CN118056569A - 一种核酸基cGAS-STING免疫佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种核酸基cGAS-STING免疫佐剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种核酸基cGAS‑STING免疫佐剂及其制备方法和应用，核酸基cGAS‑STING免疫佐剂包括核酸和无机材料，其中，无机材料和核酸复合形成纳米或微米颗粒，该纳米或微米颗粒可酸响应性分解并释放其中的核酸。本发明制备的免疫佐剂简单易合成、便于量产、稳定性高、能高效激活cGAS‑STING信号通路，无种属差异且可编程性高，有望应用于各类疾病的治疗中。

Description

一种核酸基cGAS-STING免疫佐剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫制剂技术领域，尤其涉及一种核酸基cGAS-STING免疫佐剂及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤疫苗是通过激活机体特异性抗肿瘤免疫反应的新型治疗手段，其主要由抗原和佐剂构成。免疫佐剂是一种通过激活机体天然免疫系统，调控机体免疫应答进而帮助机体抵御疾病的药剂，其可由天然或合成类的小分子和/或材料组成。免疫佐剂根据其受体的不同，可分为Toll样受体佐剂，干扰素基因刺激蛋白(StimμLator of interferon geneprotein，STING)佐剂，NOD样受体佐剂，RIG-I样受体佐剂和C型凝集素受体佐剂。STING信号通路是近些年来发现的参与机体抗病毒免疫的关键信号通路，不同于大部分的Toll样受体，cGAS-STING信号通路不仅在免疫细胞中表达，还在许多正常细胞(如内皮细胞)以及癌细胞中均能够表达，因此具有更强激活机体免疫的能力；并且，最近的一些研究显示，cGAS-STING的激活还能够有效促进树突状细胞对抗原的交叉呈递。这些优势使得cGAS-STING佐剂在近些年广受关注。
目前，新型cGAS-STING佐剂的开发主要围绕两个方向在进行。一方面是开发新型小分子，主要是通过高通量筛选与STING具有更高特异性、更强结合的小分子和通过化学修饰已有的STING激动小分子进行，如通过硫代修饰cGAMP的磷酯键可以增加其抗酶解能力。其中的一些小分子如ADU-S100，DMXAA已经进入过临床研究。另一方面，为了增加小分子的利用度，许多研究人员在探索新型载体以促进cGAS-STING佐剂的胞质递送。如密歇根大学James J.Moon团队通过改性脂质体包裹锰-环二苷酸以制备STING纳米激动剂[Naturenanotechnology,2021,16(11):1260-1270.]，芝加哥大学林文斌团队通过脂质体包裹锌-环二苷酸制备STING纳米激动剂[10.1038/s41565-022-01225-x]等。另外，还有研究人员发现金属离子如锰离子、钴离子、锌离子等也能刺激STING信号通路。但由于小分子本身的半衰期短、进胞效率低，以及与不同种属的STING蛋白亲和力不同(如DMXAA只能高亲和力激活小鼠的STING而不能激活人的STING)等原因，使得其临床转化以失败告终。单独金属离子代谢速率快、进胞效率低，这使得其激活效果受限。新型载体的构建例如PEG等往往涉及到复杂的化学合成，并且可能伴有免疫原性，使得其难以推向临床转化。因此，开发具有安全、无种属差异、高效、稳定且简单易合成的cGAS-STING佐剂具有重要意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种由无机材料和核酸制备得到的cGAS-STING免疫佐剂，简单易合成、便于量产、稳定性高、能高效激活cGAS-STING信号通路，可应用于各类疾病的治疗中。
本发明的第一个目的是提供一种核酸基cGAS-STING免疫佐剂，所述核酸基cGAS-STING免疫佐剂包括核酸和无机材料；其中，所述无机材料和核酸复合形成纳米或微米颗粒，该纳米或微米颗粒可酸响应性分解并释放其中的核酸。
现有的STING免疫佐剂大多是通过STING报告细胞筛选出来的小分子激动剂，而由于种属间甚至个体间存在的STING蛋白表达差异，其在临床试验时只在一部分人中起效。而本发明制备的核酸基cGAS-STING免疫佐剂基于cGAS通路开发，cGAS通路作为生物进化来抵御DNA病毒的一个保护机制，是生物间共同存在的，不存在上述问题，更有利于临床转化，在肿瘤等疾病的临床免疫治疗中也有望发挥重要作用。同时，小分子激动剂的结合位点有限，可编程性不高，难以进一步改性。但是本发明采用核酸，由于其本身位点多，是天然的生物大分子，可编程性极高，可以通过共价键、非共价键等偶联其他物质或进行结构优化，因此整个颗粒也可以进行编程，大大拓展了下游应用。另外，由于直接包载颗粒太大(>2μm)，细胞内吞效率低，刺激效果差，本发明提供的复合形成的佐剂颗粒相比于直接包载所得到的颗粒尺寸更为均一，形貌更可控，更易被细胞摄取，刺激效果更好。
本发明提供的核酸基cGAS-STING免疫佐剂的递送机理是，复合形成的佐剂颗粒被细胞内吞后，佐剂颗粒中的无机材料在溶酶体酸性条件下分解，通过质子海绵效应将核酸释放到细胞内，刺激cGAS-STING信号通路，引起下游IFN-b分泌以及CXCL-10等趋化因子分泌，上调树突状细胞表面共刺激分子的表达，从而启动天然免疫和适应性免疫应答，实现抑制肿瘤生长的效果。
进一步地，所述核酸可为天然提取的核酸或人工合成的核酸中的一种或多种。
进一步地，所述核酸含有不少于5nt、不少于10nt、不少于50nt、不少于100nt、不少于200nt、不少于300nt、不少于500nt、不少于1000nt的序列长度，分子量不小于6000Da。
进一步地，所述天然提取的核酸包括但不限于肿瘤DNA、肝脏DNA、脾脏DNA、小牛胸腺DNA、小麦DNA、鲱鱼DNA、鲑鱼DNA、细菌DNA、真菌DNA、病毒DNA、质粒、细菌RNA、真菌RNA、病毒RNA中的一种或多种。
进一步地，所述人工合成的核酸选自聚(脱氧鸟嘌呤-脱氧胞苷)酸钠盐、聚(脱氧鸟嘌呤-脱氧胞苷)酸钠盐、CpG、聚肌苷酸胞苷酸、poly I、poly C，DNA折纸中的一种或多种。
进一步地，所述的核酸链可进行链间硫代修饰、5’端或3’端巯基修饰、生物素修饰、聚乙二醇修饰、二苯并环辛炔修饰、醛基修饰、胆固醇修饰、染料修饰、马来酰亚胺修饰中的一种或多种。
进一步地，所述无机材料选自碳酸钙、碳酸锰、碳酸镁、碳酸铝、碳酸钴、碳酸锌、碳酸铁、碳酸锡、磷酸钙、磷酸锰、磷酸镁、磷酸铝、磷酸钴、磷酸铁、磷酸锌、磷酸锡、焦磷酸钙、焦磷酸锰、焦磷酸镁、焦磷酸铝、焦磷酸钴、焦磷酸铁、焦磷酸锌、焦磷酸锡、三聚磷酸钙、三聚磷酸锰、三聚磷酸镁、三聚磷酸铝、三聚磷酸钴、三聚磷酸铁、三聚磷酸锌、三聚磷酸锡、六聚磷酸钙、六聚磷酸锰、六聚磷酸镁、六聚磷酸铝、六聚磷酸钴、六聚磷酸铁、六聚磷酸锌、六聚磷酸锡、膦酸钙、膦酸锰、膦酸镁、膦酸铝、膦酸钴、膦酸铁、膦酸锌、膦酸锡、磷酸氢钙、磷酸氢锰、氢氧化钙、氢氧化锰、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化钴、氢氧化锌、氢化钙和二氧化锰中的一种或多种。
进一步地，所述复合为将核酸、含有所述无机材料中金属阳离子的溶液、含有所述无机材料中阴离子的溶液混合反应。
进一步地，所述核酸基cGAS-STING免疫佐剂的粒径为10-10000nm。
进一步地，所述核酸基cGAS-STING免疫佐剂在无菌水中可以长期稳定存在，或根据实际需要制成冻干剂型或进行除菌操作等。本发明制备的核酸基cGAS-STING佐剂，可在无菌水或生理溶液长期储存，无需低温。实验中发现其储存1年后仍然保持原有形貌和刺激效果。另外，其可直接通过高压蒸汽进行灭菌，亦可直接进行冷冻干燥制得干粉。这表明所述cGAS-STING佐剂稳定高，成药性极好。
进一步地，所述核酸基cGAS-STING免疫佐剂可直接在-80℃超低温冰箱进行冷冻，然后通过冷冻干燥机(Freezone,Labconco)直接进行冻干，无需加入冻干保护剂。传统的STING佐剂由于稳定性不高，在冻干时需引入额外的冻干保护剂，这会带来免疫原性的问题，从而影响体系的成药性。
进一步地，所述核酸基cGAS-STING免疫佐剂可直接通过高压蒸汽灭菌的方式(121℃，20min)进行灭菌(GR60DP,Zealway)。
进一步地，所述纳米或微米颗粒经多酚或阳离子聚合物修饰。
进一步地，所述多酚选自单宁酸、没食子酸、多巴胺、聚多巴胺、表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种或多种。
进一步地，所述阳离子聚合物选自壳聚糖、聚赖氨酸、阳离子脂质体、聚乙烯亚胺、聚精氨酸中的一种或多种。
进一步地，所述多酚或阳离子聚合物修饰的方法为：将制备得到的纳米或微米颗粒与多酚溶液或阳离子聚合物溶液混合搅拌或涡旋。
本发明的第二个目的是提供上述核酸基cGAS-STING免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤：
