CN118047754A - 一种直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针及其应用 - Google Patents
一种直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域,涉及线粒体的探针,具体涉及一种直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针及其应用。其化学结构式如式(I)所示:本发明提供的荧光探针不仅能对形态正常的线粒体进行成像外,而且能清晰地成像固定细胞中具有异常形态的线粒体,还能原位成像固定肌肉组织中含有三种不同线粒体的线粒体网状结构。与商业化线粒体探针相比,本发明所述的吡咯喹啉盐类化合物DMPQ‑12具有成本低、合成简单、光稳定性好、生物相容性较好的特点。适用于共聚焦荧光显微镜、超分辨率荧光显微镜下的线粒体荧光成像,有望在荧光生物标记领域和线粒体疾病诊断中得到深入应用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,涉及线粒体的探针,具体涉及一种直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
线粒体形态是生理学和病理学的一个基本参数。特别是,它们的异常与疾病密切相关,这些异常通常反映在大小、结构和数量上。首先,扩张型心肌病患者的心肌细胞中的线粒体变小。其次,在结构上,肌萎缩侧索硬化症(又称“渐冻症”)、帕金森氏症和阿尔茨海默氏症的神经元中,线粒体肿胀,几乎没有剩余的嵴。最后,慢性阻塞性肺病的肌肉细胞中线粒体数量减少。总之,线粒体相关疾病的大量临床观察证实了一个重要事实,即线粒体异常形态的准确可视化已成为疾病诊断的重要指标。
在临床诊断中,为了防止细胞自溶和细菌分解破坏细胞的成分和结构,必须将待检测的细胞及时固定,因为成分和结构的变化往往会影响诊断的准确性。例如,在诊断玻璃体视网膜淋巴瘤时,来自玻璃体的淋巴瘤细胞必须尽快被固定,因为它们在几分钟内开始退化。同样,在肺癌筛查中,痰中的鳞状上皮细胞也需要在储存、转运和染色之前被迅速放入固定剂中。到目前为止,对于固定细胞,电子显微镜和免疫组织化学已经成为可视化线粒体形态学的两个常用工具,尽管它们已成功用于在理论研究和疾病诊断中表征线粒体形态,但这两种技术对生物样本进行的复杂处理往往会损害线粒体形态而干扰检测。
众所周知,各种小分子荧光探针可以通过简单的孵育对各种细胞进行染色,并用不同的荧光显微镜对线粒体进行成像,重要的是,染色和成像都是无损的。不幸的是,所有现有的专一靶向线粒体的小分子探针,无论是商业的还是报道的,都完全依赖于线粒体膜电位(MMP)。换句话说,它们只能对活细胞中的线粒体进行染色和成像。一旦细胞先被固定,这些探针就失去了定位线粒体的能力。因此,开发一种直接且无损可视化固定细胞和组织内线粒体形态的小分子荧光探针是紧迫而重要的。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本发明的目的是提供一种直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针及其应用,本发明提供的荧光探针不仅能对活细胞中形态正常的线粒体进行成像,而且能清晰地成像固定细胞中具有正常或异常形态的线粒体,还能原位成像固定肌肉组织中含有三种不同线粒体的线粒体网状结构。
为了实现上述目的,本发明的技术方案为:
一方面,一种直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针,其化学结构式如式(I)所示:
该荧光探针的化学命名为:(E)-1-十二烷基-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-乙烯基)碘化喹啉,简称DMPQ-12。
