CN117999290A - 一种多特异性抗原结合蛋白及其应用 - Google Patents

一种多特异性抗原结合蛋白及其应用 Download PDF

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姜晓玲
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Abstract

本专利提供了一种多特异性抗原结合蛋白，包含：(a)第一抗原结合部分，能够特异性识别第一抗原，其中第一抗原是特异性靶向与肿瘤发生或发展有关的抗原；(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分是先天性免疫细胞激动剂；(c)第三抗原结合部分，能够特异性识别第三抗原，其中第三抗原通过调节正常和异常血管生成进而调节肿瘤微环境。本文进一步提供了包含所述多特异性抗原结合蛋白和药学上可接受载体的药物组合物，以及所述多特异性抗原结合蛋白、药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。

Description

一种多特异性抗原结合蛋白及其应用 技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种特异性地结合至两种或更多种不同抗原或表位的多特异性抗原结合蛋白及其应用。
背景技术
单克隆抗体(mAb)已经广泛用于治疗多种人类疾病，包括癌症、自身免疫疾病、感染性疾病以及心血管疾病等。目前，存在超过30种单克隆抗体，包括鼠源、全人源化和嵌合抗体，它们已经被FDA批准用于治疗用途。
这些抗体大多数是单特异性抗体，其识别单一表位并且可被选择以便通过此单一表位激活或抑制靶分子的活性。例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)是最畅销的抗癌蛋白质治疗剂之一，通过将自己附着在Her2上来阻止人体表皮生长因子在Her2上的附着，从而阻断癌细胞的生长，曲妥珠单抗还可以刺激身体自身的免疫细胞去摧毁癌细胞。但是，许多生理反应需要有待触发的两种或更多种不同蛋白质或蛋白质亚基的交联或共接合。以异聚细胞-表面受体复合物的活化为例，对于这些受体复合物，活化通常通过配体与不同蛋白质上的多个结构域的相互作用而实现，由此造成一种或两种受体组分的接近相关的活化。
多特异性抗体，可共接合多个表位或抗原，已经被设计用来同时调节两个或更多个治疗靶标，提供增强的治疗功效和加宽的潜在效用。多特异性抗体解决肿瘤发生多个机制，多维阻断肿瘤的生长。目前已有抗肿瘤药物的作用机制大概分为以下几个方面：(1)特异性靶向与肿瘤发生或发展有关的抗原，包括TSA(肿瘤特异性抗原)与TAA(肿瘤相关抗原)；(2)解除免疫抑制，刺激免疫细胞活性(如PD1免疫抑制剂疗法、CD3T细胞衔接器)；(3)改善肿瘤微环境。
目前，市面上主要通过激活T细胞活性来激活免疫细胞活性，但激活免疫T细胞的疗法具有以下临床局限性：(1)高毒性(即细胞因子风暴和神经毒性)；(2)癌细胞对MHCI的下调作用以实现免疫逃逸；(3)肿瘤患者的肿瘤微环境的T细胞活性低下；(4)实体瘤的临床疗效有限。
先天性免疫是人类在长期的进化过程中逐渐建立起来的天然防御能力，它受 遗传因素控制，具有相对稳定性；对各种寄生虫感染均具有一定程度的抵抗作用。以NK细胞为代表的先天性免疫细胞，在遇到对人体有害的多种细菌、病毒、病变和癌变的细胞时，就会主动发起攻击并消灭对方，具有广谱性。
γδT细胞是执行先天性免疫功能的T细胞。激活的γδT细胞能够通过凋亡诱导蛋白配体途径Fas-FasL和相关凋亡诱导配体受体诱导肿瘤细胞凋亡。γδT细胞能够分泌大量的细胞因子，如干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素2(IL-2)，作用于肿瘤细胞及其微环境。γδT细胞还可以通过分泌IL-2、IL-17等多种细胞因子和趋化因子，参与免疫调节。
NK细胞是医学界公认的第一道防线，与其他抗癌免疫细胞相比，NK细胞杀灭肿瘤和病毒感染细胞的作用更强、更有效，一个NK细胞可以通过释放穿孔素和颗粒酶杀伤一个体积超过NK细胞数倍的肿瘤细胞。它的激活不依赖于肿瘤细胞表面抗原，也不需要像T细胞一样，要经过免疫系统的抗原辨识反应才确定“攻击”目标。NK细胞游弋在全身血管行使免疫监视作用，它能在第一时间发现并迅速启动免疫防御和免疫稳定功能，杀死病变、癌变的细胞。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。人类主要NK细胞活化性受体包括CD16、NKG2D和自然细胞毒性受体(NCRs)，后者包括NKp30、NKp44和NKp46。
NKp30在多种先天性免疫细胞上表达，表达于所有静息与活化的NK细胞、多种效应NKT细胞、γδT-细胞、MAIT细胞。NKP30能激活NK细胞、γδT-细胞等肿瘤杀伤性细胞，进而杀伤肿瘤。NKp30识别肿瘤细胞和树突状细胞上的配体，这些配体在肿瘤细胞的一个子集上高度表达，但在大多数其他正常细胞上却不表达。刺激或抑制NKp30的活化可能用于调节NK细胞的活性，以及治疗与NK细胞活性相关的疾病或紊乱。尤其是，通过触发NKp30增强NK细胞活性可能用于治疗以NK细胞活性不足为特征的疾病或紊乱，比如癌症和传染性疾病，而通过阻断NKp30抑制NK细胞活性则能够用于治疗NK细胞介导的紊乱，例如BMC同种异体移植排斥。
多种机制导致肿瘤血管功能障碍，进而影响肿瘤微环境。其中最主要的是由血管生成和抗血管生成分子介导的信号不平衡。在非恶性组织中，这种平衡被精心维护，以确保血管的正常形态和功能。然而，在癌发生过程中，这种平衡通常 会导致血管生成，使血管变得不成熟和异常。在大多实体瘤患者中，血管异常能帮助肿瘤来逃避免疫系统的攻击。这些异常源于血管生成因子的升高，如VEGF和血管生成素2(ANG2)。使用针对这些分子的药物可以提高免疫治疗的响应能力。部分原因是，此类药物可以使异常的肿瘤血管系统正常化，来增加免疫效应细胞的浸润，即将免疫抑制的肿瘤微环境(TME)转变为免疫增强的肿瘤微环境。
本发明的多特异性抗体特异性靶向与肿瘤发生或发展有关的抗原，并可以特异性激活肿瘤微环境中的NK细胞、γδT细胞等先天性免疫细胞，解除免疫抑制。通过桥接NK、γδT先天性免疫细胞及肿瘤细胞，增加NK细胞、γδT先天性免疫细胞与肿瘤细胞的免疫突触，更加有效的杀伤肿瘤细胞。VEGF作为促血管生成因子，促进肿瘤微环境中异常血管的生长，促进肿瘤进展，而本发明的多特异性抗体通过VEGF抗体或VEGFR结合并中和游离的VEGF，阻断VEGF与受体的信号传导，抑制肿瘤微环境中血管的异常生成。
发明内容
本申请提供一种多特异性抗原结合蛋白，包含：(a)第一抗原结合部分，能够特异性识别第一抗原，其中第一抗原是特异性靶向与肿瘤发生或发展有关的抗原；(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分是先天性免疫细胞激动剂；(c)第三抗原结合部分，能够特异性识别第三抗原，其中第三抗原通过调节正常和异常血管生成进而调节肿瘤微环境。所述第二抗原结合部分和第三抗原结合部分的位置可以互换。
在一些实施方案中，所述特异性靶向与肿瘤发生或发展有关的抗原为肿瘤相关抗原(TAA)和/或肿瘤特异性抗原(TSA)。
在一些实施方案中，所述先天性免疫细胞激动剂是NK细胞激动剂和/或γδT细胞激动剂。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分能够特异性识别在先天性免疫细胞上表达的第二抗原，第二抗原结合部分与第二抗原结合后可以激活先天性免疫细胞。
在一些实施方案中，所述第三抗原是促血管生成因子。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第 三抗原结合部分是由两条重链和两条轻链组成的全长抗体。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分是包含重链可变域(VH)和/或轻链可变域(VL)的抗体片段。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分是Fab、scFab、F(ab')2、Fv、dsFv、scFv、VH或VL结构域。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分是抗原的受体。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条 重链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条重链的C端、另一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条重链的C端、另一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条重链的C端、另一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条重链的N端、另一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条重链的N端、另一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条重链的N端、另一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C 端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条 重链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到同一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条 轻链的C端，第三抗原结合部分融合到同一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条 轻链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条轻链的C端、另一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条轻链的C端、另一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条轻链的C端、另一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条轻链的N端、另一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条轻链的N端、另一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条轻链的N端、另一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端。
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在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端。
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在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条 轻链的N端和C端，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条 重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条 重链的N端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条 轻链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区或Fv区或VH、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域中的一个或多个结合单元。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fv区。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的VH部分。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的CH1结构域。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的CH2结构域。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的CH3结构域。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分位于第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的VH结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域中任意结构域之间。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分位于第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的VH结构域和CH1结构域之间。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分位于第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的CH1结构域和CH2结构域之间。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分位于第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的CH2结构域和CH3结构域之间。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的至少一条轻链。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fv区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分 的Fv区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fv区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fv区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fv区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fv区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的至少一条重链。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fv区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fv区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fv区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fv区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fv区。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和C端，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fv区。
