CN118048374A - 基于Cas6e的RNAi基因干扰系统和RNA编辑系统的构建与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas6e开发的在原核细胞中的RNAi基因干扰系统和真核细胞中的定点RNA编辑系统。本发明的方法是进行RNAi基因干扰时，Cas6e与crRNA形成复合体，促进crRNA寻找和结合目标mRNA的RBS区域，从而阻断mRNA与核糖体结合，显著降低mRNA翻译水平，最终导致基因干扰的目的。在进行RNA编辑时，Cas6e与腺嘌呤脱氨酶ADAR2(E488Q)的催化结构域融合表达，随后与crRNA形成复合体，将ADAR2的催化结构域带到指定的RNA位置完成定点A到I的编辑。上述两个系统基于Cas6e的ssRNA结合活性，实现了的RNA水平的调控和编辑。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及RNAi基因干扰系统和RNA编辑系统的构建与应用，更具体涉及基于CRISPR-Cas6e的RNAi基因干扰技术和定点RNA编辑技术。
背景技术
精确的基因调控和可编程的RNA编辑在RNA水平提供了关键的调控层，对基因功能分配、细胞表型工程和代谢工程至关重要。在自然界中，细胞已经演化出多种调整基因表达的方式，以适应发育和适应不断变化的环境，包括细菌中通过转录活性小非编码RNA(sRNAs)介导的基因抑制和真核细胞中通过microRNA(miRNAs)介导的RNA干扰(RNAi)，它们已经发展成为强大的基因调控工具。sRNAs和miRNAs介导基因调控的基本机制依赖于它们能够在mRNA和它们的目标反义区域之间形成碱基对。为了高效地定位它们各自的靶向mRNAs，sRNAs和miRNAs都与RNA分子伴侣结合，促进它们与mRNA的相互作用。在细菌中存在Hfq和ProQ这样的RNA分子伴侣与sRNA骨架相互作用，充当RNA媒介促进sRNA-mRNA的退火结合。这些分子伴侣是通过中和sRNAs的负电荷，减少两个RNA底物之间的静电排斥，并将它们带到紧密接触中来实现的。同样，在真核细胞中，miRNAs与Argonaute结合，它也通过其带正电表面促进miRNAs与mRNA的相互作用，促使siRNA-mRNA的退火结合。虽然sRNAs介导的基因调控对于细菌中的单基因调控非常强大，但在体外组装重复的长sRNA骨架并在体内进行多基因调控可能更具挑战性，因此在多基因抑制方面其实用性受到限制。
除了这些自然基因调控系统外，过去二十年间还发展了基于外源DNA结合蛋白的新策略。其中，锌指蛋白、转录激活物样效应子(TALE)、CRISPR-Cas核酸酶蛋白等已经崭露头角。虽然前两个系统设计和使用起来困难且昂贵，CRISPR-Cas系统仅需引导RNA(gRNA)和失去切割活性的核酸酶Cas(dCas)蛋白，使其更易于设计和应用。已经开发出多种dCas蛋白，包括Type II-A dCas9、Type V dCas12a和Type I Cascade，作为通过靶向启动子区域以异构地阻断转录的高效工具。通过简单地改变sgRNA或crRNA的目标区域，可以轻松实现多基因抑制。理论上，使用正交序列同时抑制数百个基因是可能的。然而，在许多细菌中，dCas蛋白表现出一定的毒性，可能导致细菌自身生长缓慢。这种毒性在多基因干扰的情况下尤其成为问题，因为成功的多基因干扰需要高浓度的dCas蛋白。虽然dCas蛋白在哺乳动物细胞中的毒性不是问题，但dCas蛋白的大尺寸使其难以装载到腺相关病毒(AAV)等运输工具中。此外，用于dCas9的多个重复长sgRNA骨架也难以组装且不稳定，多个sgRNA的组装仍然存在挑战，限制了其在多基因干扰中的实用性。
与sRNAs、miRNAs和dCas蛋白介导的基因调控相比，RNA编辑不导致mRNA含量的改变。相反，它涉及修改转录本以改变它们的功能，包括蛋白编码基因功能和RNA剪接。与sRNAs和miRNAs介导的基因调控类似，gRNA与mRNA的退火也是RNA编辑的先决条件。虽然gRNA识别其目标的精确机制尚不清楚，但已有研究表明MRP1/MRP2可以作为促进gRNA与mRNA的退火的媒介，从而进行后续的RNA编辑。RNA编辑分为三类，包括插入和删除到目标mRNAs的尿苷酸，以及核苷酸的改变。由RNA脱氨酶(ADARs)介导的RNA编辑是最普遍的类型，它将腺苷转化为肌苷(A到I)在双链RNA(dsRNA)底物中。由于肌苷被识别为鸟苷，编辑结果表现为A到G的转换突变。有两个功能性的ADAR同源体ADAR1和ADAR2。ADAR1主要靶向重复区域，而ADAR2专注于非重复区域。通过融合gRNA以及ADAR招募结构域，ADAR2已被改造用于RNA编辑应用，以增强招募ADARs进行高效的RNA编辑。这些ADAR招募结构域可以是自然存在的ADAR底物、招募ADAR2与MS2融合的MS2发卡，或者招募Cas6e或Cas13a融合的ADAR2的crRNA，证明了能够促进gRNA和mRNA退火，或者促进ADAR2招募的蛋白伙伴可以增强编辑效率。
