CN118019543A - 解淀粉芽孢杆菌用于预防和治疗帕金森氏病的用途 - Google Patents

解淀粉芽孢杆菌用于预防和治疗帕金森氏病的用途 Download PDF

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Abstract

本文公开了用于预防、改善或治疗帕金森氏病(Parkinson's disease)和/或降低与帕金森氏病相关的一种或多种风险因素、体征或症状的严重程度的组合物和方法。具体地，本公开的技术涉及用于向患有帕金森氏病或有帕金森氏病风险的受试者施用有效量的组合物的方法，所述组合物包括操作组解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)细菌的一种或多种菌株，所述一种或多种菌株被鉴定为ART24和ART12。

Description

解淀粉芽孢杆菌用于预防和治疗帕金森氏病的用途
相关申请交叉引用
本申请要求于2021年9月7日提交的美国临时专利申请第63/241,442号的优先权，所述美国临时专利申请的内容特此通过引用整体并入。
技术领域
本发明技术涉及用于预防、改善或治疗帕金森氏病和/或降低与帕金森氏病(Parkinson's disease)相关的一种或多种风险因素、体征或症状的严重程度的方法和组合物。具体地，本发明技术涉及向患有帕金森氏病或有帕金森氏病风险的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包括操作组解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)细菌的一种或多种菌株，所述一种或多种菌株被鉴定为ART24和ART12。
背景技术
提供以下描述以帮助读者理解。不承认所提供信息或所引用参考文献是本文所公开的组合物和方法的现有技术。
帕金森氏病是仅次于阿尔茨海默氏病的第二常见神经退行性疾病。帕金森氏病是一种进行性神经系统病症，主要影响运动，但患者可能经历非运动症状，包含但不限于认知能力下降、言语问题、睡眠问题和情绪问题。帕金森氏病的主要特征在于中脑中控制运动的产生多巴胺的神经元的死亡或损伤，尽管也有去甲肾上腺素产生的普遍损失。目前还没有治愈帕金森氏病的方法。因此，需要另外的疗法来预防、治疗或降低患帕金森氏病的风险。
发明内容
一方面，本发明技术的公开提供了一种用于治疗或预防有需要的受试者的帕金森氏病(PD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括细菌菌株ART24(NCIMB登录号43088)、细菌菌株ART12(NCIMB登录号43087)或其组合。
在一些实施例中，所述细菌菌株是冻干的。在一些实施例中，所述细菌菌株呈孢子形式。在一些实施例中，所述细菌菌株呈营养体形式。在一些实施例中，所述细菌菌株是呈孢子形式和所述营养体形式的菌株的混合物。
在一些实施例中，所述细菌菌株被调配成膳食补充剂。在一些实施例中，所述细菌菌株被调配成可食用产品。在一些实施例中，所述可食用产品进一步包括载体、媒剂或赋形剂。在一些实施例中，所述可食用产品进一步包括发酵食物产品、大豆、蘑菇、绿豆、刺槐豆、大米或其提取物。在一些实施例中，所述大豆是发酵大豆或发酵大豆酱。在一些实施例中，所述发酵大豆或所述发酵大豆酱是清国酱(Cheonggukjang)、豆豉(Douchi)、Hawaijar、Bekang、Peruyaan、Tungrymbai、Eoyukjang、Kinema、Aakhone、味噌(Miso)、纳豆(Natto)或Thua-nao。
在一些实施例中，所述PD包括以下中的一种或多种：震颤、肌肉僵硬、动作迟缓、姿势和平衡不良、言语变化、精细运动技能困难、认知变化、便秘、早饱、出汗过多、疲劳、脂溢性皮炎、幻觉和妄想、直立性低血压、嗅觉或味觉丧失、抑郁、焦虑、冷漠、易怒、失眠、白天过度嗜睡、REM睡眠行为障碍、生动梦和不安腿综合征、视力问题以及体重减轻。
在一些实施例中，治疗或预防包括以下中的一项或多项：增加纹状体多巴胺水平、增加纹状体DOPAC水平或增加纹状体高香草酸水平。
在一些实施例中，所述药物组合物是口服施用的。
在一些实施例中，所述方法进一步包括单独、顺序或同时施用一种或多种选自由以下组成的组的药剂：多巴胺脱羧酶抑制剂、多巴胺前体、多巴胺激动剂、儿茶酚-o-甲基转移酶抑制剂、单氨基氧化酶-B抑制剂、腺苷2A拮抗剂和抗胆碱能药或N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂。
另一方面，本发明技术的公开提供了一种组合物的用途，其用于制备用于治疗有需要的受试者的帕金森氏病(PD)的药物，其中所述组合物包括细菌菌株ART24(NCIMB登录号43088)、细菌菌株ART12(NCIMB登录号43087)或其组合。
在一些实施例中，所述细菌菌株是冻干的。在一些实施例中，所述细菌菌株呈孢子形式。在一些实施例中，所述细菌菌株呈营养体形式。在一些实施例中，所述细菌菌株是呈孢子形式和所述营养体形式的菌株的混合物。
在一些实施例中，所述细菌菌株被调配成膳食补充剂。在一些实施例中，所述细菌菌株被调配成可食用产品。在一些实施例中，所述可食用产品进一步包括载体、媒剂或赋形剂。在一些实施例中，所述可食用产品进一步包括发酵食物产品、大豆、蘑菇、绿豆、刺槐豆、大米或其提取物。在一些实施例中，所述大豆是发酵大豆或发酵大豆酱。在一些实施例中，所述发酵大豆或所述发酵大豆酱是清国酱、豆豉、Hawaijar、Bekang、Peruyaan、Tungrymbai、Eoyukjang、Kinema、Aakhone、味噌、纳豆或Thua-nao。
在一些实施例中，所述PD包括以下中的一种或多种：震颤、肌肉僵硬、动作迟缓、姿势和平衡不良、言语变化、精细运动技能困难、认知变化、便秘、早饱、出汗过多、疲劳、脂溢性皮炎、幻觉和妄想、直立性低血压、嗅觉或味觉丧失、抑郁、焦虑、冷漠、易怒、失眠、白天过度嗜睡、REM睡眠行为障碍、生动梦和不安腿综合征、视力问题以及体重减轻。
在一些实施例中，治疗或预防包括以下中的一项或多项：增加纹状体多巴胺水平、增加纹状体DOPAC水平或增加纹状体高香草酸水平。
在一些实施例中，所述药物组合物被调配用于口服施用。
在一些实施例中，所述供使用的组合物进一步包括单独、顺序或同时施用一种或多种选自由以下组成的组的药剂：多巴胺脱羧酶抑制剂、多巴胺前体、多巴胺激动剂、儿茶酚-o-甲基转移酶抑制剂、单氨基氧化酶-B抑制剂、腺苷2A拮抗剂和抗胆碱能药或N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂。
另一方面，本公开的技术提供了一种用于治疗有需要的受试者的帕金森氏病(PD)的组合物，其中所述组合物包括细菌菌株ART24(NCIMB登录号43088)、细菌菌株ART12(NCIMB登录号43087)或其组合。
在一些实施例中，所述细菌菌株是冻干的。在一些实施例中，所述细菌菌株呈孢子形式。在一些实施例中，所述细菌菌株呈营养体形式。在一些实施例中，所述细菌菌株是呈孢子形式和所述营养体形式的菌株的混合物。
在一些实施例中，所述细菌菌株被调配成膳食补充剂。在一些实施例中，所述细菌菌株被调配成可食用产品。在一些实施例中，所述可食用产品进一步包括载体、媒剂或赋形剂。在一些实施例中，所述可食用产品进一步包括发酵食物产品、大豆、蘑菇、绿豆、刺槐豆、大米或其提取物。在一些实施例中，所述大豆是发酵大豆或发酵大豆酱。在一些实施例中，所述发酵大豆或所述发酵大豆酱是清国酱、豆豉、Hawaijar、Bekang、Peruyaan、Tungrymbai、Eoyukjang、Kinema、Aakhone、味噌、纳豆或Thua-nao。
在一些实施例中，所述PD包括以下中的一种或多种：震颤、肌肉僵硬、动作迟缓、姿势和平衡不良、言语变化、精细运动技能困难、认知变化、便秘、早饱、出汗过多、疲劳、脂溢性皮炎、幻觉和妄想、直立性低血压、嗅觉或味觉丧失、抑郁、焦虑、冷漠、易怒、失眠、白天过度嗜睡、REM睡眠行为障碍、生动梦和不安腿综合征、视力问题以及体重减轻。
在一些实施例中，治疗或预防包括以下中的一项或多项：增加纹状体多巴胺水平、增加纹状体DOPAC水平或增加纹状体高香草酸水平。
在一些实施例中，所述药物组合物被调配用于口服施用。
在一些实施例中，所述用途进一步包括单独、顺序或同时施用一种或多种选自由以下组成的组的药剂：多巴胺脱羧酶抑制剂、多巴胺前体、多巴胺激动剂、儿茶酚-o-甲基转移酶抑制剂、单氨基氧化酶-B抑制剂、腺苷2A拮抗剂和抗胆碱能药或N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂。
在一些实施例中，所述细菌菌株是ART24。
在一些实施例中，所述细菌菌株是ART12。
附图说明
图1A是示出用媒剂和MPTP以及测试制品(ART24)处理的小鼠的纹状体中的多巴胺的测得含量(pg/mg组织)的图表。****P<0.0001，*P<0.05，单向ANOVA分析，随后是未校正的费希尔LSD测试(Fisher's LSD test)，与盐水/MPTP组相比，n＝10只/组。
图1B是示出用媒剂和MPTP以及测试制品(ART24)处理的小鼠的纹状体中的DOPAC的测得含量(pg/mg组织)的图表。*P<0.05，****P<0.0001，单向ANOVA分析，随后是未校正的费希尔LSD测试，与盐水/MPTP组相比，n＝10只/组。
图2是示出模拟胃液(pH 3)对ART24孢子的影响的图表。
图3A是示出对原代大鼠胚胎中脑细胞(小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元)进行LPS暴露24小时后的TNF-α释放(相对于中毒的百分比)的图表。*p<0.05，与LPS中毒组相比。
