CN118005796A - 一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用 - Google Patents
一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118005796A CN118005796A CN202410080679.3A CN202410080679A CN118005796A CN 118005796 A CN118005796 A CN 118005796A CN 202410080679 A CN202410080679 A CN 202410080679A CN 118005796 A CN118005796 A CN 118005796A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- carcinoembryonic antigen
- domain antibody
- single domain
- phage
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 9
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 title description 43
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 claims abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000002823 phage display Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 claims abstract 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 238000004091 panning Methods 0.000 claims description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 8
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 claims description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 abstract description 13
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 abstract description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 230000002494 anti-cea effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 206010052358 Colorectal cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101100495393 Rattus norvegicus Ceacam3 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 230000005773 cancer-related death Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000031877 prophase Effects 0.000 description 1
- 238000013441 quality evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用，所述单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～11所示的其中一种。本发明采用健康羊驼作为获取抗体的实验动物，经过免疫后获取羊驼外周血，并判定抗体的效价。将抗体基因片段构建至噬菌体展示载体上，进行电转收集噬菌体展示库，并利用抗体库能够对特异性抗体进行筛选的特性，对免疫羊驼后得到的抗体进行筛选，获得多个与癌胚抗原结合及可溶表达的抗体。通过细胞筛选，得到亲和力较好的可作为靶点的序列用于构建能靶向CEA的纳米抗体，并可应用于结直肠癌的临床诊断和治疗。
Description
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用。
背景技术：
噬菌体抗体展示技术是基于抗原抗体亲和力，以噬菌体表面为媒介的最常用的展示和筛选的基因工程技术。常用的噬菌体展示技术以M13、T4、T7、Qβ和MS2噬菌体等为载体，从而将编码各种抗体的核酸序列整合到噬菌体的基因组，与编码噬菌体外壳蛋白的基因进行融合。然而，噬菌体展示过程需要经过细菌转化、噬菌体包装，抗体在细胞内的不同结合特性，导致噬菌体展示系统的文库容量和多样性受到限制。根据不同的靶抗体，对噬菌体进行修饰，构建库容量大、灵活性强的展示库，能够解决噬菌体展示系统的库容量和多样性问题。噬菌体抗体展示技术正在成为生物医学领域的重要工具，并在开发用于癌症或传染病诊断的显像剂方面的应用范围不断扩大。综上所述，随着技术的不断发展和完善，噬菌体展示技术的潜在应用价值可能会进一步增加。