综上所述，现有的基因调控和可编程的RNA编辑的技术仍需进一步优化，主要从三个方面改进：1.寻找更小的工具蛋白；2.降低基因调控和可编程的RNA编辑工具的构建难度。3.基因调控和可编程的RNA编辑工具可跨物种使用，更具普适性。
发明内容
本发明的目的是提供使用基于Cas6e的精细调节基因表达水平和RNA定点编辑的方法，可在原核细胞中精细地调控一个或多个靶基因mRNA表达，在真核细胞中实现定点RNA编辑。
本发明提供一种以基因精细调控为目的基于EcCas6e蛋白的原核生物RNAi基因干扰系统，其特征在于，包括(1)EcCas6e作为核酸酶；(2)crRNA是由能与靶标基因的mRNA的RBS区域互补的序列和EcCas6e可识别结合并切割的特定发卡结构序列组成；(3)可促进crRNA与mRNA结合的蛋白，例如MRP1或MRP2。
具体地，所述的EcCas6e识别结合并切割的特定发卡结构序列如SEQ ID NO:1中所示；所述的EcCas6e的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的crRNA中与靶标基因的mRNA的RBS区域序列互补的长度为10～50bp；任选地，所述的crRNA中与靶标基因的mRNA序列互补时允许部分碱基错配；所述的crRNA中包含一个或多个靶标基因的mRNA的RBS区域序列互补序列。
优选地，EcCas6e还与MRP1或MRP2中一个或两个的一个拷贝或多拷贝融合，所述的MRP1氨基酸序列如SEQ ID NO:3中所示，所述的MRP2氨基酸序列如SEQ ID NO:4中所示。
本发明提供一种以基因精细调控为目的基于EcCas6e蛋白的原核生物RNAi基因干扰的方法，其在原核生物中导入下述三个部分的表达元件：(1)EcCas6e作为核酸酶；(2)crRNA是由能与靶标基因的mRNA的RBS区域互补的序列和EcCas6e可识别结合并切割的特定发卡结构序列组成；(3)可促进crRNA与mRNA结合的蛋白；
任选地，所述EcCas6e和crRNA位于一个质粒中表达，或者位于两个质粒中表达；
另外优选地，该方法中EcCas6e可整合到宿主基因组中表达，crRNA位于质粒中表达；
或者EcCas6e位于质粒中表达，crRNA整合到宿主基因组中表达。
在具体实施方式中，所述的EcCas6e的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的crRNA中与靶标基因的mRNA的RBS区域序列互补的长度为10～50bp；任选地，所述的crRNA中与靶标基因的mRNA序列互补时允许部分碱基错配；具体地，所述的crRNA中包含一个或多个靶标基因的mRNA的RBS区域序列互补序列；
优选地，EcCas6e还与MRP1或MRP2中一个或两个的一个拷贝或多拷贝融合，优选地，所述的MRP1氨基酸序列如SEQ ID NO:3中所示，所述的MRP2氨基酸序列如SEQ ID NO:4中所示。
具体地，所述原核生物是大肠杆菌。
本发明也提供一种以基因精细调控为目的基于EcCas6e蛋白的真核细胞RNA定点编辑系统，其特征在于，包括(1)EcCas6e作为核酸酶；(2)crRNA是由能与靶标基因的mRNA的RBS区域互补的序列和EcCas6e可识别结合并切割的特定发卡结构序列组成；(3)与EcCas6e融合表达的ADAR2蛋白；
优选地，所述的EcCas6e的氨基酸序列如SEQ ID NO:2中所示；
进一步优选地，所述的EcCas6e与腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域的N端或C端融合，两个蛋白之间的Linker，其长度为9～46aa，进一步优选地，在EcCas6e与腺嘌呤脱氨酶ADAR2融合蛋白的N端或C端添加核定位序列，具体地核定位序列如SEQ ID NO:5中所示。
具体地，所述的腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域的氨基酸如SEQ ID NO:6中所示；
所述的crRNA的长度为20～50bp，所述的crRNA中含有特定编辑位点设计的碱基，该碱基位置介于crRNA的第15～25位之间。
本发明还提供一种以基因精准编辑为目的基于EcCas6e蛋白的真核细胞RNA定点编辑的方法，其特征在于，向真核细胞中导入下述三个部分的表达元件：(1)EcCas6e作为核酸酶；(2)crRNA是由能与靶标基因的mRNA的RBS区域互补的序列和EcCas6e可识别结合并切割的特定发卡结构序列组成；(3)与EcCas6e融合表达的ADAR2蛋白。