图3B是示出对原代大鼠胚胎中脑细胞(小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元)进行LPS暴露24小时后的IL-1β释放(相对于中毒的百分比)的图表。*p<0.05，与LPS中毒组相比。
图3C是示出对原代大鼠胚胎中脑细胞(小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元)进行LPS暴露5天后的酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元(相对于对照的百分比)的图表。*p<0.05，与LPS中毒组相比。
图4A-4C是示出用MPTP和ART24处理后的斑马鱼的运动活性分析结果的图表。在50分钟(10分钟/阶段)期间响应于交替的黑暗阶段和光照阶段而移动的距离(mm)，示出为总计(图4A)和每分钟移动距离(图4B)。图4C是示出响应于所执行的三个敲击刺激中的每一个的幼虫百分比的图表。幼虫在敲击后移动超过1mm时被认为有应答。误差条在图4A和图4C中示出最大值和最小值，在图4B中示出SEM。星号指示与MPTP处理相比，在单向ANOVA分析，随后是邓尼特测试(Dunnet test)后的显著性。除DMSO和MPTP(单独)分别为N＝22和N＝26外，N＝16。“细菌”＝ART24。
图5是示出用媒剂、MPTP、ART12或ART24处理的小鼠中的纹状体高香草酸(HVA)含量(pg/mg组织)的图表。****P<0.0001，单向ANOVA分析，随后是未校正的费希尔LSD测试，与盐水/MPTP组相比，n＝15只/组。
图6A是描绘在未经处理和ART24处理的α-突触核蛋白转基因斑马鱼幼虫的结节区域中分析的6个簇的示意性图像。左侧的图像是区域1和2中没有TH表达的对照幼虫的代表性图像。右侧的图像是区域1和2中具有TH表达的ART24处理的幼虫的代表性图像。
图6B是在未经处理和ART24处理的α-突触核蛋白转基因斑马鱼幼虫的结节区域中的TH表达的归一化面积的散点图。面积已相对于对照组的平均值进行了归一化。星号指示斯图登氏t测试(Student's t-test)后的显著性。*p<0.05。误差条示出最大值和最小值。
图6C是描绘在结节区域的区域1和2的多巴胺神经元中具有酪氨酸羟化酶表达的α-突触核蛋白转基因斑马鱼幼虫的百分比的图。星号指示费希尔精确测试(Fisher'sexact test)后的显著性。*p<0.05。对照组和经处理组分别为N＝82和73。
图7A是用于斑马鱼运动移动分析的行为方案的示意图。阴影箭头表示黑暗阶段，而非阴影箭号表示光照阶段。
图7B和7C是示出在存在和不存在MPTP和ART12或ART24的情况下，在50分钟(10分钟/阶段)期间，斑马鱼响应于交替的黑暗阶段和光照阶段而移动的距离(mm)的图表，示出为总计(图7B)和每分钟移动距离(图7C)。
图7D是示出响应于所执行的三个敲击刺激中的每一个的斑马鱼幼虫百分比的图表。对于图7B和7D，误差条示出了最大值和最小值，在图7C中示出SEM。图7B中的星号指示单向ANOVA分析，随后是图基多重比较测试(Tukey's multiple comparison test)后的显著性。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。在仅DMSO组和仅MPTP组中，N＝24；在ART12和ART24组中，N＝72。
图8A是用或不用ART12处理的小鼠MPTP处理的纹状体中的帕金森氏病基因表达的图形表示。每列表示小鼠纹状体(灰色标记(从左到右的前15列)：ART12处理的；黄色标签(从左到右的接下来15列)：对照)。每行表示帕金森氏相关基因(京都基因和基因组百科全书[KEGG]组)。数据被归一化，并且红色指示高于平均表达的表达，而蓝色指示低于平均表达的表达。基因集富集分析(GSEA)鉴定，ART12处理的和对照MPTP小鼠的纹状体中的帕金森氏病基因存在显著差异。
图8B是用ART12处理(灰色列(从左到右的前15列))或不用处理(黄色列(从左到右的接下来15列)的小鼠MPTP处理的结肠中的帕金森氏病基因表达的图形表示。每行表示帕金森氏相关基因(京都基因和基因组百科全书[KEGG]组)。数据被归一化，并且红色指示高于平均表达的表达，而蓝色指示低于平均表达的表达。基因集富集分析(GSEA)鉴定，ART12处理的和对照MPTP小鼠的结肠中的帕金森氏病基因存在显著差异。
图8C是用ART24处理(灰色列(从左到右的前15列))或不用处理(黄色列(从左到右的接下来15列)的小鼠MPTP处理的结肠中的帕金森氏病基因表达的图形表示。每行表示帕金森氏相关基因(京都基因和基因组百科全书[KEGG]组)。数据被归一化，并且红色指示高于平均表达的表达，而蓝色指示低于平均表达的表达。基因集富集分析(GSEA)鉴定，ART24处理的和对照MPTP小鼠的结肠中的帕金森氏病基因存在显著差异。
具体实施方式
应了解到，本发明的技术的某些方面、方式、实施例、变体和特征在以下以不同的详细水平进行了描述以便提供对本发明技术的实质上的理解。如本说明书中所使用的某些术语的定义提供在下文中。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本发明的技术所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
I.定义
本文使用以下术语，其定义仅供参考。
如本文所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”表示单数和复数两者，除非明确指出仅表示单数。
术语“约”和范围的一般使用，无论是否由术语约限定，都意味着所理解的数量不限于本文所示的确切数量，并且旨在指基本上在引用范围内的范围，而不脱离本发明的范围。如本文所使用的，“约”将为本领域的普通技术人员所理解，并且在某种程度上将根据使用其的上下文而变化。如果术语的用途对本领域普通技术人员而言是不清楚的，则考虑到使用所述术语的上下文，“约”将意味着此特定术语的至多正或负10％。
如本文所使用的，向受试者“施用”本发明技术的药剂、药物、细菌菌株或其孢子或组合物包含向受试者引入或递送化合物以发挥其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径执行施用，这些途径包含口服、鼻内施用、肠胃外施用(静脉内施用、肌内施用、腹膜内施用或皮下施用)或局部施用或吸入施用。在一些实施例中，本发明技术的组合物被调配用于肠溶施用。在一些实施例中，组合物被调配用于口服、舌下或直肠递送。在一些实施例中，组合物被调配用作益生菌。在一些实施例中，组合物被调配用作活生物治疗剂。如本文所使用的，施用包含自我施用和由他人施用。
如本文所使用的，“ART24”是指以NCIMB登录号43088保藏的细菌菌株或其孢子，或包括所述菌株的组合物。ART24被认为是“操作组解淀粉芽孢杆菌”的成员，其包括土壤携带的解淀粉芽孢杆菌、与植物相关的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
如本文所使用的，“ART12”是指以NCIMB登录号43087保藏的细菌菌株或其孢子，或包括所述菌株的组合物。ART12被认为是“操作组解淀粉芽孢杆菌”的成员，其包括土壤携带的解淀粉芽孢杆菌、与植物相关的暹罗芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌。
如本文所使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”和“药学有效量”是指足以达到期望治疗和/或预防效果的量，例如，使得预防疾病、病状和/或其症状的量。在治疗性或预防性应用的上下文中，施用于受试者的组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度并且取决于受试者的特性，如总体健康状况、年龄、性别、体重和对组合物药物的耐受性。其还取决于疾病的程度、严重程度和类型或条件。本领域技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当的剂量。在一些实施例中，施用多剂量。另外地或可替代地，在一些实施例中，施用多种治疗组合物或化合物(例如，包括细菌菌株的药物组合物，其单独地或与另外的活性剂组合，如卡比多巴-左旋多巴(carbidopa-levodopa)、金刚烷胺(amantadine)、普拉克索(pramipexole)、罗匹尼罗(ropinirole)、罗替戈汀(rotigotine)、阿朴吗啡(apomorphine)、司来吉兰(selegiline)、雷沙吉兰(rasagiline)、沙芬酰胺(safinamide)、恩他卡朋(entacapone)、奥匹卡朋(opicapone)、苯托品(benztropine)、苯海索(trihexyphenidyl))。在本文所描述的方法中，包括本发明技术的细菌菌株或其孢子的组合物可以施用于患有帕金森氏病的一种或多种体征、症状或风险因素的受试者，包含但不限于震颤、肌肉僵硬、动作迟缓、姿势和平衡不良、言语变化、精细运动技能困难、认知变化(例如，注意力、计划、记忆、痴呆等方面的困难)、消化问题(如便秘)、早饱、出汗过多、疲劳、脂溢性皮炎、幻觉和妄想、直立性低血压、嗅觉或味觉丧失、情绪障碍(如抑郁、焦虑、冷漠和易怒)、睡眠障碍(如失眠、白天过度嗜睡、REM睡眠行为障碍、生动的梦和不安腿综合征)、视力问题(尤其是在试图近距离阅读项目时)以及体重减轻。例如，本发明技术的组合物的“治疗有效量”包含至少改善帕金森氏病的一种或多种体征、症状或风险因素的存在、频率或严重程度的水平。在一些实施例中，治疗有效量减少或改善帕金森氏病的生理影响、和/或帕金森氏病的风险因素和/或患上帕金森氏病的可能性。在一些实施例中，通过多次施用达到治疗有效量。在一些实施例中，通过单次施用达到治疗有效量。