本发明提供的探针分子含有的十二碳烷基链与线粒体膜的磷脂双分子层之间存在选择性疏水相互作用。依靠这种选择性疏水相互作用,可以在线粒体膜电位不存在的前提下,使探针分子专一结合固定细胞和组织中的线粒体,进而对线粒体形态进行更准确的观测。
另一方面,一种上述直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针的制备方法,由N-甲基-2-吡咯甲醛与1-十二烷基-4-甲基喹啉鎓(1)经过缩合反应,即得。其反应式如下所示:
第三方面,一种组合物,包括上述直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针或其药学上可接受的盐。
第四方面,一种制剂,包括活性成分或药用载体,所示活性成分为上述直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针或组合物。
第五方面,一种上述直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针、组合物或制剂的以下任一一种应用;
a)在制备直接且无损染色固定细胞线粒体的检测试剂中的应用;
b)在制备线粒体形态和/或线粒体形成的网络状结构的可视化检测试剂中的应用。
本发明所述的线粒体荧光探针DMPQ-12不受线粒体膜电位影响可以稳定靶向线粒体。
试验结果证实,首先,本发明所述荧光探针可以在线粒体膜电位不存在的情况下依靠与线粒体膜的选择性疏水相互作用而专一靶向固定细胞中的线粒体,并且能够清晰地可视化固定细胞中不同形态的线粒体。
其次,在DMPQ-12染色的固定组织中观察到三种不同形态的线粒体以及它们形成的网络状结构,为线粒体相关疾病的研究和诊断提供了简捷、无损的生物检测试剂。也预示本发明所述化合物DMPQ-12作为固定试样中线粒体的荧光探针具有广泛的应用。
第六方面,一种线粒体检测试剂盒,包括上述直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针、组合物或制剂,以及溶剂或稀释剂。
本发明的有益效果为:
本发明公开了一种直接且无损染色固定细胞线粒体的小分子荧光探针及其在可视化固定细胞和组织线粒体中的应用。大量的实验证明:本发明所述的荧光探针能够对两种不同细胞系中固定细胞的线粒体进行清晰成像。特别是在SIM下,能够清晰地观察到固定细胞中线粒体嵴的结构。除了形态正常的线粒体外,DMPQ-12也能清晰地成像固定细胞中具有异常形态的线粒体。该探针还能原位成像固定肌肉组织中含有三种不同线粒体的线粒体网状结构。与商业化线粒体探针相比,本发明所述的吡咯喹啉盐类化合物DMPQ-12具有成本低、合成简单、光稳定性好、生物相容性较好的特点。适用于共聚焦荧光显微镜、超分辨率荧光显微镜下的线粒体荧光成像,在荧光生物标记领域具有广阔的应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中用500nM的DMPQ-12染色活性MCF-7和H9c2细胞,然后用CCCP处理细胞使线粒体膜电位降低,或是用4%多聚甲醛(PFA)固定细胞,使线粒体膜电位消失,最后通过SIM得到的荧光图像。a为MCF-7,b为a的方框处的放大图,c为CCCP处理的MCF-7,d为c的方框处的放大图,e为PFA固定的MCF-7,f为e的方框处的放大图;g为H9c2,h为g的方框处的放大图,i为CCCP处理的H9c2,j为i的方框处的放大图,k为PFA固定的H9c2,l为k的方框处的放大图。图1显示探针DMPQ-12可以染色活细胞中的线粒体,当线粒体膜电位降低甚至是消失时,探针DMPQ-12仍然牢固地靶向线粒体。
图2为本发明实施例中用500nM的DMPQ-12对用4%多聚甲醛固定了12个小时的细胞进行染色,通过CLSM(a)和SIM(b)得到的荧光图像。通过CLSM,清晰地观察到一些具有典型线粒体形态的丝状结构,并在SIM下观察到线粒体嵴的结构,说明探针DMPQ-12积聚在固定细胞的线粒体中。