在一些实施方案中，所述多特异性抗原结合蛋白包含第一Fc区和第二Fc区。
在一些实施方案中，所述第一Fc区和第二Fc区是相同的Fc或不同的Fc。
在一些实施方案中，所述第一Fc区为knob-Fc，所述第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一Fc区为hole-Fc，所述第二Fc区为knob-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的VH和VL互换。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的CL和CH1互换。
在一些实施方案中，所述第一Fc区的CH3被CL或CH1替换，第二Fc区的CH3被CL或CH1替换。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的VH和VL互换、CL和CH1互换。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的VH和VL互换，第一Fc区的CH3被CL或CH1替换，第二Fc区的CH3被CL或CH1替换。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的CL和CH1互换，第一Fc区的CH3被CL或CH1替换，第二Fc区的CH3被CL或CH1替换。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的VH和VL互换、CL和CH1互换，第一Fc区的CH3被CL 或CH1替换，第二Fc区的CH3被CL或CH1替换。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的重链和/或Fc片段包含一处或多处氨基酸替换，所述替换在所述重链和Fc片段之间形成离子键。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条轻链的N端融合，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条轻链的C端融合，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条轻链的N端融合，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条轻链的N端融合，第一抗原结合部分融合第二抗原结合部分的Fab区的VH和VL互换，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条轻链的C端融合，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条轻链的C端融合，第一抗原结合部分融合第二抗原结合部分的Fab区的VH和VL互换，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole- Fc，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fab区，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fab区，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fv区，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fv区，替换部分的VH和VL互换，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fv区，替换部分的CH1和CL互换，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fv区，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fv区，替换部分的VH和VL互换，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fv区，替换部分的CH1和CL互换，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分另一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分同一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分另一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分同一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分与第二抗原结合部分融合一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链 的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分与第二抗原结合部分融合一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的另一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的同一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的另一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的同一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部 分的两条轻链的N端融合，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条轻链的C端融合，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条轻链的N端融合，第一抗原结合部分融合第二抗原结合部分的Fab区的VH和VL互换，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条轻链的C端融合，第一抗原结合部分融合第二抗原结合部分的Fab区的VH和VL互换，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fab区，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fab区，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是scFv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fab区，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是scFv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fab区，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是Fv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fv区，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是Fv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分替换第一抗原 结合部分的Fv区，替换部分的VH和VL互换，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是Fv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fv区，替换部分的CH1和CL互换，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是Fv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fv区，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是Fv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fv区，替换部分的VH和VL互换，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是Fv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分替换第一抗原结合部分的Fv区，替换部分的CH1和CL互换，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分另一侧的 Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分同一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分另一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分、第三抗原结合部分均是单域抗体(VHH)，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分同一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是scFv，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是scFv，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是scFv，第二抗原结合部分与第一抗原 结合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分与第二抗原结合部分融合一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是scFv，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是scFv，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是scFv，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分与第二抗原结合部分融合一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是Fv，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是Fv，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的另一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是Fv，第二抗原结合部分与第一抗原结 合部分的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的同一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是Fv，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是Fv，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的另一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分是全长抗体，第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是Fv，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分的同一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分和第三抗原结合部分通过连接子与所述第一抗原结合部分融合。
在一些实施方案中，所述连接子为肽连接子。
在一些实施方案中，所述肽连接子为GS连接子或突变人类IgG铰链。
在一些实施方案中，所述GS连接子为(G 4S) n，(SG 4) n或G 4(SG 4) n连接子。
在一些实施方案中，所述n为0-10的任意自然数。
在一些实施方案中，所述肽连接子为(G 4S) n。