优选地，所述的EcCas6e的氨基酸序列如SEQ ID NO:2中所示；优选地，所述的EcCas6e与腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域的N端或C端融合表达，两个蛋白之间的Linker，其长度为9～46aa，进一步优选地，在EcCas6e与腺嘌呤脱氨酶ADAR2融合蛋白的N端或C端添加核定位序列，具体地核定位序列如SEQ ID NO:5中所示；所述的腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域的氨基酸如SEQ ID NO:6中所示；所述的crRNA的长度为20～50bp，所述的crRNA中含有特定编辑位点设计的碱基，该碱基位置介于crRNA的第15～25位之间。
本发明的方法是进行RNAi基因干扰时，Cas6e与crRNA形成复合体，促进crRNA寻找和结合目标mRNA的RBS区域，从而阻断mRNA与核糖体结合，显著降低mRNA翻译水平，最终导致基因干扰的目的。在进行RNA编辑时，Cas6e与腺嘌呤脱氨酶ADAR2(E488Q)的催化结构域融合表达，随后与crRNA形成复合体，将ADAR2的催化结构域带到指定的RNA位置完成定点A到I的编辑。上述两个系统基于Cas6e的ssRNA结合活性，实现了的RNA水平的调控和编辑。本发明对上述也进行实验研究和证实。
附图说明
图1为基于Cas6e蛋白和MRP1/MRP2蛋白的基因干扰示意图。
图2为构建不同打靶crRNA质粒的流程示意图。
图3为DH5α-RFP菌株构建示意图。
图4为基于Cas6e-crRNA系统敲低mScarlet基因表达。
图5为Cas6e-crRNA干扰系统的对大肠杆菌的细胞毒性。
图6为crRNA的长度和互补位置对于基因干扰效率的影响。
图7为mNeonGreen和mScarlet双基因干扰实验。
图8为Cas6e-crRNA干扰系统敲低多个基因表达增加琥珀酸产量。
图9为Cas6e-crRNA干扰系统敲低多个基因表达降低大肠杆菌抗逆性。
图10为基于Cas6e-crRNA系统的RNA定点编辑。
具体实施方式
以下实施例将更详细地描述本发明，这些实施例仅用于示例本发明，本发明的范围不限于这些实施例。
除非特别指明，本发明书使用的所有科学技术术语具有与本发明所属领域的技术人员所通常理解相同的含义。本发明书使用的实验方法为本发明所属领域常用和已知的。
其中实施例中用到的质粒、菌种和引物信息如下。
表1本发明涉及的质粒和菌种信息
表2本发明所用引物
相关序列信息如下：
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:4
SEQ ID NO:5
SEQ ID NO:6
实施例1：基于Cas6E的RNAi基因干扰技术的单基因干扰
本实施例中基于Cas6E的RNAi基因干扰方法包含两种质粒，一种质粒表达Cas6E蛋白，一种质粒表达crRNA。
本实施例中所有的质粒构建都在大肠杆菌DH5α和TOP10中完成。工程菌都在大肠杆菌DH5α的基础上改造而来。
本实施例中质粒构建的表达载体是在可商业获得的pACYCDuet1，pUC19，pCDFDuet-1和pRSFDuet-1的质粒基础上改造完成。其他实验材料均可商业获得。本实施例中涉及到的质粒和菌株如表1所示。
1.1构建RNAi基因干扰技术测试所需的工程菌
本实施例中以大肠杆菌DH5α为出发菌株成工程菌DH5α-RFP。为了方便构建多种工程菌株，我们将功能蛋白与sgRNA放到两个质粒中构建，这样就可以实现在相同菌株(含有Cas9蛋白)中通过导入不同的靶向编辑sgRNA质粒和需要插入的基因片段构建不同的工程菌，因此需要用到两种类型的质粒，一种是功能蛋白Cas9和重组蛋白λRed的双蛋白表达质粒Pkd001，另一种是包含gRNA的高拷贝质粒Pcd001。
第一种质粒的骨架是包含ParaB启动子调控Red重组蛋白的温敏型质粒pkd000(Addgene:#62656)，用引物1和2添加两个由BsaI限制性内切酶识别并在识别序列之外切割的酶切位点，扩增目的片段。通过引物3和4从实验室现有质粒上扩增带有ParaB启动子调控表达的Cas9蛋白表达基因。将得到的载体片段和Cas9基因用BsaI和DpnI酶进行过夜酶切消化。随后通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收，将得到的目的片段通过T4连接酶连接，25℃连接2h，将连接体系转化到大肠杆菌TOP10，最终通过验证、测序得到正确的Pkd001质粒。
第二种靶向编辑sgRNA质粒，本研究中构建了两个靶向编辑sgRNA质粒，两者之间唯一区别是靶向的基因不同，第一个质粒靶向大肠杆菌DH5α的lacZ基因，第二个质粒靶向大肠杆菌DH5α的araA基因，我们将两个质粒分别命名为Pcd001和Pcd002。通过引物5和引物6用实验室现有gRNA质粒为模板扩增载体片段，并通过引物5和6引入靶向lacZ基因的打靶序列，再经过一系列的连接转化等步骤得到正确的Pcd001质粒。类似的，通过引物7和引物8引入靶araA基因的打靶序列，连接转化得到质粒Pcd002，引物序列见表2。