图3为本发明实施例中商业线粒体探针MitoTracker Deep Red(MTDR)和DMPQ-12染色固定MCF-7(a)和H9c2(b)细胞的SIM图像。探针DMPQ-12的绿色荧光很好地与来自MTDR的红色荧光重叠,表明探针DMPQ-12专一地靶向固定细胞中的线粒体。
图4为本发明实施例中探针DMPQ-12在不同浓度的心磷脂/DOPC/DPPC溶液中的最大荧光强度(a)和最大吸收波长(b)。DMPQ-12的荧光强度随着心磷脂浓度的增加而急剧增强,并且最大吸收波长发生了显著的红移,表明探针DMPQ-12与心磷脂之间具有强的结合能力。
图5为本发明实施例中DMPQ-12染色固定细胞中形态异常的线粒体的共聚焦荧光图像。分别用鱼藤酮(a)、CCCP(b)或Mdivi-1(c)处理活细胞,诱导细胞中线粒体发生形态改变,然后用4%多聚甲醛固定细胞。用DMPQ-12染色固定细胞并在CLSM下进行成像。在固定细胞中观察到甜甜圈形、球形和伸长的线粒体,表明探针DMPQ-12能够成像固定细胞中形态异常的线粒体。
图6为本发明实施例中活的(a)和固定(b)的骨骼肌组织分别用5μM的DMPQ-12和5μM的MTDR染色的共聚焦荧光图像。当染色活组织时,通过DMPQ-12和MTDR都能观察到组织中三种不同形态的线粒体。当染色固定组织时,通过DMPQ-12可以清晰地观察到三种线粒体,而在MTDR染色的固定组织中几乎没有观察到线粒体,表明探针DMPQ-12能够清楚地成像固定组织中的线粒体。
图7为本发明实施例中用0.2μM的DMPQ-12染色活的MCF-7细胞,在激光连续辐射下拍摄得到的共聚焦荧光成像图片。在激光连续辐射200s后,探针DMPQ-12仍能呈现出明显的花丝状线粒体形态,说明DMPQ-12具有优异的抗光漂白性。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于现有线粒体小分子探针难以对固定细胞或组织中的线粒体进行染色和成像,本发明提出了一种直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针及其应用。
本发明的一种典型实施方式,提供了一种直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针,其化学结构式如式(I)所示:
本发明的另一种实施方式,提供了一种上述直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针的制备方法,由N-甲基-2-吡咯甲醛与1-十二烷基-4-甲基喹啉鎓(1)经过缩合反应,即得。其反应式如下所示:
在一些实施例中,所述缩合反应中,以哌啶作为催化剂,在85~95℃条件下进行缩合反应。
在一些实施例中,1-十二烷基-4-甲基喹啉鎓的制备方法为:将4-甲基喹啉和1-碘十二烷经95~105℃加热反应后,即得。
具体地,加热反应后,加入N-甲基-2-吡咯甲醛的溶液和哌啶混合均匀,然后加热至85~95℃进行缩合反应。
本发明的第三种实施方式,提供了一种组合物,包括上述直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针或其药学上可接受的盐。
本发明所述的药学上可接受的盐可以为盐酸盐、硫酸盐、醋酸盐、枸橼酸盐、苯甲磺酸盐等。
在一些实施例中,还包括增溶剂、乳化剂、填充剂、防腐剂中的一种或多种。
本发明的第四种实施方式,提供了一种制剂,包括活性成分或药用载体,所示活性成分为上述直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针或组合物。
本发明所述药用载体包括水、缓冲溶液等。
本发明的第五种实施方式,提供了一种上述直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针、组合物或制剂的以下任一一种应用;
a)在制备直接且无损染色固定细胞线粒体的检测试剂中的应用;
b)在制备线粒体形态和/或线粒体形成的网络状结构的可视化检测试剂中的应用。