如本文所使用的，术语“冷冻干燥的”或“冷冻干燥”和“冻干的”或“冻干”可互换使用，并且是指在产品冷冻并放置于真空下后从产品中去除水以及由此产生的产品的过程。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体和/或稀释剂”或“药学上可接受的赋形剂”包含但不限于溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延缓剂等。在一些实施例中，药学上可接受的载体包括多糖、刺槐豆胶、阴离子多糖、淀粉、蛋白质、抗坏血酸钠、谷胱甘肽、海藻糖、蔗糖或果胶。在一些实施例中，多糖包括植物、动物、藻类或微生物多糖。在一些实施例中，多糖包括瓜尔胶、菊粉、直链淀粉、壳聚糖、硫酸软骨素、海藻酸盐或葡聚糖。在一些实施例中，淀粉包括大米淀粉。这种介质和药剂用于生物活性物质的用途在本领域是众所周知的。下文提供了赋形剂的另外的细节。补充活性成分，如抗微生物剂，例如抗真菌剂，也可以掺入到组合物中。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”是指当向动物或人类施用时，不产生不利、过敏或其它不良反应的物质和组合物。如本文所使用的，术语包含所有惰性、无毒、液体或固体填料、或不会以不适当的阴性方式与本发明的治疗物质反应的稀释剂、溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、防腐剂等，例如液体药物载体，例如，无菌水、盐水、糖溶液、Tris缓冲液、乙醇和/或某些油。
如本文所使用的，“益生菌”是指包括受试者的瞬时或内源性菌群的组分的细菌，其被施用以对受试者赋予有益的预防和/或治疗效果。本领域技术人员通常已知益生菌是安全的。在一些实施例中，“益生菌”包含“活的生物治疗产品”。
如本文所使用的，在统计样品中，“预防(prevention)”、“预防(prevent)”或预防“(preventing)”病症或病状是指相对于未经处理的对照，减少经处理的受试者/样品中的病症或病状的发生或复发，或者是指相对于未经处理的对照，延迟病症或病状的一种或多种症状的发作。
如本文所使用的，“受试者”和“患者”可互换地使用。在一些实施例中，受试者是动物受试者。在一些实施例中，动物受试者是哺乳动物。在一些实施例中，哺乳动物受试者是人。
如本文所使用的，术语“同时”施用是指以相同的途径并同时或基本上同时施用至少两种药剂。
如本文所使用的，术语“单独”施用是指通过不同途径同时施用或者基本上同时施用至少两种药剂。
如本文所使用的，术语“顺序”施用是指在不同时间施用至少两种药剂，施用途径相同或不同。更具体地，顺序使用是指在另一种药剂开始施用之前，完全施用一种药剂。因此，在施用另一种药剂前几分钟、几小时或几天，可以施用一种药剂。
“协同治疗效果”是指由至少两种治疗药剂的组合产生的大于相加的治疗效果，并且所述效果超过了所述药剂以其它方式单独施用所产生的效果。例如，将本发明技术的细菌菌株与其它药剂联合用于治疗帕金森氏病可能产生大于相加的治疗效果。在一些实施例中，协同效应可以允许使用比单独使用所需剂量更低剂量的本发明技术的细菌菌株和/或其它药剂。
“治疗(treating)”、“治疗(treated)”或“治疗(treatment)”疾病或病症包含：(i)抑制疾病或病症，即，阻止其发展；(ii)缓解疾病或病症，即，使得其消退；(iii)减缓病症的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。
应理解，所描述的治疗或预防医学疾病和病状的各种方式旨在表示“基本的”，其包含完全的治疗或预防但也包含次于其的治疗或预防，并且其中实现了一些生物学或医学相关的结果。
II.帕金森氏病
帕金森氏病是一种进行性神经系统病症，主要影响运动。除了运动症状，如运动迟缓、震颤、僵硬和姿势不稳定之外，患者还可能出现其它与帕金森氏症有关的健康问题。这些症状多种多样，并且统称为非运动症状。帕金森氏病的主要特征在于中脑中控制运动的产生多巴胺的神经元的死亡或损伤，尽管也有去甲肾上腺素产生的普遍损失。
早期症状包含轻微震颤，频繁发生在肢体并经常发生在手和手指上。症状通常在身体的一侧，然后扩散到整个个体。随时间的推移，症状可能会恶化，并且经常包含肌肉僵硬、运动迟缓、姿势和平衡不良、言语变化以及精细运动技能困难。帕金森氏病患者可能会出现一种或多种不同的非运动症状。这些非运动症状包含但不限于认知变化(例如，注意力、计划、记忆、痴呆等方面的困难)、消化问题(如便秘)、早饱、出汗过多、疲劳、脂溢性皮炎、幻觉和妄想、直立性低血压、嗅觉或味觉丧失、情绪障碍(如抑郁、焦虑、冷漠和易怒)、睡眠障碍(如失眠、白天过度嗜睡、REM睡眠行为障碍、生动的梦和不安腿综合征)、视力问题(尤其是在试图近距离阅读项目时)以及体重减轻。帕金森氏病的诊断没有特定的测试，并且通常通过对疾病症状的神经和身体检查来进行诊断。其它病状的测试，如MRI和大脑超声波可以用于排除出现类似症状的其它病状。轻度或早期病例的诊断可能需要与神经科医生进行多次随访，神经科医生可以评估症状随时间推移的变化。可替代地，用帕金森氏症药物，如卡比多巴-左旋多巴的临时治疗可以用作诊断工具，其中症状的显著改善证实了帕金森氏病的诊断。
目前的治疗方法无法治愈帕金森氏病，但药物可以帮助控制症状。治疗经常充当多巴胺替代品或增加脑中的多巴胺产生。最有效的治疗之一，卡比多巴-左旋多巴，是一种在转化为多巴胺之前穿过血脑屏障的前药。金刚烷胺可以用于治疗帕金森氏病的早期轻度症状，并且还可以用于抵消卡比多巴-左旋多巴的副作用，如不自主运动。模仿多巴胺作用的多巴胺激动剂也很常用，包含普拉克索、罗匹尼罗、罗替戈汀和阿朴吗啡。另一类治疗包含靶向多巴胺降解酶的抑制剂，如司来吉兰、雷沙吉兰和沙芬酰胺，其均能抑制单氨基氧化酶B，以及恩他卡朋和奥匹卡朋，其均能抑制儿茶酚o-甲基转移酶。由于副作用，抗胆碱能药，如苯托品和苯海索很少用于控制震颤，但仍然是可用的。对于晚期帕金森氏病或药物反应不稳定的患者，医师可以使用植入式电极的脑深部刺激手术通过电脉冲治疗症状。
在一些实施例中，本发明技术提供用于治疗或预防帕金森氏病，包含降低与帕金森氏病相关的一种或多种风险因素、体征或症状的严重程度的方法和组合物。在一些实施例中，所述组合物包括菌株ART24和/或ART12或其孢子。
III.ART24和ART12
本公开的技术涉及ART24菌株和/或ART12菌株或其孢子用于治疗或预防帕金森氏病的用途。ART24是指以NCIMB登录号43088为特征的细菌菌株或其孢子，或包括所述菌株的组合物。ART12是指以NCIMB登录号43087保藏的细菌菌株或其孢子，或包括所述菌株的组合物。
在一些实施例中，本发明技术的细菌菌株或其孢子在用于治疗或预防帕金森氏病的方法和组合物中使用。在一些实施例中，细菌菌株包括用于预防或控制帕金森氏病的益生菌。在一些实施例中，本发明技术的组合物包括营养体细菌细胞。在一些实施例中，本发明技术的组合物包括细菌孢子。在一些实施例中，本发明技术的组合物包括营养体细菌细胞和细菌孢子的组合。在一些实施例中，本发明技术的组合物包括已被物理破坏或裂解的ART24和/或ART12细菌菌株。在一些实施例中，本发明技术的组合物包括裂解的ART24和/或ART12细菌的分离部分。
在一些实施例中，本发明技术的细菌菌株或其孢子在用于治疗或预防有需要的受试者的帕金森氏病的方法和可食用产品组合物中使用。在一些实施例中，细菌菌株包括用于预防或控制有需要的受试者的帕金森氏病的膳食补充剂。
IV.治疗和预防方法
以下讨论仅通过举例的方式呈现且不旨在是限制性的。
本发明技术的一方面包含治疗或预防被诊断为患有、疑似患有或有患帕金森氏病的风险的受试者的帕金森氏病的方法。在治疗应用中，将包括ART24和/或ART12细菌菌株或其孢子的组合物或药物以足以治愈或至少部分阻止疾病的体征或症状，包含其并发症和疾病发展过程中的中间病理表型的量施用于疑似患有或已经患有这种疾病的受试者(例如，表现出帕金森氏病的一种或多种体征或症状的受试者)。
可以通过本领域中已知的诊断测定或预后测定中的任何测定或组合来识别患有帕金森氏病的受试者。例如，帕金森氏病的典型症状包含但不限于震颤、肌肉僵硬、动作迟缓、姿势和平衡不良、言语变化、精细运动技能困难、认知变化(例如，注意力、计划、记忆、痴呆等方面的困难)、消化问题(如便秘)、早饱、出汗过多、疲劳、脂溢性皮炎、幻觉和妄想、直立性低血压、嗅觉或味觉丧失、情绪障碍(如抑郁、焦虑、冷漠和易怒)、睡眠障碍(如失眠、白天过度嗜睡、REM睡眠行为障碍、生动的梦和不安腿综合征)、视力问题(尤其是在试图近距离阅读项目时)以及体重减轻。
在一些实施例中，用本发明技术的细菌菌株或其孢子治疗的帕金森氏病受试者将表现出以下症状中的一种或多种的改善或消除：震颤、肌肉僵硬、动作迟缓、姿势和平衡不良、言语变化、精细运动技能困难、认知变化(例如，注意力、计划、记忆、痴呆等方面的困难)、消化问题(如便秘)、早饱、出汗过多、疲劳、脂溢性皮炎、幻觉和妄想、直立性低血压、嗅觉或味觉丧失、情绪障碍(如抑郁、焦虑、冷漠和易怒)、睡眠障碍(如失眠、白天过度嗜睡、REM睡眠行为障碍、生动的梦和不安腿综合征)、视力问题(尤其是在试图近距离阅读项目时)以及体重减轻。
