CN118028390A - 微生物转化生产二胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微生物转化生产α,ω‑二胺的方法，包括如下步骤：以环烷烃为原料，用大肠杆菌工程菌模块1、大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3进行一锅法联合催化，得到α,ω‑二胺，其中大肠杆菌工程菌模块3过表达醇脱氢酶ChnD和转氨酶TA，大肠杆菌工程菌模块2过表达醇脱氢酶ADH、Baeyer‑Villiger单加氧酶BVMO、内酯酶Lac、羧酸还原酶CAR、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶SFP，同时还利用了大肠杆菌内源性醛酮还原酶AKR，大肠杆菌工程菌模块1过表达P450酶。用于生产1,6‑己二胺时，使用环己烷作为底物，得到了高达7.6mM的产物浓度。

Description

微生物转化生产二胺的方法
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，涉及微生物转化生产二胺的方法，具体地说，涉及一种大肠杆菌工程菌催化环烷烃/环烷醇/二醇反应生产α,ω-二胺的方法。
背景技术
脂肪族α,ω-二胺(DA)是大宗化学品，主要用作聚酰胺塑料制造中的单体前体，在工程塑料、机械配件、纤维、薄膜和其他应用的制造中具有广泛的应用，然而目前DA的合成方法是对环境有害的能量密集型多步骤化学反应。例如1,6-己二胺(HMD)每年大约生产1.2Mt，是尼龙66合成中最重要的单体之一，尼龙66是纺织和塑料行业重要的聚酰胺，2019年全球尼龙66市场规模估计为162.9亿美元，预计从2019年到2027年每年增长6.5％。HMD主要是通过丁二烯氢氰化在高技术控制下合成的，但其存在使用剧毒氰化氢、选择性不理想和反应复杂的缺陷。为了克服这些缺陷，多年来人们一直在尝试通过更换有害试剂或/和改变原材料基础来寻找更环保的工艺，已经开发了一些避免使用氰化物并从容易获得的材料(例如，1,6-己二醇)作为底物的方法，但仍然存在诸如高反应温度、高压和高催化剂负载等限制，因此迫切需要开发绿色、安全的DA合成路线。
生物生产方法反应条件温和，且有优异的选择性。迄今为止，仅一种从己二酸(AA)到HMD的生物催化途径有文献报道，是通过羧酸还原酶(CAR)和转氨酶(TA)催化两轮还原/胺化反应，该方法仅产生约3mM HMD，而且70％积累了中间体副产物6-氨基己酸(6-ACA)。此外，尽管一些专利提出了用于HMD生物合成的各种非天然生物途径，但均没有后续的研究开发报道。因此，非常需要一种用于高效合成HMD的新生物催化途径。
发明内容
本课题组经过数年的探索，开发了一种一锅法微生物体内生物催化级联反应，借助基因工程将环烷烃生物转化为DA。该研究包括用于生物催化路线设计的RetroBioCat工具优化和利用、用于寻找合适酶的酶挖掘和用于有效途径组装的微生物群落构建，开发的基于微生物联合催化系统成功生产出了DA比如HMD等，当使用环己醇CHOL和环己烷CH作为底物时，产物DA浓度分别高达16.5mM和7.6mM，取得了目前报道的最高HMD生物合成产量，为高效、绿色的DA生产提供了一条有前景的途径。具体而言，本发明包括如下技术方案。
一种微生物转化生产二胺(或称α,ω-二胺，DA)的方法，包括如下步骤：
以α,ω-二醇(DO)为原料，用大肠杆菌工程菌模块3催化反应，得到α,ω-二胺；或者
以环烷醇为原料，用大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3进行“一锅法”联合催化，得到α,ω-二胺；或者
以环烷烃为原料，用大肠杆菌工程菌模块1、大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3进行“一锅法”联合催化，得到α,ω-二胺，其中
大肠杆菌工程菌模块3过表达醇脱氢酶ChnD和转氨酶(TA)，简写为M3；
大肠杆菌工程菌模块2过表达醇脱氢酶ADH、Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)、内酯酶(Lac)、羧酸还原酶(CAR)、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(SFP)，并且表达内源性醛酮还原酶(AKR)，简写为M2；
大肠杆菌工程菌模块1过表达P450酶，简写为M1。
上述α,ω-二胺可以是C6-C8的α,ω-二胺即1,6-己二胺、1,7-庚二胺或者1,8-辛二胺；相应地，所述环烷醇为环己醇、环庚醇或者环辛醇；所述环烷烃为环己烷、环庚烷或者环辛烷。
优选地，所述α,ω-二胺是1,6-己二胺(HMD)，所述环烷醇为环己醇(CHOL)，所述环烷烃为环己烷(CH)。
在一种实施方式中，上述大肠杆菌工程菌模块3中过表达的所述醇脱氢酶ChnD编码基因序列为SEQ ID NO:1；所述转氨酶(TA)选自下组中的一种：CV，编码基因序列为SEQID NO:2，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为M3A；PP2159，编码基因序列为SEQ ID NO:3，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为M3B；SAV2614，编码基因序列为SEQ ID NO:4，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为M3C；PAK，编码基因序列为SEQ ID NO:5，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为M3D；或者SPO3471，编码基因序列为SEQ ID NO:6，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为M3E。
在一种实施方式中，上述大肠杆菌工程菌模块2中过表达的所述醇脱氢酶ADH编码基因序列为SEQ ID NO:7；所述Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)编码基因序列为SEQ IDNO:8；所述内酯酶(Lac)编码基因序列为SEQ ID NO:9；所述羧酸还原酶(CAR)编码基因序列为SEQ ID NO:10；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(SFP)编码基因序列为SEQ ID NO:11。
由于醛酮还原酶(AKR)是大肠杆菌内源性的，无需进行过表达。
在一种实施方式中，上述大肠杆菌工程菌模块1中过表达的所述P450酶是在专利文献CN111411128A和文献Yu HL,et al.,Bioamination of alkane with ammonium by anartificially designed multienzyme cascade.Metabolic Engineering.47,184-189(2018).中报道的P450BM319A12，编码基因序列为SEQ ID NO:12；或者是专利文献CN114836486A中报道的野生型细胞色素P450-BM3 WT(来源于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、细胞色素突变体P450-BM3 F87G或者细胞色素P450pyrTM(来源于鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.HXN-200))、或者是Salamanca,Diego,et al."Novel cyclohexanemonooxygenase from Acidovorax sp.CHX100."Applied microbiology andbiotechnology.99 6889-6897(2015).中报道的细胞色素P450CHX。