将核酸与含所述无机材料中金属阳离子的溶液、含所述无机材料中阴离子的溶液混合，复合得到所述核酸基cGAS-STING免疫佐剂。
进一步地，所述金属阳离子选自钙离子、锰离子、镁离子、铝离子、钴离子、锌离子、铁离子、锡离子中的一种或多种。
进一步地，所述阴离子选自碳酸根离子、磷酸根离子、焦磷酸根、三聚磷酸根、六聚磷酸根、膦酸根、磷酸氢根离子、碳酸氢根、氢氧根离子中的任一种。
进一步地，所述金属阳离子和所述阴离子可以是直接添加，也可以是由其化合物分解得到。
进一步地，在制备步骤中，核酸的浓度为1ng/L-100g/L；金属阳离子的终浓度为1nM-100M，阴离子的终浓度为1nM-100M。
本发明的第三个目的是提供一种核酸基无机材料在制备cGAS-STING佐剂中的应用，所述核酸基无机材料包括核酸和无机材料，其中，所述无机材料和核酸复合形成纳米或微米颗粒，该纳米或微米颗粒可酸响应性分解并释放其中的核酸。
本发明的第四个目的是提供上述核酸基cGAS-STING免疫佐剂在制备肿瘤治疗制剂中的应用。所述核酸基cGAS-STING佐剂可用于免疫抑制或免疫增强，因此可用于制备肿瘤疫苗或肿瘤治疗药物。
进一步地，所述肿瘤治疗制剂由核酸基cGAS-STING免疫佐剂与抗原进行孵育得到，优选地，将修饰多酚/阳离子聚合物的核酸基cGAS-STING免疫佐剂与抗原进行孵育。或者，将无机材料和肿瘤裂解物复合形成纳米或微米颗粒，肿瘤裂解物可来源于自体或同种异体，其中至少含有核酸和抗原。上述形成的肿瘤治疗制剂具有cGAS-STING激活功能。
进一步地，所述肿瘤包括但不限于黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌。
进一步地，所述抗原选自肿瘤、细菌、病毒抗原表位在内的mRNA、质粒DNA、蛋白、多肽、或灭活/减毒肿瘤细胞、灭活/减毒细菌或灭活/减毒/假病毒中的一种或多种。
进一步地，所述肿瘤治疗制剂的剂型为注射剂、栓塞剂、乳膏、敷料或者喷剂。
本发明的第五个目的是提供上述核酸基cGAS-STING免疫佐剂在肿瘤治疗中的应用。
进一步地，可以将通过核酸与无机材料制备成核酸基cGAS-STING佐剂经瘤内注射，实现肿瘤免疫抑制性微环境的逆转，激活抗肿瘤免疫反应，从而有效抑制肿瘤生长，是一种瘤内注射核酸基cGAS-STING佐剂实现肿瘤生长抑制的方法。
进一步地，通过联合免疫检查点阻断点疗法，可有效抑制肿瘤手术切除后的复发。
本发明的第六个目的是提供一种多功能佐剂，所述多功能佐剂包括第一佐剂和第二佐剂。
进一步地，所述纳米或微米颗粒在修饰多酚或阳离子聚合物后得到第一佐剂，所述第一佐剂还可以修饰第二佐剂制备成多功能佐剂。
进一步地，所述第二佐剂选自R837、R848、聚肌苷酸胞苷酸、CpG、脂多糖、单磷酰脂质体A中的一种或多种。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
1)本发明提供的核酸基cGAS-STING佐剂粒径均一，在水性溶剂中分散良好，在生理条件下具有良好的稳定性，可用于肿瘤微环境的调控，还能够有效地实现DNA的胞内递送，激活机体免疫反应的功能。
2)本发明提供了一种简单易合成的核酸基cGAS-STING佐剂制备方法，其中，核酸可以天然提取或通过人工合成，原料丰富、合成的颗粒均一、稳定，易保存并且适用于大批量制备。
3)本发明提供了核酸基cGAS-STING佐剂在制备肿瘤免疫治疗的佐剂中的用途，其作为肿瘤免疫治疗的佐剂时，具有良好的增强肿瘤免疫治疗的效果。瘤内注射或灌注核酸基cGAS-STING佐剂，能够有效调控肿瘤部位免疫微环境，增加能够杀伤肿瘤的免疫细胞(如自然杀伤细胞(natural killer,NK)，CD8+T淋巴细胞)在肿瘤内的浸润且有效激活这类细胞，高效地激活抗肿瘤免疫反应从而抑制肿瘤生长。
4)本发明还基于核酸基cGAS-STING佐剂制备自体肿瘤疫苗，能够有效地促进机体内抗原特异性的CD8+T细胞的产生，从而预防肿瘤的生长；并且通过联合免疫检查点阻断点疗法，可有效抑制肿瘤手术切除后的复发。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1是实施例A1制备的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂扫描电镜图；
图2是实施例A1制备的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂动态光散射粒径分布结果；
图3是实施例A1中在HCl溶液中加入不同样品后溶液pH变化曲线图；
图4是实施例A1中在不同pH缓冲溶液中孵育制备的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂，DNA释放随时间变化图；
图5是实施例A2制备的碳酸钙脾脏DNA、碳酸钙肿瘤DNA、碳酸钙小麦DNA、碳酸钙人工合成DNA基cGAS-STING佐剂扫描电镜图；
图6是实施例A3中制备的碳酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂扫描电镜图；
图7是实施例A4中制备的磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂和实施例A5中制备的磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂扫描电镜图；
图8为实施例B1中不同样品刺激骨髓来源树突状细胞分泌β-干扰素的含量统计图；
图9为B1中，不同样品刺激骨髓来源树突状细胞CXCL10趋化因子表达水平的qPCR测试结果；
图10是实施例B2中不同样品刺激IFN-293-Dual mSTING报告细胞分泌Lucia荧光素酶相对水平的统计图。
图11是实施例B3中不同样品刺激骨髓来源树突状细胞分泌β-干扰素相对水平的统计图。
图12是实施例B4和B5中不同样品刺激骨髓来源树突状细胞分泌β-干扰素相对水平统计图。
图13为实施例C1中小鼠肿瘤部位免疫微环境变化情况；其中(a)为肿瘤内树突状细胞表面共刺激分子表达水平流式细胞术测试结果；(b)为肿瘤组织内IFN-β含量ELISA测试结果；(c)为肿瘤内活化型NK细胞流式细胞术测试结果；(d)为肿瘤内活化型细胞毒性T细胞流式细胞术测试结果；
图14为实施例D1中对黑色素瘤荷瘤小鼠进行不同处理后的小鼠肿瘤生长曲线；
图15为实施例D2中结肠癌荷瘤小鼠经不同处理后小鼠肿瘤生长曲线；
图16是实施例E1制备的基于DNA基cGAS-STING佐剂的自体肿瘤疫苗的扫描电镜图；
图17是实施例E1制备的基于DNA基cGAS-STING佐剂的自体肿瘤疫苗的动态光散射粒径分布结果；
图18是实施例E2中不同样品刺激IFN-293-Dual mSTING报告细胞分泌Lucia荧光素酶相对水平统计图。
图19是实施例E3中不同样品刺激骨髓来源树突状细胞表达共刺激分子表达水平统计图；
图20是实施例E3中不同样品刺激骨髓来源树突状细胞SIINFEKL-H2Kb分子表达水平统计图；
图21是实施例E4中不同样品刺激小鼠体内肿瘤特异性T细胞含量统计图；
图22是实施例E4中各组小鼠肿瘤生长曲线；
图23是实施例E5中不同组别小鼠肿瘤生长曲线。
图24是实施例F1中制备的不同修饰核酸基cGAS-STING佐剂样品的扫描电镜图；
图25是实施例F1中制备的不同修饰核酸基cGAS-STING佐剂样品的吸附效率统计图；
图26是实施例F3中不同样品刺激骨髓来源树突状细胞表达共刺激分子表达水平统计图；
图27是实施例F4中不同样品刺激骨髓来源树突状细胞抗原交叉呈递能力统计图；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
材料来源：鲱鱼精DNA(品牌：Sigma-Aldrich，货号：d6898-1g)、cGAMP(品牌：Sigma-Aldrich，货号：sml1232-.5umo)、阳离子脂质体(品牌：Thermo，货号：l3000008)；鞣酸(品牌：Sigma-Aldrich，货号：403040-500G)，聚乙烯亚胺(品牌：Sigma-Aldrich，货号：P3143-100ML)；鸡卵清蛋白(品牌：Sigma-Aldrich，货号：Sigma-A5378)；CpG以及人工合成DNA通过生工生物工程(上海)股份有限公司获得；氯化钙、碳酸钠以及其它无机盐、有机分子等可从国药集团化学试剂有限公司等公司购得；IFN-βELISA试剂盒从R&D system公司购买(货号：DY8234-05)；流式抗体从Biolegend公司购买获得：anti-FITC-CD11c(Biolegend,克隆N418,货号：117306),anti-CD80-APC(Biolegend,克隆16-10A1,货号：104714),anti-CD86-PE(Biolegend,克隆GL-1,货号：105008),anti-SIINFEKL-APC(Biolegend,克隆25-D1.16,货号：141606),anti-CD3-PE(Biolegend,克隆145-2C11,货号：100308),anti-CD45-Percp(Biolegend,克隆30-F11,货号：103130),anti-CD69-Alexa Fluor488(Biolegend,克隆H1.2F3,货号：104516),anti-CD49b-APC(Biolegend,克隆HMa2,货号：104516),Anti-CD3-FITC(Biolegend,克隆17A2,货号：100204),anti-CD4-Percp(Biolegend,克隆GK1.5,货号：100432),anti-CD8-PE(Biolegend,克隆53-5.8,货号：140408),anti-IFN-γ-APC(Biolegend,克隆XMG 1.2,货号：505810)。
