CN117999076A - 一类1, 4-二氢-萘啶衍生物在治疗肿瘤中的应用 - Google Patents

一类1, 4-二氢-萘啶衍生物在治疗肿瘤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一类1,4‑二氢‑萘啶衍生物在治疗肿瘤中的应用。

Description

一类1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗肿瘤中的应用
本申请要求于2021年12月24日提交中国专利局、申请号为202111599362.3、发明名称为“一类1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗肿瘤中的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于制药领域，涉及1,4-二氢-萘啶衍生物的新用途，更具体的说涉及1,4-二氢-萘啶衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤为实体瘤，包括神经系统肿瘤和非神经系统肿瘤。所述神经系统肿瘤包括胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤等，所述非神经系统肿瘤包括肝癌、结肠癌、胃癌等。
背景技术
胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是最常见的恶性原发性颅内肿瘤，约占所有胶质瘤的57％，占所有原发性中枢神经系统(central nervous system，CNS)恶性肿瘤的48％(Neuro-oncology,2018.20:p.iv1-iv86)。胶质母细胞瘤致死率极高，在美国，2000-2014年间胶质母细胞瘤患者的1年存活率为41.4％，5年的存活率仅为5.8％(CA:a cancer journal for clinicians,2020.70(4):p.299-312)。现在对于胶质母细胞瘤的病因还知之甚少，目前已知的唯一可能的致病因素为电离辐射。这也为胶质母细胞瘤的预防和治疗带来一定的挑战。
根据恶性程度，可分为Ⅰ～Ⅳ级，其中Ⅰ、Ⅱ是恶行程度较低的胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ为恶性程度较高的胶质瘤。胶质母细胞瘤的治疗方式主要包括手术切除、放疗、系统治疗(化疗、靶向治疗)，其中手术后替莫唑胺同步放疗联合辅助化疗已成为新诊断胶质母细胞瘤的标准治疗方案。当前主要的化疗药物除替莫唑胺外，有亚硝脲类、丙卡巴肼、铂类、长春碱类以及喜树碱类等。但常规的化疗药物的抗肿瘤作用机制还满足不了现如今的临床需求。
在真核细胞中，巨胞饮是细胞内化胞外物质以及溶解分子的重要途径。巨胞饮过程对于肿瘤细胞有着双重作用。在营养缺乏的情况下，肿瘤细胞可通过巨胞饮途径内化胞外营养物质，从而促进肿瘤细胞生长；但通过药物处理或RAS基因的异常表达过度激活巨胞饮过程却能诱导一种新的死亡方式：巨泡式死亡(Methuosis)。巨泡式死亡是一种新的不依赖于蛋白酶体的细胞死亡形式，其特点主要是细胞质内充满巨胞饮小体派生的大量空泡。最早这种死亡方式在胶质母细胞瘤细胞中被发现(Oncogene,1999.18(13):p.2281-90)。进一步研究发现，这种死亡方式是由不依赖于网格蛋白的巨胞饮体变化促发，最终形成大量空泡，引起细胞破裂死亡(Journal of medicinal chemistry,2012.55(5):p.1940-56)。现如今 研究发现在巨胞饮体的形成过程中，有多种分子参与，其中包括Ras、Rac1、Arf6、Rab7等(The American journal of pathology,2014.184(6):p.1630-42)。