上述大肠杆菌工程菌模块3可以通过下述方法构建得到：将ChnD基因和一种TA基因(选自CV、PP2159、SAV2614、PAK和SPO3471)克隆到质粒pETDuet-1上，构建的质粒pETDuet-ChnD-TA依次包含T7启动子、ChnD基因、RBS位点和TA基因，命名为pETDuet-ChnD-TA；然后将构建的质粒pETDuet-ChnD-TA转化到大肠杆菌中，得到大肠杆菌工程菌。
在一种实施方式中，上述大肠杆菌工程菌模块2可以通过下述方法构建得到：
1)将ADH基因、CAR基因、SFP基因和BVMO基因克隆到质粒pRSFDuet-1上，构建的质粒(pRSFDuet-CAR，SFP，BVMO，ADH)包含T7启动子、两个基因之间的RBS位点，命名为(pRSFDuet-CAR，SFP，BVMO，ADH)；
2)将Lac基因在ldHA位点整合到大肠杆菌基因组中，得到大肠杆菌工程菌；
3)将构建的质粒(pRSFDuet-CAR，SFP，BVMO，ADH)转化到基因组中整合了Lac基因的大肠杆菌工程菌中。
根据质粒RSF中T7启动子下游各基因的顺序排列，大肠杆菌工程菌模块2分别命名如下：
T7启动子-ADH-CAR-SFP-BVMO(大肠杆菌基因组中整合了Lac基因)，命名为M2A；
T7启动子-ADH-BVMO-CAR-SFP(大肠杆菌基因组中整合了Lac基因)，命名为M2B；
T7启动子-BVMO-ADH-CAR-SFP(大肠杆菌基因组中整合了Lac基因)，命名为M2C；
T7启动子-CAR-SFP-BVMO-ADH(大肠杆菌基因组中整合了Lac基因)，命名为M2D；
T7启动子-CAR-SFP-ADH-BVMO(大肠杆菌基因组中整合了Lac基因)，命名为M2E；T7启动子-CAR-Linker-SFP-ADH-BVMO(大肠杆菌基因组中整合了Lac基因)，命名为M2F，即SFP与CAR融合形成融合蛋白(进一步增强CAR的催化活性)。
其中连接CAR基因和SFP基因的接头(linker)可以是碱基序列GGCGGCGGAGGCTCTGGCGGACCCGGCTCT。
上述大肠杆菌工程菌模块1可以通过下述方法构建得到：将P450酶基因克隆到表达载体pRSF-Duet(购自Novagen)上相应位点，酶切位点为NdeI和BamHI，将P450酶基因的表达置于T7启动子和lacI阻遏基因的控制下，获得重组质粒pRSF-Duet-P450；将质粒pRSF-Duet-P450转化到大肠杆菌中，得到表达P450酶的大肠杆菌工程菌。
上述方法中，当以环烷醇为原料，用大肠杆菌工程菌模块2和模块3进行“一锅法”联合催化时，采用一锅两步法的生物催化级联反应、或者一锅一步法，其中，
一锅两步法是使用细胞模块2将底物环烷醇转化为α,ω-二醇(DO)，底物环烷醇完全转化后，将细胞模块3添加反应体系中，并添加L-Ala或异丙胺作为氨供体(优选使用异丙胺作为氨供体)，进行α,ω-二醇(DO)到α,ω-二胺(DA)的反应；
一锅一步法是将细胞模块2和3组合起来形成大肠杆菌菌群2_3(EC2_3)，在一个体系中同时催化反应，并添加L-Ala或异丙胺作为氨供体，优选使用异丙胺作为氨供体；
优选地，大肠杆菌菌群2_3(EC2_3)是大肠杆菌细胞模块(M2D)与大肠杆菌细胞模块(M3A)的组合。
当以环烷烃(例如CH)为原料，用大肠杆菌工程菌模块1、大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3组成大肠杆菌菌群1_2_3(EC1_2_3)进行“一锅法”联合催化时，采用一锅两步法进行：第一步由细胞模块1和2的组合催化环烷烃(例如CH)转化为环烷醇(例如CHOL)进而转化为α,ω-二醇(DO)，第二步反应添加细胞模块3以催化α,ω-二醇(DO)转化为α,ω-二胺(DA)。
优选地，大肠杆菌菌群1_2_3(EC1_2_3)中的大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3组合是大肠杆菌(M2D)与大肠杆菌(M3D)的组合。
本发明开辟了一种全过程绿色环保的α,ω-二胺生产工艺，不仅克服了化学合成法或者半化学合成+半生物催化的诸多缺陷，还避免了多步骤酶催化反应必须提供多品种昂贵酶、辅酶或辅因子导致高经济成本的缺陷，而且微生物可以通过发酵而源源不断地提供，是取之不竭的生物反应器体系，有助于大大降低α,ω-二胺生产成本。本发明开发的微生物组催化系统在生产HMD时，使用环己醇和环己烷作为底物，产物浓度分别高达16.5mM和7.6mM，是目前最高的HMD生物合成的产量，为高效、绿色的DA生产提供了一条有前景的途径。
附图说明
图1显示了本发明设计的模块化微生物组催化级联系统以环己烷和环己醇为底物生产HMD的生物合成路径。
图2显示了醇脱氢酶(ChnD)与不同转氨酶(TA)在质粒上的组合所形成的细胞模块3催化HDO转化为HMD的对比结果。从HDO生物催化合成HMD。其中，a)大肠杆菌催化HDO转化为HMD的示意图；b)表达醇脱氢酶(ChnD)和转氨酶(TA)的大肠杆菌细胞的构建，pBR322：pETDuet-1；箭头：T7启动子；深色卵形：RBS位点；c)用于将HDO生物转化为HMD的工程大肠杆菌细胞模块3，反应条件：将表达相应酶的大肠杆菌细胞重悬于磷酸盐缓冲液(pH8.0,100mM)中，细胞密度为8g CDW L-1，20mM HDO，反应在25℃、220rpm下进行21h，以及用作氨供体的100mM L-丙氨酸或异丙胺。
图3显示了醇脱氢酶ADH、Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)、羧酸还原酶(CAR)、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(SFP)在质粒载体上的不同连接顺序所形成的细胞模块2催化CHOL转化为HDO的对比结果。其中，a)构建的大肠杆菌催化CHOL转化为HDO的示意图；b)构建表达将CHOL转化为HDO所需的所有酶的大肠杆菌细胞，RSF：pRSFDuet-1；箭头：T7启动子；深色卵形：RBS位点。Lac基因在ldHA位点被整合到基因组中；c)用于将CHOL转化为HDO的工程大肠杆菌细胞模块2，反应条件：将表达相应酶的大肠杆菌细胞重悬于磷酸盐缓冲液(pH8.0，100mM)中，细胞密度为6g CDW L-1，20mM CHOL，反应在25℃，220rpm下进行8h，大肠杆菌宿主细胞提供辅因子NAD(P)H/ATP，68mM甘油作为能量来源。
图4为重组大肠杆菌细胞模块3全细胞蛋白的SDS-PAGE照片。泳道M：蛋白量分子标准(kDa)；泳道1：大肠杆菌(M3A)；泳道2：大肠杆菌(M3D)；泳道3：大肠杆菌(M3B)；泳道4：大肠杆菌(M3E)；泳道5：大肠杆菌(M3C)。
图5为重组大肠杆菌细胞模块2全细胞蛋白的SDS-PAGE照片。泳道M：蛋白量分子标准(kDa)，泳道1：大肠杆菌(M2E)，泳道2：大肠杆菌(M2D)，泳道3：大肠杆菌(M2B)，泳道4：大肠杆菌(M2C)，泳道5：大肠杆菌(M2A)，泳道6：大肠杆菌(M2F)。
