CN118006646A - 一种可降解聚酯塑料的角质酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可降解聚酯塑料的角质酶及其应用。本发明提供了可降解聚氨酯塑料的角质酶编码基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，所编码的角质酶蛋白质氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。该角质酶能够破坏塑料完整结构，塑料表面出现孔洞和裂缝等侵蚀状。此外，该角质酶能够降解不同类型的聚酯类塑料，其中PUR泡沫和聚酯塑料PCL在2天内减重率分别达到33.88％和83.44％，农用可降解地膜PBAT和PU塑料合成寡聚物PBA‑PU在4天内的降解率分别达到66.70％和64.41％。利用该角质酶编码基因作为元件可广泛应用于废弃聚酯类塑料降解与资源化利用。
Description
技术领域
本发明属于环境科学和生物技术领域，涉及一种可降解聚酯塑料的角质酶及其应用。
背景技术
聚氨酯(Polyurethane，PU)塑料是一类由多异氰酸酯和多元醇等缩合而成的聚合物，分为聚酯型和聚醚型。PU产品类型丰富，在世界上占有较大的市场，并广泛应用于纺织、建筑、建材、汽车、国防等领域，现已成为全球产量第二大的聚酯型塑料，2020年仅中国就生产了1470万吨，消费1175万吨。然而大量使用后的PU塑料被废弃在自然环境，在造成碳资源浪费的同时，也造成了日益严重的生态灾难。目前，塑料废弃物的主要方法是填埋、焚烧、机械回收和化学回收。然而，这些处置方法会造成潜在的环境污染。此外，PU塑料结构复杂、种类多样，难以通过现有的物理、化学回收方式进行有效的再利用。
相较于传统的处理方法，利用微生物或酶对塑料进行生物回收被认为是最有前景的方法之一。目前，以高效PET解聚酶为基础的PET塑料酶法回收技术体系的建立，使得废塑料酶法降解与产物回收已经成为关注的焦点。聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料的生物循环利用已经进入到产业化前期阶段，法国Carbios公司利用植物堆肥来源的角质酶LCC在16h内可分解97％的PET塑料，单体重新聚合形成新的塑料。
然而，可降解PU塑料的解聚酶元件较少，目前尚处在资源挖掘阶段。已有的报道包括用于聚氨酯酶促分解的新的氨基甲酸酯水解酶(CN201980041682.1)，可降解聚氨酯PU的角质酶BC-CUT-013和Thc_Cut1(CN202180069579.5)以及利用PETase和氨基甲酸酯酶Aes72联合实现热塑性聚酯型聚氨酯塑料完全解聚(CN202310054434.9)等。此外，相关文献报道中也提及到部分角质酶、酯酶和/或脂肪酶也具有一定的降解PU塑料的能力。然而，PU塑料结构组分复杂，高结晶度，高度疏水，直接限制了酶的降解。因此，并非所有的酯酶都具有降解塑料的能力。因此，挖掘具有PU降解能力的塑料降解酶对于PU废弃塑料处置与资源化利用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有降解聚氨酯泡沫和农用地膜PBAT等塑料的角质酶及其编码基因，所述酶可以通过氨基酸序列基序(一级结构)、二级结构元件以及三级结构元件和氨基酸序列在线BLAST比对来识别。该角质酶来源于酵母菌(Blastobotrys)。
本发明的另一目的是提供含有该角质酶基因的基因工程菌。
本发明的又一目的是提供该基因以及该基因所编码的蛋白质的应用。
本发明所述角质酶基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为669bp，G+C含量为54.26％；所述的角质酶基因编码的角质酶蛋白质,其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2，编码222个氨基酸，理论分子量大小为23.39KD，等电点为4.65，该蛋白N端前18个氨基酸为信号肽序列，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.3。
含本发明所述的重组质粒的重组微生物。
所述的重组微生物，优选以大肠杆菌和毕氏酵母为宿主菌。
本发明所述角质酶以4-硝基苯丁酸酯为底物，37℃，pH7，比酶活达到771.8U/mg。
本发明所述角质酶基因、重组质粒、重组微生物在聚酯塑料生物降解中的基因工程应用。
作为本发明的一种优选，所述的聚酯塑料包括但不限于PUR泡沫、农用地膜PBAT、可降解塑料PCL、PL。