一方面，本发明技术提供一种用于预防或延迟有帕金森氏病风险的受试者的帕金森氏病或帕金森氏病的症状的发作的方法。在一些实施例中，本发明技术的细菌菌株被调配为可用作食物补充剂并用于在肠道中重新建立有益细菌的益生菌。在一些实施例中，本发明技术的细菌菌株被调配为可用于药物应用的活生物治疗产品。在一些实施例中，本发明技术的细菌菌株被调配为可用于药物应用的活生物治疗可食用产品。
V.施用模式和有效剂量
本发明技术的用于预防、改善或治疗帕金森氏病和/或降低与帕金森氏病相关的一种或多种风险因素、体征或症状的严重程度的组合物包含根据本发明技术的以营养体细胞和/或孢子形式提供的活益生菌ART24和/或ART12细菌。在一些实施例中，细菌菌株是冻干的。将本发明技术的组合物以有效量(即，具有期望的治疗效果的量)施用于受试者。剂量和给药方案将取决于疾病程度、所使用的ART24和/或ART12菌株的特性，例如其治疗指数、受试者和受试者的病史。有效量可以在临床前试验和临床试验期间通过医生和临床医师熟悉的方法确定。
本发明技术的组合物可以被调配用于添加到食物中，或者直接用作食物补充剂。调配可以进一步包含用于促进孢子萌发和/或细菌生长的其它益生菌药剂或营养物质。
本发明技术的可食用产品可以被调配用于添加到食物中，或者直接用作膳食补充剂。在一些实施例中，可食用产品包括发酵食物产品、大豆、蘑菇、绿豆、刺槐豆或大米。在一些实施例中，大豆是发酵大豆或发酵大豆酱。调配可以进一步包含用于促进孢子萌发和/或细菌生长的其它益生菌药剂或营养物质。
本发明技术的组合物的另外组分可以包含选自由以下组成的组的防腐剂：蔗糖、抗坏血酸钠和谷胱甘肽。在一些实施例中，防腐剂是选自由以下组成的组的冷冻保护剂：核苷酸、二糖、多元醇和多糖。在一些实施例中，冷冻保护剂选自由以下组成的组：肌苷-5'-单磷酸(IMP)、鸟苷-5'-单磷酸(GMP)、腺苷-5'-单磷酸(AMP)、尿苷-5'-单磷酸(UMP)、胞苷-5'-单磷酸(CMP)、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟苷、尿苷、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、乳清酸核苷、胸苷、肌苷、海藻糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、糊精、菊粉、抗坏血酸钠、谷胱甘肽、脱脂乳和冷冻保护剂18。
本文所描述的ART24和/或ART12细菌菌株可以掺入到药物组合物中以单独或组合施用于受试者，并且以便治疗或预防本文所描述的病症。此类组合物典型地包含活性剂和药学上可接受的载体。如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”包含与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。还可以将补充的活性化合物掺入到组合物中。载体可以是用于粉末形式调配物的基于固体的干燥材料，并且可以是用于液体或凝胶形式调配物的液体或基于凝胶的材料，其形式部分取决于施用的途径或模式。在一些实施例中，药学上可接受的载体包括多糖、刺槐豆胶、阴离子多糖、淀粉、蛋白质、抗坏血酸钠、谷胱甘肽、海藻糖、蔗糖或果胶。在一些实施例中，多糖包括植物、动物、藻类或微生物多糖。在一些实施例中，多糖包括瓜尔胶、菊粉、直链淀粉、壳聚糖、硫酸软骨素、海藻酸盐或葡聚糖。在一些实施例中，淀粉包括大米淀粉。
药物组合物通常被调配成与其预定施用途径相容。施用途径的实例包含肠溶(例如，口服、舌下、直肠)施用。治疗组合物可以以多种方式被调配成适于口服施用，例如以液体、粉末状食物补充剂、固体食物、包装食物、薄片、片剂、锭剂或胶囊，例如明胶胶囊等。在一些实施例中，本发明技术的治疗组合物包括冻干的ART24和/或ART12。在一些实施例中，冻干的ART24和/或ART12被包封。治疗组合物可以以多种方式被调配成适于直肠施用，例如栓剂、液体灌肠剂或泡沫。其它调配对于本领域技术人员来说将是显而易见的。可以用如盐酸或氢氧化钠等酸或碱调节pH。
另外地或可替代地，对于可食用产品，本发明技术的药物组合物可以被调配成膳食补充剂、营养品组合物、食物添加剂、食物组合物、散装食物组合物、散装食物添加剂、医疗食物或用于特殊饮食用途，用于肠溶(例如，口服、舌下)施用的食物。
任何治疗剂的剂量、毒性和治疗功效都可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定。可以使用从细胞培养测定和动物研究获得的数据来调配一系列用于在人类中使用的剂量。此类化合物的剂量可以处于包含ED50在内的具有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。对于这些方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初根据细胞培养测定估计。在动物模型中可以将剂量调配为实现包含如在细胞培养中测定的IC50(即，测试化合物的实现症状的半数最大抑制的浓度)在内的循环血浆浓度范围。可以使用此类信息来精确地确定人类中的有用剂量。
在一些实施例中，用浓度在至少约1x102菌落形成单位(CFU)/mL至至少约1x1010CFU/mL范围内或介于两者之间的任何值的ART24和/或ART12接种如全大豆和/或大豆酱的“可食用产品”。例如，在一些实施例中，用以下接种可食用产品：至少约1x103CFU/mL至至少约1x1010CFU/mL ART24和/或ART12、至少约1x104CFU/mL至至少约1x1010CFU/mL ART24和/或ART12、至少约1x105CFU/mL至至少约1x1010CFU/mL ART24和/或ART12、至少约1x106CFU/mL至至少约1x1010CFU/mL ART24和/或ART12、至少约1x107CFU/mL至至少约1x1010CFU/mL ART24和/或ART12、至少约1x108CFU/mL至至少约1x1010CFU/mL ART24和/或ART12、至少约1x109CFU/mL至至少约1x1010CFU/mL ART24和/或ART12。在一些实施例中，用至少约6x108CFU/mL ART24和/或ART12接种可食用产品。在一些实施例中，用至少约6x109CFU/mL ART24和/或ART12接种可食用产品。在一些实施例中，用至少约1x104CFU/mLART24和/或ART12接种可食用产品。在一些实施例中，用至少约1x104CFU/mL ART24和/或ART12接种可食用产品。在一些实施例中，用至少约1x106CFU/mL ART24和/或ART12接种可食用产品。在一些实施例中，用至少约1x108CFU/mL ART24和/或ART12接种可食用产品。在一些实施例中，用至少约1x109CFU/mL ART24和/或ART12接种可食用产品。
在一些实施例中，本发明技术的组合物含有介于104个与1012个菌落形成单位(CFU)之间的ART24和/或ART12细菌(即，营养体细胞)或细菌孢子。在一些实施例中，本发明技术的方法涉及每天施用约104个至约1012个活细菌或孢子。在一些实施例中，本发明技术的组合物以冻干材料或粉末的形式递送，以重新悬浮以供口服递送或包装成胶囊。冻干的材料和胶囊可以被涂覆以获得更好的肠溶稳定性。
示例性治疗方案需要每天一次或每周一次地施用。在治疗性应用中，有时要求相对短的间隔下相对高的剂量，直到疾病进展减少或终止或者直到受试者示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以对受试者施用预防方案。在一些实施例中，本发明技术的组合物每天施用于受试者一次、两次或三次或更多次，持续一定时间段，或直至受试者被认为治愈了原发性疾病，没有原发疾病复发的风险，或没有所述疾病的风险。在一些实施例中，本发明技术的组合物可以在受试者的剩余生命中施用于受试者。在一些实施例中，施用与缩短暴露于本领域已知的用于治疗帕金森氏病的药剂的时间配对，所述药剂如卡比多巴-左旋多巴、金刚烷胺、普拉克索、罗匹尼罗、罗替戈汀、阿朴吗啡、司来吉兰、雷沙吉兰、沙芬酰胺、恩他卡朋、奥匹卡朋、苯托品、苯海索，随后给药一次、两次或三次或更多次，持续一定时间段，或直至受试者被认为治愈了原发性疾病或没有所述疾病复发的风险。在一些实施例中，预防方法包括在每天一次、两次或三次或更多次施用本发明技术的组合物，持续一定时间段内或直至在已知有帕金森氏病风险的患者的情况下所述患者被认为没有发展疾病的风险。
本领域技术人员应理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，包含但不限于疾病或病症的严重程度、先前治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，和存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的本文所描述的药学组合物对受试者进行的治疗可以包含单次治疗或系列治疗。
VI.ART24和/或ART12的组合疗法
在一些实施例中，本发明技术的ART24和/或ART12菌株或其孢子可以与一种或多种另外的用于预防或治疗帕金森氏病的疗法组合。另外的治疗剂包含但不限于一种或多种另外的治疗剂，所述另外的治疗剂选自由以下组成的组：卡比多巴-左旋多巴、金刚烷胺、普拉克索、罗匹尼罗、罗替戈汀、阿朴吗啡、司来吉兰、雷沙吉兰、沙芬酰胺、恩他卡朋、奥匹卡朋、苯托品、苯海索。
在一些实施例中，将另外的治疗剂与本发明技术的ART24和/或ART12菌株或其孢子组合施用于受试者，从而产生协同治疗效果。例如，将ART24和/或ART12与一种或多种另外的用于预防或治疗帕金森氏病的治疗剂一起施用将在预防或治疗所述疾病方面具有大于相加的效果。