测试设备与测试方法：
通过Zeiss G500扫描电子显微镜表征DNA基cGAS-STING佐剂形貌。
通过Malvern Zeta动态光散射仪表征DNA基cGAS-STING佐剂的粒径。
通过Presens微电极表征DNA基cGAS-STING佐剂的质子中和能力。
CXCL-10的表达通过使用qPCR试剂盒(Biosharp)测得。
Nanodrop微量分光光度计，型号：NanoDrop 2000c，品牌：Thermo Scientific。
统计学计算：计算P值显示组件统计学差异，附图中的，“*”表明P<0.05；“**”表明P<0.01，P值通过使用双尾学生t检验计算而得。
实施例A：核酸基cGAS-STING佐剂的制备与性质检测
实施例A1：一种碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂
由于鲱鱼精DNA已经有商业化的产品，易获得且纯度高，不含蛋白等杂质，因此选用其作为模式DNA制备实施例A1。
所述碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂的制备方法：
将鲱鱼精DNA(双链，长度为100-1000bp)溶于超纯水中，搅拌至完全溶解，配成1.25mg/mL鲱鱼精DNA水溶液。将制备的鲱鱼精DNA水溶液加热至95℃并维持10min，随后静置使其恢复至室温；往2mL上述鲱鱼精DNA水溶液中加入50μL 0.5M的CaCl2水溶液，并混合均匀，随后往上述混合液中缓慢滴加50μL 0.5M的Na2CO3水溶液，搅拌约10min，得到白色悬浊液，溶液中的白色颗粒即为DNA基cGAS-STING佐剂，可通过14800rpm离心弃去上清后加去离子水洗涤得到纯净碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂。
所述碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂的性质检测：
对实施例A1中制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂进行定性检测，分别进行扫描电镜检测、动态光散射、质子中和能力检测以及微酸响应性释放检测。
其中，扫描电镜检测的结果如图1所示，结果显示，实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂在水中呈单分散状态分布，表明本发明制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂的粒径均一，在水中分散良好。
动态光散射检测的结果如图2所示，结果显示，实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂粒径主要集中在700～900nm左右，具有良好的单分散性。
为研究实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂的酸中和能力，向HCl水溶液中加入不同量实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂以进行质子中和实验，如图3所示，实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂能够有效中和酸性溶液中的氢离子，使酸性溶液的pH值升高，证明了其具有良好的质子中和能力，可用于中和溶酶体的质子，促进DNA的溶酶体逃逸。
为研究实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂微酸响应性释放DNA的能力。将实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂分别与pH7.4，pH6.8和pH5.3的PBS缓冲液进行共孵育，通过离心收集上清测定不同时间点DNA释放的情况，如图4所示，碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂在pH6.8和pH5.3情况下相较于pH7.4均能释放DNA，且在pH5.3下释放显著高于pH7.4。这表明碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂能够在微酸条件下有效释放DNA，有利于促进下游cGAS-STING信号通路激活。
实施例A2：一种碳酸钙脾脏DNA、碳酸钙肿瘤DNA、碳酸钙小麦DNA、碳酸钙人工合成DNA基cGAS-STING佐剂。
为验证该技术对不同DNA的广泛适用性，我们首先通过标准化的苯酚/氯仿法提取小鼠脾脏DNA和小鼠肿瘤DNA。简而言之，从小鼠身上切除了脾脏和肿瘤等器官。取0.14MNaCl-0.10M EDTA-2Na去除脏器血液，用10mL 0.14M NaCl-0.10M EDTA-2Na将脏器血液磨碎，再用尼龙网过滤去除杂物。4000rpm离心10min后，得到的沉淀用0.14M NaCl-0.10MEDTA-2Na洗涤2-3次，在7.4mL 0.14M NaCl-0.10M EDTA-2Na中悬浮。将25％(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)滴加到上述粗产物中，不断搅拌，0.6mL，60℃水浴，轻轻摇晃10min。冷却至室温后，加入5M NaCl 2mL，再搅拌10min，再与10mL氯仿/异丙醇(24∶1,V/V)有机混合物混合，剧烈摇动10min，静置。收集得到的上水相，再进行两次氯仿/异丙醇介导的蛋白提取循环。最后纯化后，用15-20mL冷的无水乙醇沉淀DNA。离心收集DNA，然后冷冻干燥。
另外，我们利用十六烷基三甲基溴化铵法(hexadecyltrimethylammoniumbromide,CTAB)提取小麦DNA。首先，制备了含2％(W/V)CTAB、0.1M Tris-HCl(pH 8.0)、20mMEDTA、1.4M NaCl、1％(W/V)K30聚乙烯醇吡啶酮、0.2％(V/V)β-巯基乙醇的CTAB缓冲液，并在65℃加热。采集几克小麦幼苗的叶子，在液氮中迅速磨成粉末。将粉末转移到加热的CTAB缓冲液中，轻轻搅拌孵育1h。样品冷却至室温后，与相同体积的氯仿/异戊醇(24∶1,V/V)剧烈混合。离心(10,000g,15min)获得上水溶液，与等量异丙醇混合，静置30min，离心(10,000g,15min)得到粗DNA。用5mM CH3COONa/75％乙醇(1:9,V/V)浸泡DNA沉淀10min后弃用。然后，将DNA沉淀溶于10mM Tris-HCl(pH 8.0)中，并加入1mM EDTA，直到挥发出剩余的乙醇。取等量苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1,V/V/V)与DNA溶液混合，10000g离心15min，进一步去除蛋白质杂质。然后，收集水相，添加十分之一的3M CH3COONa/HCl(pH5.2)和两倍体积的无水乙醇，然后在4℃中静置过夜，以沉积DNA。最后，离心收集DNA，用75％乙醇洗涤，冷冻干燥，进行进一步实验。
所述碳酸钙脾脏DNA、碳酸钙肿瘤DNA、碳酸钙小麦DNA、碳酸钙人工合成DNA基cGAS-STING佐剂的制备方法：
实施例A2.1的制备方法与实施例A1相同，区别仅在于：将实施例A1中的鲱鱼精DNA替换为脾脏DNA(双链，长度为50-2000bp)、即可制得碳酸钙脾脏DNA基cGAS-STING佐剂。
实施例A2.2的制备方法与实施例A1相同，区别仅在于：将实施例A1中的鲱鱼精DNA替换为肿瘤DNA(双链，长度为50-2000bp)，即可制得碳酸钙肿瘤DNA基cGAS-STING佐剂。
实施例A2.3的制备方法与实施例A1相同，区别仅在于：将实施例A1中的鲱鱼精DNA替换为小麦DNA(双链，长度为50-2000bp)，即可制得碳酸钙小麦DNA基cGAS-STING佐剂。
实施例A2.4的制备方法与实施例A1相同，区别仅在于：将实施例A1中的鲱鱼精DNA替换为人工合成DNA(双链，长度为50-2000bp)，即可制得碳酸钙人工合成DNA基cGAS-STING佐剂。
所述碳酸钙脾脏DNA、碳酸钙小麦DNA、碳酸钙肿瘤DNA、碳酸钙人工合成DNA基cGAS-STING佐剂的性质检测：
对实施例A2中制得的碳酸钙脾脏DNA、碳酸钙肿瘤DNA、碳酸钙小麦DNA、碳酸钙人工合成DNA基cGAS-STING佐剂分别进行扫描电镜检测。