结直肠癌(CRC)是全球癌症死亡的主要原因，转移是结直肠癌癌症相关死亡的主要原因。转移性结直肠癌的治疗进展甚微。设计靶向和有效的治疗方法仍然是结直肠癌治疗的未满足的主要临床需求。癌胚抗原(CEA)是一种在大多数结直肠肿瘤中过表达的糖蛋白，因此，对于癌胚抗原阳性的肿瘤疾病，可通过靶向癌胚抗原抗体作为检测或治疗药物，可用于产生新的靶向癌胚抗原治疗结直肠癌的治疗策略。目前关于靶向癌胚抗原的抗体药物尚无报道。因此，本发明提供一种靶向癌胚抗原的单域抗体，能够与可用与癌胚抗原特异性结合，可用于结直肠癌等恶性肿瘤的治疗。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用，通过噬菌体展示技术筛选出能够与癌胚抗原(CEA)特异性结合的sdAb序列并挑选其中特异性强的序列进行载体构建及真核表达，从而获得亲和力高的抗体。这些对CEA具有高度靶向性的抗体可应用于结直肠癌的临床诊断和治疗。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
(一)本发明提供一种靶向癌胚抗原的单域抗体，所述单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～11所示的其中一种。
进一步的，所述单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:4～5、SEQID NO:8～9以及SEQ ID NO:11所示的其中一种。
进一步的，所述单域抗体为骆驼源的VHH。
(二)本发明提供以上所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，包括：
S1、取免疫羊驼外周血，提取外周血淋巴细胞RNA，反转录扩增cDNA；
S2、以cDNA为模板，扩增羊驼抗体VHH基因片段，将VHH基因片段与载体连接，得到重组噬菌体载体；
S3、通过重组噬菌体载体构建单域抗体噬菌体文库；
S4、通过癌胚抗原对所述单域抗体噬菌体文库进行淘选，得到抗CEA的阳性噬菌体。
进一步的，所述步骤S1中，羊驼免疫的方法为：
S1.1、初次免疫前采血留作阴性血清；
S1.2、将完全弗氏佐剂与癌胚抗原混合乳化后对羊驼进行注射，进行初次免疫，并检测免疫效价；
S1.3、将不完全弗氏佐剂与癌胚抗原混合乳化后对羊驼进行注射，进行若干次加强免疫，加强免疫间隔为两周，加强免疫后一周检测血清效价。
进一步的，所述步骤S2中，构建单域抗体噬菌体文库的方法为：
S2.1、以cDNA为模板，通过巢式PCR扩增方法扩增VHH基因片段；
S2.2、通过限制性内切酶酶切连接方法，将VHH基因片段与M13噬菌体展示载体质粒连接，电转化至感受态细胞中，得到单域抗体噬菌体文库。
进一步的，所述S4中，噬菌体文库进行淘选后，对抗CEA的阳性噬菌体进行筛选，得到与癌胚抗原亲和力高的靶向癌胚抗原的单域抗体，筛选方法为：将筛选的阳性克隆通过噬菌体展示方法表达抗体，使用ELISA方法鉴定上述阳性克隆与癌胚抗原的亲和力，筛选与癌胚抗原亲和力高的阳性克隆，并进行序列分析，得到靶向癌胚抗原的单域抗体。
(三)本发明还提供以上所述的靶向癌胚抗原的单域抗体在制备癌胚抗原检测试剂中的应用。
(四)本发明还提供以上所述的靶向癌胚抗原的单域抗体在制备癌胚抗原阳性肿瘤如结直肠癌治疗药物中的应用。
(五)本发明提供一种核酸，编码以上所述的靶向癌胚抗原的单域抗体。
(六)本发明还提供以上所述的核酸在制备针对癌胚抗原阳性肿瘤的基因治疗药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明基于噬菌体展示技术，采用健康羊驼作为获取抗体的实验动物，经过免疫后获取羊驼外周血，并判定抗体的效价。将抗体基因片段构建至噬菌体展示载体上，进行电转收集噬菌体展示库，并利用抗体库能够对特异性抗体进行筛选的特性，对免疫羊驼后得到的抗体进行筛选，获得多个与癌胚抗原结合及可溶表达的抗体。通过细胞筛选，得到亲和力较好的可作为靶点的序列用于构建能靶向癌胚抗原的纳米抗体，可应用于结直肠癌的临床诊断和治疗。本发明为结直肠肿瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药，同时可为结直肠肿瘤的诊断提供相应的检测试剂。
附图说明
图1为两次采血的羊驼血清效价检测。A为对羊驼进行第三次免疫后采血的全血效价检测；B为对羊驼进行第四次免疫后采血的全血效价检测；
图2为total RNA琼脂糖凝胶检测；
图3为文库的Insert rate琼脂糖凝胶电泳检测；
图4为11个VHH抗体表达上清ELISA鉴定结果；
图5为11个VHH抗体表达上清亲和力测定结果；
图6为3个高亲和力VHH抗体的结合曲线；
图7为7个高亲和力VHH抗体的具体序列。
具体实施方式：
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合相关附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例
本实施例提供靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，包括以下步骤：
1、免疫羊驼
本项目使用一只羊驼(未免疫健康羊驼，5周岁)进行免疫，免疫过程包括抗原检测，免疫以及采血等。按照具体的目标蛋白及免疫效果，安排至少4次免疫，并根据需要判断是否追加额外免疫，免疫方法见下述：
(1)初次免疫前采血10ml留作阴性血清，按照ELISA方法测试免疫效价。
(2)初免(第0天)：将250μl弗氏完全佐剂和250μl 1mg/ml癌胚抗原蛋白的体积进行1:1混合，放在注射乳化器上进行乳化，乳化约1h 20min后，检测乳化结果，形成“油包水”乳化液(或者用震荡混合器乳化)，在羊驼颈部四个点注射0.5ml的乳化液，即一只羊驼注射250μg的蛋白。初免后采血10ml，按照ELISA方法测试免疫效价。