DH5α-RFP、DH5α-s1和DH5α-d1三个工程菌构建实验步骤简要如下：
1.将Pkd001化学转化到DH5α中，LB中30℃复苏1h，涂布于氨苄抗性LB平板，30℃过夜培养。
2.挑单菌于5ml的含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，30℃过夜振荡培养。
3.将过夜培养DH5α菌(含有Pkd001)以1:100的比例加入到50mL含有氨苄抗生素的LB液体培养基，30℃下220rpm摇菌至OD600:0.1～0.2,加诱导剂阿拉伯糖终浓度10mM(L-阿拉伯糖储存浓度：1M，无菌水溶解后0.22um过膜除菌)，继续30℃下220rpm摇菌大约2小时至OD600:0.4～0.8。
4.将菌液制备电转感受态，先将其至于冰上30mins，4℃温度下5000rpm离心5mins；去除上清，原培养液1/5体积的预冷过的无菌水轻轻重悬菌体。4℃温度下再次5000rpm离心5mins；原培养液1/5体积的预冷过的10％甘油重悬轻轻重悬菌体，4℃温度下再次5000rpm离心5mins，重复一次10％甘油重悬离心操作，最后使用原培养液1/5体积10％甘油重悬置于冰上待用。
5.将Pcd001或Pcd002质粒与同源重组片段同时加入到电转感受态细胞中，轻轻混匀，转移至电击杯，2.5kV电击，迅速加入液体LB重悬，转移到5mL LB中30℃220rpm复苏2h，然后转入到30ml含氨苄抗生素，链霉素和10mM阿拉伯糖的LB中30℃220rpm诱导2h；将诱导培养后的菌液涂布于含氨苄抗生素，链霉素和10mM阿拉伯糖的LB平板，30℃过夜培养。
6.第二天在平板上挑单菌落至液体LB中37℃震荡培养，使用菌液PCR进行验证，DH5α-RFP构建结果如图3。
1.2构建基于Cas6e蛋白的基因干扰质粒
本实施例中基于Cas6e系统的蛋白表达质粒总共构建了四种，主要用到三种蛋白，分别为：EcCas6e(SEQ ID NO:2)，MRP1(SEQ ID NO:3)和MRP2(SEQ ID NO:4)。三种蛋白的碱基序列可通过NCBI网站下载，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。基于Cas6e蛋白和MRP1/MRP2蛋白的基因干扰原理见图1。
为了验证不同蛋白组合对于干扰的效果，我们将不同蛋白组合构建到以质粒Pac000(Addgene：#41187)为骨架的质粒上。在研究过程中，为了保证系统蛋白的表达受riboswitch调控，本研究引入枯酸调控系统，由引物9和10扩增CymR阻遏蛋白，通过引物11和12将包含trc启动子的Pac000骨架扩增下来，通过引物13和14扩增Cas6e蛋白。三个DNA片段分别通过BsaⅠ和DpnⅠ进行酶切消化，Cas6e片段插入到CymR阻遏蛋白和骨架之间，经过验证得到Pac001质粒。类似的，通过引物15和16扩增MRP1-MRP2融合蛋白，引物17和18扩增得到MRP1蛋白，引物19和20扩增得到MRP2蛋白，将这三种蛋白通过G4S2 linker(SEQ ID NO:5)连接到以Pac001为骨架Cas6e蛋白的C端，分别得到Pac002，Pac003和Pac004质粒。
本实施例中crRNA质粒的构建，为了全面评估基于Cas6e的crRNA干扰系统，本实施例中从干扰的位置，长度，拷贝数，以及多个基因同时打靶的作用等多方面系统性地评估该工具的效果，构建了许多不同sgRNA质粒，这些质粒之间唯一的不同就是crRNA序列不同，所以为了方便构建，我们通过引物21和22扩增得到以Puc000(Addgene：#68710)为骨架且包含J23119启动子，T7终止子的的片段，然后通过两条互补的引物磷酸化后退火形成双链DNA的方式在J23119启动子后插入Cas6e的识别间隔序列，退火引物序列见表2中的编号23至38，两个Cas6e识别位点中间添加了两个BsaⅠ识别切割位点，酶切位点的粘性末端互不相同，最终得到质粒。这样得到的质粒只需要和不同的目的片段进行酶切连接即可一步构建出多种不同crRNA的质粒。Puc001酶切后暴露的两个酶切割位点与退火片段的酶切位点相互对应。具体流程如图2。实验中所涉及到的引物见表2。
1.3利用基于Cas6e蛋白的基因干扰系统调控红色荧光蛋白表达