本发明所述的角质酶BaCut1在聚酯塑料生物降解中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的聚酯塑料包括但不限于PUR泡沫、农用地膜PBAT、可降解塑料PCL、PL。
本发明所述角质酶BaCut1能够降解PUR泡沫，农用可降解地膜PBAT，PU塑料合成寡聚物PBA-PU以及聚酯塑料PCL,在37℃，2天内，PUR泡沫和PCL减重率分别达到33.88％和83.44％，在37℃，4天内，PBAT和PBA-PU降解率分别达到66.70％和64.41％。
本发明所属的角质酶降解聚氨酯塑料，能够降解PUR泡沫和PU塑料合成寡聚物PBA-PU产生己二酸。
本发明所述角质酶在聚氨酯塑料降解、转化和资源化利用领域的生产应用。
本发明所述角质酶基因作为降解元件在工程化底盘细胞构建中的应用。
有益效果
1.本发明以从土样中筛选出的酵母菌为材料，参考基因组序列信息并结合PCR扩增，成功获得角质酶基因序列。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为669bp，G+C含量为54.26％，编码222个氨基酸，N端前18个氨基酸为信号肽。
2.该角质酶基因表达的产物，在酶浓度为40μg/mL，底物浓度为8mg/mL，对包括PUR泡沫，农用地膜PBAT，可降解塑料PCL以及PU塑料合成寡聚物PBA-PU等，均具有高效的降解能力。
3.本发明的塑料生物酶法解聚技术条件温和、过程高效、副产物少、绿色环保，是废弃塑料处置的理想手段，也是国内外研究热点。在废弃PUR塑料和农用地膜处置及资源化利用方面具有重要的应用价值。
附图说明
图1角质酶编码基因的PCR扩增电泳图
图2重组角质酶BaCut1的SDS-PAGE电泳图
M：蛋白marker；1：不含目的基因的宿主细胞破碎上清纯化的重组蛋白；2：含有目的基因的宿主细胞破碎上清；3：纯化的重组蛋白
图3角质酶BaCut1降解PUR泡沫塑料和PBAT薄膜的电镜观察
图4角质酶BaCut1降解前后不同类型聚酯型塑料的重量损失
具体实施方式
实施例1角质酶编码基因的PCR扩增
参考NCBI数据库中的Blastobotrys sp.G-9基因组信息(PRJNA1061465)并结合ORF预测，获取目的蛋白编码基因的全长序列。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为669bp，G+C含量为54.26％，基因序列为SEQ ID NO.1，编码222个氨基酸，N端前18个氨基酸为信号肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。委托南京擎科生物科技有限公司对该全序列进行合成，连接至pET29a质粒上，并转化至大肠杆菌DH5α。该大肠杆菌菌株及其质粒作为后续蛋白表达的模板。在该蛋白异源表达过程中，去掉N端信号肽，其在大肠杆菌中表达所用引物为F1和R1，毕赤酵母中表达所用引物为F2和R2，PCR扩增结果见图1。
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R1：5-gtggtggtggtggtgctcgagTTAGGAAGTCAAGGCCTTAACGA-3(Xho I)；
F2：5-cggccgtctcggatcggtaccATGGCTCCCCTGGAGCGA-3(Kpn I)；
R2：5-gagatgagtttttgttctagaTCAatgatgatgatgatgatgGGAAGTCAAGGCCTTAACG-3(Xba I)。
实施例2角质酶在大肠杆菌中的表达纯化与活性测定
以大肠杆菌BL21作为表达宿主，将去掉信号肽的角质酶编码基因的PCR扩增产物通过酶连转化连接至pET29a载体上，构建pET29a-baCut1质粒，后将该质粒导入到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，涂布含有50mg/L卡那霉素的LB平板，挑取单菌落通过测序验证获取含有pET29a-baCut1质粒的大肠杆菌细胞。将构建好的含有表达质粒的大肠杆菌采用IPTG诱导的方法，诱导重组蛋白在大肠杆菌中的表达，重组蛋白的纯化采用Ni柱亲和层析的方法。结果表明该角质酶在大肠杆菌具有较好的表达量，达到200.73mg/L，通过Ni柱纯化获得纯度较高的异源表达重组角质酶(图2)。后续以大肠杆菌重组表达的异源表达蛋白开展该角质酶的活性测定与降解性能评估。以4-硝基苯丁酸酯为底物，37℃，pH7条件下，该角质酶的比酶活达到771.8U/mg。
实施例3角质酶在毕氏酵母中的表达与活性测定