扫描电镜检测的结果如图5所示，结果显示，实施例A2.1制得的碳酸钙脾脏DNA、实施例A2.2制得的碳酸钙肿瘤DNA、实施例A2.3制得的碳酸钙小麦DNA基cGAS-STING、实施例A2.4制得的碳酸钙人工合成DNA基cGAS-STING佐剂均在水中呈椭球状，并且以单分散状态分布，粒径约为300nm～1800nm，表明本发明制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂的粒径均一，在水中分散良好。
实施例A3：一种碳酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂
为进一步验证该技术的广泛适用性，我们使用具有类似微酸响应性释放的无机材料碳酸锰制备实施例A3。
所述碳酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂的制备方法：
实施例A3的制备方法与实施例A1相同，区别仅在于：将实施例A1中的CaCl2水溶液替换为MnCl2水溶液，即可制得碳酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂。
所述碳酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂的性质检测：
对实施例A3中制得的碳酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂进行扫描电镜检测。
扫描电镜检测的结果如图6所示，结果显示，实施例A3中制得的碳酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂在水中呈单分散状态分布，粒径约为500nm～3000nm，表明本发明制得的碳酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂的粒径均一，在水中分散良好。
实施例A4：一种磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂
为进一步阐述该技术的广泛适用性，我们使用具有类似微酸响应性释放的无机材料磷酸锰制备实施例A4。
所述磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂的制备方法：实施例A4的制备方法与实施例A1相同，区别仅在于：将实施例A1中的CaCl2水溶液替换为MnCl2水溶液，50μL 0.5M的Na2CO3水溶液替换为50μL 0.33M的Na3PO4水溶液，即可制得磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂。
所述碳酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂的性质检测：
对实施例A4中制得的磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂进行扫描电镜检测。
扫描电镜检测的结果如图7(a)所示，结果显示，实施例A4中制得的磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂在水中呈单分散状态分布，粒径约为500nm～800nm，表明本发明制得的磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂的粒径均一，在水中分散良好。
实施例A5：一种磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂
为进一步阐述该技术的广泛适用性，我们使用RNA(货号：P1530-25MG,品牌：Sigma-Aldrich)制备实施例A5。
所述磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂的制备方法：实施例A5的制备方法与实施例A1相同，区别仅在于：将实施例A1中的鲱鱼精DNA水溶液替换为RNA水溶液，CaCl2水溶液替换为MnCl2水溶液，50μL 0.5M的Na2CO3水溶液替换为50μL 0.33M的Na3PO4水溶液，即可制得磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂。所述磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂的性质检测：
对实施例A5中制得的磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂进行扫描电镜检测。
扫描电镜检测的结果如图7(b)所示，结果显示，实施例A5中制得的磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂在水中呈单分散状态分布，粒径约为500nm～3500nm，表明本发明制得的磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂的粒径均一，在水中分散良好。
实施例B：核酸基cGAS-STING佐剂在细胞水平刺激免疫能力研究
实施例B1：碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂刺激骨髓来源树突状细胞能力研究
对实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂在细胞水平对其刺激骨髓来源树突状细胞的行为进行检测，并且将其与商业化的cGAS-STING佐剂cGAMP进行对比，另将无微酸响应性释放的DNA碳酸钙混合物作为对照证明单纯的混合物不能实现复合物的效果，以进一步阐明该DNA基cGAS-STING佐剂的有效性与作用机制。
实验分组如下：
实施例B1.1：对照组(未经处理的骨髓来源树突状细胞)；
实施例B1.2：cGAMP(浓度为2μg/mL)；
实施例B1.3：DNA碳酸钙混合物(DNA浓度为10μg/mL，碳酸钙浓度为250μg/mL，将两者直接物理混合制得DNA碳酸钙混合物)；
实施例B1.4：实施例A1化学合成制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂(鲱鱼精DNA浓度为10μg/mL，碳酸钙浓度为250μg/mL)。
cGAS-STING信号通路激活会刺激树突状细胞β-干扰素的分泌和CXCL-10等趋化因子的表达。因此，为检测实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂cGAS-STING信号通路激活能力。将实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂与骨髓来源树突状细胞共同孵育24h，通过酶联免疫吸附测定检测β-干扰素的表达，通过qPCR测定树突状细胞CXCL-10趋化因子的表达。酶联免疫吸附测定的结果如图8所示，结果显示碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂能够有效刺激骨髓来源树突状细胞分泌β-干扰素，与cGAMP有类似的效果，而DNA碳酸钙混合物组效果不显著，说明碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂具有刺激cGAS-STING信号通路功能，且通过微酸性条件下在胞内释放DNA来实现刺激cGAS-STING信号通路功能的功能。另外，实验中发现，鲱鱼精DNA本身即使在10倍浓度下(100μg/mL)，也无法刺激骨髓来源树突状细胞产生IFN-β，表明其无法刺激cGAS-STING信号通路，原因是其本身被内吞至溶酶体后会迅速水解，使其无法有效从溶酶体逃逸进入胞浆，从而无法发挥免疫刺激功能。
qPCR测定的结果如图9所示，结果显示碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂能够有效刺激骨髓来源树突状细胞表达CXCL-10趋化因子，与cGAMP有类似的效果，而DNA碳酸钙混合物组效果不显著，这进一步说明碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂具有刺激cGAS-STING信号通路功能，且通过微酸性条件下在胞内释放DNA实现这一功能。
实施例B2：碳酸钙脾脏DNA、碳酸钙肿瘤DNA、碳酸钙小麦DNA、碳酸钙人工合成DNA基cGAS-STING佐剂刺激cGAS-STING报告细胞能力研究
为多维度阐述该技术的广泛适用性和有效性，我们利用cGAS-STING信号报告细胞对实施例A2.1制得的碳酸钙脾脏DNA、实施例A2.2制得的碳酸钙肿瘤DNA、实施例A2.3制得的碳酸钙小麦DNA、实施例A2.4制得的人工合成DNA基cGAS-STING佐剂进行cGAS-STING信号激活能力检测，并加入实施例A1制备得到的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂作为对比。具体而言，在细胞水平上利用IFN-293-Dual mSTING报告细胞指示不同样品激活STING通路的能力，该报告细胞经cGAS质粒瞬时转染，能够稳定表达小鼠STING和Lucia荧光素酶，当该细胞的STING通路被激活后，会表达Lucia荧光素酶，表达的荧光素酶能够与荧光素底物海肾荧光素反应产生荧光信号，荧光信号强度越高说明STING通路被激活的程度越高。