在任何情况下，多种治疗剂可以按任何顺序施用或甚至同时施用。如果同时施用，则多种治疗剂可以以单一、统一的形式提供，也可以以多种形式提供(仅作为实例，作为单一药丸或作为两个单独的药丸)。其中一种治疗剂可以多次给药，或者两种治疗剂都可以多次给药。另外，组合方法、组合物和调配物不限于仅使用两种药剂。
实例
提供以下实例仅作为说明并且不具有限制性。本领域的技术人员将易于认识到多种可以改变或变更以产生本质上相同或类似结果的非关键参数。实例决不应被解释为限制由所附权利要求限定的本发明技术的范围。
实例1：ART24在用于治疗或预防帕金森氏病的方法中是有效的。
动物模型
此实例证明ART24在用于治疗或预防体内小鼠模型的帕金森氏病的方法中是有效的。
介绍
MPTP是一种强效且具有选择性的黑质纹状体多巴胺能神经毒素，在人类、非人类灵长类动物和小鼠中产生特发性帕金森氏病(PD)的许多神经病理学特征。在小鼠中，MPTP导致黑质纹状体多巴胺能变性和运动障碍。增加多巴胺能功能或阻断MPTP神经毒性的药理学药剂也能减轻MPTP相关的运动功能障碍，并已在临床上用于治疗帕金森氏病。此外，MPTP介导的毒性可能与疾病中多巴胺能损失相关的机制有关，这表明此模型也可能有助于鉴定减缓或减少黑质纹状体多巴胺能损失的药剂。
这项研究旨在测试ART24和海藻糖在MPTP诱导的PD模型中的作用。
实验程序
动物描述：
·物种：小鼠
·菌株：C57Bl/6
·动物来源：查尔斯河实验室
·年龄或体重：8周
·性别：雄性
·随机化：动物被随机分配到不同的治疗组；
·研究的盲化：小组信息对科学家是设盲的。
圈养和饲喂：
·适应/调节：
ο在研究前在Melior动物圈养设施待七天
·圈养：
ο将小鼠圈养在12小时的光照/黑暗循环中(在上午7:00开灯)
ο每个笼子不超过4只小鼠
ο通风笼架系统
·饮食：
ο标准啮齿动物随意进食和饮水
设计：
·施用途径：针对MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐)和媒剂，IP；针对ART24和媒剂(海藻糖)，PO
·给药体积：针对MPTP，10mL/kg；针对ART24，0.1mL
·调配物：针对MPTP的PBS；针对ART24的基于盐水的调配物
·剂量水平：针对MPTP、ART24，20mg/kg
·剂量频率：针对MPTP，4剂(QD)；针对ART24，11天BID
·研究持续时间：11天
·组数量：4
·每组动物数量：13
·动物总数：52(这项研究中纳入57只小鼠)
表1：研究设计。
*每组给药的动物总数为15只，以考虑可能的动物损失。
方法
MPTP模型。MPTP在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中调配，并以20mg/kg的剂量(以10mL/kg递送2mg/mL)QD施用于小鼠，持续4天。
IHC的组织解剖。在研究结束时，用异氟烷对随机选择的动物(n＝3/组)进行深度麻醉。
·脑采集：
ο将动物用冰冷的含有肝素(30u/ml)、pH 7.4的PBS灌注通过心脏。为每只动物灌注50ml PBS。
ο灌注50ml 20％ PFA；
ο仔细提取大脑，并将其转移到20％ PFA溶液中，后固定48小时
ο在48小时后，将脑转移到PBS中，并按照IHC实验室的建议进行处理。
神经递质测量结果(DA和DOPAC)。将10只小鼠各自麻醉，并通过心脏穿刺将血液收集到K2EDTA管中。提取并解剖脑。将吻侧部分解剖并取出纹状体。将纹状体冷冻，并随后评估多巴胺和代谢物的水平。
将纹状体在0.3M高氯酸中均质化。通过反相HPLC-ECD分析所得上清液的单胺水平。
处理血液的血浆。将所得血浆快速冷冻以进行进一步分析。
数据分析。使用双向重复测量ANOVA和事后费希尔LSD多重比较测试对数据进行分析。还使用ROUT方法分析原始数据中的离群值(Q＝1％)。GraphPad Prism 9用于数据分析和图示。
结果
如图1A和1B所示，与盐水/媒剂处理的动物相比，用MPTP处理在纹状体中产生的多巴胺和DOPAC含量显著减少。同样如图1A和1B所示，与盐水/MPTP给药的动物相比，用ART24处理导致对多巴胺(图1A)和DOPAC(图1B)浓度的显著影响(P<0.05)。用海藻糖处理对实验终点没有产生显著影响(图1A和1B)。
因此，这些结果证明ART24在用于预防、降低有需要的受试者的帕金森氏病的风险或治疗帕金森氏病的方法中是有效的。
人类受试者
使用本领域已知和接受的选择标准招募被诊断为患有或疑似患有帕金森氏病并且目前表现出帕金森氏病的一种或多种症状和/或病理的人类受试者。
预防和治疗方法
以与疾病的阶段和严重程度相称的剂量和频率向受试者施用ART24。在一些实施例中，ART24每天、每周或每月施用一次。在一些实施例中，ART24每天、每周或每月施用多次。
为了证明人类的预防和治疗方法，在帕金森氏病的症状和/或病理发展之前或之后向受试者施用ART24，并使用本领域已知的方法评估症状/病理的逆转或预期症状/病理的减弱。
结果
预期ART24将抑制人类受试者的帕金森氏病症状和/或病理的恶化。这些结果将表明，ART24对于预防和治疗此类病症是有用和有效的。
实例2：ART24在用于减少帕金森氏病的动物模型的纹状体中的炎症标志物的方法 中是有效的。
此实例预示性地证明ART24在用于减少体内动物模型的帕金森氏病的动物模型的纹状体中的炎症标志物的方法中是有效的。
方法
脑制备。将小鼠暴露于以下三种治疗条件之一：(1)PBS和盐水阴性对照；(2)用于纹状体炎症的MPTP和盐水阳性对照；以及(3)MPTP和测试制品(“TA”＝ART24)条件，以测定ART24在纹状体中的抗炎作用。对小鼠实施安乐死，并收集脑。使用脑切片机将小鼠脑切成2mm的部分，然后将每个部分嵌入到一个块中，以确保捕获所述区域(纹状体)。使用组织处理器对这些切片进行脱水和石蜡浸润，并立即将其嵌入在盒中，其中使用切片机切割5μm的切片，并将其安装在super frost plus载玻片上。
免疫标记和成像。将5μm厚的脑切片在60℃下烘烤一小时，然后用乙醇以逐步梯度进行再水合。然后使切片经历IHC以标记Iba1+小神经胶质细胞和GFAP，方法是首先用含6％驴血清的0.2％ PBST阻断一小时，然后用山羊抗Iba1(1:250，艾博抗公司(Abcam))和小鼠抗GFAP(1:200，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))温育一小时，并使用驴抗山羊AF488和驴抗小鼠AF555(1:500，赛默飞世尔科技公司)温育一小时的次级抗体。DAPI(1:4000)用于核染色，并用含90％甘油的1X PBS中覆盖载玻片。使用Leica Versa 8载玻片成像仪对载玻片进行成像，并在40倍放大率(0.1625μm/像素)下跨两个通道(405nm处的DAPI、488nm处的Iba1和555nm处的GFAP)曝光。
细胞计数和定量。对来自脑切片的Iba1和GFAP荧光的图像减去背景和分割，以转换为二进制图像，从而对手动绘制的纹状体内的细胞进行计数。Iba1和GFAP是已知在PD的MPTP模型中增加的炎症标志物。对于每个样品，密度值在其切片计数中取平均值，以表示一个脑，然后测量所述组在其它样品之间的差异。对于统计分析，单向ANOVA与图基多重比较测试一起进行事后分析，以评估组间差异的显著性。
结果
预期这些结果将表明，用ART24处理小鼠将减少已知在帕金森氏病模型中增加的炎症标记物，如Iba1和GFAP。因此，这些结果将表明ART24在用于预防、降低有需要的受试者的帕金森氏病的风险或治疗帕金森氏病的方法中是有效的。
实例3：ART24符合EFSA抗生素敏感性指南，并且不含毒力因子或致病岛
如表2所展示，ART24符合欧洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)指南。所列抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)以μg/mL表示。根据EFSA测试建议，对经冻干的ART24批次CO-33-10A2和CO-33-12A2以及研究和主细胞库CO-33-ART24BHI和CO-33-ART24 SYD进行了另外的研究，并且这些结果如表3所示。
表2：符合EFSA抗生素易感性指南的ART24
N＝6的平均结果。*板中浓度最低时没有生长。
表3：符合EFSA抗生素易感性指南的ART24
a使用CLSIM45(2015年)断点标准的分类解释(如可用的话)。卡那霉素和链霉素的MIC解释使用了欧洲食品安全局的截止值(2012年)。
简而言之，从3-5个ART24菌落中选择材料，并将其悬浮于4mL MRD中，以获得约1x108CFU/mL的细胞浓度。从此悬浮液中将46μL转移到含有10％ BHI肉汤的23mL90％Iso-Sensitest肉汤(CM0473，Oxoid)中，直至最终接种物浓度为5x105CFU/mL。用100μL的最终悬浮液填充预制96孔板的孔。用AeraSeal(A9224，西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))密封膜密封板(以促进需氧芽孢杆菌的生长)。然后将板在37℃下温育24小时。24小时后记录结果，作为抑制可见生长的最低浓度的抗生素。使用预制板VetMIC Lact-1和Lact-2(瑞典乌普萨拉的SVA)，其包括抗生素氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素、氯霉素、新霉素、青霉素、奎奴普丁-达福普汀、利奈唑胺、甲氧苄氨嘧啶、环丙沙星和利福平。
本发明技术的菌株中不存在抗生素耐药性，排除了抗生素耐药性水平转移的风险。