以毕氏酵母作为表达宿主，将去掉信号肽的角质酶编码基因的PCR扩增产物通过酶连转化连接至pEFaA载体上，构建pEFaA-baCut1质粒，经测序验证后，将构建好的质粒利用限制性内切酶Sca I对正确的重组质粒进行线性化。利用电转的方法将线性化质粒导入到毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布到含有100μg/mL Zeocin的YPD平板上，待长出后使用目的基因的特征引物进行菌落PCR，以检测目的基因是否整合到酵母染色体中。阳性克隆命名为P.pastoris GS115(pEFaA-baCut1)。将表达菌株P.pastoris GS115(pEFαA-baCut1)划线平板培养，挑取单菌落至50mL液体YPD三角瓶中，28℃，200rpm培养24h；然后在室温下4000rpm，离心5min，弃去上清液，将菌体用25mL BMMY培养基重悬，开始诱导酵母细胞的表达；继续28℃条件下，200rpm培养，每隔24h补加甲醇至终浓度为0.5％(v/v)，共培养96h；待培养结束后，通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量，其表达量为54.55mg/L。
实施例4角质酶BaCut1对聚酯类塑料降解能力测定
称取40mg PUR泡沫、农用可降解地膜PBAT、PU塑料合成寡聚物PBA-PU、聚酯可降解PCL，PUR泡沫采用121℃蒸汽灭菌20min的方式除菌，农用可降解地膜PBAT采用75％乙醇长期(3天以上)浸泡除菌，PBA-PU和PCL采用75％乙醇浸泡20min，紫外灭菌30min的方式灭菌。随后将无菌的干燥塑料分别与200μg BaCut1孵育(5mL,50mM Tris-HCl,pH 8)。37℃孵育一段时间后，用称量好质量的滤纸过滤，用去离子水清洗滤纸上残留的塑料3次，随后放置在40℃干燥箱烘干至质量不发生变化，随后称取样品质量，得到的质量减去滤纸质量即为剩余塑料的质量。塑料质量的减少量与塑料初始质量之比即为该塑料的减重率。以经0.4MTCA沉淀变性的蛋白质溶液和Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8)作为对照处理。将经BaCut1处理过的塑料放在烘箱中充分干燥，用干净的刀片切取成约0.20mm厚的薄片，用黑色的双面胶带将薄片固定在扫描电子显微镜进样的样品台上，并用离子溅射仪在塑料薄片表面镀上一层金膜，随后将样品台固定在样品座上推进扫描电子显微镜SU8010(日本日立公司)，通过调整放大倍数、焦距和观察位置对PUR塑料的表面形貌进行观察并拍照记录。
不同处理组塑料电镜观察结果发现，角质酶BaCut1处理后的PUR泡沫和PBAT塑料表面被分解侵蚀，呈现碎片状(图3)。塑料减重结果表面，角质酶BaCut1能够降解不同类型的聚酯类塑料，其中PUR泡沫和聚酯塑料PCL在2天内减重率分别达到33.88％和83.44％，农用可降解地膜PBAT和PU塑料寡聚物PBA-PU在4天内的降解率分别达到66.70％和64.41％。结果表明，角质酶BaCut1具有良好聚酯塑料降解能力。
Claims (10)
1.一种角质酶基因，其特征在于该基因全长核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。
2.权利要求1所述的角质酶基因编码的具有聚酯塑料降解能力的角质酶BaCut1，其特征在于氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。
3.含权利要求1所述角质酶基因的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于所述的重组质粒是将权利要求1所述角质酶基因克隆到质粒pET29a或pEFαA中所得。
5.含权利要求1所述的角质酶基因或权利要求3或4所述的重组质粒的重组微生物。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于以大肠杆菌或酵母为宿主菌。
7.权利要求1所述角质酶基因、权利要求3或4所述的重组质粒、权利要求5所述的重组微生物在聚酯塑料生物降解中的基因工程应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的聚酯塑料包括但不限于PUR泡沫、农用地膜PBAT、可降解塑料PCL、PL。
9.权利要求2所述的角质酶BaCut1在聚酯塑料生物降解中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的聚酯塑料包括但不限于PUR泡沫、农用地膜PBAT、可降解塑料PCL、PL。
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