本实施例中基于Cas6e-crRNA的基因干扰实验设计如图4，步骤如下，将含有Cas6e蛋白的质粒与crRNA质粒共同转入DH5α-RFP中，涂到含有相应抗性的板子上，过夜培养。将长出来的单菌落挑到15mL摇菌管中。然后将长出来的菌落按照1：100的比例转接到新的培养基中，并且在一小时之后加入终浓度为5μM的枯酸(4-异丙基苯甲酸)诱导剂进行诱导。振荡培养12小时后，取150μL加入96孔板进行红色荧光检测。本实施例中使用酶标仪对红色荧光蛋白的荧光值进行检测，红色荧光蛋白mScarlet的激发波长和检测波长分别是560nm和600nm，为了尽量避免荧光检测时间点的菌液中菌量不同导致的数值差异影响以及检测菌体本身的背景值带来的影响，需要通过检测相对荧光值检测基因干扰程度，计算公式为：相对荧光值＝(检测荧光值-背景值)/OD600值。
通过红色荧光检测结果我们发现，只包含Cas6e蛋白的菌株与只含有非目标靶向的菌株的荧光值与对照菌株相当，这表明这两种组分的单独存在并不会对目的基因产生干扰作用。但是，我们发现只含有目标靶向的crRNA质粒菌株的荧光值较对照菌株下降了三分之一(图4)，Cas6e、Cas6e-MRP1、Cas6e-MRP2和Cas6e-MRP1-MRP2四种蛋白组合系统的相对荧光值都出现了10～20倍的下降，单独Cas6e蛋白与crRNA的组合系统敲低红色荧光值约20倍(图4)。这表明通过Cas6e-crRNA复合物就能够有效的抑制目标基因的表达。
实施例2：基于Cas6e的RNAi基因干扰技术的优化与双基因干扰
2.1Cas6e-crRNA干扰系统的细胞毒性检测
本实施例中首先验证Cas6e-crRNA干扰系统的细胞毒性大小，在DH5α-RFP中通过检测生长率进行系统毒力测试，将过夜培养的三组菌液(CK/crRNA/Cas6e-crRNA)按照1：100倍稀释到新鲜培养基中，每个实验组都添加相对应的抗生素维持功能质粒存在，实验组和对照组都添加枯酸诱导剂以确保实验变量单一，每1.5小时检测一次菌体密度。显微观察大肠杆菌形态，收集上述样品并观察十倍稀释的样品。在Leica DM5000B显微镜上拍摄了这些培养物的显微图像。使用流式细胞术检测大肠杆菌生长形态，收集上述样品后以预冷的磷酸盐缓冲盐水稀释400倍，作为分析的样本。使用BD LSR Fortess X-20流式细胞仪分析大肠杆菌细胞形态。通过Flow Jo 10.8.1软件对前向散射和侧向散射进行门控。对于每个样本收集了20,000细胞。
从结果中(图5)我们能看见，无论是crRNA单独存在还是完整的Cas6e-crRNA系统都不会影响干扰菌体的生长速度和细胞形态。因为所选择的靶向基因mScarlet是插入到大肠杆菌基因组的，该基因对于大肠杆菌不是必须的，抑制该基因不会对大肠杆菌自身的细胞活动造成影响，这说明了该系统本身不会影响菌体的正常生长。
2.2Cas6e-crRNA干扰系统的中crRNA长度优化
为了探究互补序列的长度对基因抑制的影响，需要选取不同互补序列长度来进行观察，我们构建了六种互补序列长度不同的质粒(Puc001-007)，它们的长度分别为：50个碱基，35个碱基，30个碱基，25个碱基，15个碱基，10个碱基。实验菌株为DH5α-RFP，分别做两个实验组，第一实验组将Puc001-007质粒单独转入实验菌株当中，第二实验组将Cas6e蛋白和互补长度不同的六个质粒通过电转共同转入DH5α-RFP当中，涂布于相应抗生素的LB培养基上，37℃过夜培养。将长出来的单菌落挑到15mL摇菌管中，然后将长出来的菌落按照1：100的比例转接到新的液体LB培养基中37℃振荡培养，并且在一小时之后加入终浓度为5μm的枯酸诱导剂进行诱导，继续振荡培养12小时后取样测量红色荧光值。
结果如图6所示，当crRNA单独存在时，互补序列的长度与基因抑制程度成正比，互补序列越长，该基因的表达量越低。在一定范围内，互补序列越长，crRNA与目标基因的mRNA的SD序列区域的结合更加快速且牢固，从而阻止了核糖体的有效结合进而阻止了基因的翻译。当Cas6e蛋白与crRNA质粒共同存在时，六个不同长度对于基因的抑制效果都明显增强(约20倍)，这表明了Cas6e蛋白在基因抑制中所起到的重要作用，考虑到脱靶效应和后续多基因抑制的设计难度，我们选取了基因抑制效果略好的25个碱基长度作为该系统的最终互补长度。
2.3Cas6e-crRNA干扰系统的中crRNA与mRNA结合位置优化
随后我们探究了crRNA与目标基因的mRNA结合位置的不同对于基因干扰效率的影响，除了之前结合的RBS位置外(P2)，我们又选取了两个非SD序列互补的位置P1和P3，它们分别位于P2的上游25个碱基和下游50个碱基。当互补位置位于P1和P3时对于基因的抑制效果都较P2差，这说明互补序列的位置在SD序列处能更加有效的阻止核糖体和mRNA的结合。P1的抑制效果比P3高3倍左右，这说明P1位置对于核糖体的结合还具有一定的阻碍效果，但是P3的位置处于RBS之后，推测仅有的50％抑制效果是由于阻止了部分结合的核糖体继续翻译，效果十分有限。
在本实施例中，我们确定了Cas6e-crRNA干扰系统中crRNA长度为25个碱基长度为最佳长度，同时也确定了与目的基因的SD序列位置互补的crRNA的基因干扰效果最佳。
