CN118001450A - 一种壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于材料制备领域，涉及一种壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵及其制备方法与应用。将壳聚糖与水、冰醋酸混合后，加入季铵化壳聚糖溶液，混匀，再加入碳酸氢钠，混匀，形成水凝胶；水凝胶置于低温下过夜，形成固体A；固体A室温解冻，得到海绵B，将海绵B用水浸泡洗涤，冷冻干燥，即得壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵。本发明提供的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵与现有止血、伤口愈合材料相比，具有以下优点：成本低，操作简单，不引入任何交联剂，去除壳聚糖的酸性同时又具备抗菌性，具有良好的形态记忆性能、快速止血功效，且能促进伤口愈合。
Description
技术领域
本发明属于材料制备领域，涉及一种壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵及其制备方法与应用。
背景技术
无法控制的出血是导致死亡的主要原因。传统的纱布或绷带只对浅表损伤有止血效果，但是针对不规则、不可控、不可压缩的创伤性出血几乎没有止血效果。许多新型止血材料已被开发以促进快速止血，如水凝胶、多孔微球和粘合剂等。其中，海绵良好的形状恢复性能、快速液体吸收能力以及在压缩状态下能注射到伤口处以快速扩张并完全填充不规则出血伤口的特点，使其在止血应用方面具有巨大潜力。此外，开放性伤口长时间暴露在空气中容易发生细菌(金黄色葡萄球菌是引起皮肤伤口感染的主要细菌)感染，可引起严重的局部伤口感染，甚至引发败血症导致死亡。因此，开发具有抗菌性能和快速止血的多功能伤口敷料是迫切需要的。
壳聚糖(CS)作为一种低成本的天然多糖，具有优异的生物相容性和抗菌性，具有止血和促进伤口愈合的优势，因此被广泛应用于止血和伤口敷料。壳聚糖溶于酸性溶液制备的敷料置于创口时会产生过敏等不良反应刺激，但是将壳聚糖的酸性去除时，其抗菌性下降。此外，临床常用的壳聚糖制品，大多数以溶液、粉末状以及绷带形式存在，使用并且携带均不便利。但是，当壳聚糖制成海绵往往需要引入交联剂(如戊二醛、京尼平以及环氧氯丙烷等等)难以从体系中去除且存在一定的细胞毒性。然而，单一的壳聚糖海绵因机械性能差、脆性大等原因发展受到限制，这是由于壳聚糖的半结晶性导致其机械强度低、回弹能力差，开发可压缩壳聚糖海绵面临着巨大的挑战。因此，急需开发一种治疗急性出血修复的新材料。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新型壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵及其制备方法与应用，在不引入任何交联剂的条件下，去除壳聚糖的酸性的同时壳聚糖与季铵化壳聚糖形成强氢键发生相分离形成水凝胶，随后经过冷冻干燥得到一系列具有形状记忆性、抗菌、止血和促进伤口愈合的壳聚糖海绵。该海绵表现出快速的血液触发形状恢复、良好的抗菌性能，同时能够以快速控制伤口出血，促进伤口愈合。
发明思路：壳聚糖在酸性条件下溶解，与季铵化壳聚糖混溶，在碱性条件下混合后短时间内形成强氢键发生相分离形成水凝胶，并经冷冻干燥后得到壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明公开了一种壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵的制备方法，包括如下步骤：
(1)将壳聚糖与水、冰醋酸混合，得到壳聚糖酸性溶液；
(2)向步骤(1)得到的壳聚糖酸性溶液中加入季铵化壳聚糖溶液，混匀，得到第一混合液；
(3)向步骤(2)得到的第一混合液中加入碳酸氢钠，混匀，形成水凝胶；
(4)将步骤(3)得到的水凝胶置于-10℃～-20℃的条件下过夜，形成固体A；
(5)将步骤(4)得到的固体A室温解冻，得到海绵B，将海绵B用水浸泡洗涤，冷冻干燥，即得壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵。
在一些实施例中，步骤(1)中，所述壳聚糖，脱乙酰度大于等于95％，粘度为100-200mpa.s。
其中，所述壳聚糖购自于麦克林，CAS号为9012-76-4。
在一些实施例中，步骤(1)中，所述壳聚糖酸性溶液中壳聚糖的浓度为10.0mg/mL～30.0mg/mL；所述水与冰醋酸的体积比为15：(0.005～0.40)。