将实施例A1、实施例A2.1、实施例A2.2、实施例A2.3制得的佐剂样品分别与ISG-SEAP/KI-[IFN-β]Lucia细胞(品牌：InvivoGen，货号：293d-mstg)共同孵育24h，再利用海肾荧光素(品牌：InvivoGen，货号：rep-qlc1)检测细胞培养液上清中Lucia荧光素酶水平。结果如图10所示，结果显示，实施例A1、实施例A2.1、实施例A2.2、实施例A2.3、实施例A2.4制备得到的佐剂样品均能够有效提高培养液上清中Lucia荧光素酶水平，这说明实施例A2.1制得的碳酸钙脾脏DNA、实施例A2.2制得的碳酸钙肿瘤DNA、实施例A2.3制得的碳酸钙小麦、实施例A2.4制得的人工合成DNA基cGAS-STING佐剂，具有与实施例A1制备得到的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂相同的性质，能够有效激活STING通路，STING通路激活说明机体的天然免疫系统被激活，即该佐剂具有免疫刺激的效果，能够进一步用于肿瘤免疫治疗。
实施例B3：碳酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂刺激骨髓来源树突状细胞能力研究
由于cGAS-STING信号通路激活会刺激树突状细胞分泌β-干扰素，因此，为检测实施例A3制得的碳酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂cGAS-STING信号通路激活能力，将实施例A1制备得到的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂、实施例A3制得的碳酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂分别与骨髓来源树突状细胞共同孵育24h，通过酶联免疫吸附测定检测β-干扰素的表达。酶联免疫吸附测定的结果如图11所示，结果显示实施例A1与实施例A3制得的佐剂样品均能够有效刺激骨髓来源树突状细胞分泌β-干扰素，说明骨髓来源树突状细胞在该样品的刺激下成熟，β-干扰素还具有抗肿瘤活性，即两种佐剂样品均具有刺激树突状细胞的效果，具有应用于肿瘤免疫治疗的潜力。
实施例B4：磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂刺激骨髓来源树突状细胞能力研究
由于cGAS-STING信号通路激活会刺激树突状细胞分泌β-干扰素，因此，为检测实施例A4制得的磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂cGAS-STING信号通路激活能力，将实施例A4制得的磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂与骨髓来源树突状细胞共同孵育24h，通过酶联免疫吸附测定检测β-干扰素的表达，并加入实施例A1制备得到的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂作为对比。酶联免疫吸附测定的结果如图12(a)所示，结果显示实施例A1与实施例A4制得的磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂均能够有效刺激骨髓来源树突状细胞分泌β-干扰素，说明A4制得的磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂具有与实施例A1制备得到的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂相同的性质。
实施例B5：磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂刺激骨髓来源树突状细胞能力研究
由于cGAS-STING信号通路激活会刺激树突状细胞分泌β-干扰素，因此，为检测实施例A5制得的磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂cGAS-STING信号通路激活能力，将实施例A5制得的磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂与骨髓来源树突状细胞共同孵育24h，通过酶联免疫吸附测定检测β-干扰素的表达，并加入实施例A1制备得到的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂、锰离子作为对比。
实验分组如下：
实施例B5.1：对照组(未经处理的骨髓来源树突状细胞)；
实施例B5.2：氯化锰溶液(锰离子浓度为13.5μg/mL)；
实施例B5.3：实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂(鲱鱼精DNA浓度为10μg/mL，碳酸钙浓度为250μg/mL)。
实施例B5.4：实施例A5制得的磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂(RNA浓度为1μg/mL，锰元素浓度为13.5μg/mL)。
酶联免疫吸附测定的结果如图12(b)所示，结果显示实施例A5制得的磷酸锰RNA基cGAS-STING佐剂具有与实施例A1制备得到的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂相同的性质，能够有效刺激骨髓来源树突状细胞分泌β-干扰素，且高于实施例B5.2，说明A5制得的磷酸锰鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂具比二价锰离子(Mn2+)有更强的刺激效果，原因是该颗粒能够促进提高胞内Mn的浓度并且释放RNA。
实施例C：核酸基cGAS-STING佐剂在活体水平对cGAS-STING信号通路激活的检测
为多维度阐明微酸响应性释放无机材料核酸基cGAS-STING佐剂的刺激效果，本实施例以碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂为例，对实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂在活体水平对cGAS-STING信号通路的激活进行检测，并且将其与商业化的cGAS-STING佐剂cGAMP、无微酸响应性释放的DNA碳酸钙混合物进行对比，以进一步阐明该DNA基cGAS-STING佐剂的有效性与作用机制。
将带有B16-F10黑色素瘤的小鼠各分为四组，其中包括：
实施例C1：对照组；
实施例C2：瘤内注射cGAMP(100μg/kg)；
实施例C3：瘤内注射碳酸钙鲱鱼精DNA碳酸钙混合物(碳酸钙鲱鱼精DNA剂量500μg/kg，碳酸钙剂量为12.5mg/kg，将两者直接物理混合制得鲱鱼精DNA碳酸钙混合物)；
实施例C4：瘤内注射实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂(DNA剂量500μg/kg，碳酸钙剂量为12.5mg/kg)。
对荷瘤小鼠瘤内注射碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂(剂量：DNA剂量500μg/kg，碳酸钙剂量为12.5mg/kg)，碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂每两天注射一次，共注射五次(低剂量，多次注射)，在完成第五次注射的24h后检测通过流式细胞术和酶联免疫吸附测定肿瘤中免疫细胞及肿瘤中细胞因子的变化。结果如图13所示。
图13(a)代表肿瘤内树突状细胞共刺激分子表达的情况，图13(b)代表肿瘤内IFN-β分泌水平，图13(c)代表肿瘤内活化型NK细胞的比例，图13(d)代表肿瘤内活化CD8+T细胞的比例。每张图中圆点代表对照组，方形代表注射cGAMP组，正三角形代表注射DNA碳酸钙混合物组，倒三角形代表注射碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂组。每组的五个点代表五个平行样的检测数据。