此外，针对产生毒素等的已知芽孢杆菌物种，用KEGG、RAST SEED Viewer、IslandViewer 4和ACT比较进行搜索，在本发明技术的ART24菌株的基因组中没有揭示任何毒力因子或致病岛。因此，这些结果证明了菌株的益生菌安全性，因为其缺乏对共生体和/或病原体产生耐药性的倾向。
实例4：冷冻干燥(冻干)以保存ART24
此实例证明ART24在其中菌株被冷冻干燥(或冻干)的组合物和方法中是有用的。
2x SG孢子培养基：Difco营养肉汤16.0g/L；KCl，2.0g/L；MgSO4.7H2O，0.5g/L。在高压釜中将pH调节至7.0。在高压灭菌和冷却后，添加1M Ca(NO3)2.4H2O，1.0ml/L；0.1MMnCl2.4H2O，1.0ml/L；1mM FeSO4.7H2O，1.0ml/L；50％(w/v)葡萄糖，2.0ml/L。
孢子制备方法：用来自新鲜ART24菌落的细胞接种50ml BHI(1.10493.0500，默克公司(Merck))培养基。在37℃的烧瓶中需氧生长24小时，以200rpm振荡(轨道平台振荡器)。在适当的容器中以1/200稀释到1L 2x SG培养基中，并在37℃下生长，以200rpm振荡。每天使用光学显微镜检查样品中的孢子。相差显微镜是理想的。在2-3天后，>90％的群体应已形成孢子。如果可能的话，在离心机中以9000rpm的将颗粒细胞沉淀20分钟，保持低温，否则少量使用台式离心机就足够了。将孢子用冰冷的水洗涤并离心2-3次，以去除残留的营养物质并使剩余的营养体细胞裂解。将孢子团粒重新悬浮于10mg/ml溶菌酶溶液中，并在37℃下振荡温育1小时。将孢子用冰冷的水洗涤并离心4-6次，以去除残留的营养物质并使剩余的营养体细胞裂解。在VirTis Advantage Wizard冷冻干燥机中冷冻干燥孢子的3ml等分试样24小时，并在室温下储存在密封的冷冻干燥小瓶中以供长期储存。
基于Infogest COST作用概述的SGF制备模拟胃液，其含有37.3g/L KCl，68g/LKH2PO4，84g/L NaHCO3，117g/L NaCl，30.5g/L(NH4)CO3，44.1g/L CaCl2和2mL 20,000U/mL溶液。如图2所示，ART24的孢子在暴露于模拟胃液时存活。
如表4所示，ART24的孢子在冷冻干燥和再悬浮后达到100％的存活能力。
为了测试细胞的稳健性，将菌株冷冻干燥。简而言之，根据本领域已知的方法生长ART24的过夜培养物，并将其重悬于15％w/v海藻糖溶液中。进行细胞计数。
将培养物冷冻干燥22小时，之后将其重悬于等体积的损失的水中。进行细胞计数。表4示出了存活能力结果。
表4：ART24在冷冻干燥(冻干)后的存活能力
因此，这些结果证明ART24在其中菌株被冷冻干燥(或冻干)的组合物和方法中是有用的。
实例5：ART24对中脑培养上脂多糖(LPS)诱导的损伤具有神经保护作用。
此实例证明ART24对中脑神经元具有神经保护作用，并可用于治疗或预防帕金森氏病的方法。
方法
表5概述了此实例的实验设计。
表5：实验设计。
方案在3种单独的培养物中进行。对于每种培养物，每种条件在第12天(LPS后第5天)进行六次测量，并在第8天进行三次测量。每个板含有3种类型的对照，以验证实验：用媒剂处理的对照条件(无损伤)、用媒剂处理的LPS条件和用阳性对照(例如，地塞米松(dexamethasone))处理的LPS条件。
测试条件。ART24细菌提取物重悬于DMSO中：
·IPA：细菌团粒的异丙醇提取物，储备液的稀释度如下：1:2500X。
读数。
·LPS损伤和化合物治疗后24小时的读数：TNF-α、IL-1β
·LPS损伤和化合物治疗5天后的读数：酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元(多巴胺能神经元)的百分比。
结果
如图3A、3B和3C，与单独LPS处理组相比，用ART24处理由神经元和神经胶质细胞组成的中脑神经元培养物分别降低了TNF-α水平、降低了IL-1β水平并增加了TH阳性神经元。
这些结果证明了ART24的神经保护作用。因此，这些结果证明ART24在用于治疗或预防帕金森氏病的方法中是有用的。
实例6：ART24在用于治疗或预防体内斑马鱼模型的帕金森氏病的方法中是有效 的。
此实例证明ART24在用于治疗或预防体内斑马鱼模型的帕金森氏病(PD)的方法中是有效的。这项研究旨在测试ART24在MPTP诱导的PD模型中的作用。
方法
斑马鱼幼虫在水中给药有MPTP(250μM；受精后96小时至120小时)或假手术处理(仅DMSO；n＝22)。ART24在暴露于MPTP的鱼的水中给药(4x106CFU/mL；n＝16)。在由10分钟交替黑暗/光照时间段组成的50分钟测试期间，用成像系统评估移动。与MPTP处理相比，通过单向ANOVA分析，随后是邓尼特测试分析数据。
结果
运动活动分析。如图4A和4B所示，MPTP处理的斑马鱼幼虫具有显著减少的总运动移动距离(假手术的24％；p<0.001)，其被ART24减弱(假手术的61％；p<0.001)。
结论
ART24处理改善了MPTP斑马鱼模型的运动移动(图4A和4B)。因此，这些结果证明ART24在用于预防、降低有需要的受试者的帕金森氏病的风险或治疗帕金森氏病的方法中是有效的。
实例7：ART24和ART12在用于治疗或预防MPTP诱导的帕金森氏病的体内小鼠模型 的帕金森氏病的方法中是有效的。
此实例证明ART24和ART12在用于治疗或预防体内小鼠模型的帕金森氏病的方法中是有效的。
实验程序
动物描述：
·物种：小鼠
·菌株：C57Bl/6
·动物来源：查尔斯河实验室
·年龄或体重：8周
·性别：雄性
·随机化：动物被随机分配到不同的治疗组；
·研究的盲化：研究未设盲。
圈养和饲喂：
·适应/调节：
ο不少于五天
·圈养：
ο将小鼠圈养在12小时的光照/黑暗循环中(在上午7:00开灯)
ο每个笼子不超过3只小鼠
ο通风笼架系统
·饮食：
ο标准啮齿动物随意进食和饮水
设计：
·施用途径：针对MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐)和媒剂，IP；针对ART24和ART12以及媒剂(海藻糖)，PO
·给药体积：针对MPTP，10mL/kg；针对ART24和ART12，0.1mL
·调配物：针对MPTP的PBS；针对ART24和ART12的基于盐水的调配物
·剂量水平：针对MPTP，5x108CFU/剂量ART24和ART12，20mg/kg
·剂量频率：针对MPTP，4剂(QD)；针对ART24和ART12，10天BID
·研究持续时间：10天
·组数量：4
·每组动物数量：15
·动物总数：60
表6：研究设计。
方法
MPTP模型。MPTP在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中调配，并以20mg/kg的剂量(以10mL/kg递送2mg/mL)QD IP施用于小鼠，持续4天。
组织解剖。将每组小鼠麻醉并通过心脏穿刺收集血液。处理血液的血浆。解剖脑。
将脑半切。将吻侧部分解剖并取出纹状体(分别为左侧和右侧)。对左右纹状体进行称重，并在单独的试管中冷冻。随后评估右纹状体的多巴胺和代谢物的水平。将左纹状体收集在单独的试管中并冷冻。将左侧纹状体样品送去进行总转录组分析(RNAseq)。简而言之，分离mRNA，构建cDNA文库并测序，并将产物映射到小鼠参考基因组。进行基因表达定量并进行差异表达分析。进行富集分析以鉴定与途径或疾病状态相关的基因组。将盲肠内含物收集在单独的试管中并冷冻。
冲洗结肠，将其分为近侧块和远侧块，称重并快速冷冻。将近侧样品送去进行总转录组分析(RNAseq)。简而言之，分离mRNA，构建cDNA文库并测序，并将产物映射到小鼠参考基因组。进行基因表达定量并进行差异表达分析。进行富集分析以鉴定与途径或疾病状态相关的基因组。冲洗小肠，将其分为十二指肠和回肠区域，称重并快速冷冻。收集肝脏并快速冷冻。
在第一次MPTP给药后第6天，从所有小鼠收集干净的捕获粪便团粒。为了收集，将小鼠放置在无菌表面(无菌手术垫)上，并使用无菌仪器将粪便(至少3个团粒)收集到无菌管中。
多巴胺和代谢产物以及HVA分析。将小鼠麻醉，并通过心脏穿刺将血液收集到K2EDTA管中。提取并解剖脑。将吻侧部分解剖并取出纹状体。将左右纹状体分别冷冻，并随后评估右纹状体的多巴胺和代谢物的水平。将纹状体在0.3M高氯酸中均质化。通过反相HPLC-ECD分析所得上清液的单胺水平。处理血液的血浆。将所得血浆快速冷冻以进行进一步分析。
数据分析。使用单向ANOVA和费希尔LSD事后hoc测试对数据进行分析。还使用ROUT方法分析原始数据中的离群值(Q＝1％)。GraphPad Prism 9用于数据分析和图示。
结果
如图5所示，与盐水/MPTP给药的小鼠相比，ART24和ART12都显著增加了小鼠纹状体中的多巴胺代谢产物高香草酸(HVA)水平。如图8A-8C所示，用ART12处理的MPTP给药的小鼠增加了纹状体组织(ART12)和结肠组织(ART12和ART24)中的帕金森氏基因表达(KEGG分组)，表明刺激了与帕金森氏病相关的途径中的基因表达。
因此，这些结果证明ART24和ART12在用于预防、降低有需要的受试者的帕金森氏病的风险或治疗帕金森氏病的方法中是有效的。
实例8：ART24对斑马鱼α-突触核蛋白帕金森氏病模型中的多巴胺能神经元的作 用。
这项实验的目的是评估用ART24的纯冻干培养物处理的斑马鱼幼虫中的突变的SNCA基因的过表达诱导的结节区域中多巴胺能神经元损失的挽救作用。此实例证明ART24在用于治疗或预防体内斑马鱼模型的帕金森氏病的方法中是有效的。
介绍