在一些实施例中,所述线粒体位于固定试样中。所述固定试样例如固定细胞、固定肌肉组织等。
具体地,本发明所述具有极低的细胞染色浓度及良好的光稳定性的荧光探针DMPQ-12在快速靶向固定细胞线粒体中的应用。
其中,所述细胞是培养的乳腺癌细胞(MCF-7)以及心肌细胞(H9c2);所述荧光探针DMPQ-12的激发光是488nm,能使细胞内的线粒体显示出红光。
本发明所述的线粒体荧光探针DMPQ-12不受线粒体膜电位影响可以稳定靶向线粒体的应用。
在上述应用中:当活的MCF-7和H9c2细胞与探针DMPQ-12孵育后,探针可以染色细胞中的线粒体;然后用CCCP或者4%多聚甲醛对染色后的活细胞进行处理,使线粒体膜电位降低甚至消失,探针DMPQ-12可以不受线粒体膜电位的影响,仍然稳定靶向细胞中的线粒体而不发生泄漏。
本发明提供的探针DMPQ-12对心磷脂具有高的结合力。
本发明所述荧光探针DMPQ-12在通过共聚焦显微镜(CLSM)和结构光照明显微镜(SIM)可视化固定细胞线粒体中的应用。
其中,所述CLSM是FV 1200,SIM是配备Lattice SIM2的蔡司Elyra 7超分辨率显微镜。
本发明所述荧光探针DMPQ-12在直接且无损染色固定细胞线粒体中的应用。
本发明的第六种实施方式,提供了一种线粒体检测试剂盒,包括上述直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针、组合物或制剂,以及溶剂或稀释剂。
在上述线粒体检测试剂盒的使用过程为:直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针、组合物或制剂可以为固体也可以为液体,当其为固体时,采用溶剂将固体分散均匀,然后进行下一步染色成像使用;当其为液体时,采用稀释剂将液体稀释后进行下一步染色成像使用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
下述实施例中,所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均从商业途径得到。
实施例1:探针DMPQ-12的合成
将4-甲基喹啉(0.143g,1mmol)和1-碘十二烷(0.296g,1mmol)依次加入圆底烧瓶中,并将反应体系在120℃下搅拌16小时。用薄层色谱硅胶板监测反应的进展。当反应物完全消耗时,将N-甲基-2-吡咯甲醛(0.109g,1mmol)和200μL哌啶加入混合物中,使用乙醇(8mL)作为溶剂,并将混合物在95℃下搅拌12小时。冷却至室温后,通过柱色谱法(CH2Cl2/MeOH,100:1v/v)纯化混合物,得到黑色固体DMPQ-12(0.29g,55%)。1H NMR(DMSO-d6,400MHZ):δ(ppm)9.15(d,J=8Hz,1H),8.97(d,J=8Hz,1H),8.46(q,J=9.3Hz,2H),8.18(q,J=8Hz,2H),7.94(q,J=10.6Hz,2H),7.38(d,J=4Hz,1H),7.21(t,J=2Hz,1H),6.31(q,J=2.6Hz,1H),4.87(t,J=8Hz,2H),3.89(s,3H),1.92(m,2H),1.22(s,18H),0.84(t,J=6Hz,3H).13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ(ppm):153.56,146.45,138.25,135.19,132.45,131.97,130.54,128.93,127.01,126.44,119.37,115.09,114.65,113.90,111.02,56.36,34.59,31.76,29.74,29.46,29.36,29.33,29.17,28.99,26.28,22.56,14.42.HRMS(m/z):[M]+calculated for C28H39N2 +,403.3108;found,403.3158.