图6为重组大肠杆菌细胞模块1全细胞蛋白的SDS-PAGE照片。泳道M：蛋白量分子标准(kDa)，泳道1：大肠杆菌(M1)。
图7显示了构建的大肠杆菌菌群以一锅一步的方式用于催化CHOL生产HMD的实验情况。其中，a，EC2_3催化的一锅一步方式将CHOL转化为HMD的方案。b，比较不同的EC2_3以一锅一步的方式将CHOL生物转化为HMD。反应条件：将大肠杆菌细胞模块2和3以4：3的比例重新悬浮在磷酸盐缓冲液(pH8.0,100mM)中，总细胞密度为14g CDW L-1,20mM CHOL，反应在25℃、220rpm下进行22h，辅因子NAD(P)H/ATP由大肠杆菌宿主细胞提供，使用68mM甘油作为能源，使用60mM异丙胺作为氨供体。c，EC2_3催化CHOL以一锅一步方式转化为HMD的时间过程。反应条件：将大肠杆菌(M2D)和大肠杆菌(M3A)以2:1的比例组成的大肠杆菌菌群2_3重悬于磷酸盐缓冲液(pH8.0,100mM)中，总细胞密度为14g CDW L-1,20mM CHOL，反应在25℃，220rpm下进行48h，辅因子NAD(P)H/ATP由大肠杆菌宿主细胞提供，使用102mM甘油作为能源和添加80mM异丙胺作为氨供体。
图8显示了构建的大肠杆菌菌群以一锅两步的方式用于催化CHOL生产HMD的实验情况。其中，a，大肠杆菌菌群2_3以一锅两步方式催化CHOL转化为HMD的方案。b，比较不同EC2_3在CHOL生物转化为HMD中的一锅两步方式。反应条件：将大肠杆菌细胞模块2和3以4：3的比例重新悬浮在磷酸盐缓冲液(pH8.0,100mM)中，总细胞密度为14g CDW L-1，20mM CHOL，反应在25℃、220rpm条件下进行22h，辅因子NAD(P)H/ATP由大肠杆菌宿主细胞提供，使用68mM甘油作为能量来源，添加60mM L-丙氨酸或异丙胺作为氨供体。反应过程中，待第一步反应完成后，在反应8h后加入细胞模块3和氨供体。c，EC2_3催化CHOL以一锅两步方式转化为HMD的时间过程。反应条件：将大肠杆菌(M2D)和大肠杆菌(M3D)以4：3的比例组成的大肠杆菌菌群2_3重悬于磷酸盐缓冲液(pH8.0,100mM)中，总细胞密度为14g CDW L-1，20mMCHOL，反应在25℃，220rpm下进行32h，辅因子NAD(P)H/ATP由大肠杆菌宿主细胞提供，使用68mM甘油作为能源和80mM异丙胺作为氨供体。反应过程中，待第一步反应完成后，在反应8h后加入细胞模块3和氨供体。
图9显示了构建的大肠杆菌菌群以一锅两步的方式用于催化环己烷CH生产HMD的实验情况。其中，a，EC1_2_3催化的一锅两步方式将CH转化为HMD的示意图。b，EC1_2_3催化CH转化为HMD的一锅两步方式的细胞密度和模块比例优化。反应条件：将由设计比例的模块1、2和3组成的大肠杆菌菌群重新悬浮在具有特定细胞密度、30mM CH的磷酸盐缓冲液(pH8.0、100mM)中。反应在25℃，220rpm下进行32h，辅因子NAD(P)H/ATP由大肠杆菌宿主细胞提供，使用136mM甘油作为能源，使用80mM异丙胺作为氨供体。在反应过程中，反应7h后加入细胞模块3和氨供体异丙胺。c，EC1_2_3以一锅两步方式催化CH转化为HMD的时间过程。反应条件：由大肠杆菌(M1)、大肠杆菌(M2D)和大肠杆菌(M3D)组成的大肠杆菌菌群以3：3：4的比例重新悬浮在磷酸钾缓冲液(pH8.0，100mM)中，在20g CDW L-1细胞密度下、30mM CH，反应在25℃、220rpm下进行44h，辅因子NAD(P)H/ATP由大肠杆菌宿主细胞提供，使用54mM甘油作为能源，80mM异丙胺用作氨供体。在反应过程中，反应8h后加入细胞模块3和氨供体异丙胺。
图10显示了大肠杆菌菌群一锅法从C6-C8环烷烃或环烷醇生产α,ω-二胺的示意图。
图11为大肠杆菌菌群2_3催化环己醇转化为HMD的反应样品的GC-MS分析。a，HMD标准品的GC色谱图。b，HMD标准品的质谱分析。获得HMD标准的碎片模式。c，大肠杆菌菌群2_3催化环己醇转化为HMD的GC色谱图。d，HMD产品的质谱分析。获得了HMD产品的碎片模式。GC-MS分析使用配备Rtx-5MS色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)的岛津GCMS-QP2010SE进行。
图12为大肠杆菌菌群1_2_3催化环己烷转化为HMD的反应样品的GC-MS分析。a，HMD标准品的GC色谱图。b，HMD标准品的质谱分析。获得HMD标准的碎片模式。c，大肠杆菌菌群1_2_3催化CH转化为HMD的GC色谱图。d，HMD产物的质谱分析。获得了HMD产品的碎片模式。GC-MS分析使用配备Rtx-5MS色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)的岛津GCMS-QP2010SE进行。
图13为大肠杆菌菌群2_3催化环庚醇转化为庚二胺的反应样品的GC-MS分析。a，1,7-庚二胺标准品的GC色谱图。b，1,7-庚二胺标准品的质谱分析。获得1,7-庚二胺标准品的碎片模式图。c，大肠杆菌菌群2_3催化环庚醇转化为1,7-庚二胺的GC色谱图。d，1,7-庚二胺产物的质谱分析。获得了1,7-庚二胺产物的碎片模式图。GC-MS分析使用配备Rtx-5MS色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)的岛津GCMS-QP2010SE进行。
图14为大肠杆菌菌群1_2_3催化环庚烷转化为庚二胺的反应样品的GC-MS分析。a，1,7-庚二胺标准品的GC色谱图。b，1,7-庚二胺标准品的质谱分析。获得1,7-庚二胺标准品的碎片模式图。c，大肠杆菌菌群1_2_3催化环庚烷转化为1,7-庚二胺的GC色谱图。d，1,7-庚二胺产物的质谱分析。获得了1,7-庚二胺产物的碎片模式图。GC-MS分析使用配备Rtx-5MS色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)的岛津GCMS-QP2010SE进行。
图15为大肠杆菌菌群2_3催化环辛醇转化为辛二胺的反应样品的GC-MS分析。a，1,8-辛二胺标准品的GC色谱图。b，1,8-辛二胺标准品的质谱分析。获得1,8-辛二胺标准品的碎片模式图。c，大肠杆菌菌群2_3催化环辛醇转化为1,8-辛二胺的GC色谱图。d，1,8-辛二胺产物的质谱分析。获得了1,8-辛二胺产物的碎片模式图。GC-MS分析使用配备Rtx-5MS色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)的岛津GCMS-QP2010SE进行。
图16为大肠杆菌菌群1_2_3催化环辛烷转化为辛二胺的反应样品的GC-MS分析。a，1,8-辛二胺标准品的GC色谱图。b，1,8-辛二胺标准品的质谱分析。获得1,8-辛二胺标准品的碎片模式图。c，大肠杆菌菌群1_2_3催化环辛烷转化为1,8-辛二胺的GC色谱图。d，1,8-辛二胺产物的质谱分析。获得了1,8-辛二胺产物的碎片模式图。GC-MS分析使用配备Rtx-5MS色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)的岛津GCMS-QP2010SE进行。
具体实施方式