在一些实施方案中，所述特异性靶向与肿瘤发生或发展有关的抗原选自GPC3、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CD133、CD138、CDK4、CEA、Claudin6、Claudin18.2、AFP、ALK、B7H3、BAGE蛋白质、BCMA、BIRC5(存活素)、BIRC7、β-连环蛋白(β-catenin)、 brc-ab1、BRCA1、BORIS、CA9、CA125、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、CCR8、NA17、NKG2D、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白质、周期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白、GD2、GD3、GloboH、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IL13Rα2、LMP2、κ-Light、LeY、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-12、MART-1、间皮素、ML-IAP、MOv-γ、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16、MUM1、Ras、RGS5、Rho、ROR1、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TNFR2、TMPRSS2、汤-诺氏抗原、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和尿溶蛋白-3、5T4、乙肝表面抗原(HBSAG)、组织多肽抗原(TPA)、糖类抗原153(CA153)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原724(CA724)、糖类抗原242(CA242)、糖类抗原50(CA50)、CYFRA21-1(Cy211)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、前列腺特异性抗原(PSA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲状腺球蛋白(TG)、铁蛋白(SF)、β2-微球蛋白(β2-MG)、鳞状细胞抗原(SCC)。
在一些实施方案中，所述第一抗原选自CD24。
在一些实施方案中，所述第一抗原选自Claudin18.2。
在一些实施方案中，所述第二抗原选自NKP30、NKP46、CD16、NKP44、CD244、CD226、NKG2D、NKG2、KIR。
在一些实施方案中，所述第二抗原选自NKP30。
在一些实施方案中，所述第二抗原选自Vδ1T、Vδ2T、Vδ3T、γδTreg、γδT17、IFN-γ+γδT。
在一些实施方案中，所述第三抗原选自EGF、FGF、FGF-α、FGF-β、VEGF、VEGFR、HDGF、HGF、HGFK1、NRP-1、ANG、Ang1、Ang2、PDGF、PDGFR、PIGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β受体、CD31、CD105、MCP-1、COX-2、AC133、Id2/Id3、IL-1α、IL-6、IL-1β、IL-8、CXCL5、、MMP、THBS、AREG、ET-1、AAMP、AGGF1、AMOT、ANGLPTL3、ANGPTL4、BTG1、NOS3、TNFSF12、VASH2、整联蛋白α vβ 3、α 5β 1、VE-钙黏蛋白、瘦蛋白、肝配蛋白、纤溶酶原激活物、纤 溶酶原激活物抑制因子-1。
在一些实施方案中，所述第三抗原选自VEGF。
在一些实施方案中，所述第三抗原结合部分是VEGFR。
在一些实施方案中，所述第一抗原为CD24，所述第二抗原为NKP30，所述第三抗原为VEGF。
在一些实施方案中，所述第一抗原为CD24，所述第二抗原为NKP30，所述第三抗原结合部分为VEGFR。
在一些实施方案中，所述第一抗原为Claudin18.2，所述第二抗原为NKP30，所述第三抗原为VEGF。
在一些实施方案中，所述第一抗原为Claudin18.2，所述第二抗原为NKP30，所述第三抗原结合部分为VEGFR。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的Fab、scFab、F(ab')2、Fv、dsFv、scFv、VH或VL结构域为嵌合抗体、全人抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的单域抗体(VHH)为骆驼抗体、鲨鱼抗体或人源化单域抗体。
在一些实施方案中，所述全长抗体包含选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合的Fc片段。
在一些实施方案中，所述Fc片段选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其组合。
在一些实施方案中，所述Fc片段是人类Fc片段。
在一些实施方案中，所述全长抗体与具有人IgG野生型Fc片段的相应抗体相比，具有增强的FcγR结合亲和力。
在一些实施方案中，所述全长抗体与具有人IgG野生型Fc片段的相应抗体相比，具有降低的FcγR结合亲和力。
本申请还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述任一实施方案所述的多特异性抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。
本申请还提供上述任一实施方案所述的多特异性抗原结合蛋白或药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述癌症是鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细 胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、头颈癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、中枢神经系统癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌、皮肤癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宫颈癌、脑癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、咽喉癌、肝胆癌。
本申请还提供上述任一实施方案所述的多特异性抗原结合蛋白及其药物组合物在治疗癌症中的用途。
在一些实施方案中，所述癌症是鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、头颈癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、中枢神经系统癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌、皮肤癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宫颈癌、脑癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、咽喉癌、肝胆癌。
除非另有定义，本文使用的所有领域术语、符号和其它科学术语旨在具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚起见和/或为了便于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且在此包含此类定义不应被解释为表示与本领域中通常理解的事情的差异。
术语“多特异性抗原结合蛋白”是指能够与两个或两个以上的目标抗原或目标抗原表位特异性结合的蛋白分子。能够对两个目标抗原或目标抗原表位特异性结合的蛋白分子称为双特异性抗原结合蛋白，包含抗体或抗体的抗原结合片段(如单链抗体)的“双特异性结合蛋白”在本文中可以与“双特异性抗体”互换。
术语“抗原结合结构域”是指在多特异性蛋白分子或在抗体分子中，能够非共价地、可逆地并且特异性地结合至抗原的能力的部分。抗原结合结构域可以是能直接与抗原结合的配体结合结构域部分，也可以是能直接与抗原结合的包含抗体可变区的结构域。如本文所用的，所述术语“抗原结合结构域”涵盖了抗体片段，所述抗体片段保留了非共价地、可逆地并且特异性地结合抗原的能力。
术语“抗体”包含包括通过双硫键相互连接的四条多肽链，二条重(H)链和二条轻(L)链的免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如IgM)。每个L链通过一个共价二硫键连接于H链，而两个H链视H链同种型而定通过一个或多个二硫键彼此连接。每个重链在N末端具有可变区(在本文中缩写为VH)，继之以恒定区。各重链包含重链可变区(文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。这一重链恒定区包含三个区(结构域)，CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个区(结构域，CL1)。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守性区域，称为框架区(framework region，FR，也称骨架区、构架区)。各VH和VL是由三个CDR和四个FR所组成，以下列顺序由氨基端排列到羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体可以是不同亚类(subclass)的抗体。
术语“抗体”包括但不限于：单克隆抗体、全人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、双特异性或多特异性抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本披露的抗体的抗Id抗体)。这些抗体可以属于任何同种型/类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA1和IgA2)。
术语“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个保留结合所述抗体结合的抗原的能力的部分。抗体的“抗原结合片段”的实例包括(1)Fab片段；(2)F(ab′)2片段；(3)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(4)Fv片段；(5)dAb片段，由VH结构域组成；(6)CDR，经分离互补决定区。
此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv))。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选的片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗原结合片段还可并入至包含一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，该对串联Fv片段连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。
在某些实施例中，抗体的抗原结合片段在任何可变区和恒定区的配置中，可变区和恒定区可直接彼此相连接或可通过完整或部分的绞链或连接子区相连接。绞链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸所组成，使其在单一多肽分子中于相邻的可变和/或恒定区之间产生柔性和半柔性连结。再者，在本发明的抗体的抗原结合片段可包含以非共价彼此相互连结和/或与一个或多个单体VH或VL区相连结(例如以双硫键)的任何上列的可变区和恒定区配置的同源二聚体或异源二聚体(或其它多聚体)。
术语“先天性免疫细胞”，又称固有免疫细胞，是指不通过在其细胞表面上表达抗体或TCR来识别病原性物质(例如，癌细胞、细菌、病毒和酵母)，而是表达与结合病原体的抗体的Fc区结合的受体(例如，在其细胞表面上的受体)或蛋白，和/或表达与模式相关分子模式(PAMP)和/或与危险相关分子模式(DAMP)结合的受体的细胞，其中PAMP与病原体相关，DAMP与受损或转化的细胞相关。先天性免疫细胞的非限制性实例包括肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞和γδT细胞等。先天性免疫细胞的其他实例是本领域已知的。
术语“鼠源抗体”是将来源于免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融 合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，进而进行筛选、抗体制备和抗体纯化。
术语“嵌合抗体”，是抗体分子(或其抗原结合片段)，其中(1)所述恒定区或其部分被改变、置换或更换，使得所述抗原结合位点(可变区)与不同或改变的类型、效应子功能和/或种类的恒定区连接，或者与赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因素、药物等)连接；或(2)所述可变区或其部分被改变、置换或更换为具有不同或改变的抗原特异性的可变区。例如，可以通过用来自人免疫球蛋白的恒定区替代其恒定区来修饰小鼠抗体。由于被人恒定区置换，所述嵌合抗体可以保留其识别抗原的特异性，同时与原始小鼠抗体相比在人体中具有降低的抗原性。
术语“人源化抗体”，是指含有源于人抗体序列的氨基酸残基的嵌合抗体。人源化抗体可含有来自非人动物或合成抗体的CDR或HVR中的一些或全部，而抗体的框架区和恒定区含有源于人抗体序列的氨基酸残基。可以克服嵌合抗体由于携带大量异源蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少的反向突变或回复突变，以保持活性。
术语“全人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或源自利用人抗体库或人抗体编码序列的非人来源的氨基酸序列的抗体。如果抗体含有恒定区，则所述恒定区也衍生自此类人序列，例如人种系序列或人种系序列的突变形式，或者含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体。全人抗体明确排除人源化抗体。