Rac1可通过调节肌动蛋白的装配进而影响巨胞饮体的形成，另外，Rac1的激活可通过GIT-1的介导而使激活的Arf6减少，进而阻碍巨胞饮体的循环(Molecular cancer research:MCR,2010.8(10):p.1358-74)。近年来也发现陆续了一些小分子化合物通过激活MKK4、JNK和Rac1等机制，诱导细胞发生巨泡式死亡，包括methamphetamine、indolyl chalcone、vaquinnol-1、MOMIPP、CX-5011等(Oncotarget 2016,7,55863-55889；BMC cancer 2019,19,77；BBA-Molecular Cell Research 2020,118807)。
1,4-二氢-萘啶衍生物是一种既能抑制乙酰胆碱酯酶活性，又能阻滞细胞外钙离子通过钙通道流入细胞的化合物。通过其抑制胆碱酯酶的活性，可延缓乙酰胆碱的水解速度，提高突触间隙乙酰胆碱水平，达到治疗阿尔茨海默症以及血管痴呆的作用(专利号CN104203945B和CN106632317A)。另外，通过抑制钙离子内流，可提高神经细胞对缺血的耐受性，扩张脑血管和改善脑供血，保护神经元，有效改善血管性痴呆患者的认知功能。
发明内容
1,4-二氢-萘啶衍生物是一种既能抑制乙酰胆碱酯酶活性，又能阻滞细胞外钙离子通过钙通道流入细胞的化合物，可用于治疗阿尔茨海默症及血管性痴呆。该类化合物可通过一种不依赖于抑制胆碱酯酶及阻滞钙通道的新作用机制诱导肿瘤细胞发生巨泡式死亡，从而发挥抗肿瘤的作用。
本发明的目的是提供一种通过新机制治疗肿瘤并能有效延长患者生存期的药物，所述药物为1,4-二氢-萘啶衍生物或其药学上可接受的盐。
具体的，本发明提供了一类如式I所示1,4-二氢-萘啶衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用，
其中，R1或R2为氢、卤素或C1-C6烷基；
R3选自C1-C6烷基，所述烷基中任意-CH2-可被一个或两个以上的-O-置换；
R4为氢、卤素。
具体的，所述化合物选自：
化合物1：如S1所示；
化合物2：如S2所示；
化合物3:如S3所示；
化合物4：如S4所示；
化合物5：如S5所示；
化合物6：如S6所示。
上述药物，以诱导肿瘤细胞发生巨泡式死亡，出现空泡化细胞表型，并抑制肿瘤细胞增殖，发挥抑制肿瘤生长的作用，最终达到治疗肿瘤的目的。
因此，本发明提供1,4-二氢-萘啶衍生物或其药学上可接受的盐及其药物组合物在制备抗肿瘤药物中的新用途。
所述肿瘤为实体瘤，包括神经系统肿瘤和非神经系统肿瘤。所述神经系统肿瘤包括胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤等，所述非神经系统肿瘤包括肝癌、结肠癌、胃癌等。
具体的，本发明提供了1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗实体瘤中的应用。
本发明提供了1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗神经系统肿瘤中应用。
本发明提供了1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗脑瘤中的应用。
本发明提供了1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗神经胶质瘤中的应用。
本发明提供了1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗胶质母细胞瘤的应用。
本发明提供了1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗肝癌、结肠癌和胃癌中的应用。
本发明提供了1,4-二氢-萘啶衍生物与替莫唑胺联合治疗神经胶质瘤中的应用。
本发明提供了1,4-二氢-萘啶衍生物与放疗联合治疗神经胶质瘤中的应用。
本发明的优点和积极效果：