目前，人工设计的级联催化引起了越来越多的关注，因为它能够从简单、廉价和容易获得的起始底物出发一锅法高效地合成目标化合物。例如，islatravir是一种抗病毒核苷类似物，由默克公司合成，是一个五酶体外级联反应的突出案例，其将对苯二甲酸用作聚对苯二甲酸乙二醇酯制造的单体前体，通过对二甲苯的五种酶催化的体内连续氧化反应生产得到。要在级联催化中实现高效的靶向化合物生产，需要很好地解决生物催化路线设计、酶选择和酶组装三个问题。随着计算生物学、酶学和合成生物学的快速发展，已经开发出越来越多的技术来解决上述三个问题，包括(i)已经建立的计算工具，如逆转录合成、RetroPath2.0和RetroBioCat指导逆向合成并促进路线设计过程；(ii)有效的酶筛选方法，如文献挖掘和基因组挖掘，以及先进的酶工程方法，如半理性设计和机器学习，已用于鉴定具有所需特性的适当酶；(iii)酶表达调控策略，例如启动子/RBS优化、多质体系统、基因拷贝修饰和微生物菌群介导的途径重构，已用于解决组装时酶活性或表达比不平衡的问题、设计的一锅体内/体外生物催化级联中的酶。最后，通过优化反应条件，可以实现目标化合物的高效生产。
在生物转化法生产DA的研究中，我们设计了一种基于逆合成分析的DA体内生物催化合成途径。这种生物催化级联通过使用简单且容易获得的环烷烃作为底物的三个大肠杆菌细胞模块组成的微生物组进行催化。以环烷烃(例如CH)转化为DA作为模式反应，并在每个大肠杆菌细胞模块中实现平衡的酶活性和蛋白表达，促进DA的生产，筛选具有所需特性的酶和细胞模块并进行优化。最后，采用一锅法绿色生物催化实现了从环烷烃或环烷醇高效生物合成DA。
本发明使用RetroBioCat进行了DA合成的生物合成路径设计。考虑到在一个微生物内难以实施整个生物合成路径的代谢过程，并且起始原料环烷烃(例如CH)、环烷醇(例如CHOL)等廉价前体的选择多样性，将代谢途径进行了分阶段的模块化。如图1所示，以1,6-己二胺(HMD)合成为例，从廉价的大宗化工原料环己烷出发，将生物合成路径设计为三个细胞模块即模块1(Cell Module 1)、模块2(Cell Module 2)和模块3(Cell Module3)，这三个细胞模块彼此独立，且可以实现依序的级联组合。细胞模块1用于催化环烷烃(例如CH)经羟基化生成环烷醇(例如CHOL)；细胞模块2用于催化环烷醇(例如CHOL)经过多步反应生成α,ω-二醇比如1,6-己二醇(HDO)；细胞模块3用于催化α,ω-二醇经过多步反应生成α,ω-二胺比如1,6-己二胺(HMD)。
应理解，图1所示的生物催化级联不仅仅适用于1,6-己二胺(HMD)的合成，同样适用于1,7-庚二胺、1,8-辛二胺等其它α,ω-二胺的生物合成。
在基于生物催化逆向合成分析设计了这种HMD人工生物合成路线后，考虑到与体外酶催化方法相比，可以避免成本昂贵的处理和反应步骤(例如酶纯化、添加昂贵的辅助因子)，决定采用微生物体内重组酶系途径。另一方面，为了消除在单个细胞中表达多种酶引起的潜在表达负担和氧化还原限制，通过将酶分布在三个细胞模块中，采用了使用模块化微生物菌群的概念(图1)，这三个模块构成一个完整的生物催化级联比如大肠杆菌菌群1_2_3。具体来说，细胞模块1过表达的单加氧酶P450在内源性辅因子NADPH存在下催化惰性化合物CH羟基化为CHOL；细胞模块2中过表达的醇脱氢酶(ADH)催化CHOL氧化为环己酮(CHONE)，Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)催化CHONE转化为ε-己内酯(CL)，内酯酶(Lac)催化CL水解为6-羟基己酸(HHA)，羧酸还原酶(CAR)借助磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(SFP)将羧酸还原为6-羟基己醛(6-hydroxyhexanal)，并且内源性醛酮还原酶(AKR)催化6-羟基己醛还原为HDO；细胞模块3涉及两轮乙醇脱氢酶(ChnD)和转氨酶(TA)的催化，过表达的乙醇脱氢酶(ChnD)先将HDO氧化为6-羟基己醛(6-hydroxyhexanal)，过表达的转氨酶(TA)将6-羟基己醛转化为6-氨基-1-己醇(6-aminohexan-1-ol)，接着乙醇脱氢酶(ChnD)再将6-氨基-1-己醇氧化为6-氨基己醛(6-aminohexanal)，然后转氨酶(TA)再将6-氨基己醛转化为HMD。
不同来源的同一种类酶在一个细胞模块中的表达和催化效果往往有一定差异，因此，对于在大肠杆菌中过表达的各种酶进行了筛选。由于不同的酶分布在三个细胞模块中，这三个模块有必要进行酶活性相协调的平衡组合，以便保障“一锅法”级联催化的实施。
本文中，有时将术语“级联催化”称为“联合催化”，这是本领域技术人员能够理解的，都是指通过两种以上酶组成的酶系统分步骤催化反应。当用于描述表达这些酶的细胞模块组合的“级联催化”、“联合催化”时，指的是EC1_2_3和EC2_3大肠杆菌菌群的分步骤催化反应。
用于将廉价易得的环烷烃(例如CH)或者环烷醇(例如CHOL)作为起始原料生产，“一锅法”级联催化的细胞模块投料形式分为一锅两步法和一锅一步法。
以环烷烃(例如CH)为原料时，可以采用一锅两步法进行：第一步由细胞模块1和2的组合催化环烷烃(例如CH)转化为环烷醇(例如CHOL)进而转化为α,ω-二醇(DO)，第二步反应添加细胞模块3以催化α,ω-二醇(DO)转化为α,ω-二胺(DA)。以环烷醇(例如CHOL)为原料时，可以采用一锅一步法，将细胞模块2和3组合起来在一个体系中同时催化反应。
研究和发现，在各个酶都确定的情况下，数种酶在同一个质粒骨架上不同的连接顺序方式有时候也会导致细胞模块的催化性能产生差异，进而需要对细胞模块2与细胞模块3的组合匹配进行调整。
将外源的酶在细胞模块比如大肠杆菌宿主菌中进行过表达，可以通过常规的质粒转化法实施，即，将酶基因克隆入适合于在细胞模块中复制的质粒载体上，然后通过化学转化法或者电转化方法转入细胞模块中；也可以通过基因编辑技术将酶基因克隆在细胞模块的基因组上，所述基因编辑技术例如选自下组：同源双交换，TALEN系统，CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cpf1系统，CRISPR-Cas12系统，CRISPR-BEST系统，MuGENT(multiplex genomeediting by natural transformation，通过自然转化进行多重基因组编辑)等。
本领域技术人员容易理解，为了在大肠杆菌中最佳地表达外源的酶基因比如BVMO、ADH、CAR、SFP等，需要对其表达基因进行了密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常表示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