在一些实施例中，优选地，步骤(1)中，所述壳聚糖酸性溶液中壳聚糖的浓度为13.0mg/mL～24.0mg/mL；所述水与冰醋酸的体积比为15：(0.10～0.20)，进一步优选地，所述水与冰醋酸的体积比为15：0.10、15：0.15或15：0.20。
在一些实施例中，步骤(2)中，所述季铵化壳聚糖溶液中，溶剂为水，溶质为季铵化壳聚糖，溶液中季铵化壳聚糖的浓度为0.01～0.08g/mL。
在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，所述季铵化壳聚糖溶液中，溶剂为水，溶质为季铵化壳聚糖，溶液中季铵化壳聚糖的浓度为0.04g/mL。
其中，所述季铵化壳聚糖根据现有技术(Multifunctional Tissue-AdhesiveCryogel Wound Dressing for Rapid Nonpressing Surface Hemorrhage and WoundRepair.ACS Appl.Mater.Interfaces 2020,12,35856-35872.或Quaternized chitosan-coated nanoemulsions:A novel platform for improving the stability,anti-inflammatory,anti-cancer and transdermal properties of Plaiextract.Carbohydrate Polymers.2020,230,115625)的制备方法制备得到。
在一些实施例中，步骤(2)中，所述季铵化壳聚糖溶液中季铵化壳聚糖与所述壳聚糖酸性溶液中壳聚糖的质量比为1：(0.50～9.00)。
在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，所述季铵化壳聚糖溶液中季铵化壳聚糖与所述壳聚糖酸性溶液中壳聚糖的质量比为1：(0.50～3.00)，进一步优选为1：1.00～1.75，更进一步优选为1：1.00、1：1.25、1：1.50或1：1.75。
在一些实施例中，步骤(3)中碳酸氢钠与步骤(1)中冰醋酸的质量体积比为(0.100～0.500)g：(0.05～0.50)mL。
在一些实施例中，优选地，步骤(3)中碳酸氢钠与步骤(1)中冰醋酸的质量体积比为(0.120～0.300)g：(0.10～0.20)mL。
在一些实施例中，优选地，步骤(4)中，将步骤(3)得到的水凝胶置于-20℃的条件下过夜，形成固体A。
在一些实施例中，步骤(5)中，所述浸泡，浸泡时间为2～3天。
其中，步骤(5)中，海绵B用水浸泡洗涤，用水洗涤，洗涤的目的为除去多余壳聚糖和季铵化壳聚糖。
其中，步骤(5)中，所述冷冻干燥在真空冷冻干燥机中进行，除去海绵B中的水分。
上述的制备方法制备得到的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵也在本发明的保护范围之内。
上述的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵在制备形状记忆性和/或抗菌和/或止血材料中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵在制备促进伤口愈合材料中的应用也在本发明的保护范围之内。
有益效果：
(1)本发明在制备壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵过程中，在不引入任何交联剂、去除壳聚糖的酸性的同时壳聚糖与季铵化壳聚糖形成强氢键发生相分离形成水凝胶。经过冷冻干燥得到一系列具有形状记忆性、抗菌、止血和促进伤口愈合的壳聚糖海绵。本发明提供的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵表现出快速的血液触发形状恢复、良好的抗菌性能，同时能够以快速控制伤口出血，有望成为一种治疗伤口修复的潜在材料。
(2)本发明制备壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵的工艺简单、成本低、无毒，有望成为一种治疗急性出血复的潜在材料。
(3)本发明提供的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵与现有止血、伤口愈合材料相比，具有以下优点：成本低，操作简单，不引入任何交联剂，去除壳聚糖的酸性同时又具备抗菌性，具有良好的形态记忆性能、快速止血功效，且能促进伤口愈合。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为实施例1～实施例4制备的海绵的电镜图。
图2为实施例1制备的海绵的形状恢复能力图。