术语“单克隆抗体”是指来自基本上同质抗体群体的抗体。基本同质的抗体群体包含基本相似并结合相同表位的抗体，除了在单克隆抗体产生过程中通常可出现的变体外。此类变体通常仅以少量存在。单克隆抗体针对单个抗原位点有高度特异性。与通常包括针对不同决定基(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定基。单克隆抗体除了其特异性之外，优势还在于它们是通过杂交瘤培养而合成，无其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表示抗体如从基本上同源的抗体群体获得的抗体特性，并且不应理解为需 要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可通过各种技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，此类方法以及用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中进行描述。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换地用于指代与抗体片段相比呈其基本上完整形式的抗体。特定来说，全长4链抗体包括具有包括Fc区的重链和轻链的那些。恒定域可以是天然序列恒定域或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一种或多种效应功能。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述短语还适用于一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外指示，否则特定的多肽序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体。
术语“氨基酸”是指二十种常见的天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)；组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。在一些实施方案中，术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸。可以使用任何合适的非天然氨基酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸包含用于将药剂与MIAC缀合的反应性部分。
术语“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人类FcR。此外，优选FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类的受体，包括等位基因变体和替代地剪接形式的这些受体，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)与FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有主要区别在于其细胞质域的相似的氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其细胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。
术语“Fc片段”包含通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应功能由Fc区的序列决定，所述区也被某些种类的细胞上存在的Fc受体(FcR)识别。
术语“knob-Fc”是指用具有更大侧链体积的氨基酸残基取代所述Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基，从而在所述第一亚基的CH3结构域内产生可定位在所述第二亚基的CH3结构域内的凹陷中的凸起。例如，通过将一条重链的CH3第366位丝氨酸T突变为色氨酸W，形成一个突起的类似“杵”的凸起。
术语“hole-Fc”是指用具有更小侧链体积的氨基酸残基取代所述Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基，从而在所述第二亚基的CH3结构域内产生所述第一亚基的CH3结构域内的凸起可定位在其中的凹陷。例如，通过将另外一条重链的第366位丝氨酸T突变为丝氨酸S，第368位亮氨酸L突变为丙氨酸A，第407位氨基酸由酪氨酸Y突变为缬氨酸V或突变为丙氨酸A，突变后形成一个凹陷的类似“臼”的凹陷。
术语“Fab片段”由完整的L链以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定域(CH1)组成。各Fab片段对于抗原结合是单价的，即，其具有单一抗原结合位点。例如，可以重组产生或通过全长抗体的木瓜蛋白酶消化产生Fab片段。
术语“Fab'片段”不同于Fab片段之处在于在CH1域的羧基末端处添加了几个额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理特异性识别并结合抗原的F(ab')2来生产。
术语“F(ab')2片段”最初作为在其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对而产生。可以重组或通过胃蛋白酶消化完整的抗体(其除去大部分Fc区同时保留完整铰链区的部分)产生F(ab')2片段。通过用还原剂如β-巯基乙醇处理可以将F(ab')2片段解离(成两个Fab'分子)。
术语“scFab”是指单链Fab片段，在重链可变域(VH)和轻链(CL)之间引入多肽接头，形成单链Fab片段(scFab)。
术语“Fv片段”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由一个重链可变区结构域与一个轻链可变区结构域通过紧密的非共价结合形成 的二聚体组成。这两个结构域的折叠产生六个高变环(3个环来自H链并且3个环来自L链)，这些高变环贡献了用于抗原结合的氨基酸残基并且赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单个可变域具有识别并结合抗原的能力，但与完整结合位点相比其亲和力较低。
术语“单链Fv”或“sFv”或“scFv”片段是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单一多肽链中。所述Fv多肽可以进一步在VH与VL结构域之间包含多肽接头，所述多肽接头使scFv能够形成抗原结合所希望的结构。“scFv-Fc”片段包含连接于Fc结构域的scFv。例如，Fc结构域可以连接到scFv的C末端。取决于scFv中可变结构域的取向(即VH-VL或VL-VH)，Fc结构域可以在VH或VL后。Fc结构域可以是本领域已知的或本文所述的任何合适的Fc结构域。在一些情况下，Fc结构域是IgG1Fc结构域。
术语“dsFv”是指二硫键稳定型Fv片段。在dsFv中，每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连接。为产生此类分子，将VH和VL的框架区中的各一个氨基酸突变为半胱氨酸，其反过来形成稳定的链间二硫键。典型地，VH中的位置44和VL中的位置100突变为半胱氨酸。所述术语dsFv涵盖本领域中已知的dsFv(其中VH和VL通过链间二硫键而不是接头肽连接的分子)或scdsFv(其中VH和VL通过接头和链间二硫键连接的分子)两者。
术语“多特异性抗体”是指包含两个或更多个抗原结合结构域，能够结合两个或更多个不同的表位(例如，两个、三个、四个或更多个不同的表位)，表位可以在相同或不同的抗原上的抗体。多特异性抗体的示例包括结合两个不同表位的“双特异性抗体”，结合三个不同表位的“三特异性抗体”。
术语“融合”是指通过连接子等技术方式将两段氨基酸序列连接组成一条新序列，从而形成新的人工合成蛋白或抗体。
术语“接头(Linker)”或“连接子(Linker)”或用于连接两个蛋白质结构域中间的“L1”指连接性多肽序列，用于连接蛋白质结构域，具有一定的柔性，接头的使用不会使蛋白质结构域原有的功能丧失。
术语“双抗体”是指通过以下操作所制备的小抗体片段：在VH与VL域之间构建具有短接头(约5-10个残基)的scFv片段，以使得实现V域的链间而非 链内配对，由此产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”scFv片段的异二聚体，其中两种抗体的VH和VL域存在于不同多肽链上。
术语“氨基酸突变”或“氨基酸差异”是指，与原蛋白质或多肽相比，变体蛋白质或多肽存在氨基酸的突变或改变，包括在原蛋白质或多肽的基础上发生一个或多个氨基酸的插入、缺失或替换。
术语抗体的“可变区”或“可变域”是指单独的或组合的抗体轻链的可变区(VL)或抗体重链的可变区(VH)。如在本领域中已知的，重链和轻链的可变区各自由通过3个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的4个框架区(FR)组成。每一条链中的CDR通过FR紧密地保持在一起并且与来自另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合部位的形成。来自骆驼科物种的仅重链抗体具有单个重链可变区，其被称为“VHH”。VHH因此是一种特殊类型的VH。
术语“可变”是指以下事实：可变域的某些区段在抗体之间在序列上广泛不同。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对于其特定抗原的特异性。然而，可变性在整个可变域范围上并非均匀分布的。相反，它集中于轻链与重链可变域内三个称为高变区(HVR)的区段中。可变域的更高度保守部分被称作框架区(FR)。天然重链与轻链的可变域各自包含四个FR区，大部分采用β-折叠构型，由三个HVR连接，其形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的HVR通过FR区紧密保持在一起，并且与其它链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。恒定域不直接牵涉于抗体与抗原的结合中，但展现出各种效应功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性。
术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，((1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication 91-3242)提供。如本文中一些实施方式中使用的，CDR可以以Kabat规则定义轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，以及重链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)。
术语“抗原结合结构域”是指分子具有非共价地、可逆地并且特异性地结合至抗原的能力的部分。示例性抗原结合结构域包括抗原结合片段和基于免疫球蛋 白的支架和基于非免疫球蛋白的支架的部分，所述支架保留了非共价地、可逆地并且特异性地结合抗原的能力。如本文所用的，所述术语“抗原结合结构域”涵盖了抗体片段，所述抗体片段保留了非共价地、可逆地并且特异性地结合抗原的能力。
术语“抗体恒定区结构域”指来源于抗体的轻链和重链的恒定区的结构域，包括CL和来源于不同类抗体的CH1、CH2、CH3和CH4结构域。抗体中用于连接重链CH1和CH2结构域的铰链区不属于本公开所定义的“抗体恒定区结构域”的范畴。
术语“肿瘤抗原”是指由肿瘤细胞产生的物质，任选是蛋白质，包括“肿瘤相关抗原”或“TAA”(其是指在肿瘤细胞中产生的且与相应的正常组织相比在癌症中差异表达的蛋白质)以及“肿瘤特异性抗原”或“TSA”(其是指在肿瘤细胞中产生的且与相应的正常组织相比在癌症中特异性表达或异常表达的肿瘤抗原)。
术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”是指在癌性细胞的表面上完全或作为片段表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物、脂质或它们的一些组合)，并且其可用于优先将药理学药剂靶向癌性细胞。“肿瘤相关抗原”的非限定示例包含，例如CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CD133、CD138、CDK4、CEA、Claudin18.2、AFP、ALK、B7H3、BAGE蛋白质、BCMA、BIRC5(存活素)、BIRC7、β-连环蛋白(β-catenin)、brc-ab1、BRCA1、BORIS、CA9、CA125、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、NA17、NKG2D、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白质、周期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如GAGE-1、GAGE-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3)、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IL13Rα2、LMP2、κ-Light、LeY、MAGE蛋白(例如MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6和MAGE-12)、MART-1、间皮素(mesothelin)、ML-IAP、MOv-γ、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、Ras、RGS5、Rho、 ROR1、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、汤-诺氏抗原(Thompson-nouvelle antigen；Tn)、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和尿溶蛋白-3、5T4(Trophoblast glycoprotein)。