在这项研究中，使用过表达α-突触核蛋白基因(SNCA基因)：Tg(L5c13巢蛋白:GFP-2A-SNCAmut)的转基因斑马鱼系作为帕金森氏病(PD)的模型。此系通过巢蛋白启动子在神经元的前体细胞中表达人α-突触核蛋白WT-EGFP。α-突触核蛋白(SNCA)是一种神经元蛋白，被认为调控突触小泡的运输和随后的神经递质释放。其中一种神经递质是多巴胺，其对控制自主和非自主运动的开始和停止至关重要。在患有PD的人类中，最常见的突变之一是α-突触核蛋白基因的复制，这表明α-突触蛋白可能具有毒性功能获得效应。
材料与方法
材料。60X E3培养基(对于2L：34.8g NaCl，1.6g KCl，5.8g CaCl2·2H2O，9.78gMgCl2·6H2O，pH＝7.2(具有NaOH 1M)，1 x E3培养基：含16.5mL 60 X E3储备溶液的1LdH2O)；柠檬酸钠、SDS、山羊血清、Phusion DNA聚合酶(F-530S，赛默飞世尔科技公司)、PCR引物(IDT技术)、PBST、Tween 20(西格玛公司)、DIG-RNA标记试剂盒T7(罗氏公司(Roche))、牛血清白蛋白(BSA)、抗地高辛AP Fab片段(罗氏公司)、NBT(西格玛公司)、BCIP(西格玛公司)、甲醇(默克公司)、蛋白酶K、PFA 4％(西格玛公司)、20X SSC(西格玛公司)、甲酰胺(西格玛公司)。
表7：PCR引物(IDT)。
基因 诊断PCR引物
Th-Fw AATCGGAACATGGCGGGAGG(SEQ ID NO:1)
Th-Rv TAATACGACTCACTATAGCAGTCCTGCTCCATACGCTTT(SEQ ID NO:2)
测试系统。所有实验均使用斑马鱼(zebrafish)(斑马鱼(Danio rerio))胚胎作为实验模型进行。
斑马鱼维护。成年Tg(L5c13巢蛋白:GFP-2A-SCNAmut)斑马鱼和其后代在28-29℃下维持14小时光照：10小时黑暗(早上7点开灯；晚上9点关灯)。
处理程序。从72hpf至120hpf处理至少72Tg(L5c13巢蛋白:GFP-2A-SCNAmut)的斑马鱼幼虫，每24小时更换一次培养基。在120hpf时，将幼虫固定在4％ PFA中以进行原位杂交方案(ISH)。
核糖合成和原位杂交(ISH)。根据制造商的说明，使用RNA标记试剂盒(罗氏公司)进行探针的体外转录。将120hpf的去绒毛膜的胚胎在室温下固定在含4％多聚甲醛的1XPBS中，持续4小时，并如Thisse和Thisse,《自然实验手册(Nat Protoc.)》2008中所描述进行全支架原位杂交。
成像。在ISH后，在亮场立体镜下对整个幼虫的酪氨酸羟化酶(TH)表达模式进行成像。用Fiji软件在6个不同的区域/簇中分析图像(图6A)以表达ISH。为了确定整体表达模式，计算了每个区域的面积。在每个幼虫中，将来自6个区域的所有面积相加，并相对于对照组的平均面积进行归一化。对簇1或2中没有TH表达的幼虫进行注释以进行进一步分析。
统计分析。使用未配对T测试(多巴胺能阳性神经元的面积)或费希尔精确测试(存在神经元簇1和2的幼虫的百分比)进行统计分析。
结果
将Tg(L5c13巢蛋白:GFP-2A-SNCAmut)斑马鱼系用ART24的纯冻干培养物以4x106CFU/mL处理，以评估其是否对结节区域中的多巴胺能神经元的损失产生挽救作用。因此，进行酪氨酸羟化酶的原位检测，并测量其在结节区域的表达面积。结果表明，用4x106CFU/ml的ART24处理的Tg(L5c13巢蛋白:GFP-2A-SNCAmut)斑马鱼幼虫具有增加的TH表达(图6A)。另外，存在于30％未经处理的Tg(L5c13巢蛋白:GFP-2A-SNCAmut)斑马鱼幼虫中的神经元组1和2(双侧顶盖前簇)的损失也通过ART24的处理而得到改善(图6B-6C)。在MPTP处理的斑马鱼幼虫中也显示出双侧顶盖前簇的丧失(McKinley ET等人,《脑研究：分子脑研究(Brain Res Mol Brain Res.2005)。
结论
结果表明，ART24能够挽救斑马鱼幼虫中的突变的SNCA基因的过表达诱导的结节区域中多巴胺能神经元的损失。因此，这些结果证明ART24在用于预防、降低有需要的受试者的帕金森氏病的风险或治疗帕金森氏病的方法中是有效的。
实例9：ART24和ART12菌株对帕金森氏病的MPTP斑马鱼模型的运动的功效。
此实验的目的是通过幼虫运动评估，确定ART24和ART12在用于治疗或预防斑马鱼MPTP模型中的帕金森氏病的方法中的功效。
材料与方法
材料。60X E3培养基(对于2L：34.8g NaCl，1.6g KCl，5.8g CaCl2·2H2O，9.78gMgCl2·6H2O，pH＝7.2(具有NaOH 1M)，1 x E3培养基：含16.5mL 60 X E3储备溶液的1LdH2O)；MPTP(赛默飞世尔科技公司，150687)；48孔板；EthoVision XT12软件(荷兰瓦赫宁根诺达思信息技术公司(Noldus Information Technologies,Wageningen,TheNetherlands))；DanioVision(荷兰瓦赫宁根诺达思信息技术公司)。
测试系统。所有实验均使用斑马鱼(zebrafish)(斑马鱼(Danio rerio))胚胎作为实验模型进行。
斑马鱼维护。成年野生型斑马鱼和其后代在28-29℃下维持14小时光照：10小时黑暗(早上7点开灯；晚上9点关灯)。
行为研究方案。通过来自荷兰瓦赫宁根诺达思信息技术公司的EthoVision XT 12软件和DanioVision装置追踪和分析斑马鱼幼虫运动。这个封闭系统由放置在装有循环水的腔室上方的相机和设置在28℃下的温度传感器组成。板中的幼虫放置在腔室中，所述腔室可以通过软件控制提供不同的刺激(光照/黑暗环境、敲击、声音)。
行为实验前二十四小时，在48孔微孔板中用DMSO(阴性对照)、250μM的MPTP(阳性对照)和250μM MPTP与4x106CFU/mL的ART12或ART24组合处理。之后，进行光照/黑暗交替的标准方案：50分钟(总时间)划分成改变光照刺激和黑暗刺激的10分钟的间隔(图7A)。在实验结束时，添加敲击刺激(间隔2分钟的三次敲击)以测量惊吓应答(图7A)。这是一个有用的内部实验对照，用于排除在处理条件下的幼虫由于严重的运动神经元改变而对不同的光照/黑暗刺激没有应答的可能性。
统计分析。使用单向ANOVA分析，然后是图基多重比较测试进行统计分析。
结果
将成年野生型鱼类进行杂交，并将后代维持到受精后4天(dpf)。在4dpf时，将幼虫个体化平板接种在48孔板中，并且然后进行处理。在24小时的处理(5dpf)后，将幼虫放置到DanioVision腔室中，在所述腔室中，呈现预定的一系列交替的黑暗和光照环境，以评估其运动。结果总结在图7B-7C中。
结论
如图7B-7C，用ART24或ART12处理将斑马鱼帕金森氏病MPTP模型中的运动的水平挽救到类似于阴性对照(DMSO)的水平。因此，这些结果证明ART24和ART12在用于预防、降低有需要的受试者的帕金森氏病的风险或治疗帕金森氏病的方法中是有效的。
生物保藏
申请人要求应仅向经申请人批准的专家提供保藏微生物的样品。
解淀粉芽孢杆菌菌株ART24于2018年6月21日以NCIMB登录号43088保藏于英国阿伯丁巴克斯本克雷布斯通工业区弗格森大厦AB21 9YA(Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)的国家工业食品和海洋细菌保藏中心(National Collection of Industrial Food and Marine Bacteria)(NCIMB有限公司)(国际保藏管理局)。
解淀粉芽孢杆菌菌株ART12于2018年6月21日以NCIMB登录号43087保藏于英国阿伯丁巴克斯本克雷布斯通工业区弗格森大厦AB21 9YA的国家工业食品和海洋细菌保藏中心(NCIMB有限公司)(国际保藏管理局)。
保藏是根据关于为专利程序目的对微生物的保藏进行国际承认的布达佩斯条约进行的。
等效物
本发明技术不限于本申请中所描述的特定实施例，这些特定实施例旨在作为本发明技术的单个方面的单独绘示。在不脱离本发明技术的精神和范围的情况下，可以对本发明的技术进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。根据以上描述，除了本文所列举的那些方法和设备之外，在本发明技术的范围内的在功能上等效的方法和装置对本领域技术人员而言将是显而易见的。此类修改和变化旨在落入所附权利要求书的范围之内。本发明技术应仅由所附权利要求书以及这样的权利要求书有权获得的等效物的全部范围限制。应理解，本发明技术不限于特定方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然，所述特定方法、试剂、化合物、组合物或生物系统可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的而并非旨在进行限制。
上述说明书中提到的每一份公开和专利出于所有目的通过引用整体并入本文。在不脱离本发明技术的范围和精神的情况下，所描述的本发明技术的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体实施例描述了本发明技术，但不应将所要求保护的本发明技术不适当地限定为此类具体实施例。实际上，对于本领域和相关领域的技术人员而言显而易见的用于实施本发明技术的所描述的模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims (47)