实施例2:细胞培养
MCF-7细胞和H9c2细胞在含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素和链霉素的高糖培养基(H-DMEM)中培养。于37℃,5% CO2的饱和湿度的孵箱中,每2-3天传代1次。待细胞生长到对数期,接片培养:①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min,酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中,备用;②将100mL细胞瓶中长满的细胞用PBS洗三遍,用1mL 0.25%胰酶消化3-5分钟,小心地倒出胰酶,加入新鲜培养液吹打均匀并细胞计数,以培养液的添加量控制细胞密度,使细胞终浓度为每毫升1×105,然后接种至内上述含盖玻片的培养皿中,放入5%CO2培养箱中37℃培养,使细胞贴片生长。待细胞长满盖玻片后,即获得用于实验的细胞。
实施例3:首先将探针DMPQ-12溶解在DMSO溶液中配制浓度为1mM的母液。待细胞在玻底共聚焦培养皿上贴壁后,用500nM的DMPQ-12染色细胞,在CO2培养箱中孵育10min。然后通过SIM观察染色情况。对于CCCP处理的细胞,完成上述染色后,将10μM的CCCP溶液加入到染色完成后的细胞培养皿中,在CO2培养箱中孵育30min,处理完成以后立即拿到SIM下观察染色情况。而需要固定处理的细胞则需要在完成上述染色后,向细胞培养皿中加入1mL 4%多聚甲醛,固定处理1小时,处理完成以后通过SIM观察染色情况。激发波长:488nm,收光范围:>560nm。
由图1的结果可知:在SIM下,DMPQ-12突出显示了对应于嵴的线粒体折叠结构,表明探针积聚在线粒体内膜中(图1a-b和g-h)。此外,即使在DMPQ-12染色后用CCCP和4%PFA处理细胞,在SIM显微镜下仍然可以清楚地看到线粒体嵴的特征结构(图1c-f和i-l)。这些图像清楚地证明不论细胞中线粒体膜电位如何变化,DMPQ-12都能够对细胞中的线粒体进行染色。
实施例4:在不同显微镜下观察DMPQ-12染色的固定细胞
将培养的MCF-7细胞和H9c2细胞用4%的多聚甲醛固定12小时以确保线粒体膜电位消失。将完全被固定的细胞用PBS清洗三次,然后用500nM的DMPQ-12染色10分钟(在CLSM下的染色浓度为0.2μM,在SIM下的染色浓度为500nM),通过CLSM和SIM对细胞进行成像。激发波长:473nm,收光范围:550-650nm(CLSM);激发波长:488nm,收光范围:>560nm(SIM)。
由图2的结果可知:共聚焦荧光成像显示,DMPQ-12的明亮荧光来自细胞质中具有典型线粒体形态的丝状结构。而通过SIM,在单个线粒体的放大SIM图像中,探针主要位于线粒体内膜折叠形成的嵴。在纵向截面中,线粒体呈锯齿状,在横向截面中观察到轮辐状线粒体。上述结果表明,SIM可以以更高的分辨率准确地观察到DMPQ-12在固定细胞线粒体中的精确分布。
实施例5:在SIM下进行DMPQ-12和MTDR对固定细胞的共染色实验
活的MCF-7和H9c2细胞首先用0.1μM的MTDR孵育30min,然后用PBS漂洗三次。接下来,将细胞在培养基中进一步培养2小时,以确保MTDR的苄基氯基团与线粒体蛋白的硫醇充分反应。然后用4%PFA固定细胞12小时,并用500nM的DMPQ-12染色固定细胞10分钟。最后,将染色好的细胞在SIM下成像。激发波长:DMPQ-12:488nm,MTDR:642nm。收光范围:DMPQ-12:>560nm,MTDR:>640nm。
由图3的结果可知:来自探针DMPQ-12的绿色荧光与来自MTDR的红色荧光很好地重叠在一起,并且这两个探针依赖于距离的强度分布是同步的。这些结果表明探针DMPQ-12能够专一靶向固定细胞中的线粒体。
实施例6:探针DMPQ-12与各种细胞器膜中富含的DOPC和DPPC以及线粒体膜中特有的心磷脂进行滴定实验。将探针DMPQ-12溶解在DMSO中配制成浓度为1mM的储备液。同样的,将DOPC、DPPC、心磷脂溶解在甲醇中配制成浓度为1mM的储备液。在滴定实验中,探针DMPQ-12的测试浓度为1μM。向含有探针的溶液中逐渐滴加DOPC/DPPC/心磷脂,测试混合溶液的紫外以及荧光光谱。激发波长:490nm。
由图4的结果可知:DMPQ-12的荧光强度随着心磷脂浓度的增加而急剧增强,但随着DOPC/DPPC浓度的增加,荧光强度缓慢增强。此外,DMPQ-12的荧光强度在探针/心磷脂比例为1:10时饱和。另一方面,相对于DMPQ-12本身,心磷脂中的最大吸收波长发生了显著的红移(25nm),而在相同的浓度比下,DMPQ-12在DOPC/DPPC中的最大吸收波长几乎没有变化。这些结果表明探针DMPQ-12与心磷脂的结合比与DOPC/DPPC的结合更强。