三个细胞模块优选使用同一种微生物进行构建，例如都使用大肠杆菌作为宿主细胞来表达每个模块的酶。在构建用于将HDO转化为HMD的细胞模块3时，我们使用了来自不动杆菌属的乙醇脱氢酶(ChnD)和来自不同来源的转氨酶(TA)。为了找到ChnD与TA的最佳组合，将含有59种转氨酶的大肠杆菌全细胞催化剂分别与含有ChnD的大肠杆菌以1:1的比例单独混合，在3mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0,100mM)中重悬，细胞密度为8g CDW L-1，底物为30mMHDO。反应在25℃，220rpm条件下进行18h，L/D-丙氨酸(100mM丙氨酸和100mM D-丙氨酸)或异丙胺(100mM)作为氨供体，用于将HDO转化为HMD。筛选结果显示，当与ChnD结合时，59种转氨酶中有5种显示出优异的催化活性。然后我们单独进行ChnD与五种转氨酶(CV、PP2159、SAV2614、PAK或SPO3471)在单个细胞中的共表达。将携带TA和ChnD基因的质粒pETDuet-1转化到大肠杆菌中，从而产生五个具有不同质粒构型的大肠杆菌细胞。转氨酶为CV时，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为M3A；转氨酶PP2159时，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为M3B；转氨酶为SAV2614时，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为M3C；转氨酶为PAK时，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为M3D；转氨酶为SPO3471时，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为M3E。为了比较醇脱氢酶(ChnD)与不同转氨酶(TA)的组合，使用五种新构建的细胞模块将20mM HDO转化为HMD。结果如图2所示，除了大肠杆菌细胞模块(M3C)，当使用L-Ala或异丙胺作为氨供体时，所有细胞催化剂都有明显的HMD产生。其中，大肠杆菌细胞模块(M3E)表现出最好的催化性能，并在21小时内产生17.0mM HMD。结果表明，构建的细胞模块3可以实现从HDO生物催化生产HMD，从而为后续从CH或CHOL生产HMD提供了可能。
在构建用于将CHOL转化为HDO的细胞模块2过程中，尝试将所有酶在单个细胞中共表达。理论上，在这种生物催化级联反应中，需要在同一个大肠杆菌细胞中表达六种酶。然而，根据这些酶的动力学数据，发现内酯酶(Lac)显示出比其他酶高得多的活性。因此，为了平衡其表达和活性，决定单独将其整合到基因组中以降低表达、但足以达到所需的活性。此外，由于已经报道了负责大肠杆菌中醛还原的内源性醛酮还原酶(AKR)，我们认为内源性AKR也可以用于将6-羟基己醛还原为HDO，因此将在大肠杆菌中表达的外源AKR除去(图3中b)。基于以上分析，需要构建携带四种酶基因的质粒，包括来自不动杆菌属的Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)、来自短乳杆菌的乙醇脱氢酶(ADH)、来自脓肿分枝杆菌ATCC1997733的羧酸还原酶(CAR)和来自枯草芽孢杆菌的磷酸泛酰巯基乙炔基转移酶(SFP)。接下来，基于pRSFDuet-1质粒中酶基因的不同顺序，将不同的质粒(图3中b)转化到其基因组已与ldHA位点的Lac基因整合的大肠杆菌细胞中，获得五种重组大肠杆菌细胞模块2。此外，我们还将SFP与CAR融合形成融合蛋白，希望进一步增强CAR的催化活性，获得了第六个重组大肠杆菌细胞。根据质粒RSF中T7启动子下游各基因的顺序排列，大肠杆菌工程菌模块2分别命名如下：
T7启动子-ADH-CAR-SFP-BVMO(大肠杆菌基因组中整合了Lac基因)，命名为M2A；
T7启动子-ADH-BVMO-CAR-SFP(大肠杆菌基因组中整合了Lac基因)，命名为M2B；
T7启动子-BVMO-ADH-CAR-SFP(大肠杆菌基因组中整合了Lac基因)，命名为M2C；
T7启动子-CAR-SFP-BVMO-ADH(大肠杆菌基因组中整合了Lac基因)，命名为M2D；
T7启动子-CAR-SFP-ADH-BVMO(大肠杆菌基因组中整合了Lac基因)，命名为M2E；
T7启动子-CAR-Linker-SFP-ADH-BVMO(大肠杆菌基因组中整合了Lac基因)，命名为M2F，即SFP与CAR融合形成融合蛋白。
然后，为了比较大肠杆菌工程菌模块2的催化效果，使用这六种大肠杆菌细胞模块2作为全细胞催化剂，将CHOL转化为HDO。结果如图3中c所示，大多数细胞模块2表现出高催化性能；其中，M2B和M2D在反应3小时后产生较高浓度的HDO产物(6.6mM和8.0mM)，反应8h后可以产生19.7～19.8mM HDO(对应产率为98.5～99％)。其余的细胞模块2如M2A、M2E和M2F催化活性略低，但也产生了18.2至19.1mM的HDO。
在我们之前的研究中，专利文献CN111411128A和文献Yu HL,et al.,Bioamination of alkane with ammonium by an artificially designed multienzymecascade.Metabolic Engineering.47,184-189(2018).中构建了可将CH羟基化为CHOL的细胞模块1即重组大肠杆菌E.coli(P450BM319A12)，因此可以将不同的细胞模块(细胞模块1、2和3)组合成大肠杆菌菌群(EC)，并催化从CHOL或CH到HMD的合成。
上述大肠杆菌菌群(EC)能够用于生物合成经济价值很高的1,6-己二胺(HMD)。为了扩大底物范围并验证开发的大肠杆菌菌群的普适性，还测试了两种具有不同碳数(C7至C8)的环烷醇和环烷烃。具体使用环庚烷、环辛烷、环庚醇、环辛醇作为底物，分别使用EC1_2_3和EC2_3大肠杆菌菌群进行级联催化，实验结果证实了1,7-庚二胺和1,8-辛二胺的合成，表明本发明的细胞模块1-3级联催化同样适用于1,7-庚二胺、1,8-辛二胺等C7至C8的α,ω-二胺的生物合成，具有底物广谱性。
目前没有关于以C6至C8环烷烃或环烷醇为原料生物合成HMD、1,7-庚二胺或1,8-辛二胺的文献报道。我们开发的一锅法多酶表达细胞模块级联催化体系具有通用性，能够以廉价且容易获得的大宗化学品环烷烃或环烷醇作为底物，成功地实现了α,ω-二胺的生产，特别是对于非常有价值的HMD，当使用CHOL和CH作为底物时，分别得到了高达16.5mM和7.6mM的产物浓度，为工业化学生产过程中遇到的问题提供了全新构思的解决方案。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序委托生工生物工程股份有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.2，121℃高温高压灭菌20min。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉)，121℃高温高压灭菌20min。
固体培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、15g/L琼脂粉，混匀后分装到锥形瓶，竖立放置于121℃高温高压灭菌20min，降温后加入相应浓度抗生素，倒平板，待冷凝成固体即可。
化合物环烷烃、环烷醇、α,ω-二胺的含量分析
气相色谱分析：
使用SH-Rtx-WAX色谱柱进行GC分析的程序：使用SH-Rtx-WAX色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)分析获得的混合物。温度程序如下：5℃min-1从50℃到120℃，40℃min-1到240℃，并在240℃下保持3min。
使用SH-Rtx-5色谱柱进行GC分析的程序：使用SH-Rtx-5色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)分析获得的混合物。温度程序如下：对于6-羟基己酸(HHA)分析，5℃min-1从60℃到100℃，20℃min-1到240℃，并在240℃下保持1min。对于环己醇(CHOL)、环己酮(CHONE)、ε-己内酯(CL)、1,6-己二醇(HDO)分析，在80℃下保持3min，然后在12℃min-1从80℃到165℃，并在165℃下保持1min，80℃min-1至280℃，并在280℃下保持2min。