1.一种用于治疗或预防有需要的受试者的帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括细菌菌株ART24(NCIMB登录号43088)、细菌菌株ART12(NCIMB登录号43087)或其组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌菌株是冻干的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细菌菌株呈孢子形式。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细菌菌株呈营养体形式。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细菌菌株是呈孢子形式和所述营养体形式的菌株的混合物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株被调配成膳食补充剂。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株被调配成可食用产品。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述可食用产品进一步包括载体、媒剂或赋形剂。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述可食用产品进一步包括发酵食物产品、大豆、蘑菇、绿豆、刺槐豆、大米或其提取物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述大豆是发酵大豆或发酵大豆酱。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述发酵大豆或所述发酵大豆酱是清国酱(Cheonggukjang)、豆豉(Douchi)、Hawaijar、Bekang、Peruyaan、Tungrymbai、Eoyukjang、Kinema、Aakhone、味噌(Miso)、纳豆(Natto)或Thua-nao。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述PD包括以下中的一种或多种：震颤、肌肉僵硬、动作迟缓、姿势和平衡不良、言语变化、精细运动技能困难、认知变化、便秘、早饱、出汗过多、疲劳、脂溢性皮炎、幻觉和妄想、直立性低血压、嗅觉或味觉丧失、抑郁、焦虑、冷漠、易怒、失眠、白天过度嗜睡、REM睡眠行为障碍、生动梦和不安腿综合征、视力问题以及体重减轻。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中治疗或预防包括以下中的一项或多项：增加纹状体多巴胺水平、增加纹状体DOPAC水平或增加纹状体高香草酸水平。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述药物组合物是口服施用的。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其进一步包括单独、顺序或同时施用一种或多种选自由以下组成的组的药剂：多巴胺脱羧酶抑制剂、多巴胺前体、多巴胺激动剂、儿茶酚-o-甲基转移酶抑制剂、单氨基氧化酶-B抑制剂、腺苷2A拮抗剂和抗胆碱能药或N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂。
16.一种组合物的用途，其用于制备用于治疗有需要的受试者的帕金森氏病(PD)的药物，其中所述组合物包括细菌菌株ART24(NCIMB登录号43088)、细菌菌株ART12(NCIMB登录号43087)或其组合。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述细菌菌株是冻干的。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的用途，其中所述细菌菌株呈孢子形式。
19.根据权利要求16或权利要求17所述的用途，其中所述细菌菌株呈营养体形式。
20.根据权利要求16或权利要求17所述的用途，其中所述细菌菌株是呈孢子形式和所述营养体形式的菌株的混合物。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的用途，其中所述细菌菌株被调配成膳食补充剂。
22.根据权利要求17至20中任一项所述的用途，其中所述细菌菌株被调配成可食用产品。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述可食用产品进一步包括载体、媒剂或赋形剂。
24.根据权利要求22所述的用途，其中所述可食用产品进一步包括发酵食物产品、大豆、蘑菇、绿豆、刺槐豆、大米或其提取物。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述大豆是发酵大豆或发酵大豆酱。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述发酵大豆或所述发酵大豆酱是清国酱、豆豉、Hawaijar、Bekang、Peruyaan、Tungrymbai、Eoyukjang、Kinema、Aakhone、味噌、纳豆或Thua-nao。
27.根据权利要求16至26中任一项所述的用途，其中所述PD包括以下中的一种或多种：震颤、肌肉僵硬、动作迟缓、姿势和平衡不良、言语变化、精细运动技能困难、认知变化、便秘、早饱、出汗过多、疲劳、脂溢性皮炎、幻觉和妄想、直立性低血压、嗅觉或味觉丧失、抑郁、焦虑、冷漠、易怒、失眠、白天过度嗜睡、REM睡眠行为障碍、生动梦和不安腿综合征、视力问题以及体重减轻。
28.根据权利要求16至27中任一项所述的用途，其中治疗或预防包括以下中的一项或多项：增加纹状体多巴胺水平、增加纹状体DOPAC水平或增加纹状体高香草酸水平。
29.根据权利要求16至28中任一项所述的用途，其中所述药物组合物被调配用于口服施用。
30.根据权利要求16至29中任一项所述的用途，其进一步包括单独、顺序或同时施用一种或多种选自由以下组成的组的药剂：多巴胺脱羧酶抑制剂、多巴胺前体、多巴胺激动剂、儿茶酚-o-甲基转移酶抑制剂、单氨基氧化酶-B抑制剂、腺苷2A拮抗剂和抗胆碱能药或N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂。
31.一种用于治疗有需要的受试者的帕金森氏病(PD)的组合物，其中所述组合物包括细菌菌株ART24(NCIMB登录号43088)、细菌菌株ART12(NCIMB登录号43087)或其组合。
32.根据权利要求31所述的供使用的组合物，其中所述细菌菌株是冻干的。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的供使用的组合物，其中所述细菌菌株呈孢子形式。
34.根据权利要求31或权利要求32所述的供使用的组合物，其中所述细菌菌株呈营养体形式。
35.根据权利要求31或权利要求32所述的供使用的组合物，其中所述细菌菌株是呈孢子形式和所述营养体形式的菌株的混合物。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的供使用的组合物，其中所述细菌菌株被调配成膳食补充剂。
37.根据权利要求32至35中任一项所述的供使用的组合物，其中所述细菌菌株被调配成可食用产品。
38.根据权利要求37所述的供使用的组合物，其中所述可食用产品进一步包括载体、媒剂或赋形剂。
39.根据权利要求37所述的供使用的组合物，其中所述可食用产品进一步包括发酵食物产品、大豆、蘑菇、绿豆、刺槐豆、大米或其提取物。
40.根据权利要求39所述的供使用的组合物，其中所述大豆是发酵大豆或发酵大豆酱。
41.根据权利要求40所述的供使用的组合物，其中所述发酵大豆或所述发酵大豆酱是清国酱、豆豉、Hawaijar、Bekang、Peruyaan、Tungrymbai、Eoyukjang、Kinema、Aakhone、味噌、纳豆或Thua-nao。
42.根据权利要求31至41中任一项所述的供使用的组合物，其中所述PD包括以下中的一种或多种：震颤、肌肉僵硬、动作迟缓、姿势和平衡不良、言语变化、精细运动技能困难、认知变化、便秘、早饱、出汗过多、疲劳、脂溢性皮炎、幻觉和妄想、直立性低血压、嗅觉或味觉丧失、抑郁、焦虑、冷漠、易怒、失眠、白天过度嗜睡、REM睡眠行为障碍、生动梦和不安腿综合征、视力问题以及体重减轻。
43.根据权利要求31至42中任一项所述的供使用的组合物，其中治疗或预防包括以下中的一项或多项：增加纹状体多巴胺水平、增加纹状体DOPAC水平或增加纹状体高香草酸水平。
44.根据权利要求31至43中任一项所述的供使用的组合物，其中所述药物组合物被调配用于口服施用。
45.根据权利要求31至44中任一项所述的供使用的组合物，其进一步包括单独、顺序或同时施用一种或多种选自由以下组成的组的药剂：多巴胺脱羧酶抑制剂、多巴胺前体、多巴胺激动剂、儿茶酚-o-甲基转移酶抑制剂、单氨基氧化酶-B抑制剂、腺苷2A拮抗剂和抗胆碱能药或N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂。
46.根据权利要求1至15中任一项所述的方法、根据权利要求16至30中任一项所述的用途或根据权利要求31至45中任一项所述的供使用的组合物，其中所述细菌菌株是ART24。
47.根据权利要求1至15中任一项所述的方法、根据权利要求16至30中任一项所述的用途或根据权利要求31至45中任一项所述的供使用的组合物，其中所述细菌菌株是ART12。
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