2.4Cas6e-crRNA干扰系统实现双基因干扰
本实施例中以大肠杆菌DH5α为出发菌株成工程菌DH5α-D1和DH5α-D2。为了方便构建多种工程菌株，我们将功能蛋白与sgRNA放到两个质粒中构建，这样就可以实现在相同菌株(含有Cas9蛋白)中通过导入不同的靶向编辑sgRNA质粒和需要插入的基因片段构建不同的工程菌，因此需要用到两种类型的质粒，一种是功能蛋白Cas9和重组蛋白λRed的双蛋白表达质粒Pkd001，另一种是包含gRNA的高拷贝质粒Pcd001和Pcd002。
为了探究基于Cas6e-crRNA的干扰系统能否应用在多基因抑制中，我们使用了两种设计方案对该系统进行评估。在第一种方案中，我们使用了两个相互独立的启动子转录具有不同RBS序列的mNeonGreen和mScarlet基因，示意图见图7，构建底盘菌株为DH5α-D1。从图中可知，每个crRNA单独转录时会使其同源基因沉默20倍以上，这与上述单基因抑制的结果一致。当两个crRNA共转录时，同样可以有效敲低两个基因的表达量。在第二种方案中，我们使用了具有不同RBS序列的mNeonGreen和mScarlet基因被单一启动子转录为双基因操纵子，示意图见图7，构建底盘菌株为DH5α-D2，两种crRNA的共转录有效的抑制了两个基因的表达，但是值得注意的是，每个crRNA的单独转录不仅会抑制其目的基因的表达，同时也会影响同一操纵子当中的另一个基因的表达(3倍左右)。我们猜测同一操纵子中的非靶向基因的抑制是由于同源位点crRNA的结合引起了mRNA的降解，同一操纵子中，单基因靶向操纵子促进了mRNA降解，导致其操纵子中的非靶向基因受到抑制。这说明crRNA引导的靶向是具有特异性的，从而表明Cas6e-crRNA具有同时抑制多基因的潜力。
实施例3：基于Cas6e的RNAi技术的多基因干扰在发酵工程中的应用
本实施例中我们将显著提高琥珀酸盐产量作为目标，琥珀酸盐是在大肠杆菌进行混合酸发酵的厌氧条件下自然形成的产物。在有氧条件下，自然状态下不可能产生琥珀酸作为产品。因为在有氧代谢中，琥珀酸只是TCA循环的中间产物。它经由琥珀酰辅酶CoA合成酶形成，随后由琥珀酸脱氢酶(SDH)转化为延胡索酸。通过琥珀酸脱氢酶(SDH)的氧化反应，琥珀酸向电子传递链提供电子用来进行氧化磷酸化。由于这种循环的存在，大肠杆菌培养液中很难检测到琥珀酸的存在，并且乙酸盐是大肠杆菌在有氧条件下主要副产物。为了能够在有氧条件下生产琥珀酸，必须改变原有的代谢途径，重新设计中枢代谢途径。首先，为了在有氧条件下使琥珀酸积累成为可能，我们需要阻止表达TCA循环中的琥珀酸脱氢酶(sdhCD)。一旦sdh基因失活，琥珀酸就会在有氧生长过程中开始积累。同时通过敲低丙酮酸氧化酶(poxB)、乙酸激酶(ackA)和磷酸转乙酰酶(pta)阻断两个竞争性的乙酸途径用于增加TCA循环的碳通量增加琥珀酸产量。最后通过失活aceBAK操纵子的阻遏物(iclR)激活乙醛酸旁路使异柠檬酸裂合酶(aceA)表达，增加异柠檬酸流向琥珀酸的支路，代谢通路示意图见图8。因此同时敲低上述6个基因的表达，理论上会增加大肠杆菌柠檬酸的产量。
具体实施步骤如下：将Pac001和Puc014共同转入MG1655电转感受态，得到琥珀酸产生菌株MG1655-SA。同时用MG1655野生型菌株用作对照组。将实验组与对照组分别在含有相应抗生素和无抗生素的LB培养基中过夜培养。随后将实验组和对照组按照1:100比例转接到5mL的液体LB，实验组添加相应抗生素，两组都添加5μM枯酸诱导剂，在37℃，摇床中250rpm培养8小时。离心收菌，用1mL PBS溶液重悬菌液，再次离心弃上清。用5mL M9(0.4％甘油)培养基重悬，添加相应抗生素和诱导剂在摇床中37℃250rpm培养24小时。取1mL发酵液，最大转速离心5min，将上清液用超滤膜过滤，加入到进样小瓶，使用高效液相色谱检测琥珀酸产量。琥珀酸HPLC检测条件如下，色谱仪：伍丰液相LC-100HPLC；色谱柱：依利特SuperilAQ-C18；流动相：5mmol/L稀硫酸；流速：0.6mL/min；紫外检测波长：210nm；柱温：52℃。
结果表明Cas6e-crRNAi系统持续表达成功干扰了ackA，iclR，poxB，pta，sdhC和sdhD这六个基因后，大肠杆菌菌株中琥珀酸的产量增加了100倍左右，这表明用单个crRNA阵列可高效地同时控制多个基因的表达。
实施例4：基于Cas6e的RNAi技术的多基因干扰在微生物基因功能研究中的应用