实施例7:活的MCF-7细胞分别用8μM鱼藤酮处理6小时,10μM CCCP处理1.5小时,15nM Mvidi-1处理6小时。处理后的细胞用4%PFA固定12小时,然后用0.2μM DMPQ-12染色固定细胞10分钟并在CLSM下进行成像。激发波长:473nm,收光范围:550-650nm。
由图5的结果可知:通过CLSM,分别在固定细胞中观察到甜甜圈形、球形和伸长的线粒体。以上结果表明探针DMPQ-12能够检测固定细胞中形态异常的线粒体。
实施例8:取大鼠后腿的骨骼肌组织,一部分将其浸入1mL的培养基中,一部分用4%多聚甲醛固定18小时。将浸入在培养基中的组织以及固定好的组织用5μM的DMPQ-12/MTDR染色30分钟,然后在CLSM下观察肌肉组织纵切面的线粒体形态。DMPQ-12,激发波长:473nm,收光范围:550-650nm。MTDR,激发波长:633nm,收光范围:655-755nm。
由图6的结果可知:在DMPQ-12染色的活组织和固定组织中观察到三种不同形态的线粒体:I带线粒体(IBM)、纤维平行线粒体(FPM)和交叉纤维连接线粒体(CFCM)。同样,在MTDR染色的活肌中也观察到上述三种类型的线粒体,而在固定肌中几乎没有观察到线粒体。这些结果表明,探针DMPQ-12能够清楚地显示固定组织中的线粒体。
实施例9:用0.2μMDMPQ-12染色活的MCF-7细胞,在激光辐射条件下连续成像200s。DMPQ-12,激发波长:473nm,收光范围:550-650nm。
由图7的结果可知:探针DMPQ-12在激光连续辐射200s时仍能呈现出明显的花丝状线粒体形态。上述实验现象说明,DMPQ-12表现出优异的抗光漂白性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针,其特征时,其化学结构式如式(I)所示:
2.一种权利要求1所述的直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针的制备方法,其特征是,由N-甲基-2-吡咯甲醛与1-十二烷基-4-甲基喹啉鎓(1)经过缩合反应,即得。
3.如权利要求2所述的直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针的制备方法,其特征是,所述缩合反应中,以哌啶作为催化剂,在85~95℃条件下进行缩合反应;
或,1-十二烷基-4-甲基喹啉鎓的制备方法为:将4-甲基喹啉和1-碘十二烷经95~105℃加热反应后,即得;
或,加热反应后,加入N-甲基-2-吡咯甲醛的溶液和哌啶混合均匀,然后加热至85~95℃进行缩合反应。
4.一种组合物,其特征是,包括权利要求1所述的直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针或其药学上可接受的盐。
5.如权利要求4所述组合物,其特征是,所述的药学上可接受的盐可以为盐酸盐、硫酸盐、醋酸盐、枸橼酸盐或苯甲磺酸盐;
或,还包括增溶剂、乳化剂、填充剂、防腐剂中的一种或多种。
6.一种制剂,其特征是,包括活性成分或药用载体,所述活性成分为权利要求1所述的直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针或权利要求4或5所述的组合物。
7.如权利要求6所述的制剂,其特征是,所述药用载体包括水或缓冲溶液。
8.一种权利要求1所述的直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针、权利要求4或5所述的组合物或权利要求6或7所述的制剂的以下任一一种应用;
a)在制备直接且无损染色固定细胞线粒体的检测试剂中的应用;
b)在制备线粒体形态和/或线粒体形成的网络状结构的可视化检测试剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其特征是,所述线粒体位于固定试样中;或,所述固定试样为固定细胞和/或固定肌肉组织。
10.一种线粒体检测试剂盒,包括权利要求1所述的直接且无损染色固定细胞和组织中线粒体的小分子荧光探针、权利要求4或5所述的组合物或权利要求6或7所述的制剂,以及溶剂或稀释剂。
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