“肿瘤特异性抗原”或“TSA”的非限定示例包含，例如乙肝表面抗原(HBSAG)、组织多肽抗原(TPA)、糖类抗原153(CA153)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原724(CA724)、糖类抗原242(CA242)、糖类抗原50(CA50)、CYFRA21-1(Cy211)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、前列腺特异性抗原(PSA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲状腺球蛋白(TG)、铁蛋白(SF)、β2-微球蛋白(β2-MG)、鳞状细胞抗原(SCC)。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原的由抗体(或其抗原结合片段)结合的部分。表位通常由表面可接近的氨基酸残基和/或糖侧链组成，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象性表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指靶标与抗体之间的可测量和可重现相互作用诸如结合，此在包括生物分子的异质群体存在下，确定所述靶标的存在。举例来说，结合或特异性结合靶标(其可为表位)的抗体是相比于它结合其他靶标，以更大亲和力、亲合力，更易于和/或以更久持续时间结合这个靶标的抗体。通常，抗体以大约小于10-8M，例如大约小于10-9M、10-10M、10-11M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“亲和力”是指分子的单个结合位点(例如，MIAC的抗原结合模块)与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。在各抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力与抗原在多个氨基酸位点处相互作用；相互作用愈大，亲和力愈强。除非另外指示，否则如本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法测量，例如通过使用表面等离子体共振(SPR)技术(例如仪器)或生物层干涉测量法(例如，仪器)来测量。
术语“高亲和力”通常是指具有1E-9M或更小的KD(例如1E-10M或更小 的KD、1E-11M或更小的KD、1E-12M或更小的KD、1E-13M或更小的KD、1E-14M或更小的KD等)的抗体或抗原结合片段。
术语“KD”或“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，抗体以小于大约1E-8M，例如小于大约1E-9M、1E-10M或1E-11M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原，例如，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。KD值越小，亲和力越大。
术语“抗体效应功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性，并且随抗体同型而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。“降低的或最小化的”抗体效应功能意指相比于野生型或未经修饰的抗体，抗体效应功能减小了至少50％(或者60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)。抗体效应功能的测定可容易由本领域普通技术人员确定和测量。
术语“效应细胞”是表达一个或多个FcR并执行效应功能的白细胞。在一个方面，效应细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应功能。介导ADCC的人类白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀手(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性白细胞。效应细胞可从天然来源(例如血液)中分离。效应细胞一般是与效应期相关的淋巴细胞，并且用于产生细胞因子(辅助T细胞)、杀灭感染病原体的细胞(细胞毒性T细胞)或分泌抗体(分化的B细胞)。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如，自然杀手(NK)细胞、嗜中性白细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性地结合至带有抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“装备(arm)”细胞毒性细胞并且是通过该机制杀灭靶细胞所需的。介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞则表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。为了评价所关注的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定。对于这类测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀手(NK)细胞。
术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的溶解。 经典补体途径的激活是通过补体系统的第一组分(C1q)与结合至其同源抗原上的(适当子类的)抗体的结合来引发。为了评价补体激活，可进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。具有经改变的Fc区氨基酸序列和提高或降低的C1q结合能力的抗体变体描述于美国专利第6,194,551B1号和WO99/51642中。那些专利出版物的内容明确地通过引用并入本文中。
术语“单域抗体”或“VHH”是指只包含一个重链可变区(VHH)的单一抗原结合多肽。
术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。
术语“载体”是指能够递送一个或多个目标基因或序列并且优选地在宿主细胞中表达其的构建体。载体可为质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒或病毒粒子。一种类型的载体可在引入宿主细胞中后整合至宿主细胞的基因组中，并且由此连同宿主基因组一起复制(例如非游离型哺乳动物载体)。另一类型的载体能够在它所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。能够引导它们所操作性地连接的可表达外来核酸的表达的另一特定类型的载体通常被称为“表达载体”。表达载体通常具有驱动可表达外来核酸的表达的控制序列。被称为“转录载体”的较简单载体仅能够被转录而非翻译：它们可在靶标细胞中复制而非表达。术语“载体”涵盖所有类型的载体，无论它们的功能如何。能够引导它们所操作性地连接的可表达核酸的表达的载体通常被称为“表达载体”。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
术语“宿主细胞”是指可被工程改造来产生目标蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括不限于培养细胞，例如源于啮齿动物(大鼠、小鼠、豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞诸如CHO、BHK、NSO、SP2/0、YB2/0；人细胞，例如HEK293F细胞、HEK293T细胞；或人组织或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞(例如S2细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞)以及包含在转基因动物或培养组织内的细胞。所述术语不仅涵盖特定主题细胞，而且还涵 盖这种细胞的子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而发生在继代中，所以所述子代可能不与亲本细胞相同，但仍然被包括在术语“宿主细胞”的范围内。
术语“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
术语“治疗”是指在具有所述疾病状况的所述哺乳动物中导致合乎需要或有益的作用。合乎需要或有益的作用可包括疾病的一种或多种症状(即肿瘤生长和/或转移，或由免疫细胞的数目和/或活性介导的其他影响等)的频率或严重性降低，或疾病、疾患或病症的进一步发展得到遏止或抑制。在治疗哺乳动物的癌症的情形下，合乎需要或有益的作用可包括抑制癌细胞的进一步生长或扩散，使癌细胞死亡，抑制癌症的复发，减轻与癌症相关的疼痛，或改进哺乳动物的存活期。作用可为主观的或客观的。
术语“有效量”是指获得任一种或多种有益的或所需的治疗结果所必需的药物、化合物或药物组合物的量。对于预防用途，有益的或所需的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作，包括病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗应用，有益的或所需的结果包括临床结果，诸如减少各种本公开靶抗原相关病症的发病率或改善所述病症的一个或多个症状，减少治疗病症所需的其它药剂的剂量，增强另一种药剂的疗效，和/或延缓患者的本公开靶抗原相关病症的进展。
术语“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。
术语“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
术语“同源性”或“氨基酸序列同一性百分比(％)”在本文中可以互换，是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个 位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。通常，当比对两个序列时进行比较以给出最大百分比同源性。为了测定氨基酸序列同一性百分比所进行的比对可用本领域技能范围内的各种方法实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。
术语“单价”是指具有单一抗原结合结构域的抗原结合分子。
术语“二价”是指具有两个抗原结合结构域的抗原结合分子。所述结构域可以是相同的或不同的。因此，二价抗原结合分子可以是单特异性或双特异性的。
术语“三价”是指具有三个抗原结合结构域的抗原结合分子。
术语“四价”是指具有四个抗原结合结构域的抗原结合分子。
术语“五价”是指具有五个抗原结合结构域的抗原结合分子。
术语“六价”是指具有六个抗原结合结构域的抗原结合分子。
术语“分离的”抗体是已经从其产生环境的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体。优选地，经分离的多肽不与来自其产生环境的所有其它组分结合。其产生环境的污染组分是通常将干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中，多肽将被纯化：(1)至大于95重量％的抗体，如通过例如Lowry法所测定，并且在一些实施方案中，至大于99重量％；(2)至足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，通过利用转杯式测序仪；或(3)至同质，使用考马斯蓝或优选银染色剂，在非还原或还原条件下，通过SDS-PAGE。经分离的抗体包括原位在重组细胞内的抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，经分离的多肽或抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
术语“药物制剂”是指其剂型容许有效发挥活性成分的生物活性，并且不含对于施用制剂的受试者有不可接受的毒性的额外组分的制剂。这类制剂是无菌的。“无菌”制剂是无菌的或不含所有活的微生物及其芽孢。
术语“药学上可接受的载体”是指适合在用于递送结合分子的制剂中使用的任何非活性物质。载体可为防粘剂、粘合剂、包覆剂、崩解剂、填充剂或稀释剂、防腐剂(诸如抗氧化剂、抗细菌剂或抗真菌剂)、甜味剂、吸收延迟剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂等。适合药学上可接受的载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、右旋糖、植物油(诸如橄榄油)、盐水、缓冲剂、缓冲盐水、以及等张剂诸如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化钠。
术语“免疫检查点分子”是指上调信号或下调信号的免疫系统中的分子。“刺激性免疫检查点分子”或“共刺激性分子”是上调免疫系统中的信号的免疫检查点分子。“抑制性免疫检查点分子”是下调免疫系统中的信号的免疫检查点分子。
术语“癌症”指以异常细胞的不受控(并且通常是迅速的)生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。癌症的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤，和白血病或淋巴样恶性。这种癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、中枢神经系统癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌、皮肤癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宫颈癌、脑癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、咽喉癌、肝胆癌。
本发明的多特异性抗原结合蛋白通过多靶点组合产生抗肿瘤的协同作用。一方面，多特异性抗原结合蛋白靶向肿瘤抗原；另一方面，NK细胞能被多特异性抗原结合蛋白在肿瘤微环境中特异性激活；同时，可以解除肿瘤微环境的免疫抑制。
本发明的多特异性抗原结合蛋白在发挥肿瘤靶向作用的同时，还可以增加肿瘤微环境效应细胞，解除肿瘤微环境中免疫抑制。
附图说明
图1描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的两条轻链的N端融合，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合。
图2描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的两条重链的N端融合，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合。
图3描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的两条轻链的C端融合，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合。