本实施例中我们将微生物基因功能研究作为目标，我们构建了一个由单一操纵子操控的靶向adiA,ansP,dgkA,iclR,marR,mreC,narQ,plsB,wzb,ycfS,yncE,yncG和yncH13个基因的crRNA阵列质粒Puc015，它们这些基因共同影响着宿主菌株的pH稳态，群体感应，应激反应和基本膜生物合成。抑制这些基因势必会影响宿主细胞对于外界环境压力下的存活率，我们选取头孢克肟和氧氟沙星两种抗生素用来模拟外界环境压力，观察实验组与对照组面对同种压力下的菌落存活率。我们按照抗生素耐受实验方法进行处理，将未经过抗生素处理的组作为对照组，将经过两种抗生素处理过后的组作为两个实验组。为了更好的观察菌落数的变化，每次实验对象都进行了八次梯度稀释，并将每个梯度都进行了点滴实验，即每个培养基上画出九宫格，每个格子代表一个浓度梯度，点滴的体积都为20μL。结果经过处理的两个实验组的菌落数都比对照组少了两个数量级(图9)，这表明两个实验组的耐受环境压力的能力都有一定程度的下降，这说明了Cas6e-crRNA系统同时对多达13个基因的敲低是可行的。
实施例5：基于Cas6e-crRNA系统的RNA定点编辑
本实施例中我们将利用Cas6e-crRNA系统的在酵母中实现RNA定点编辑。首先我们构建了含有不同linker的EcCas6e和ADAR2(E488Q)蛋白质融合表达的质粒，同时构建了带有或不带有核定位信号(NLS)的质粒，分别为RE001-RE005。pYES2骨架由引物81和82获得，引物用于改变EcCas6e蛋白质和ADAR2(E488Q)之间的linker，核定位信号通过引物获得或消除。为了提高RNA编辑的效率，我们构建了携带与编辑位点错配位置不同的crRNA质粒。为了便于构建这些质粒，我们首先通过磷酸化引物75和76用两个反向的BsaI切割位点替换了间隔序列，得到了RE008。通过磷酸化引物/>将两条互补的磷酸化引物退火获得两端具有突出部分的小DNA片段。使用引物51和52，以RE008为模板扩增载体片段，随后用BsaI和DpnI处理，与小DNA片段连接，获得目标质粒(RE007-RE019)，质粒信息见表1，引物信息见2。
为了测试EcCas6e-ADAR2DD的活性，我们利用mScarlet基因生成了一个RNA编辑的报告基因，通过引入一个无义突变(W96X(UGG->UAG))(见图10中A)。在没有RNA编辑的情况下，mScarlet翻译在96号氨基酸位置停止，导致酵母中无红色荧光蛋白产生。通过ADAR2DD将A转化为I可以恢复酵母中红色荧光蛋白的表达。首先，我们评估了长度为35和40个核苷酸的两个EcCas6e-ADAR2DD的spacer，有或没有NLS。不匹配距离设置为15个核苷酸。作为对照，只含有crRNA或EcCas6E-ADAR2DD的细胞没有红色荧光，而同时含有crRNA和EcCas6E-ADAR2DD的细胞显示了红色荧光(见图10中D)。我们发现EcCas6e-ADAR2DD在两个spacer长度下显示了类似的编辑活性。我们通过逆转录和Sanger测序检测了mScarlet的mRNA，显示了7.0％的编辑效率(图10中D)。
为了进一步提高编辑效率，我们系统地优化了不匹配的位置。我们在35个碱基spacer内引入了一系列crRNA靶点，将不匹配的编辑位点(C)引入沿crRNA序列的各个位置(图10中F)。由于ADAR2DD需要两侧各有10个碱基对的dsRNA区域来进行正确结合，而在crRNA的茎-环侧还需要额外的10个碱基对的dsRNA区域来实现有效的EcCas6e退火，因此不匹配的距离从15个碱基增加到25个碱基。总共，我们生成了11个不同的构建。尽管所有11个位置都可以检测到红色荧光，但信号强度存在变化，最高峰出现在19个碱基和21个碱基的不匹配距离(图10中G)。为了评估进一步优化EcCas6e-ADAR2DD的潜力，我们修改了EcCas6e和ADAR2DD之间的链接器，使用了35个碱基spacer并在19个碱基或21个碱基的不匹配距离。我们观察到链接器也影响RNA编辑效率。使用19个碱基的不匹配距离和链接器3时获得最高的荧光强度(图10中H)。Sanger测序分析显示编辑效率约为27％(图10中I)。这些结果表明EcCas6e-ADAR2DD系统具有crRNA模板A至I RNA编辑(crAIE)的能力。本实施例中构建的质粒RE001至RE019的信息见表1。
Claims (10)
1.一种以基因精细调控为目的基于EcCas6e蛋白的原核生物RNAi基因干扰系统，其特征在于，包括(1)EcCas6e作为核酸酶；(2)crRNA是由能与靶标基因的mRNA的RBS区域互补的序列和EcCas6e可识别结合并切割的特定发卡结构序列组成；(3)可促进crRNA与mRNA结合的蛋白，例如MRP1或MRP2。
2.如权利要求1所述的原核生物RNAi基因干扰系统，其特征在于，所述的EcCas6e识别结合并切割的特定发卡结构序列如SEQ ID NO: 1中所示；所述的EcCas6e的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述的crRNA中与靶标基因的mRNA的RBS区域序列互补的长度为10～50bp；任选地，所述的crRNA中与靶标基因的mRNA序列互补时允许部分碱基错配；所述的crRNA中包含一个或多个靶标基因的mRNA的RBS区域序列互补序列。