图3为实施例1～实施例4制备的海绵的五次循环压缩数据图。
图4为实施例1～实施例4制备的海绵的溶血率图。
图5为实施例9中不同材料的实物图。
图6为实施例1～实施例4制备的海绵的抗菌性能图。
图7为不同材料创伤愈合能力评估图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
本发明实施例中所用的壳聚糖，脱乙酰度大于等于95％，粘度为100-200mpa.s，购自于麦克林，CAS号为9012-76-4。
本发明实施例中所用的季铵化壳聚糖根据现有技术(Multifunctional Tissue-Adhesive Cryogel Wound Dressing for Rapid Nonpressing Surface Hemorrhage andWound Repair.ACS Appl.Mater.Interfaces 2020,12,35856-35872.)的制备方法制备得到。
实施例1
(1)取15mL去离子水，加入0.2g壳聚糖，加入0.10mL冰醋酸溶液，混匀，得到壳聚糖酸性溶液；
(2)向步骤(1)得到的壳聚糖酸性溶液中加入5mL季铵化壳聚糖水溶液(含有0.2g季铵化壳聚糖)，搅拌均匀，得到第一混合液；
(3)向步骤(2)得到的第一混合液中加入0.147g碳酸氢钠，搅拌混匀形成水凝胶；
(4)将步骤(3)得到的水凝胶置于在-20℃条件下过夜，形成固体A；
(5)将步骤(4)得到的固体A置于室温解冻，得到海绵B，将海绵B置于水中浸泡2-3d，随后用水多次冲洗除去多余壳聚糖和季铵化壳聚糖，洗涤后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，除去样品中的水分，最终得到壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵，产品记为QCS/CS1。
实施例2
(1)取15mL去离子水，加入0.25g壳聚糖，加入0.10mL冰醋酸溶液，混匀，得到壳聚糖酸性溶液；
(2)向步骤(1)得到的壳聚糖酸性溶液中加入5mL季铵化壳聚糖水溶液(含有0.2g季铵化壳聚糖)，搅拌均匀，得到第一混合液；
(3)向步骤(2)得到的第一混合液中加入0.147g碳酸氢钠，搅拌混匀形成水凝胶；0.147g：0.25g＝1：1.70
(4)将步骤(3)得到的水凝胶置于在-20℃条件下过夜，形成固体A；
(5)将步骤(4)得到的固体A置于室温解冻，得到海绵B，将海绵B置于水中浸泡2-3d，随后用水多次冲洗除去多余壳聚糖和季铵化壳聚糖，洗涤后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，除去样品中的水分，最终得到壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵，产品记为QCS/CS2。
实施例3
(1)取15mL去离子水，加入0.3g壳聚糖，加入0.15mL冰醋酸溶液，混匀，得到壳聚糖酸性溶液；
(2)向步骤(1)得到的壳聚糖酸性溶液中加入5mL季铵化壳聚糖水溶液(含有0.2g季铵化壳聚糖)，搅拌均匀，得到第一混合液；
(3)向步骤(2)得到的第一混合液中加入0.221g碳酸氢钠，搅拌混匀形成水凝胶；0.221g：0.3g＝1：1.36
(4)将步骤(3)得到的水凝胶置于在-20℃条件下过夜，形成固体A；
(5)将步骤(4)得到的固体A置于室温解冻，得到海绵B，将海绵B置于水中浸泡2-3d，随后用水多次冲洗除去多余壳聚糖和季铵化壳聚糖，洗涤后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，除去样品中的水分，最终得到壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵，产品记为QCS/CS3。
实施例4
(1)取15mL去离子水，加入0.35g壳聚糖，加入0.20mL冰醋酸溶液，混匀，得到壳聚糖酸性溶液；
(2)向步骤(1)得到的壳聚糖酸性溶液中加入5mL季铵化壳聚糖水溶液(含有0.2g季铵化壳聚糖)，搅拌均匀，得到第一混合液；
(3)向步骤(2)得到的第一混合液中加入0.294g碳酸氢钠，搅拌混匀形成水凝胶；0.294g：0.35g＝1：1.19
(4)将步骤(3)得到的水凝胶置于在-20℃条件下过夜，形成固体A；
(5)将步骤(4)得到的固体A置于室温解冻，得到海绵B，将海绵B置于水中浸泡2-3d，随后用水多次冲洗除去多余壳聚糖和季铵化壳聚糖，洗涤后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，除去样品中的水分，最终得到壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵，产品记为QCS/CS4。