图4描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的一条轻链的N端融合，全长抗体融合第二抗原结合部分的Fab区的VH和VL互换，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图5描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图6描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的一条轻链的C端融合，全长抗体融合第二抗原结合部分的Fab区的VH和VL互换，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图7描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的N端融合。
图8描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图9描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分替换全长抗体的一侧Fab区，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的N端融合，多特 异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图10描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分替换全长抗体的一侧Fab区，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图11描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是scFv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分替换全长抗体的一侧Fab区，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图12描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是scFv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分替换全长抗体的一侧Fab区，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图13描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是Fv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分替换全长抗体的Fv区，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图14描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是Fv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分替换全长抗体的Fv区， 替换部分的VH和VL互换，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图15描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是Fv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分替换全长抗体的Fv区，替换部分的CH1和CL互换，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的N端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图16描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是Fv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分替换全长抗体的Fv区，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图17描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是Fv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分替换全长抗体的Fv区，替换部分的VH和VL互换，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图18描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是Fv，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分替换全长抗体的Fv区，替换部分的CH1和CL互换，第三抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图19描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图 中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的两条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体的一侧Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图20描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体另一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图21描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体同一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图22描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体的一侧Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图23描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体另一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图24描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单 域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)或scFv或抗原受体，图中以第三抗原结合部分是单域抗体(VHH)为示例，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体同一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图25描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是scFv，第二抗原结合部分与全长抗体的两条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体的一侧Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图26描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是scFv，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体的另一侧Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图27描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是scFv，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体与第二抗原结合部分融合一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图28描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是scFv，第二抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体的一侧Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图29描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是scFv，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体的另一侧Fab区，多特异 性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图30描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是scFv，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体与第二抗原结合部分融合一侧的Fab区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图31描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是Fv，第二抗原结合部分与全长抗体的两条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体的一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图32描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是Fv，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体的另一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图33描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是Fv，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的N端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体的同一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图34描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是Fv，第二抗原结合部分与全长抗体的两条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体的一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图35描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单 域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是Fv，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体的另一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图36描述示例性多特异性抗原结合蛋白，能够特异性识别第一抗原的全长抗体与第二抗原结合部分、第三抗原结合部分融合，所述第二抗原结合部分是单域抗体(VHH)，第三抗原结合部分是Fv，第二抗原结合部分与全长抗体的一条重链的C端融合，第三抗原结合部分替换全长抗体的同一侧Fv区，多特异性抗原结合蛋白的第一Fc区为knob-Fc，第二Fc区为hole-Fc。
图37为构建抗体CNVR-A、CNVR-B对NKP30蛋白结合活性。
图38为构建抗体CNVR-C对NKP30蛋白结合活性。
图39为构建抗体CNVR-A、CNVR-B、CNVR-C对VEGFA蛋白结合活性。
图40为流式细胞术检测Claudin18.2抗体对PANC-1-Claudin18.2细胞的结合。
图41为流式细胞术检测NC组对PANC-1-Claudin18.2细胞的结合。
图42为流式细胞术检测NKP30单抗对PANC-1-Claudin18.2细胞的结合。
图43为流式细胞术检测IgG1同型对照对PANC-1-Claudin18.2细胞的结合。
图44为流式细胞术检测构建抗体CNV-C1对PANC-1-Claudin18.2细胞的结合。
图45为流式细胞术检测构建抗体CNVR-A对PANC-1-Claudin18.2细胞的结合。
图46为流式细胞术检测构建抗体CNVR-B对PANC-1-Claudin18.2细胞的结合。
图47为流式细胞术检测构建抗体CNVR-C对PANC-1-Claudin18.2细胞的结合。
图48为构建抗体介导NK细胞对PANC-1-claudin18.2细胞的特异性杀伤。
具体实施方式
以下结合附图对本发明技术方案进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本申请的范围并不受这些实施方式的限定，乃以申请专利的范围为准。
实施例1：核苷酸序列的获得与优化
针对Claudin18.2、NKP30靶点、VEGF，根据图1-6的6种结构分别构建三功能抗体，本实施例构建的三功能抗体中，第一抗原结合部分靶向Claudin18.2；第二抗原结合部分靶向NKP30，采用VHH形式；第三抗原结合部分靶向VEGF，采用VEGF受体或scFv形式。其中靶向VEGF的抗原结合片段若为VEGF受体，则为VEGF受体VEGFR1，依次命名为CNVR-A至CNVR-F；靶向VEGF的形式若为scFv形式，依次命名为CNV-A至CNV-F，其中scFv中VH与VL序列从抗体N端至C端的顺序为VH-VL，依次命名为CNV-A1至CNV-F1，若为VL-VH顺序，则依次命名为CNV-A2至CNV-F2。
抗体的轻链和重链氨基酸序列信息参见表1，VEGFR1或VEGF scFv通过前接接头融合至两条重链的C末端(即CH3后)，NKP30为纳米人源化抗体，后接接头融合至相应位置。根据需要，调整所述抗体氨基酸序列的Fc为其他IgG类型，如IgG1等，并进一步在各重链中设计所需形式的氨基酸突变，由此得到目标抗体的氨基酸序列，使用的序列及构建的抗体氨基酸序列组合见表1和表2。