3.如权利要求1所述的原核生物RNAi基因干扰系统，其特征在于，EcCas6e还与MRP1或MRP2中一个或两个的一个拷贝或多拷贝融合，所述的MRP1氨基酸序列如SEQ ID NO: 3中所示，所述的MRP2氨基酸序列如SEQ ID NO: 4中所示。
4.一种以基因精细调控为目的基于EcCas6e蛋白的原核生物RNAi基因干扰的方法，其特征在于，
其在原核生物中导入下述三个部分的表达元件：(1)EcCas6e作为核酸酶；(2)crRNA是由能与靶标基因的mRNA的RBS区域互补的序列和EcCas6e可识别结合并切割的特定发卡结构序列组成；(3)可促进crRNA与mRNA结合的蛋白；
任选地，所述EcCas6e和crRNA位于一个质粒中表达，或者位于两个质粒中表达；
另外优选地，该方法中EcCas6e可整合到宿主基因组中表达，crRNA位于质粒中表达；
或者EcCas6e位于质粒中表达，crRNA整合到宿主基因组中表达。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的EcCas6e的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的crRNA中与靶标基因的mRNA的RBS区域序列互补的长度为10～50bp；任选地，所述的crRNA中与靶标基因的mRNA序列互补时允许部分碱基错配；具体地，所述的crRNA中包含一个或多个靶标基因的mRNA的RBS区域序列互补序列；
优选地，EcCas6e还与MRP1或MRP2中一个或两个的一个拷贝或多拷贝融合，优选地，所述的MRP1氨基酸序列如SEQ ID NO: 3中所示，所述的MRP2氨基酸序列如SEQ ID NO: 4中所示；
具体地，所述原核生物是大肠杆菌。
6.一种以基因精细调控为目的基于EcCas6e蛋白的真核细胞RNA定点编辑系统，其特征在于，包括(1)EcCas6e作为核酸酶；(2)crRNA是由能与靶标基因的mRNA的RBS区域互补的序列和EcCas6e可识别结合并切割的特定发卡结构序列组成；(3)与EcCas6e融合表达的ADAR2蛋白。
7.如权利要求6所述的真核细胞RNA定点编辑系统，其特征在于，所述的EcCas6e的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中所示；
优选地，所述的EcCas6e与腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域的N端或C端融合，两个蛋白之间的Linker，其长度为9～46aa，进一步优选地，在EcCas6e与腺嘌呤脱氨酶ADAR2融合蛋白的N端或C端添加核定位序列，具体地核定位序列如SEQ ID NO: 5中所示。
8.如权利要求6所述的真核细胞RNA定点编辑系统，其特征在于，所述的腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域的氨基酸如SEQ ID NO: 6中所示；
所述的crRNA的长度为20～50bp，所述的crRNA中含有特定编辑位点设计的碱基，该碱基位置介于crRNA的第15～25位之间。
9.一种以基因精准编辑为目的基于EcCas6e蛋白的真核细胞RNA定点编辑的方法，其特征在于，向真核细胞中导入下述三个部分的表达元件：(1)EcCas6e作为核酸酶；(2)crRNA是由能与靶标基因的mRNA的RBS区域互补的序列和EcCas6e可识别结合并切割的特定发卡结构序列组成；(3)与EcCas6e融合表达的ADAR2蛋白。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，
所述的EcCas6e的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中所示；优选地，所述的EcCas6e与腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域的N端或C端融合表达，两个蛋白之间的Linker，其长度为9～46aa，进一步优选地，在EcCas6e与腺嘌呤脱氨酶ADAR2融合蛋白的N端或C端添加核定位序列，具体地核定位序列如SEQ ID NO: 5中所示；所述的腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域的氨基酸如SEQ ID NO: 6中所示；所述的crRNA的长度为20～50bp，所述的crRNA中含有特定编辑位点设计的碱基，该碱基位置介于crRNA的第15～25位之间。
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