实施例5：材料表征
分别将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4制备的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵(实施例1制备的QCS/CS1、实施例2制备的QCS/CS2、实施例3制备的QCS/CS3、实施例4制备的QCS/CS4)进行电镜扫描，具体的海绵电镜图如图1所示，从图中可知，壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵具有互连的多孔结构。
实施例6：形状恢复能力测试
以壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵QCS/CS1为代表，对实施例1制备的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵QCS/CS1进行按压测试形状恢复能力，为了评估海绵的形态恢复能力，将海绵压缩到最小(往下按压或左右按压)，然后分别向压缩后的海绵中加入1mL的水和血液，观察海绵的形态恢复情况。具体的测试结果请见图2，从图中可知，从不同方向(往下按压或左右按压)对壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵进行预先按压，然后变形后的海绵能够快速(1-3秒内)吸水或吸血并恢复原状。
实施例7：力学性能测试
分别将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4制备的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵(实施例1制备的QCS/CS1、实施例2制备的QCS/CS2、实施例3制备的QCS/CS3、实施例4制备的QCS/CS4)进行循环压缩测试，用流变仪(DHR-1，TA，USA)测试海绵的压缩性能，将海绵浸泡在PBS(pH＝7.4，0.1mol/mL)中，然后循环5次，压缩应变为75％，压缩速率设置为1mm/s。具体的压缩测试数据结果请见图3，从图中可知，随着壳聚糖用量的增多，压缩应力是逐渐增强的，说明壳聚糖增加了海绵的力学性能。
实施例8：生物相容性测试
分别将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4制备的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵(实施例1制备的QCS/CS1、实施例2制备的QCS/CS2、实施例3制备的QCS/CS3、实施例4制备的QCS/CS4)进行溶血率测试：将抗凝全血在4000rpm下离心10min，得到红细胞(RBC)，然后将红细胞用生理盐水稀释至终浓度5％。取0.5mL稀释后的红细胞加入到0.5mL不同浓度的海绵分散液中(将海绵置于液氮中脆断，随后将其置于研钵中进行充分研磨，并分散于生理盐水中形成海绵分散液，分散液中海绵的浓度分别为5和10mg/mL)中，在37℃下孵育1h。孵育结束后，所有样品以1000rpm离心10min，拍照。取200μL上清液转入96孔板，在540nm处测定上清液吸光度OD。用去离子水和生理盐水分别作阳性对照和阴性对照。溶血率的计算公式如下：
具体的测试结果请见图4，从图中可知，各组海绵的溶血率均低于5％，说明制备的海绵具有良好的生物相容性。
实施例9：控制实验
(1)壳聚糖酸性溶液的制备：
取20mL去离子水，加入0.2g壳聚糖，加入0.10mL冰醋酸溶液，混匀，得到壳聚糖酸性溶液，记为CS；产品图见图5a。
(2)壳聚糖酸溶解后碱中和
取20mL去离子水，加入0.2g壳聚糖，加入0.10mL冰醋酸溶液，混匀，随后加入0.147g碳酸氢钠，得到的产品记为CS+NaHCO3，详见图5b。
(3)壳聚糖酸溶解、碱中和、混合季铵化壳聚糖
取15mL去离子水，加入0.2g壳聚糖，加入0.10mL冰醋酸溶液，混匀，得到壳聚糖酸性溶液；向得到壳聚糖酸性溶液中加入5mL季铵化壳聚糖水溶液(含有0.2g季铵化壳聚糖)，搅拌均匀，得到第一混合液；向第一混合液中加入0.147g碳酸氢钠，搅拌均匀形成水凝胶，记为CS+QCS+NaHCO3，产品详见图5c。
从图5中可知，(i)壳聚糖在酸性条件形成均一的壳聚糖酸性溶液(图5a)；(ii)在壳聚糖酸性溶液中加入碳酸氢钠后，碳酸氢钠中和壳聚糖的酸性环境后形成壳聚糖微纤维，然而壳聚糖微纤维表现出疏水性，易于从溶液中析出(图5b)；(iii)但是，当壳聚糖酸性溶液体系中引入季铵化壳聚糖后，季铵化壳聚糖在中和壳聚糖的酸性环境时与壳聚糖微纤维形成强氢键，增加了体系的交联位点促进水凝胶的形成，进而形成稳定的水凝胶网络(图5c)；注：图5c右边倒置含有水凝胶的瓶子是产品CS+QCS+NaHCO3的实验瓶(即图5c的实验瓶)。