(3)加强免疫(第14、28、42、56、63天)：将125μl弗氏不完全佐剂和125μl 1mg/ml癌胚抗原蛋白的体积进行1：1混合，放在注射乳化器上进行乳化，乳化约1h 20min后，检测乳化结果，形成“油包水”乳化液，每只羊驼注射0.25ml的乳化液，即每只羊驼注射125μg的蛋白。每次加强免疫后(第35、49、60、67天)，采血10ml，按照ELISA方法测试免疫效价。
终免之后，通过ELISA检测抗血清效价，显示血清抗体总效价大于2187k(图1)，提示前期羊驼免疫是成功的。
2、重组噬菌体载体的构建
收集免疫后羊驼的外周血，利用淋巴细胞分离液(GE Ficoll-Paque Plus)分离获得羊驼的PBMC，根据TRIzol操作手册，提取总RNA(图2)。并利用oligo(dT)反转录扩增cDNA。以cDNA为模板，通过巢式PCR扩增方法扩增羊驼抗体VHH基因片段，通过限制性内切酶酶切连接方法，将VHH基因片段与M13噬菌体展示载体质粒连接，得到重组噬菌体载体。所述巢式PCR扩增的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12(CTGCCCAGGCCGCCATGGCC)所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13(GATTGTGCACCGCGCCGGCCGC)所示。
PCR扩增体系及条件如下：
酶连体系如下：
| 试剂 | 用量 |
| VHH(BgLI) | 500ng |
| PhV12(SfiI+AP) | 1.1μg |
| 10*T4 ligation buffer | 5μl |
| T4 ligase | 2μl |
| ddH2O | up to 50μl |
3、单域抗体噬菌体文库的构建
将重组噬菌体载体电转化至感受态细胞(SS320大肠杆菌菌株)中，得到单域抗体噬菌体文库。每个电转使用300ng连接产物，电击转化操作按照标准操作流程处理，使用的液体及固体培养基为2YT培养基(100μg/mL Ampicillin)。
电转化完成后，从总菌液中取100μl进行10倍比梯度稀释，并将稀释后的菌液涂布固体培养基平板，通过次日的克隆计数来评估噬菌体抗体文库库容。通过菌液PCR及测序来判定文库质量(VHH插入率及有效插入率)。
单域抗体噬菌体文库质量评价：(1)噬菌体文库库容：根据单个感受态(SS320大肠杆菌菌株)电转效率及电转总数量确定噬菌体文库库容，经检测，单域抗体噬菌体文库的库容为2.5*108。(2)VHH插入率：挑选48个单菌落进行菌液PCR鉴定，VHH插入率大于95％(图3)。(3)VHH有效插入率：随机挑选并测序45个克隆来评价文库的VHH有效插入率(in-framerate)，VHH有效插入率大于95％。(3)随机挑选并测序44个克隆来评价文库的多样性，测序结果显示，所测序列多样性为97.6％。
4、噬菌体文库的淘选
通过癌胚抗原对所述单域抗体噬菌体文库进行淘选，得到抗CEA阳性噬菌体。
淘选过程按照标准操作流程操作：将癌胚抗原包被于氨基偶联酶标条，与噬菌体文库振荡结合1h后，用0.1M TEA洗脱结合的噬菌体，在洗脱液中立即加入1M Tris-HCl中和。在辅助噬菌体的作用下感染细菌，经过抗生素培养，获得第一轮噬菌体文库，完成第一次淘选，将所述第一轮噬菌体文库按照第一次淘选的方法进行第二次和第三次淘选，得到富集的噬菌体文库。每一步噬菌体筛选都会设立相应空白对照，避免假阳性。
应用噬菌体ELISA方法鉴定阳性克隆，并以此计算噬菌体文库的阳性克隆产出率。
5、抗体的筛选及亲和力鉴定
噬菌体文库进行淘选后，对抗CEA阳性噬菌体进行筛选，得到与癌胚抗原亲和力高的靶向癌胚抗原的单域抗体。
所述筛选方法为：随机挑选经过淘选后的阳性克隆470个，通过噬菌体展示方法表达抗体，使用ELISA方法鉴定上述阳性克隆与癌胚抗原的亲和力，筛选与癌胚抗原亲和力高的阳性克隆，并进行序列分析，得到靶向癌胚抗原的单域抗体。
在经过1轮筛选及表达鉴定后，共获得92个与目标蛋白结合、可溶表达并测序的sdAb序列，对这些序列挑选11个特异性强的进行载体构建及真核表达，编号为：1-1、6-2、13-1、18-1、20-1、21-1、23-1、32-1、33-1、35-1和53-1，氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～11所示。ELSIA结果显示，21-1、1-1、6-2、13-1、18-1、20-1、32-1、33-1、35-1和53-1 10个单克隆sdAb均能特异性与CEA5结合，而不与CEA1、6和8结合，参见图4。
亲和力结果显示，共获得1-1、6-2、18-1、20-1、33-1、32-1和53-2 7个亲和力高的VHH抗体，参见图5和图6，序列分析结果显示，7个具有高亲和力的VHH抗体，序列各不相同(图7)，氨基酸序列对应为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:4～5、SEQ ID NO:8～9以及SEQ IDNO:11所示。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种靶向癌胚抗原的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列为SEQ IDNO:1～11所示的其中一种。