衍生化：
将先前获得的混合物(乙酸乙酯中的产物)以13,680×g离心10min以去除Na2SO4，然后将200μL上清液转移到新的1.5mL试管中。将乙酸乙酯完全蒸发后，将所得固体溶解在60μL吡啶和30μL N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)中。衍生化反应在65℃下进行1h，然后将混合物用于使用SH-Rtx-5色谱柱进行GC分析以分析HHA。
高效液相色谱分析：
脂肪族α,ω-氨基醇和α,ω-二胺的转化分析通过反相HPLC技术使用配备Shim-pack GISTC18色谱柱(4.6×250mm，5μm，日本岛津)。流动相由17％水(溶剂A)和83％乙腈(溶剂B)组成，流速为0.8mL/min。进样量为10μL，监测的吸收波长为254nm。
实施例中使用的菌株/质粒见表1。
表1.实施例中的菌株/质粒
实施例中使用的部分引物见表2。
表2.实施例中的引物
表2中，名称中的“-F”代表正向；“-R”代表反向。
需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶/酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。
上述表1中列出的非商品化的菌株/质粒由湖北大学生命科学学院李爱涛课题组构建保存，任何单位和个人都可以获得这些菌株/质粒用于验证本发明，但未经湖北大学允许不得用作其他用途，包括开发利用、科学研究和教学。
实施例1：重组大肠杆菌的构建
构建重组大肠杆菌所用的菌株、质粒、引物列于上述表1和表2中，基因序列详细信息列于附后的序列表中。其中醇脱氢酶ChnD编码基因序列为SEQ ID NO:1；转氨酶(TA)编码基因序列为SEQ ID NO:2，PP2159编码基因序列为SEQ ID NO:3，SAV2614编码基因序列为SEQ ID NO:4，PAK编码基因序列为SEQ ID NO:5，SPO3471编码基因序列为SEQ ID NO:6；醇脱氢酶ADH编码基因序列为SEQ ID NO:7；Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)编码基因序列为SEQ ID NO:8；内酯酶(Lac)编码基因序列为SEQ ID NO:9；羧酸还原酶(CAR)编码基因序列为SEQ ID NO:10；磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(SFP)编码基因序列为SEQ ID NO:11；细胞色素P450突变体P450BM319A12编码基因序列为SEQ ID NO:12。
本领域技术人员可以根据常规的基因工程手段构建出各个重组大肠杆菌工程菌。为说明书描述简洁清晰、避免冗长重复起见，构建重组大肠杆菌的通用方法如下所述：
使用具有15至20bp同源臂的引物，通过PCR扩增编码酶的基因和线性质粒骨架的DNA片段，从而实现随后的重组。通过重叠PCR组装编码酶的基因，并在T5核酸外切酶存在下克隆到线性载体中以产生15bp或20bp粘性末端，以便提高重组效率。反应混合物为5μL，含有线性载体、酶基因、缓冲液4.0(New England Biolabs)和T5核酸外切酶，在冰水中孵育5分钟，然后快速加入50μL感受态细胞(大肠杆菌DH5α)进行转化，转化完成后接种在含有适当抗生素的LB琼脂上。挑选得到的转化子，并对目标DNA片段进行测序以确认得到正确的转化子。将含有靶向酶基因的质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到目标工程菌，用于蛋白质表达和全细胞生物催化剂的制备。
实施例2：蛋白质表达和全细胞催化剂制备
本领域技术人员可以根据常规技术手段培养各个重组大肠杆菌工程菌来表达目标蛋白。为说明书描述简洁清晰、避免冗长重复起见，蛋白质表达和全细胞催化剂制备的典型程序如下所述：
将构建的重组大肠杆菌细胞接种到含有抗生素(50μg mL-1卡那霉素、100μg mL-1氨苄青霉素或两者)的4mL LB培养基中，并在37℃、220rpm下培养6h。将预培养物(4mL)转移到1L摇瓶中，加入适当抗生素的400mL TB培养基中，在37℃、220rpm下培养2～3h直到OD600达到0.6～0.8，然后加入IPTG(最终浓度为0.2mM)用于诱导蛋白表达。将温度调整到25℃保持14～16h。通过在5000×g、10℃下离心10min来收获细胞，用100mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗涤，并在随后的反应中用作全细胞生物催化剂。
例如，图4显示了重组大肠杆菌细胞模块3全细胞蛋白的SDS-PAGE分析结果；图5显示了重组大肠杆菌细胞模块2全细胞蛋白的SDS-PAGE分析结果；图6显示了重组大肠杆菌细胞模块1全细胞蛋白的SDS-PAGE分析结果。实验结果表明了本发明中所需的重组大肠杆菌构建成功。
实施例3：通过CRISPR-Cas9系统在大肠杆菌基因组中进行基因编辑
在大肠杆菌BL21(DE3)中，基因组上的ldhA被具有CRISPR-Cas9介导的基因编辑系统的靶基因内酯酶取代。该系统由三部分组成：两个质粒(pCas和pTarget)和一个供体DNA(通过重叠PCR组装的具有500bp上游和下游同源ldhA的内酯酶DNA片段)。
预先制备含有pCas的感受态细胞，在卡那霉素(50mg/mL)和L-阿拉伯糖(20mM终浓度)存在下于30℃培养以进行λ-Red诱导。然后通过电穿孔将pTarget和供体DNA转化到含有pCas的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。在30℃下恢复3h后，将细胞涂在含有卡那霉素(50mg/mL)和壮观霉素(100mg/mL)的LB琼脂上，在30℃下培养过夜。通过菌落PCR和DNA测序鉴定后，将内酯酶基因成功插入基因组的转化子用于两轮质粒固化。首先，将转化体接种到2ml含有卡那霉素(50mg/mL)和IPTG(2mM)的LB培养基中用于pTarget固化。其次，将pTarget系列固化的菌落在LB培养基中37℃培养，用于pCas固化，因为它的温度敏感复制子。
通过上述基因编辑技术，将Lac基因在ldHA位点整合到了大肠杆菌基因组中。
实施例4：细胞模块3将HDO转化为HMD
将底物1,6-己二醇(HDO)(最终浓度为20mM)添加到3mL模块化大肠杆菌细胞悬浮液中，该细胞在磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)中表达模块3的酶(最终细胞密度为8g CDW L-1)，缓冲液中含有100mM异丙胺作为氨供体。反应在25℃、220rpm的50mL摇瓶中进行指定的反应。之后，以适当的时间间隔取样并准备用于HPLC分析。为了确定HMD浓度，制备每个反应样品用于HPLC-C18柱的HPLC分析，样品制备方法如下：208μL磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)，250μL丹磺酰氯(溶于丙酮，6mg丹磺酰氯/10mL丙酮)和75μL饱和NaHCO3溶液(pH＝9.5)加入42μL反应样品中，超声处理10min后，静置10min。随后，将500mL甲醇添加到该混合物中。用0.22μm膜过滤器过滤后，通过HPLC分析反应样品。所有实验一式三份进行。