实施例10：抗菌活性
分别称取一定等质量的QCS/CS海绵(分别为实施例1制备的QCS/CS1、实施例2制备的QCS/CS2、实施例3制备的QCS/CS3、实施例4制备的QCS/CS4，均为10mg)，并置于紫外光灯下灭菌30min。向灭菌后的海绵中加入400μL PBS溶液(pH＝7.4，0.1mol/mL)进行充分浸泡，并分别加入10μL(106CFU/mL)金黄色葡萄球菌、10μL(106CFU/mL)大肠肝菌后在37℃下孵育4h。随后，将细菌溶液进行稀释并取10μL细菌溶液涂布于琼脂平板上，在37℃下孵育24h后观察琼脂平板上的菌落并拍照。对照组(Control组)中不含海绵，评估海绵的抑菌活性。
具体的测试结果请见图6，从图中可知，相对于对照组(Control组)，制备的QCS/CS具有良好的抗菌性能，主要的原因是季铵化壳聚糖表面带正电荷与细菌表面负电荷发生静电作用导致细菌死亡。
实施例11：促进伤口愈合实验
本实施例以壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵QCS/CS1为代表，对实施例1制备的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵QCS/CS1进行创伤愈合能力评估。
在SD大鼠(5-6周龄，150-200g，雄性，购自南京青龙山实验动物养殖有限公司)背部制备直径为1.5cm的圆形创口，随后将商用明胶海绵(Gelatin)以及QCS/CS1海绵分别置于伤口处，Gelatin和QCS/CS1海绵用量相同(用量为：直径1.5cm，厚度0.5cm)，治疗期间每3天更换一次海绵，治疗12天，于第7天和第12天进行拍照，观察各组大鼠皮肤恢复情况。以不进行任何处理的伤口组为对照组(Control组)。
具体的测试结果请见图7，从图中可知，制备的QCS/CS1海绵相比于对照组和商用海绵组，具有良好的促创面愈合能力。
本发明提供了一种壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将壳聚糖与水、冰醋酸混合，得到壳聚糖酸性溶液；
(2)向步骤(1)得到的壳聚糖酸性溶液中加入季铵化壳聚糖溶液，混匀，得到第一混合液；
(3)向步骤(2)得到的第一混合液中加入碳酸氢钠，混匀，形成水凝胶；
(4)将步骤(3)得到的水凝胶置于-10℃～-20℃的条件下过夜，形成固体A；
(5)将步骤(4)得到的固体A室温解冻，得到海绵B，将海绵B用水浸泡洗涤，冷冻干燥，即得壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述壳聚糖，脱乙酰度大于等于95％，粘度为100-200mpa.s。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述壳聚糖酸性溶液中壳聚糖的浓度为10.0mg/mL～30.0mg/mL；所述水与冰醋酸的体积比为15：(0.005～0.40)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述季铵化壳聚糖溶液中，溶剂为水，溶质为季铵化壳聚糖，溶液中季铵化壳聚糖的浓度为0.01～0.08g/mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述季铵化壳聚糖溶液中季铵化壳聚糖与所述壳聚糖酸性溶液中壳聚糖的质量比为1：(0.50～9.00)。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中碳酸氢钠与步骤(1)中冰醋酸的质量体积比为(0.100～0.500)g：(0.05～0.50)mL。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述浸泡，浸泡时间为2～3天。
8.权利要求1～7中任意一项所述的制备方法制备得到的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵。
9.权利要求8所述的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵在制备形状记忆性和/或抗菌和/或止血材料中的应用。
10.权利要求8所述的壳聚糖/季铵化壳聚糖海绵在制备促进伤口愈合材料中的应用。
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