2.根据权利要求1所述的靶向癌胚抗原的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:4～5、SEQ ID NO:8～9以及SEQ ID NO:11所示的其中一种。
3.权利要求1～2任意一项所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、取免疫羊驼外周血，提取外周血淋巴细胞RNA，反转录扩增cDNA；
S2、以cDNA为模板，扩增羊驼抗体VHH基因片段，将VHH基因片段与载体连接，得到重组噬菌体载体；
S3、通过重组噬菌体载体构建单域抗体噬菌体文库；
S4、通过癌胚抗原对所述单域抗体噬菌体文库进行淘选，得到抗CEA的阳性噬菌体。
4.根据权利要求3所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，其特征在于：
所述步骤S1中，羊驼免疫的方法为：
S1.1、初次免疫前采血留作阴性血清；
S1.2、将完全弗氏佐剂与癌胚抗原混合乳化后对羊驼进行注射，进行初次免疫，并检测免疫效价；
S1.3、将不完全弗氏佐剂与癌胚抗原混合乳化后对羊驼进行注射，进行若干次加强免疫，加强免疫间隔为两周，加强免疫后一周检测血清效价。
5.根据权利要求3所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，其特征在于：
所述步骤S2中，构建单域抗体噬菌体文库的方法为：
S2.1、以cDNA为模板，通过巢式PCR扩增方法扩增VHH基因片段；
S2.2、通过限制性内切酶酶切连接方法，将VHH基因片段与M13噬菌体展示载体质粒连接，电转化至感受态细胞中，得到单域抗体噬菌体文库。
6.根据权利要求3所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，其特征在于：
所述S4中，噬菌体文库进行淘选后，对抗CEA的阳性噬菌体进行筛选，得到与癌胚抗原亲和力高的靶向癌胚抗原的单域抗体，筛选方法为：
将筛选的阳性克隆通过噬菌体展示方法表达抗体，使用ELISA方法鉴定上述阳性克隆与癌胚抗原的亲和力，筛选与癌胚抗原亲和力高的阳性克隆，并进行序列分析，得到靶向癌胚抗原的单域抗体。
7.权利要求1～2任意一项所述的靶向癌胚抗原的单域抗体在制备癌胚抗原检测试剂中的应用。
8.权利要求1～2任意一项所述的靶向癌胚抗原的单域抗体在制备癌胚抗原阳性肿瘤治疗药物中的应用。
9.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1～2任意一项所述的靶向癌胚抗原的单域抗体。
10.权利要求9所述的核酸在制备针对癌胚抗原阳性肿瘤的基因治疗药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410080679.3A CN118005796A (zh) | 2024-01-19 | 2024-01-19 | 一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410080679.3A CN118005796A (zh) | 2024-01-19 | 2024-01-19 | 一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118005796A true CN118005796A (zh) | 2024-05-10 |
Family
ID=90945488
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410080679.3A Pending CN118005796A (zh) | 2024-01-19 | 2024-01-19 | 一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118005796A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011034660A1 (en) * | 2009-09-16 | 2011-03-24 | Immunomedics, Inc. | Class i anti-cea antibodies and uses thereof |
| CN107880130A (zh) * | 2017-12-17 | 2018-04-06 | 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 | 一种具有高亲和力的抗癌胚抗原纳米抗体及应用 |
| CN108659130A (zh) * | 2018-05-28 | 2018-10-16 | 长春力太生物技术有限公司 | 一种高亲和力的抗癌胚抗原纳米抗体及其应用 |
| CN111533805A (zh) * | 2016-12-04 | 2020-08-14 | 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 | 一种抗癌胚抗原的高亲和力纳米抗体及其应用 |
| CN116813785A (zh) * | 2023-06-28 | 2023-09-29 | 青岛汉德森生物科技有限公司 | 抗癌胚抗原的特异性抗体及其应用 |
-
2024
- 2024-01-19 CN CN202410080679.3A patent/CN118005796A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011034660A1 (en) * | 2009-09-16 | 2011-03-24 | Immunomedics, Inc. | Class i anti-cea antibodies and uses thereof |