结果见图2，图2显示了五种构建的细胞模块将20mM HDO转化为HMD。除了大肠杆菌细胞模块(M3C)，当使用L-Ala或异丙胺作为氨供体时，所有细胞催化剂都有明显的HMD产生。其中，大肠杆菌细胞模块(M3E)表现出最好的催化性能，并在21小时内产生17.0mMHMD。该结果表明，构建的细胞模块3可以实现从HDO生物催化生产HMD，从而为后续从CH或CHOL生产HMD提供了可能。
实施例5：细胞模块2将CHOL转换为HDO
将底物环己醇(CHOL)(最终浓度为20mM)添加到3mL模块化大肠杆菌细胞悬浮液中，该细胞在磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)中表达模块2的酶(最终细胞密度为6g CDW L-1)，缓冲液中含有68mM甘油以促进NADPH再生。反应在25℃、220rpm的50mL摇瓶中进行指定的反应。之后，以适当的时间间隔取样并准备用于GC分析。为了确定HDO浓度，制备每个反应样品用于SH-Rtx-WAX色谱柱的GC分析，样品制备方法如下所示：375μL磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)和500μL含有4mM正癸烷的乙酸乙酯将(内标)添加到125μL含有饱和NaCl溶液的反应样品中，然后涡旋和离心(13,680×g，1min)。有机相用无水Na2SO4干燥，然后直接用于GC分析。所有实验一式三份进行。
结果见图3，图3中c显示了六种大肠杆菌细胞模块2作为全细胞催化剂将CHOL转化为HDO的催化效果。大多数细胞模块2表现出高催化性能；其中，M2B和M2D在反应3小时后产生较高浓度的HDO产物(6.6mM和8.0mM)，反应8h后可以产生19.7～19.8mM HDO(对应产率为98.5～99％)。其余的细胞模块2如M2A、M2E和M2F催化活性略低，但也产生了18.2至19.1mM的HDO。
实施例6：大肠杆菌菌群2_3催化CHOL转化为HMD
HMD的一锅一步生物合成：采用10mL反应系统。将底物CHOL(最终浓度为20mM)添加到10mL含有大肠杆菌菌群2_3悬浮液(最终CDW为24g L-1，细胞模块2和细胞模块3的比例为2：1)的磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)，缓冲液中还含有102mM甘油以促进NADPH再生、以及80mM异丙胺作为HMD合成的氨供体。反应在250mL摇瓶中在25℃、220rpm下进行。对于优化实验，反应体系为3mL。所有实验一式三份进行，误差线表示标准偏差。
HMD的一锅两步生物合成：将底物CHOL(最终浓度为20mM)添加到10mL含有大肠杆菌菌群2_3悬浮液(最终CDW为14g L-1，细胞模块2和细胞模块3为4:3)的磷酸钾缓冲液(0.1M,pH8.0)，缓冲液中还含有68mM甘油以促进NADPH再生和80mM异丙胺作为用于合成HMD的氨供体。其中，细胞模块3和异丙胺在25℃反应8h后加入。反应在25℃、220rpm条件下在250mL摇瓶中进行。对于优化实验，反应体系为3mL。
以适当的时间间隔取样并准备用于HMD和AH的HPLC分析，如细胞模块3将HDO转化为HMD的典型程序部分所述。为了测定CHOL、CHONE、CL、HDO浓度，制备每个反应样品使用SH-Rtx-5色谱柱用于GC分析，样品制备方法如下所示：375μL磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)和500μL含有4mM正癸烷(内标)的乙酸乙酯添加到125μL含有饱和NaCl溶液的反应样品中，然后涡旋和离心(13,680×g，1min)。有机相用无水Na2SO4干燥，然后直接用于GC分析。为了确定HHA浓度，制备每个反应样品使用SH-Rtx-5色谱柱用于GC分析，样品制备方法如下所示：375μL磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)、50μLHCl(4M)和500μL乙酸乙酯加入到125μL反应样品中，然后涡旋和离心(13,680×g，1min)。有机相用无水Na2SO4干燥，随后进行衍生化步骤，然后用于GC分析。所有实验一式三份进行。
结果见图7和图8，图7-8中b和c显示了大肠杆菌菌群2_3能够以一锅一步方式、一锅两步方式催化CHOL转化为HMD，符合本发明的构思预期。
实施例7：大肠杆菌菌群1_2_3催化CH转化为HMD
将底物环己烷(CH)(最终浓度为30mM)添加到10mL含有大肠杆菌菌群1_2_3悬浮液(最终CDW为20g L-1，细胞模块1、细胞模块2和细胞模块3的比例为3：3：4)的磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)，缓冲液还含有68mM甘油以促进NADPH再生和80mM异丙胺作为HMD合成的氨供体。其中，细胞模块3和异丙胺在反应8h后加入。反应在25℃、220rpm反应条件下在250mL摇瓶中进行。以适当的时间间隔取样并准备用于HPLC和GC分析，如大肠杆菌菌群2_3催化CHOL转化为HMD部分所述。所有实验一式三份进行。
结果见图9，图9中b和c显示了大肠杆菌菌群1_2_3能够以一锅两步方式催化CH转化为HMD，符合本发明的构思预期。
实施例8：底物扩大实验
进一步考察本发明构建的大肠杆菌菌群对于底物范围的适用性。
参照实施例4-7的方法，分别用C7的环庚醇和环庚烷、C8的环辛醇和环辛烷代替上述实施例中底物C6的环己醇和环己烷，使用同样的细胞模块1、细胞模块2和细胞模块3及同样的反应条件，分别进行催化合成1,7-庚二胺和1,8-辛二胺的试验。从环烷醇合成α,ω-二胺的反应条件：将含有比例为2：1的大肠杆菌(M2D)和大肠杆菌(M3A)的大肠杆菌菌群重新悬浮在磷酸盐缓冲液(pH8.0，100mM)中，总细胞密度为24g CDW L-1、底物浓度为20mM环己醇、15mM环庚醇或15mM环辛醇。反应在25℃、220rpm下进行32h，辅因子NAD(P)H/ATP由大肠杆菌宿主细胞提供，使用102mM甘油作为能源，添加80mM异丙胺作为氨供体。从环烷烃合成α,ω-二胺的反应条件：将含有比例为3：3：4的大肠杆菌(M1)、大肠杆菌(M2D)和大肠杆菌(M3D)的大肠杆菌菌群重新悬浮在磷酸盐缓冲液中(pH8.0，100mM)，细胞密度为20g CDW L-1、底物浓度为30mM环己烷、15mM环庚烷或20mM环辛烷。反应在25℃、220rpm下进行32h，辅因子NAD(P)H/ATP由大肠杆菌宿主细胞提供，使用68mM甘油作为能源，添加80mM异丙胺作为氨供体。8.5h后加入细胞模块3大肠杆菌(M3D)和异丙胺。以适当的时间间隔取样，进行产物HPLC和GC分析。
结果见图10-16，图10-16显示了大肠杆菌菌群大肠杆菌菌群1_2_3能够以一锅一步方式、一锅两步方式催化C6-C8的环烷烃(例如CH)、环烷醇(例如CHOL)转化为α,ω-二胺，符合本发明的构思预期，表明本发明开辟成功了一条全过程绿色环保的α,ω-二胺生产工艺。

Claims (10)

1.一种微生物转化生产二胺的方法，包括如下步骤：
以α,ω-二醇为原料，用大肠杆菌工程菌模块3催化反应，得到α,ω-二胺；或者
以环烷醇为原料，用大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3进行“一锅法”联合催化，得到α,ω-二胺；或者