表1序列
表2构建抗体的序列组合
将上述各目标氨基酸序列转化为核苷酸序列，并针对可能影响抗体在哺乳动物细胞中表达的一系列参数：密码子偏好性、GC含量(即DNA的4种碱基中鸟嘌呤G和胞嘧啶C所占的比率)、CpG岛(即CpG双核苷酸在基因组中密度较高的区域)、mRNA的二级结构、拼接位点、前成熟PolyA位点、内部Chi位点(基因组中一段短的DNA片段，在该位点附近发生同源重组的几率增加)或者核糖体结合位点、RNA不稳定序列、反向重复序列及可能干扰克隆的限制性酶切位点等进行优化；同时增加了可能会提高翻译效率的相关序列，例如Kozak序列、SD序列。设计得到分别编码上述抗体的重链基因和轻链基因，另外在重链和轻链的5’端分别设计根据氨基酸序列优化而得的编码信号肽的核苷酸序列；此外，还对轻链和重链核苷酸序列的3’端分别加上终止密码子。
实施例2：基因合成与表达载体的构建
采用pcDNA3.1-G418载体作为表达所述多功能抗体的质粒载体。pcDNA3.1-G418载体含有启动子CMVPromoter、真核筛选标记G418标签和原核筛选标签Ampicilline。基因合成得到构建抗体表达轻链和重链的核苷酸序列，用HindIII和XhoI对载体和目的片段进行双酶切，回收后通过DNA连接酶进行酶连，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑选出阳性克隆并进行质粒提取和酶切验证，获得含所述抗体质粒。
实施例3：质粒抽提
将含有上述各目的基因的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，将转化细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上培养，挑选质粒克隆至液体LB培养基中培养，260rpm摇菌14小时，由无内毒素质粒大抽试剂盒抽提质粒，用无菌水溶解并用核酸蛋白定量仪进行浓度测定。
实施例4：质粒转染、瞬转表达与抗体纯化
在37℃、8％CO 2、100rpm下培养ExpiCHO至细胞密度6×10 6个/ml。使用脂质体将构建的质粒按照组合配对转染到上述细胞中，转染质粒浓度为1mg/ml，脂质体体积参照ExpiCHO TM Expression System试剂盒确定，在32℃、5％CO 2，100rpm下培养7-10天。转染18-22h之后和第5天之间分别补料一次。4000g离心上述培养产物，0.22μm滤膜过滤并收集培养基上清液，检测上清中抗体表达量，结果见表3。而后采用Protein A、离子柱纯化所得的抗体蛋白并收集洗脱液。
Protein A、离子柱纯化的具体操作步骤为：细胞培养液经过高速离心后取上清，利用GE的Protein A层析柱进行亲和层析。层析使用平衡缓冲液为1×PBS(pH7.4)，细胞上清上样结合后利用PBS洗涤至紫外线回到基线，然后利用洗脱缓冲液0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱目的蛋白，利用Tris调节pH至中性保存。将亲和层析所得产物调节pH至低于或者高于pI 1-2个pH单位，适当稀释以控制样本电导在5ms/cm以下。利用合适的对应pH缓冲液如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等条件，利用本领域内常规的离子交换层析方法如阴离子交换或者阳离子交换进行对应pH条件下NaCl梯度洗脱，根据SDS-PAGE选择目的蛋白所在的收集管合并保存。
然后，将纯化后所得的洗脱液超滤换液至缓冲液中。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定检测蛋白质。
经SDS-PAGE测定证明，非还原胶条件含有目的条带，还原胶下目标抗体均含有目的条带，对应于所需抗体的重链以及轻链。因此，经所述质粒转染、瞬转表达和纯化，证明得到结构正确抗体。
表3构建抗体瞬转表达量
结构名称 表达量(mg/mL)
CNVR-A 0.211
CNVR-B 0.095
CNVR-C 0.095
CNV-A1 0.061
CNV-B1 0.062
CNV-C1 0.054
CNV-A2 0.065
CNV-B2 0.053
CNV-C2 0.051
实施例5：ELISA检测抗体对NKP30的亲和力
采用pH7.4的PBS缓冲液将Human-NKP30-His稀释至0.5μg/mL，每孔100μL加入到96孔ELISA板中，4℃包被过夜。用1％BSA封闭液封闭1小时后。PBST洗板3次后，将构建抗体用0.5％BSA样品稀释液稀释至10μg/ml，以此为起始浓度，进行3倍梯度稀释，共11个梯度，并设阴性对照(空白孔与IgG1同型对照)与阳性对照，阳性对照为NKP30人源化抗体(序列见SEQ ID No.32)，每孔100μL，37℃孵育1h。再用PBST洗板3次，将HRP标记的山羊抗人IgG-Fc用样品稀释液按1:20000稀释，每孔加入100μL，室温孵育1小时。PBST洗板4次后，每孔加入100μL TMB底物，室温避光孵育10分钟，每孔加入100μL1M HCl液终止显色反应。在多功能酶标仪上选择波长450nm，参比波长570nm测定96孔板中各孔的吸光值，每孔吸光值(OD)＝OD 450nm-OD 570nm。将构建抗体的浓度取对数后作为横坐标，测得的每孔吸光值为纵坐标，选用Sigmoidaldose-response(Variable Slope)方式(GraphPad Prism软件，GraphPad Software，San Diego，California)进行非线性回归，得到目标抗体与NKP30蛋白的结合曲线。
构建抗体分子的ELISA结果如图37-38所示，所述多功能抗体各结构在各浓度下均可与NKP30结合，CNVR-A、CNVR-B与阳性对照相比，与NKP30蛋白的结合活性无明显差异。
实施例6：ELISA检测抗体VEGFR1端对VEGFA的亲和力
采用pH7.4的PBS缓冲液将人VEGFA-his蛋白(Acro，Cat:VE5-H5248)稀释至1μg/mL，每孔100μL加入到96孔ELISA板中，4℃包被过夜。用1％BSA封闭液封闭1小时。PBST洗板3次，将构建的表达抗体用0.5％BSA样品稀释液稀释至20μg/ml，以此为起始浓度，进行3倍梯度稀释，共11个梯度，并设阴性对照(空白孔与IgG1同型对照)，每孔100μL，37℃孵育1h。再用PBST洗板3次，将HRP标记的山羊抗人IgG Fc用样品稀释液按1:20000稀释，每孔加入100μL，室温孵育1小时。PBST洗板4次后，每孔加入100μL TMB底物，室温避光孵育10分钟，每孔加入100μL 1M HCl液终止显色反应。在多功能酶标仪上选择波长450nm，参比波长570nm测定96孔板中各孔的吸光值，每孔吸光值(OD)＝OD 450nm-OD 570nm。将构建抗体的浓度取对数后作为横坐标，测得的每孔吸光值为纵坐标，选用Sigmoidaldose-response(Variable Slope)方式(GraphPad Prism软件，GraphPad Software，San Diego，California)进行非线性回归，得到目标抗体与VEGFA蛋白的结合曲线。
构建抗体分子的ELISA结果分别如图39所示，所述3种多功能抗体在各浓度下均可与VEGFA结合，而阴参不结合。总体而言，各构建抗体均展现出与VEGFA蛋白的结合活性。
实施例7：流式细胞术检测构建抗体与PANC-1-Claudin18.2细胞的结合
PANC-1-Claudin18.2为人工构建的Claudin18.2过表达PANC-1工程细胞株，经过Claudin18.2单抗(由SEQ ID No.22、SEQ ID No.33组成)的验证表达，见图40。取细胞状态良好并处于对数期生长的PANC-1-Claudin18.2细胞悬液，800g室温离心3分钟，去掉上清，使用PBS洗涤细胞2次后，PBS重悬细胞至2×10 5/ml，按照1ml/离心管分成若干份。加入100ul使用PBS稀释至10ug/ml的构建抗体，即检测第一抗体(一抗)，并设空白对照组Blank(无一抗与荧光二抗)，阴性对照组NC(无一抗)，同型对照组(IgG1)，阴性对照组为NKP30单抗(序列见SEQ ID No.32)，充分混匀后，室温孵育半小时。800g室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次。取100ul重悬细胞，加入0.2uL PE标记的PE anti-human IgG Fc(Biolegend Cat:398004)荧光二抗，充分混匀后，室温避光孵育30min；800g室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；使用100uLPBS重悬细胞，进行流式分析。
结果如图41-43所示，IgG1、NKP30单抗、NC组与空白对照组对比，与PANC-1-claudin18.2细胞均无结合，而各构建抗体(如图44-47)与PANC-1-claudin18.2细胞均有较好结合。
实施例8：构建抗体介导的PANC-1-Claudin18.2细胞杀伤实验
选择构建抗体CNVR-A、CNVR-B、CNVR-C，检测其对PANC-1-Claudin18.2肿瘤细胞的特异性杀伤实验。使用形态正常、处于对数期的PANC-1-Claudin18.2细胞，胰酶消化后使用完全培养基中和，1000rpm室温离心4min并使用RPMI1640基础培养基(含5％FBS)重悬后，以2×10 4/孔、50uL/孔铺于96孔板；使用RPMI 1640基础培养基(含5％FBS)稀释构建的抗体至50nM，然后5倍梯 度稀释，共8个浓度梯度，100ul/孔，设置3重复；重悬NK细胞，以6×10 4/孔、50uL/孔加入对应孔中，使效靶比为3:1，同时设置靶细胞最大裂解孔(M)、靶细胞自发释放孔(ST)、效应细胞自发释放孔(SE)、总体积校正空白孔(BV)和培养基空白对照孔(BM)。静置10min后，1000rpm室温离心4min，于5％CO 2、37℃二氧化碳细胞培养箱中孵育4h。提前45min在M、B-V孔加入裂解液，混匀，孵育结束后1000rpm室温离心4min。吸取50uL上清至LDH分析板，再加入50ul/孔分析缓冲液(assay buffer)溶解的底物，室温避光反应30min。而后加入50uL/孔终止液，静置10min后于490nm进行读数(Cyto Tox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay，Cat：G1780)。计算细胞裂解率，公式为OD(样品孔，ST，SE)-OD(B-M)、OD(M)-OD(B-V)、细胞裂解率％＝OD(样品孔-ST-SE)×100/OD(M-ST)，利用GraphPad Prism软件绘制细胞裂解率％与浓度拟合数据图。
由图48可以看出，构建抗体组的PANC-1-claudin18.2细胞裂解死亡，而无关抗体组无明显抗肿瘤活性，NKP30单抗同样不具有抗肿瘤活性，说明构建抗体介导NK细胞特异性杀伤Claudin18.2阳性的PANC-1-claudin18.2靶细胞。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (61)

  1. 一种多特异性抗原结合蛋白，其特征在于包含：
    (a)第一抗原结合部分，能够特异性识别第一抗原，其中第一抗原是特异性靶向与肿瘤发生或发展有关的抗原；
    (b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分是先天性免疫细胞激动剂；
    (c)第三抗原结合部分，能够特异性识别第三抗原，其中第三抗原通过调节正常和异常血管生成进而调节肿瘤微环境；
    所述第二抗原结合部分和第三抗原结合部分的位置可以互换。
  2. 根据权利要求1所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述特异性靶向与肿瘤发生或发展有关的抗原为肿瘤相关抗原(TAA)和/或肿瘤特异性抗原(TSA)。
  3. 根据权利要求1所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述先天性免疫细胞激动剂是NK细胞激动剂和/或γδT细胞激动剂。
  4. 根据权利要求3所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分能够特异性识别在先天性免疫细胞上表达的第二抗原，第二抗原结合部分与第二抗原结合后可以激活先天性免疫细胞。
  5. 根据权利要求1或3所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第三抗原是促血管生成因子。
  6. 根据权利要求1-5任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分是由两条重链和两条轻链组成的全长抗体。
  7. 根据权利要求1-5任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分是包含重链可变域(VH)和/或轻链可变域(VL)的抗体片段。
  8. 根据权利要求1或7所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分是Fab、scFab、F(ab')2、Fv、dsFv、scFv、VH或VL结构域。
  9. 根据权利要求1-5任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分是单域抗体 (VHH)。
  10. 根据权利要求1-5任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分是抗原的受体。
  11. 根据权利要求1-10任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端和/或C端。
  12. 根据权利要求11所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条重链的C端。
  13. 根据权利要求11所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条重链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条重链的N端。
  14. 根据权利要求11-13任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条重链的N端和/或C端。
  15. 根据权利要求11-14任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的至少一条轻链的N端和/或C端。