| CN111533805A (zh) * | 2016-12-04 | 2020-08-14 | 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 | 一种抗癌胚抗原的高亲和力纳米抗体及其应用 |
| CN107880130A (zh) * | 2017-12-17 | 2018-04-06 | 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 | 一种具有高亲和力的抗癌胚抗原纳米抗体及应用 |
| CN108659130A (zh) * | 2018-05-28 | 2018-10-16 | 长春力太生物技术有限公司 | 一种高亲和力的抗癌胚抗原纳米抗体及其应用 |
| CN116813785A (zh) * | 2023-06-28 | 2023-09-29 | 青岛汉德森生物科技有限公司 | 抗癌胚抗原的特异性抗体及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘亚文;张晓;郭万美;谢英林;宋水燕;朱晓宇;敬媛媛;于建立;宋海鹏;: "抗癌胚抗原纳米抗体展示文库的构建与筛选", 科学技术与工程, no. 28, 8 October 2018 (2018-10-08), pages 189 - 194 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1341595C (en) | Procedure for obtaining dna, rna, peptides, polypeptides, or proteins byrecombinant dna techniques | |
| JP3344584B2 (ja) | 組換えライブラリースクリーニング法 | |
| AU2005291012B2 (en) | Methods for antibody library screening | |
| CN110003335B (zh) | Cd47单域抗体、核酸及试剂盒 | |
| EP4043491B1 (en) | B7-h3 nanobody and preparation method therefor and use thereof | |
| CN108017712B (zh) | 一种鲨鱼抗体来源的蛋白骨架及其应用 | |
| Manoutcharian et al. | Phage displayed biomolecules as preventive and therapeutic agents | |
| CN111153999A (zh) | Ctla-4纳米抗体、制备方法及其应用 | |
| KR20140027915A (ko) | 단일 세포 내 생체 분자의 동시 검출 | |
| JP2022141629A (ja) | 免疫レパートリー発掘 | |
| CN115850473A (zh) | Il-8抗体及其应用 | |
| Xu et al. | Selection and identification of mimic epitopes for gastric cancer-associated antigen MG7 Ag | |
| CN108659124B (zh) | 一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及其应用 | |
| CN118005796A (zh) | 一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用 | |
| CN115850474A (zh) | 一种il-8单克隆抗体及其应用 | |
| JP4729043B2 (ja) | 抗体ライブラリーをスクリーニングする方法 | |
| CN1485432A (zh) | 利用噬菌体展示技术展示抗原制备抗体的方法 | |
| CN114057880A (zh) | 一种dll3单克隆抗体 | |
| CN1429916A (zh) | 规模化原核和真核细胞体内抗体和抗原文库构建及筛选 | |
| Hung et al. | Phage Display for Imaging Agent Development | |
| CN114315990B (zh) | 新型冠状病毒特异性单克隆抗体的制备及其应用 | |
| Xin et al. | A subtractive fluorescence-activated cell-sorting strategy to identify mimotopes of HBV–preS protein from bacterially displayed peptide library | |
| US20230134754A1 (en) | Methods and compositions for protein detection | |
| EP3730624A1 (en) | Method for determining and system for determining polypeptide bonding to target molecule | |
| CN110003334B (zh) | 多肽、cd19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |