豆球蛋白（7S）是构成豌豆蛋白的主要成分之一，主要由三个亚基（α、β、γ）构成，并且亚基之间通过非共价相互作用维持结构，具有丰富的氨基酸含量及高营养价值。豌豆球蛋白具有可逆自组装特性，并且其结构通常有中空的疏水核心，独特的空间结构使其具有稳定高效结合疏水性多酚的特性。但是，同许多蛋白质一样，豌豆球蛋白具有有限的稳定性，在食品加工过程中会导致变性和功能丧失。
通过糖基化制备的蛋白质-多糖聚合物具有较高的稳定性和生物活性，能够增强蛋白质的溶解性、抗氧化性和生物相容性，被广泛用于制备装载多酚的载体以发挥其作用。这些偶联物具有这两种生物聚合物的优良技术功能，对环境因素变化，如光，热、盐等具有高耐性，减少生物活性物质的泄露和降解，还可抑制蛋白质的水解及氧化。在食品工业中，糖基化蛋白作为纳米载体载运多酚具有广泛的应用前景。现有专利关于糖基化豌豆球蛋白作为纳米载体负载多酚的制备方法及应用的报道较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种糖基化豌豆球蛋白纳米载体去稳定高效的负载姜黄素的方法。综合糖基化生物聚合物的优越性实现多酚类化合物的高负载及稳态化封装，扩大了豌豆球蛋白的利用范围，改善了姜黄素在食品加工过程中稳定性的问题，提高其在功能性食品中的应用。且该方法成本低，工艺简洁。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：将豌豆球蛋白和低聚木糖分别溶解在水中，获得豌豆球蛋白溶液和低聚木糖溶液；
步骤2：将豌豆球蛋白溶液和低聚木糖溶液混合，得到豌豆球蛋白低聚木糖混合溶液；将所述豌豆球蛋白低聚木糖混合溶液的pH值调至6.9-7.1后，于60-70℃加热0.1-12h，得到7S-XOS共价复合物；透析后冷冻干燥得到共价复合物粉末；
步骤3：将共价复合物粉末加入水中，搅拌后得到7S-XOS共价复合物溶液；
步骤4：将7S-XOS共价复合物溶液的pH值调至11.9-12.1，在300-700rpm搅拌15-60分钟后，与姜黄素悬浮液按照1：0.5-1.5的体积比混合，然后于22-28℃，700-1200rpm条件下搅拌3-8min，随后pH值调至6.9-7.1后得到负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物。
优选的技术方案为：豌豆球蛋白溶液的浓度为5-15mg/mL，低聚木糖溶液的浓度为5-15mg/mL。
优选的技术方案为：豌豆球蛋白溶液和低聚木糖溶液之间的质量比例为1：0.8-1.5。
优选的技术方案为：7S-XOS共价复合物溶液的浓度为2-8mg/mL。
优选的技术方案为：将7S-XOS共价复合物溶液的pH值调至12.0后，在400-600rpm条件下保留40-50min，将姜黄素分散于pH值为12的水中以相同的体积比加入，且姜黄素在糖基化蛋白递送体系中的终浓度为0.25-0.35mg/mL，避光反应，混合时间及搅拌速度为4-6min和900-1100rpm。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本发明使用豌豆球蛋白有效的包埋姜黄素制备纳米复合物，姜黄素具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗癌等效用，蛋白质的包封可以作为一层保护屏障降低其对外界环境的敏感性，糖基化修饰的蛋白可以进一步增强蛋白质的稳定性，减少其荷载的姜黄素在不利环境下的氧化和降解。
2、本发明利用豌豆球蛋白与低聚木糖通过湿法糖基化作为载体负载姜黄素形成共价复合物，基于共价复合物的姜黄素载体具有比单独豌豆球蛋白载体更高负载量的特性，并且热稳定性及离子稳定性更高。这将有助于糖化豌豆球蛋白-姜黄素纳米复合物在功能性食品中的应用。
3、本发明在负载姜黄素复合物制备过程中选用pH循环法，所使用原料均属安全，无污染试剂，未引入无水乙醇、尿素等有机试剂或其他高压，加热复杂过程，避免了对环境造成危害及操作过程的复杂性。
附图说明
图1为7S和XOS湿法糖基化不同时间粒径体积变化图。
图2为7S和XOS湿法糖基化不同时间的红外光谱图。
图3为7S-XOS共价复合物不同时间负载姜黄素的包封率、负载量图。
图4为7S-XOS-Cur纳米复合物的热稳定性图。
图5为7S-XOS-Cur纳米复合物的离子稳定性图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-5。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整。提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。
以下实施例所述试剂或材料若无说明，均为市售。
实施例1：一种负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物的制备方法
一种负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将7S和低聚木糖（XOS）分别溶解在去离子水溶液中，7S、XOS的浓度均为10mg/mL，25℃下用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，搅拌速度为800rpm。
（2）7S和XOS的湿法糖基化反应产物的制备：将7S和XOS溶液质量比1：1混合后，得7S/低聚木糖混合溶液。用1moL/L氢氧化钠和盐酸溶液调整复合物溶液至pH7.0后将其放入水浴锅中于65℃加热0-12h，得到7S-XOS共价复合物。透析后冷冻干燥,得到共价复合物粉末。
（3）糖基化蛋白-姜黄素复合物的制备：将共价复合物粉末溶于水中，浓度为5mg/mL, 用磁力搅拌器搅拌使其充分溶解得到7S-XOS共价复合物溶液。将7S-XOS共价复合物溶液pH调至12.0，在500rpm搅拌45分钟后，姜黄素粉末溶于pH12.0水中，体积比为1：1与共价复合物溶液混合后于25℃，1000rpm条件下搅拌5min，随后用2moL/L氢氧化钠和盐酸溶液调整复合物溶液至pH7.0得7S-XOS-Cur纳米复合物。
姜黄素是联合国粮农组织食品法典委员会批准的食品添加剂，姜黄素具有的药食两用特性使其在食品工业中广受欢迎，但在实际应用中存在稳定性低、水溶性差等的缺陷，本研究中利用糖基化豌豆球蛋白载体的包封是一种解决策略去提高姜黄素的稳定性，不仅减少了食品加工过程中活性物质的损耗，保持了姜黄素本身的生物活性，并且载体本身绿色健康可食用，扩大了其应用范围，例如可以应用在高蛋白饮品中，使其成为高营养价值、高生物活性的功能性饮品，还可将纳米粒子转化成粉末状应用在糖果及面食中，并且其在食品保鲜及抗菌中也有巨大的潜力。
表1示出了本发明实施例1制备得到的7S和XOS湿法糖基化不同时间的接枝度和褐变度。随着糖基化时间的延长，糖基化产物的接枝度和褐变度逐渐升高。
图1示出了本发明实施例1制备得到的7S和XOS湿法糖基化不同时间粒径体积变化图。糖基化后豌豆球蛋白的体积比糖基化前增加。表明糖基化反应的发生。
图2示出了本发明实例1制备得到的7S和XOS湿法糖基化不同时间的红外光谱图。7S-XOS光谱图中出现了XOS的特征峰，表明了XOS成功接枝到7S上。
图3示出了本发明实施例1制备得到的7S-XOS共价复合物不同时间负载姜黄素的包封率、负载量图。糖基化后豌豆球蛋白对姜黄素的包封率及负载量增加。
图4示出了本发明实施例1制备得到的7S-XOS-Cur纳米复合物的热稳定性图。选择样品为负载量最高的7S-XOS-Cur-12h进行热稳定性实验，在65℃，75℃及85℃下，糖基化蛋白中姜黄素的保留率均高于单独的豌豆球蛋白及游离姜黄素，具有良好的热稳定性。
图5示出了本发明实施例2制备得到的7S-XOS-Cur纳米复合物的离子稳定性图。选择样品为负载量最高的7S-XOS-Cur-12h进行离子稳定性实验，在不同浓度NaCl添加下，糖基化蛋白的粒子粒径变化幅度明显小于单独的蛋白，表明其具有良好的离子稳定性。
在“Self‐assembled pea vicilin nanoparticles as nanocarriers forimproving the antioxidant activity, environmental stability and sustained‐release property of curcumin[J]. Journal of the Science of Food andAgriculture, 2023. https://doi.org/10.1002/jsfa.13132”中，作者利用pH循环法去制备豌豆球蛋白负载姜黄素的纳米载体，结果表明豌豆球蛋白可以封装大量的姜黄素，其负载量高于其他复杂蛋白质，如乳清分离蛋白及核桃蛋白，并且在75℃加热120分钟的过程中，豌豆球蛋白负载的姜黄素的保留率远高于单独姜黄素的保留率。说明豌豆球蛋白的包封可以为姜黄素提供一层保护层减少其在食品加工过程中的氧化和降解。
本发明利用低聚木糖糖基化豌豆球蛋白后，同样利用pH循环法去制备糖基化豌豆球蛋白负载姜黄素的载体，发现糖基化豌豆球蛋白载体负载姜黄素的包封率是单独豌豆球蛋白载体负载姜黄素的1.17倍，负载量是其1.15倍。在65℃-85℃加热半小时后，糖基化豌豆球蛋白负载姜黄素载体的姜黄素保留率显著高于单独的豌豆球蛋白负载姜黄素载体，分别是其1.04倍，1.12倍和1.38倍。载体溶液在不同浓度氯化钠（0-600 mM）处理后，糖基化豌豆球蛋白负载姜黄素载体的平均粒径变化远低于单独的豌豆球蛋白负载姜黄素载体，在600mM氯化钠浓度时，糖基化豌豆球蛋白负载姜黄素载体的平均粒径增大了2.08倍，而单独豌豆球蛋白负载姜黄素载体却增加了10.88倍。总体说明糖基化豌豆球蛋白载体具有比单独的豌豆球蛋白更高的姜黄素负载量，并且其负载姜黄素的载体也具有更高的热稳定性及离子稳定性。
实施例2：一种负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物的制备方法
一种糖基化豌豆球蛋白纳米载体的制备方法及负载姜黄素的应用，包括以下步骤：
（1）将7S和低聚木糖（XOS）分别溶解在去离子水溶液中，7S、XOS的浓度均为10mg/mL，25℃下用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，搅拌速度为800rpm。
（2）7S和XOS的湿法糖基化反应：将7S和XOS溶液质量比1：1混合后，得7S/低聚木糖混合溶液。用1moL/L氢氧化钠和盐酸溶液调整复合物溶液至pH7.0后将其放入水浴锅中于65℃加热0-12h，得到7S-XOS共价复合物。透析后冷冻干燥,得到共价复合物粉末。
（3）将共价复合物粉末溶于水中，浓度为5mg/mL, 用磁力搅拌器搅拌使其充分溶解。7S-XOS共价复合物溶液。
（4）将7S-XOS共价复合物溶液pH调至12.0，在500rpm搅拌45分钟后，姜黄素粉末溶于pH12.0水中，体积比为1：1与共价复合物溶液混合后于25℃，1000rpm条件下搅拌5min，随后用2moL/L氢氧化钠和盐酸溶液调整复合物溶液至pH7.0得7S-XOS-Cur纳米复合物。
优选的，步骤（1）中7S溶液和XOS溶液质量体积浓度为10mg/mL。
优选的，步骤（2）中7S和XOS共价复合物的制备选用湿法糖基化。
优选的，步骤（2）中复合溶液的体积比优选为1：1进行复合。
优选的，步骤（2）中反应温度优选为65℃。
优选的，步骤（2）中的加热时间为8h。
优选的，步骤（3）中的共价复合物浓度为5mg/mL。
优选的，步骤（4）中负载姜黄素复合物的制备采用pH循环法，将糖基化豌豆球蛋白纳米递送体系pH调至12.0后，优选在500rpm保留45min，将姜黄素溶于pH12的去离子水中以相同的体积比加入，且姜黄素在糖基化蛋白递送体系中的终浓度为0.3mg/mL，避光反应，混合时间及搅拌速度优选为5min和1000rpm。随后将复合物溶液的pH调至pH7，离心后冷冻干燥得到负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物粉末。
本发明还提供了上述制备方法制备7S-XOS-Cur纳米复合物。
本发明还提供了上述制备方法制备7S-XOS-Cur纳米复合物，通过对7S和XOS的质量比例精准控制，将7S与XOS溶液混合通过水浴加热湿法糖基化制备7S-XOS共价复合物，随后将其作为Cur载体表现出更高的负载能力，更高的热稳定性及离子稳定性。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (5)
1.一种负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：将豌豆球蛋白和低聚木糖分别溶解在水中，获得豌豆球蛋白溶液和低聚木糖溶液；
步骤2：将豌豆球蛋白溶液和低聚木糖溶液混合，得到豌豆球蛋白低聚木糖混合溶液；将所述豌豆球蛋白低聚木糖混合溶液的pH值调至6.9-7.1后，于60-70℃加热0.1-12h，得到7S-XOS共价复合物；透析后冷冻干燥得到共价复合物粉末；
步骤3：将共价复合物粉末加入水中，搅拌后得到7S-XOS共价复合物溶液；
步骤4：将7S-XOS共价复合物溶液的pH值调至11.9-12.1，在300-700rpm搅拌15-60分钟后，与姜黄素悬浮液按照1：0.5-1.5的体积比混合，然后于22-28℃，700-1200rpm条件下搅拌3-8min，随后pH值调至6.9-7.1后得到负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物。
2.根据权利要求1所述的负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：豌豆球蛋白溶液的浓度为5-15mg/mL，低聚木糖溶液的浓度为5-15mg/mL。
3.根据权利要求1所述的负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：豌豆球蛋白溶液和低聚木糖溶液之间的质量比例为1：0.8-1.5。
4.根据权利要求1所述的负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：7S-XOS共价复合物溶液的浓度为2-8mg/mL。
5.根据权利要求1所述的负载姜黄素的糖基化豌豆球蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：将7S-XOS共价复合物溶液的pH值调至12.0后，在400-600rpm条件下保留40-50min，将姜黄素分散于pH值为12的水中以相同的体积比加入，且姜黄素在糖基化蛋白递送体系中的终浓度为0.25-0.35mg/mL，避光反应，混合时间及搅拌速度为4-6min和900-1100rpm。
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