结果显示，如图13(a)所示，在注射碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂后，肿瘤内树突状细胞共刺激分子CD80、CD86的表达明显上调，这表明该DNA基cGAS-STING佐剂能够有效刺激DC成熟并促进其启动免疫应答；如图13(b)所示，在注射碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂后，肿瘤内IFN-β分泌水平明显上调，这表明碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂具有刺激cGAS-STING信号通路功能并且能够启动先天性免疫应答；如图13(c)所示，在注射碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂后，肿瘤内活化型NK细胞的比例明显增加，这表明碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂能够有效增强NK细胞活性，促进先天性免疫应答；如图13(d)所示，在注射碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂后，肿瘤内活化型T细胞的比例明显增加，这表明碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂能够有效增强T细胞活性，促进适应性免疫应答；这些免疫细胞比例的变化和细胞因子水平的改变均有助于抑制肿瘤生长，说明该碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂能够引起抗肿瘤免疫反应，从而有助于提高抗肿瘤治疗效果。
整体而言，碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂与cGAMP具有类似甚至更优的效果，而DNA碳酸钙混合物组效果不显著，说明碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂具有刺激cGAS-STING信号通路的功能，且通过微酸性条件下在胞内释放DNA实现这一功能。
实施例D：瘤内注射核酸基cGAS-STING佐剂用于肿瘤免疫治疗
实施例D1：瘤内注射碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂用于B16-F10肿瘤免疫治疗
在以上结果的基础上，本实施例以碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂，探究了瘤内注射核酸基cGAS-STING佐剂用于肿瘤免疫治疗的能力，并且将其与商业化的cGAS-STING佐剂cGAMP、无微酸响应性释放的DNA碳酸钙混合物进行对比，以进一步阐明该DNA基cGAS-STING佐剂的有效性与作用机制。
将带有B16-F10黑色素瘤小鼠各分为四组，其中包括：
实施例D1.1：对照组；
实施例D1.2：瘤内注射cGAMP(100μg/kg)；
实施例D1.3：瘤内注射DNA碳酸钙混合物(DNA剂量500μg/kg，碳酸钙剂量为12.5mg/kg，将两者直接混合制得DNA碳酸钙混合物)；
实施例D1.4：瘤内注射通过实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂(鲱鱼精DNA剂量500μg/kg，碳酸钙剂量为12.5mg/kg)。
对小鼠进行相应的治疗后，测量其肿瘤的生长，结果见于图14，为不同治疗组小鼠的生长曲线。结果表明，实施例D1.4的肿瘤体积明显低于实施例D1.1、实施例D1.2和实施例D1.3，说明注射碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂后的肿瘤生长得到有效的抑制。表明碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂能够实现有效的黑色素肿瘤免疫治疗。整体而言，碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂与cGAMP具有类似甚至更优的效果，说明碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂具有刺激cGAS-STING信号通路的功能，且通过微酸性条件下在胞内释放DNA实现这一功能。
cGAMP是市场已有的小分子药物，能够刺激STING通路，市场价格较高，与该市售试剂相比，本申请的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂具有原料成本更低、制备方法简单、刺激效果强的多重优点，并且具有较好的安全性，具有市场应用潜力。
并且，相较于该小分子试剂，本申请所得到的佐剂具有纳米或微米级结构，在体内具有更好的药代动力学、生物分布的参数，能够延长在病灶部位的作用时间，从而引起持续的免疫刺激，还具有改善肿瘤微环境的能力，逆转免疫抑制，增强肿瘤治疗效果。
实施例D2：瘤内注射碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂用于结肠癌肿瘤免疫治疗
上述结论在结肠癌皮下肿瘤模型中也得到了验证。将带有结肠癌皮下肿瘤模型的小鼠分为四组，其中包括：
实施例D2.1：对照组；
实施例D2.2：瘤内注射cGAMP(100μg/kg)；
实施例D2.3：瘤内注射鲱鱼精DNA和碳酸钙的混合物，(鲱鱼精DNA剂量500μg/kg，碳酸钙剂量为12.5mg/kg，将两者直接物理混合制得鲱鱼精DNA碳酸钙混合物)；
实施例D2.4：瘤内注射通过实施例A1制得的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂(鲱鱼精DNA剂量500μg/kg，碳酸钙剂量为12.5mg/kg)。
对小鼠进行相应的治疗后，测量其肿瘤的生长，结果见于图15。图15为不同治疗组小鼠的生长曲线。结果表明，实施例D2.4的肿瘤体积明显低于实施例D2.1、实施例D2.2和实施例D2.3，说明注射碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂后的肿瘤生长得到有效的抑制。表明，瘤内注射碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂能够有效抑制结肠癌肿瘤的生长。整体而言，碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂与cGAMP具有类似甚至更优的效果，而DNA碳酸钙混合物组效果不显著，说明碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂具有刺激cGAS-STING信号通路的功能，且通过微酸性条件下在胞内释放DNA实现这一功能。
实施例E：一种具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗
实施例E1：一种具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗的制备方法和性质检测
为进一步拓展该类佐剂的使用范围，考虑到肿瘤细胞内本身存在大量的DNA且碳酸钙肿瘤DNA基cGAS-STING佐剂具有cGAS-STING刺激效果，我们通过将肿瘤细胞裂解后得到肿瘤裂解物，肿瘤裂解物中包含DNA和肿瘤抗原，利用碳酸钙直接装载肿瘤裂解物，对DNA和肿瘤抗原同时进行装载，制备一种核酸基具有cGAS-STING激活功能自体肿瘤疫苗。
所述具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗的制备方法：
将肿瘤细胞用75℃水浴2h灭活，并用超声辅助将其溶于4M至8M的尿素中，配成蛋白浓度为1mg/mL的肿瘤细胞裂解物溶液。将其加热至95℃并维持10min，随后静置使其恢复至室温；往1mL上述肿瘤裂解物溶液中加入140μL 0.5M的CaCl2水溶液，并混合均匀，随后往上述混合液中缓慢滴加140μL 0.5M的Na2CO3水溶液，搅拌约30min，得到白色悬浊液，溶液中的白色颗粒即为基于DNA基cGAS-STING佐剂自体肿瘤疫苗，可通过离心洗涤得到纯净的基于DNA基cGAS-STING佐剂自体肿瘤疫苗颗粒。
所述具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗的自体的性质检测：
对实施例E1制得的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗进行定性检测，分别进行扫描电镜检测、动态光散射检测。
其中，扫描电镜检测的结果和动态光散射检测的结果分别如图16和图17所示，结果显示，实施例E1制得的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗颗粒粒径均一，主要集中在1100nm左右，为球形或椭球形颗粒。
该佐剂中来自于肿瘤裂解物的DNA能够发挥STING通路刺激的功能，同时含有的肿瘤抗原能够进一步帮助免疫细胞建立针对肿瘤的活化基质，二者结合能使抗肿瘤免疫反应最大化，实现更好的肿瘤治疗效果，并且引起免疫记忆效应，抑制肿瘤的转移和复发。
实施例E2：具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗刺激报告细胞能力研究
为多维度阐述该技术的广泛适用性和有效性，我们利用cGAS-STING信号报告细胞对实施例E1制得的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗进行cGAS-STING信号激活能力检测，并加入肿瘤细胞裂解物作为对比。具体而言，将实施例E1制得的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗颗粒进行cGAS-STING信号激活能力检测，采用实施例B2的方法。
实验分组如下：
实施例E2.1：对照组(未经处理的报告细胞)；
实施例E2.2：肿瘤细胞裂解物(浓度为50μg/mL)；
实施例E2.3：通过实施例E1制得的基于核酸基cGAS-STING佐剂自体肿瘤疫苗(肿瘤细胞裂解物浓度为50μg/mL，碳酸钙浓度为350μg/mL)。
结果如图18所示，结果显示，实施例E1制得的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗能够有效提高培养液上清中Lucia荧光素酶水平，而细胞裂解物本身效果不显著，这说明实施例实施例E1制得的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗颗粒具有刺激cGAS-STING信号通路的功能，且通过碳酸钙介导的微酸性DNA胞内释放实现这一功能。
实施例E3：具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗的刺激骨髓来源树突状细胞能力研究
为进一步展现具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗的优势，对实施例E1制得的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗颗粒在细胞水平对其刺激骨髓来源树突状细胞的行为进行检测。将实施例E1制得的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗颗粒与骨髓来源树突状细胞共同孵育24h，并且与肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞裂解物碳酸钙混合物进行对比。通过流式细胞术检测树突状细胞表面共刺激分子的表达和SIINFEKL-H2Kb分子的表达。
实验分组如下：
实施例E3.1：对照组(未经处理的骨髓来源树突状细胞)；
实施例E3.2：肿瘤细胞裂解物(浓度为50μg/mL)；
实施例E3.3：肿瘤细胞裂解物碳酸钙混合物(肿瘤细胞裂解物浓度为50μg/mL，碳酸钙浓度为350μg/mL，将两者直接物理混合制得肿瘤细胞裂解物碳酸钙混合物)；
实施例E3.4：通过实施例E1制得的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗(肿瘤细胞裂解物浓度为50μg/mL，碳酸钙浓度为350μg/mL)。
流式细胞术的检测结果如图19和图20所示，结果显示，实施例E3.4中树突状细胞表面共刺激分子和SIINFEKL-H2Kb分子的表达最高，并且实施例E3.4与实施例E3.3相比效果更好，说明实施例E1制得的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗颗粒能够有效促进骨髓来源树突状细胞CD80和CD86共刺激分子和SIINFEKL-H2Kb分子的表达，与此同时，该效果基于碳酸钙和肿瘤裂解物形成的整体，而非二者的简单混合，这表明本申请所述自体肿瘤疫苗能够有效促进树突状细胞成熟和对抗原进行交叉呈递，有助于启动特异性抗肿瘤免疫应答。
实施例E4：具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗的肿瘤预防效果
为展现具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗在活体水平的抗肿瘤效果，我们在小鼠水平上开展了肿瘤预防实验，并且将其与商业化的cGAS-STING佐剂cGAMP、无微酸响应性释放的肿瘤裂解物和碳酸钙混合物进行对比，以进一步阐明该具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗的有效性与作用机制。
将小鼠分为四组，其中包括：
实施例E4.1：对照组；
实施例E4.2：皮下注射cGAMP和肿瘤细胞裂解物，(cGAMP剂量为100μg/kg；肿瘤细胞裂解物剂量为5mg/kg，将两者直接混合后注射)；
实施例E4.3：皮下注射肿瘤细胞裂解物与碳酸钙混合物(碳酸钙剂量为35mg/kg；肿瘤细胞裂解物剂量为5mg/kg，将两者直接物理混合后注射)；
实施例E4.4：注射实施例E1制备的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗，(碳酸钙剂量为35mg/kg；肿瘤细胞裂解物剂量为3mg/kg)。
在小鼠腹部右侧通过皮下注射方式的注射疫苗，每七天注射一次，共三次。在最后一次注射完疫苗的第六天取小鼠外周血进行流式分析。图21为不同治疗组小鼠体内肿瘤特异性的T细胞测试结果图。在最后一次注射完疫苗的七天，在小鼠腹部左侧接种黑色素肿瘤，随后测量肿瘤的生长，结果见于图22。
为检测小鼠在接种疫苗后体内是否产生了肿瘤特异性的T细胞，我们通过流式细胞数分析了小鼠外周血中肿瘤特异性的T细胞，图21结果显示，实施例E4.4诱导的肿瘤特异性的T细胞相对其它组有显著性提高，这表明具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗能够有效刺激小鼠体内肿瘤特异性的T细胞产生，这说明具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗能够有效启动抗肿瘤特异性免疫应答。
为检测小鼠在接种疫苗后能否有效抑制肿瘤生长，我们通过在接种了不同疫苗的小鼠皮下接种B16-OVA细胞肿瘤细胞后观察其生长，图22结果显示，实施例E4.4诱导的肿瘤特异性的T细胞相对其它组有显著性抑制，注射具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗后肿瘤生长得到了有效的抑制，这表明具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗具有优异的肿瘤预防效果。
实施例E5：具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗的抑制术后肿瘤复发效果
为拓展具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗在活体水平的适用范围，我们进一步展现了该疫苗联合anti-PD-1免疫检查点阻断法在抑制术后肿瘤复发的效果。在小鼠腹部左侧接种黑色素肿瘤，待肿瘤长至200mm3时，通过手术切除90％肿瘤，构建黑色素瘤不完全切除小鼠模型，手术后第几天将小鼠分为四组，并进行给药，其中包括：
实施例E5.1：对照组；
实施例E5.2：静脉注射anti-PD-1(剂量为1mg/kg)；
实施例E5.3：皮下注射基于实施例E1制备的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗(碳酸钙剂量为35mg/kg；肿瘤裂解物剂量为3mg/kg)；
实施例E5.4：静脉注射anti-PD-1，皮下注射基于实施例E1制备的具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗组(anti-PD-1剂量为1mg/kg；碳酸钙剂量为35mg/kg；肿瘤裂解物剂量为3mg/kg)。
随后测量肿瘤的生长，结果见于图23。图23结果显示，注射具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗的肿瘤复发得到了明显的抑制，并且在联合anti-PD-1免疫疗法的情况下效果更为显著，这表明具有cGAS-STING激活功能的核酸基自体肿瘤疫苗在与免疫检查点阻断疗法联用后能够抑制肿瘤复发。
实施例F：多酚/阳离子聚合物修饰核酸基cGAS-STING佐剂用以制备多功能佐剂或疫苗
为进一步拓展该技术的适用范围，我们使用多酚或阳离子聚合物对核酸基cGAS-STING佐剂进行表面修饰。
实施例F1：多酚/阳离子聚合物修饰核酸基cGAS-STING佐剂
所述多酚/阳离子聚合物修饰核酸基cGAS-STING佐剂的制备方法及性质检测：
取2.5mg核酸基cGAS-STING佐剂，本实施例中以碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂为例，往100μL含2.5mg通过实施例A1的方法制备得到的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂中加入20μL 50g/L的多酚/阳离子聚合物(本实施例中以聚乙烯亚胺、鞣酸为例)，涡旋五分钟后，离心，收集颗粒。
制得的聚乙烯亚胺修饰核酸基cGAS-STING佐剂和鞣酸修饰核酸基cGAS-STING佐剂颗粒如图24所示，颗粒均呈稳定、呈单分散状态。
实施例F2：核酸基cGAS-STING多功能佐剂/疫苗
实验分组如下：
实施例F2.1：未修饰的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂(鲱鱼精DNA浓度为10μg/mL，碳酸钙浓度为250μg/mL)；
实施例F2.2：实施例F1中制备得到的经鞣酸修饰的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂(鲱鱼精DNA浓度为10μg/mL，碳酸钙浓度为250μg/mL)；
实施例F2.3：实施例F1中制备得到的经聚乙烯亚胺修饰的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂(鲱鱼精DNA浓度为10μg/mL，碳酸钙浓度为250μg/mL)；
所述核酸基cGAS-STING多功能佐剂的制备方法与性质检测：
将通过实施例F1的制备方法制得的多酚/阳离子聚合物修饰的核酸基cGAS-STING佐剂(本实施例以聚乙烯亚胺修饰的核酸基cGAS-STING佐剂、鞣酸修饰的核酸基cGAS-STING佐剂为例)分别与其它佐剂混合(本实施例中，其它佐剂以CpG为例)，通过离心收集上清，通过Nanodrop微量分光光度计测上清中CpG的浓度。
所述核酸基cGAS-STING疫苗的制备方法与性质检测：
将通过实施例F1的制备方法制得的多酚/阳离子聚合物修饰核酸基cGAS-STING佐剂(本实施例以聚乙烯亚胺修饰核酸基cGAS-STING佐剂、鞣酸修饰核酸基cGAS-STING佐剂为例)分别与抗原混合(本实施例中，抗原以模式抗原鸡卵清蛋白为例)，通过离心收集上清，通过BCA法测上清中鸡卵清蛋白的浓度。
结果如图25所示，相比于未处理的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂，其经聚乙烯亚胺或鞣酸修饰后，都能够有效提升CpG和鸡卵清蛋白的吸附效率，说明多酚/阳离子聚合物修饰核酸基cGAS-STING佐剂具有较强的吸附能力，可用于制备核酸基cGAS-STING多功能佐剂/疫苗。吸附抗原能有效引起特异性免疫反应，提高免疫治疗精度，吸附其他佐剂能够联合多种免疫刺激途径，放大免疫反应，从而达到更好的疗效。
实施例F3：核酸基cGAS-STING多功能佐剂刺激骨髓来源树突状细胞能力研究
对实施例F2制得的核酸基cGAS-STING多功能佐剂颗粒在细胞水平对其刺激骨髓来源树突状细胞的行为进行检测。将实施例F2制得的核酸基cGAS-STING多功能佐剂颗粒与骨髓来源树突状细胞共同孵育24h。通过流式细胞术检测树突状细胞表面共刺激分子的表达和/或SIINFEKL-H2Kb分子的表达。
实验分组如下：
实施例F3.1：空白对照组(未经处理的骨髓来源树突状细胞)；
实施例F3.2：未修饰的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂与CpG直接物理混合(鲱鱼精DNA浓度为10μg/mL，碳酸钙浓度为250μg/mL，CpG浓度为1μg/mL)；
实施例F3.3：通过实施F2制备的经鞣酸修饰的核酸基cGAS-STING多功能佐剂(鲱鱼精DNA浓度为10μg/mL，碳酸钙浓度为250μg/mL，CpG浓度为1μg/mL)；
实施例F3.4：通过实施F2制备的经聚乙烯亚胺修饰的核酸基cGAS-STING多功能佐剂(鲱鱼精DNA浓度为10μg/mL，碳酸钙浓度为250μg/mL，CpG浓度为1μg/mL)；
流式细胞术的检测结果如图26所示，结果显示，实施例F3.3和实施例F3.4中骨髓来源树突状细胞CD80和CD86共刺激分子表达相比于实施例F3.2具有更强的刺激效果，一方面表明再次证明该核酸基cGAS-STING佐剂的可进一步工程化协同其它佐剂共同起效，另一方面说明该策略得到的多功能佐剂相较于有效成分的简单混合具有更好的效果，且通过该策略得到的产物，其稳定性更好，同时还可提高被吸附的免疫佐剂或抗原的生物利用度。
实施例F4：核酸基cGAS-STING疫苗刺激骨髓来源树突状细胞能力研究
对实施例F2制得的核酸基cGAS-STING疫苗颗粒在细胞水平对其刺激骨髓来源树突状细胞的行为进行检测。将实施例F2制得的核酸基cGAS-STING疫苗颗粒与骨髓来源树突状细胞共同孵育24h。通过流式细胞术检测树突状细胞表面共刺激分子的表达和/或SIINFEKL-H2Kb分子的表达。
实验分组如下：
实施例F4.1：空白对照组(未经处理的骨髓来源树突状细胞)；
实施例F4.2：未修饰的碳酸钙鲱鱼精DNA基cGAS-STING佐剂与鸡卵清蛋白直接物理混合(鲱鱼精DNA浓度为10μg/mL，碳酸钙浓度为250μg/mL，鸡卵清蛋白浓度为5μg/mL)；
实施例F4.3：通过实施F2制备的经鞣酸修饰的核酸基cGAS-STING疫苗(鲱鱼精DNA浓度为10μg/mL，碳酸钙浓度为250μg/mL，鸡卵清蛋白浓度为5μg/mL)；
实施例F4.4：通过实施F2制备的经聚乙烯亚胺修饰的核酸基cGAS-STING疫苗(鲱鱼精DNA浓度为10μg/mL，碳酸钙浓度为250μg/mL，鸡卵清蛋白浓度为5μg/mL)；
如图27所示，实施例F4.3和实施例F4.4中骨髓来源树突状细胞SIINFEKL-H2Kb分子的表达相比于实施例F4.2具有更强的刺激效果，一方面表明核酸基cGAS-STING疫苗能够有效促进树突状细胞成熟和对抗原进行交叉呈递，有助于启动特异性抗肿瘤免疫应答，另一方面说明该策略得到的核酸基cGAS-STING疫苗相较于有效成分的简单混合具有更好的效果，且通过该策略得到的产物，其稳定性更好，同时还可提高被吸附的免疫佐剂或抗原的生物利用度。
综上，本发明提供的核酸基cGAS-STING免疫佐剂具有良好的理化性质，能够激活机体的天然免疫系统、促进抗原特异性免疫细胞的产生和增加肿瘤内杀伤性免疫细胞的浸润，从而抑制肿瘤生长，实现肿瘤治疗。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种核酸基cGAS-STING免疫佐剂，其特征在于：所述核酸基cGAS-STING免疫佐剂包括核酸和无机材料；其中，所述无机材料和核酸复合形成纳米或微米颗粒，所述核酸基cGAS-STING免疫佐剂可酸响应性分解并释放所述核酸。
2.根据权利要求1所述的核酸基cGAS-STING免疫佐剂，其特征在于：所述无机材料选自碳酸钙、碳酸锰、碳酸镁、碳酸铝、碳酸钴、碳酸锌、碳酸铁、碳酸锡、磷酸钙、磷酸锰、磷酸镁、磷酸铝、磷酸钴、磷酸铁、磷酸锌、磷酸锡、焦磷酸钙、焦磷酸锰、焦磷酸镁、焦磷酸铝、焦磷酸钴、焦磷酸铁、焦磷酸锌、焦磷酸锡、三聚磷酸钙、三聚磷酸锰、三聚磷酸镁、三聚磷酸铝、三聚磷酸钴、三聚磷酸铁、三聚磷酸锌、三聚磷酸锡、六聚磷酸钙、六聚磷酸锰、六聚磷酸镁、六聚磷酸铝、六聚磷酸钴、六聚磷酸铁、六聚磷酸锌、六聚磷酸锡、膦酸钙、膦酸锰、膦酸镁、膦酸铝、膦酸钴、膦酸铁、膦酸锌、膦酸锡、磷酸氢钙、磷酸氢锰、氢氧化钙、氢氧化锰、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化钴、氢氧化锌、氢化钙和二氧化锰中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的核酸基cGAS-STING免疫佐剂，其特征在于：所述核酸基cGAS-STING免疫佐剂的粒径为10-10000nm。
4.根据权利要求1所述的核酸基cGAS-STING免疫佐剂，其特征在于：所述纳米或微米颗粒修饰有多酚或阳离子聚合物。
5.根据权利要求4所述的核酸基cGAS-STING免疫佐剂，其特征在于：所述多酚选自单宁酸、没食子酸、多巴胺、聚多巴胺、表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的核酸基cGAS-STING免疫佐剂，其特征在于：所述阳离子聚合物选自壳聚糖、聚赖氨酸、阳离子脂质体、聚乙烯亚胺、聚精氨酸中的一种或多种。
7.权利要求1-6任一项所述的核酸基cGAS-STING免疫佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将核酸与含所述无机材料中金属阳离子的溶液、含所述无机材料中阴离子的溶液混合，复合得到所述核酸基cGAS-STING免疫佐剂。
8.一种核酸基无机材料在制备cGAS-STING佐剂中的应用，其特征在于：所述核酸基无机材料由无机材料和核酸复合形成纳米或微米颗粒得到，核酸基无机材料可酸响应性分解并释放所述核酸。
9.权利要求1-6任一项所述的核酸基cGAS-STING免疫佐剂在制备肿瘤治疗制剂中的应用。
10.一种多功能佐剂，其特征在于：所述多功能佐剂包括第一佐剂和第二佐剂，所述第一佐剂选自权利要求4-6任一项所述的核酸基cGAS-STING免疫佐剂，所述第二佐剂选自R837、R848、聚肌苷酸胞苷酸、CpG、脂多糖、单磷酰脂质体A中的一种或多种。
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