以环烷烃为原料，用大肠杆菌工程菌模块1、大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3进行“一锅法”联合催化，得到α,ω-二胺，其中
大肠杆菌工程菌模块3过表达醇脱氢酶ChnD和转氨酶(TA)，
大肠杆菌工程菌模块2过表达醇脱氢酶ADH、Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)、内酯酶(Lac)、羧酸还原酶(CAR)、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(SFP)，并且表达内源性醛酮还原酶(AKR)，
大肠杆菌工程菌模块1过表达P450酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α,ω-二胺是C6-C8的α,ω-二胺即1,6-己二胺、1,7-庚二胺或者1,8-辛二胺；相应地，所述环烷醇为环己醇、环庚醇或者环辛醇；所述环烷烃为环己烷、环庚烷或者环辛烷。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块3中过表达的所述醇脱氢酶ChnD编码基因序列为SEQ ID NO:1；所述转氨酶(TA)选自下组中的一种：CV，编码基因序列为SEQ ID NO:2；PP2159，编码基因序列为SEQ ID NO:3；SAV2614，编码基因序列为SEQID NO:4；PAK，编码基因序列为SEQ ID NO:5；SPO3471，编码基因序列为SEQ ID NO:6。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块2中过表达的所述醇脱氢酶ADH编码基因序列为SEQ ID NO:7；所述Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)编码基因序列为SEQ ID NO:8；所述内酯酶(Lac)编码基因序列为SEQ ID NO:9；所述羧酸还原酶(CAR)编码基因序列为SEQ ID NO:10；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(SFP)编码基因序列为SEQID NO:11。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块1中过表达的所述P450酶是在专利文献CN111411128A和文献Yu HL,et al.,Bioamination of alkane withammonium by an artificially designed multienzyme cascade.MetabolicEngineering.47,184-189(2018).中报道的P450BM319A12，编码基因序列为SEQ ID NO:12；或者是专利文献CN114836486A中报道的野生型细胞色素P450-BM3 WT、细胞色素突变体P450-BM3F87G或者细胞色素P450pyrTM；或者是Salamanca,Diego,et al."Novelcyclohexane monooxygenase from Acidovorax sp.CHX100."Applied microbiology andbiotechnology.996889-6897(2015).中报道的细胞色素P450CHX。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块3通过下述方法构建得到：将ChnD基因和一种TA基因(选自CV、PP2159、SAV2614、PAK和SPO3471)克隆到质粒pETDuet-1上，构建的质粒pETDuet-ChnD-TA依次包含T7启动子、ChnD基因、RBS位点和TA基因，命名为pETDuet-ChnD-TA；然后将构建的质粒pETDuet-ChnD-TA转化到大肠杆菌中，得到大肠杆菌工程菌。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块2通过下述方法构建得到：
1)将ADH基因、CAR基因、SFP基因和BVMO基因克隆到质粒pRSFDuet-1上，构建的质粒pRSFDuet-CAR-SFP-BVMO-ADH包含T7启动子、两个基因之间的RBS位点，命名为(pRSFDuet-CAR，SFP，BVMO，ADH)；
2)将Lac基因在ldHA位点整合到大肠杆菌基因组中，得到大肠杆菌工程菌，
3)将构建的质粒(pRSFDuet-CAR，SFP，BVMO，ADH)转化到基因组中整合了Lac基因的大肠杆菌工程菌中。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，根据质粒(pRSFDuet-CAR，SFP，BVMO，ADH)中T7启动子下游各基因的顺序排列，大肠杆菌工程菌模块2分别命名如下：
T7启动子-ADH-CAR-SFP-BVMO，即大肠杆菌基因组中整合了Lac基因，命名为M2A；
T7启动子-ADH-BVMO-CAR-SFP，即大肠杆菌基因组中整合了Lac基因，命名为M2B；
T7启动子-BVMO-ADH-CAR-SFP，即大肠杆菌基因组中整合了Lac基因，命名为M2C；
T7启动子-CAR-SFP-BVMO-ADH，即大肠杆菌基因组中整合了Lac基因，命名为M2D；
T7启动子-CAR-SFP-ADH-BVMO，即大肠杆菌基因组中整合了Lac基因，命名为M2E；
T7启动子-CAR-Linker-SFP-ADH-BVMO，即大肠杆菌基因组中整合了Lac基因，命名为M2F，即SFP与CAR融合形成融合蛋白(进一步增强CAR的催化活性)。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块1通过下述方法构建得到：将P450酶基因克隆到表达载体pRSF-Duet(购自Novagen)上相应位点，酶切位点为NdeI和BamHI，将P450酶基因的表达置于T7启动子和lacI阻遏基因的控制下，获得重组质粒pRSF-Duet-P450；将质粒pRSF-Duet-P450转化到大肠杆菌中，得到表达P450酶的大肠杆菌工程菌。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当以环烷醇为原料，用大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3进行“一锅法”联合催化时，采用一锅两步法的生物催化级联反应、或者一锅一步法，其中，
一锅两步法是使用细胞模块2将底物环烷醇转化为α,ω-二醇(DO)，底物环烷醇完全转化后，将细胞模块3添加反应体系中，并添加L-Ala或异丙胺作为氨供体，进行α,ω-二醇到α,ω-二胺(DA)的反应；
一锅一步法是将细胞模块2和3组合起来形成大肠杆菌菌群2_3(EC2_3)，在一个体系中同时催化反应，并添加L-Ala或异丙胺作为氨供体；
当以环烷烃为原料，用大肠杆菌工程菌模块1、大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3组成大肠杆菌菌群1_2_3(EC1_2_3)进行“一锅法”联合催化时，采用一锅两步法进行：第一步由细胞模块1和2的组合催化环烷烃转化为环烷醇进而转化为α,ω-二醇(DO)，第二步反应添加细胞模块3以催化α,ω-二醇(DO)转化为α,ω-二胺(DA)。
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