本发明提供的作为肿瘤治疗的新型药物，即1,4-二氢-萘啶衍生物是一种通过特异性诱导肿瘤细胞发生巨泡式死亡的药物，对正常细胞影响较小，有利于开发既安全又有效的治疗肿瘤的药物。
附图说明
图1 1,4-二氢-萘啶衍生物诱导T98细胞发生空泡化表型；
图2 S2诱导多种肿瘤细胞发生空泡化；
图3钙通道抑制剂不诱导肿瘤细胞空泡化；
图4胆碱酯酶抑制剂不诱导肿瘤细胞空泡化；
图5钙通道抑制剂联合胆碱酯酶抑制剂不诱导肿瘤细胞空泡化；
图6 S2给药2周对裸鼠脑内U87MG胶质瘤生长曲线的影响；
图7 S2给药2周抑制裸鼠脑内U87MG胶质瘤生长；
图8 S2延长脑原位移植胶质瘤裸鼠的生存期；
图9 S2+TMZ联合用药2周对裸鼠脑内U87MG胶质瘤生长曲线的影响；
图10 S2+TMZ联合用药2周对脑内胶质瘤生长的影响；
图11 S2+TMZ联合用药延长U87MG脑原位癌小鼠存活；
图12 TMZ不能抑制T98胶质瘤生长，不能减少实体瘤体积和重量；
图13 S2抑制T98胶质瘤生长，减少实体瘤体积和重量。
具体实施方式
下述实施例举例说明本发明，不应被认为是对本发明的限制。
实施例1 1,4-二氢-萘啶衍生物对胶质母细胞瘤细胞空泡化诱导作用及增殖抑制作用研究
1材料和方法
1.1细胞
人神经胶质瘤细胞系T98G细胞来购自于南京科佰生物科技有限公司。
1.2 1,4-二氢-萘啶衍生物编号及结构
1.3化合物溶液配制
称取一定量待测化合物，用DMSO溶解，制成终浓度为100mM的均一溶液。
1.4试剂与耗材
1.5细胞培养及细胞表型观察
T98G细胞稳定传代两次，待细胞密度达85％以上，用0.05％trypsin-EDTA消化3分钟，培养基重悬细胞，以一定密度接种于12孔板中，每孔体系为1mL；培养24小时，按照分组情况分别每孔加入上述配制的化合物溶液，使培养体系中化合物浓度分别为：5μM、10μM、20μM、40μM、60μM。加入等体积的DMSO作为对照孔。
加药处理6小时后，显微镜20×物镜下观察，每孔随机选取五个视野拍照记录。若所观察视野中，细胞内出现边界清晰、明亮的空泡，并且至少符合下列条件中任意一条：1)至少含有1个直径大于3μm的空泡；2)含有3个以上直径大小在0.5～3μm范围内的空泡；则认定为巨泡式死亡阳性细胞。
空泡化率R(％)＝CELL 阳性/(CELL 正常+CELL 阳性)×100％
其中，CELL 阳性：巨泡式死亡阳性细胞数量；CELL 正常：正常形态细胞数量
1.6细胞增殖抑制检测
T98G细胞稳定传代两次，待细胞密度达到85％以上，用0.05％trypsin-EDTA消化3分钟，重悬细胞，以相应密度接种于96孔板中，培养24小时,按照培养体系终浓度0.41μM、1.23μM、3.7μM、11.1μM、33.3μM、100μM加药处理72小时后，采用CellCounting-Lite TM 2.0试剂盒检测细胞活力。按照CellCounting-Lite TM 2.0试剂盒说明书加入100μL/孔试剂，震荡10分钟，在多功能读板仪上读取化学发光值(LUM)，计算细胞相对活力。
肿瘤细胞相对活力V(％)＝(LUM-LUM 本底)/(LUM 正常对照组-LUM 本底组)×100％。LUM 本底为该检测试剂加入到完全培养基孔本底读数。采用GraphPad Prism 8.0.1统计软件推算半抑制浓度(IC 50)。
2实验结果
2.1 1,4-二氢-萘啶衍生物诱导T98G细胞发生空泡化
S1、S2(包括(+)-S2和(-)-S2)、S3、S4、S5和S6能够诱导T98发生空泡化(图1和表1)，其中S1诱导空泡化的活性最弱，S2诱导空泡化的活性最强。
表1 1,4-二氢-萘啶衍生物诱导T98G细胞发生空泡化定量分析
表中数据平均值±SD；“-”表示化合物有沉淀析出，数据未计算。
2.2 1,4-二氢-萘啶衍生物抑制T98G细胞增殖
1,4-二氢-萘啶衍生物能够抑制神经肿瘤细胞T98G增殖，肿瘤增殖抑制活性IC 50见(表2)。其中S1增殖抑制活性较弱，与诱导空泡化活性基本一致。