  16. 根据权利要求1-10任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端和/或C端。
  17. 根据权利要求16所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条轻链的C端。
  18. 根据权利要求16所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的一条轻链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的同一条轻链的N端。
  19. 根据权利要求16-18任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的另一条轻链的N端和/或C端。
  20. 根据权利要求16-19任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的至少一条重链的N端和/或C端。
  21. 根据权利要求1-10任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端和/或C端。
  22. 根据权利要求21所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端。
  23. 根据权利要求21所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条重链的N端。
  24. 根据权利要求21-23任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的至少一条轻链的N端和/或C端。
  25. 根据权利要求1-10任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端和/或C端。
  26. 根据权利要求25所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端。
  27. 根据权利要求25所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的C端，第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的两条轻链的N端。
  28. 根据权利要求25-27任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第三抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的至少一条重链的N端和/或C端。
  29. 根据权利要求1-10任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第三抗原结合部分替换第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的Fab区或Fv区或VH、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域中的一个或多个结合单元。
  30. 根据权利要求1-10任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第三抗原结合部分位于第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分的VH、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域中任意结构域之间。
  31. 根据权利要求29或30所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的至少一条轻链。
  32. 根据权利要求31所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的至少一条轻链的N端。
  33. 根据权利要求31或32所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第 二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的至少一条轻链的C端。
  34. 根据权利要求30-33任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的至少一条重链。
  35. 根据权利要求34所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的至少一条重链的N端。
  36. 根据权利要求34或35所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分融合到第一抗原结合部分的至少一条重链的C端。
  37. 根据权利要求1-36任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述多特异性抗原结合蛋白包含第一Fc区和第二Fc区。
  38. 根据权利要求37所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一Fc区和第二Fc区是相同的Fc或不同的Fc。
  39. 根据权利要求38所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一Fc区为knob-Fc，所述第二Fc区为hole-Fc。
  40. 根据权利要求38所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一Fc区为hole-Fc，所述第二Fc区为knob-Fc。
  41. 根据权利要求1-40任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的VH和VL互换。
  42. 根据权利要求1-41任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的CL和CH1互换。
  43. 根据权利要求1-41任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一Fc区的CH3被CL或CH1替换，第二Fc区的CH3被CL或CH1替换。
  44. 根据权利要求1-43任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的重链和/或Fc片段包含一处或多处氨基酸替换，所述替换在所述重链和Fc片段之间形成离子键。
  45. 根据权利要求1-44任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合部分和第三抗原结合部分通过连接子与所述第一抗原结合部分融 合。
  46. 根据权利要求45所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述连接子为肽连接子。
  47. 根据权利要求46所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述肽连接子为GS连接子或突变人类IgG铰链。
  48. 根据权利要求1-47任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述特异性靶向与肿瘤发生或发展有关的抗原选自GPC3、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CD133、CD138、CDK4、CEA、Claudin6、Claudin18.2、CCR8、AFP、ALK、B7H3、BAGE蛋白质、BCMA、BIRC5(存活素)、BIRC7、β-连环蛋白(β-catenin)、brc-ab1、BRCA1、BORIS、CA9、CA125、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、NA17、NKG2D、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白质、周期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白、GD2、GD3、GloboH、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IL13Rα2、LMP2、κ-Light、LeY、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-12、MART-1、间皮素、ML-IAP、MOv-γ、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16、MUM1、Ras、RGS5、Rho、ROR1、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TNFR2、TMPRSS2、汤-诺氏抗原、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和尿溶蛋白-3、5T4、乙肝表面抗原(HBSAG)、组织多肽抗原(TPA)、糖类抗原153(CA153)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原724(CA724)、糖类抗原242(CA242)、糖类抗原50(CA50)、CYFRA21-1(Cy211)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、前列腺特异性抗原(PSA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲状腺球蛋白(TG)、铁蛋白(SF)、β2-微球蛋白(β2-MG)、鳞状细胞抗原(SCC)。
  49. 根据权利要求1-48任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第二抗原选自NKP30、NKP46、CD16、NKP44、CD244、CD226、NKG2E、NKG2D、NKG2C、KIR。
  50. 根据权利要求1-48任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述 第二抗原选自Vδ1T、Vδ2T、Vδ3T、γδTreg、γδT17、IFN-γ +γδT。
  51. 根据权利要求1-50任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第三抗原选自EGF、FGF、FGF-α、FGF-β、VEGF、VEGFR、HDGF、HGF、HGFK1、NRP-1、ANG、Ang1、Ang2、PDGF、PDGFR、PIGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β受体、CD31、CD105、MCP-1、COX-2、AC133、Id2/Id3、IL-1α、IL-6、IL-1β、IL-8、CXCL5、、MMP、THBS、AREG、ET-1、AAMP、AGGF1、AMOT、ANGLPTL3、ANGPTL4、BTG1、NOS3、TNFSF12、VASH2、整联蛋白α vβ 3、α 5β 1、VE-钙黏蛋白、瘦蛋白、肝配蛋白、纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制因子-1。
  52. 根据权利要求9-51任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的Fab、scFab、F(ab')2、Fv、dsFv、scFv、VH或VL结构域为嵌合抗体、全人抗体或人源化抗体。
  53. 根据权利要求9-52任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分和/或第三抗原结合部分的单域抗体(VHH)为骆驼抗体、鲨鱼抗体或人源化单域抗体。
  54. 根据权利要求1-53任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述全长抗体包含选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合的Fc片段。
  55. 根据权利要求54所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述Fc片段选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其组合。
  56. 根据权利要求54或55所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述Fc片段是人类Fc片段。
  57. 根据权利要求54-56任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述全长抗体与具有人IgG野生型Fc片段的相应抗体相比，具有增强的FcγR结合亲和力。
  58. 根据权利要求54-56任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述全长抗体与具有人IgG野生型Fc片段的相应抗体相比，具有降低的FcγR结合亲和力。
  59. 一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-58中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。
  60. 权利要求1-58任一项所述的多特异性抗原结合蛋白或权利要求59所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
  61. 根据权利要求60所述的用途，其中所述癌症是鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、头颈癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、中枢神经系统癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌、皮肤癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宫颈癌、脑癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、咽喉癌、肝胆癌。
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