表2化合物对T98G细胞增殖抑制活性
实施例2 S2体外抑制肿瘤细胞增殖活性的研究
1材料和方法
1.1细胞
人脑胶质瘤细胞系U87MG，人脑胶质瘤细胞系T98G和人脑胶质瘤细胞系U251，购自于南京科佰生物科技有限公司；人脑胶质瘤细胞系A172，人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH，人肝癌细胞系HepG2，小鼠结肠癌细胞系CT26.WT和仓鼠卵巢细胞亚株CHO-K1购自于武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.2试剂和耗材
1.3给药溶液的配制
精密称取S2粉末，用DMSO溶解，制备成浓度为100mM的均一溶液，作为母液。
1.4细胞培养及细胞表型观察
U87MG，T98G，U251，SK-N-SH，A-172和HepG2等细胞贴壁培养于MEM+10％FBS+1％P/S，按照1:3传代；CT26.WT贴壁培养于RPMI-1640+10％FBS+1％P/S培养基中，按照1:3传代；CHO-K1贴壁培养于Ham's F-12K+10％FBS+1％P/S培养基中，按照1:3传代。
上述所用细胞复苏后稳定传代两次，待细胞密度达85％以上，用0.05％trypsin-EDTA消化3分钟，培养基重悬细胞，以一定密度接种于6孔板中，每孔体系为2mL；培养24小时，按照分组情况分别每孔加入上述配制的S2溶液2μL(DMSO终浓度0.1％)，使细胞培养体系内的S2浓度达到30μM。
加药处理6小时后，显微镜20×物镜下观察，每孔随机选取五个视野拍照记录。若所观察视野中，细胞内出现边界清晰、明亮的空泡，并且至少符合下列条件中任意一条：1)至少含有一个直径大于3μm的空泡；2)含有三个以上直径大小在0.5～3μm范围内的空泡；则认定为巨泡式死亡阳性细胞(Journal of Medicinal Chemistry 2018 61(12),5424-5434)。
空泡化率R(％)＝CELL 阳性/(CELL 正常+CELL 阳性)×100％
其中，CELL 阳性：巨泡式死亡阳性细胞数量；CELL 正常：正常形态细胞数量
1.5细胞活力检测
按上述各类细胞复苏稳定传代两次，待细胞密度达85％以上，用0.05％trypsin-EDTA消化三分钟，重悬细胞，以相应密度接种于96孔板中，培养24小时,按照培养体系终浓度0.41μM、1.23μM、3.7μM、11.1μM、33.3μM、100μM加药处理48小时后，采用Cell Counting-Lite TM 2.0试剂盒检测细胞活力。按照Cell Counting-Lite TM 2.0试剂盒说明书加入100μL/孔试剂，震荡10min，在多功能读板仪上读取化学发光值(LUM)，计算细胞相对活力。
肿瘤细胞相对活力V(％)＝(LUM-LUM 本底)/(LUM 正常对照组-LUM 本底组)×100％。LUM 本底为该检测试剂加入到完全培养基孔本底读数。采用GraphPad Prism 8.0.1统计软件推算半抑制浓度(IC 50)。
2实验结果
2.1 S2诱导肿瘤细胞空泡化
S2能够诱导人胶质瘤细胞系U87MG、T98G、U251和A172，人神经母瘤细胞系SK-N-SH等神经肿瘤细胞发生空泡化(图2A-D)，同时也能诱导非神经系统肿瘤细胞发生空泡化(图2A-D)，包括人肝癌细胞HepG2和小鼠结肠癌细胞CT26.WT；但是不会诱导非肿瘤细胞系仓鼠卵巢细胞CHO-K1发生空泡化。
2.2 S2抑制肿瘤细胞增殖
S2能够抑制神经肿瘤细胞和非神经肿瘤系统增殖，IC 50范围4.7～14.3μM，但对非肿瘤细胞系增殖抑制作用很弱(IC 50＞100μM)(表3)。
表3 S2对肿瘤细胞的增殖抑制作用
肿瘤细胞 IC 50(μM)
U87MG 11.7μM
T98G 9.4μM
U251 14.3μM
SK-N-SH 11.4μM
A172 4.7μM
HepG2 10.1μM
CT26.WT 7.1μM
CHO-K1 ～100μM
实施例3 AChE抑制剂和VGCC阻断剂对T98细胞空泡化表型的影响
1材料和方法
1.1细胞
人脑胶质瘤细胞系T98G购自于南京科佰生物科技有限公司
1.2试剂和耗材
1.3给药溶液的配制
待测药品包括：硝苯地平、维拉帕米、地尔硫卓、氟桂利嗪和多奈哌齐。
精密称取上述待测药品，用DMSO溶解，分别制备成浓度为20mM的均一溶液，作为母液。
1.4细胞培养及细胞表型观察
T98G细胞稳定传代两次，待细胞密度达85％以上，用0.05％trypsin-EDTA消化3分钟，培养基重悬细胞，以一定密度接种于12孔板中，每孔体系为1mL；培养24小时，按照分组情况分别每孔加入上述配制的化合物溶液，使培养体系中化合物浓度分别为：0.1μM、1μM、5μM、20μM。加入等体积的DMSO作为对照孔。
加药处理6小时后，显微镜20×物镜下观察，若所观察视野中，细胞内出现边界清晰、明亮的空泡，并且至少符合下列条件中任意一条：1)至少含有1个直径大于3μm的空泡；2)含有3个以上直径大小在0.5～3μm范围内的空泡；则认定为巨泡式死亡阳性细胞。
2实验结果
2.1钙通道抑制剂(VGCC)未能诱导肿瘤细胞空泡化
钙通道抑制剂硝苯地平、维拉帕米、地尔硫卓、氟桂利嗪(最高药物浓度20μM)均未能诱导人胶质瘤细胞系T98G出现空泡化细胞表型(图3)。
2.2胆碱酯酶(AChE)抑制剂未能诱导肿瘤细胞空泡化
胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐(最高药物浓度20μM)未能诱导人胶质瘤细胞系T98G出现空泡化细胞表型(图4)。
2.3钙通道抑制剂联合胆碱酯酶抑制剂未能诱导肿瘤细胞空泡化
钙通道抑制剂硝苯地平或维拉帕米(20μM)与胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐(20μM)联合应用均未能诱导人胶质瘤细胞系T98G出现空泡化细胞表型(图5)。
实施例4 S2在U87MG-Luc胶质母细胞瘤细胞裸鼠原位移植瘤模型上的药效研究试验
1材料和方法
1.1实验动物
BALB/c Nude裸鼠，雄性，SPF级，体重20-22g，上海灵畅生物科技有限公司。
1.2试剂和耗材
本实验中的主要试剂信息如下表：
1.3实验设备
本实验中的主要设备信息如下表：
1.4给药制剂配制
S2
溶剂：5％乙醇+0.8％Solutol+5％葡萄糖
配制方法：取适量S2，按比例加入无水乙醇超声溶解，按比例加入Solutol HS-15超声混匀(观察没有一丝一缕现象)，超声过程中缓慢加入纯化水溶解后，按比例加入葡萄糖，超声溶解即得溶液，溶液放置4℃避光保存。
1.5实验方法
1.5.1 U87MG-Luc胶质母细胞瘤细胞裸鼠原位移植瘤模型制备
U87MG-Luc细胞接种前0.05％-trypsin-EDTA消化细胞，并使用预冷的PBS重悬至4×10 7cell/mL，转移到置于冰上备用；裸鼠用异氟烷气体麻醉，而后将麻醉后动物俯卧位固定于立体定位仪上，用碘伏消毒裸鼠头皮，手术刀矢状切开裸鼠头皮，用碘伏清洁切口，暴露颅骨，延前囟前1.0mm,旁开右侧2.0mm,用颅骨钻打孔；用10μL平头微量注射器手动注射5μL细胞悬液(2×10 5个细胞),进针深度3.5mm，退针0.5mm，注射时间约10分钟。停针5分钟后，缓慢拔针，消毒缝合切口，最后肌肉注射5万单位青霉素预防感染。
1.5.2动物分组与给药
本次实验共分为5组，分别为模型组、TMZ组、S2给药组-LD(0.25mg/kg)、S2给药组-MD(0.5mg/kg)、S2给药组-HD(1mg/kg)。将造模后的动物，机率均等单盲分入各组。接种后第5天始，每天静脉给药一次，持续15天。模型组每天静脉给溶剂一次，持续15天。
1.5.3脑内肿瘤细胞活体成像
分别于接种第4、12、18、25天，腹腔注射200μL 15mg/mL D-荧光素钾盐溶液(溶液经0.22μm滤膜过滤除菌)，10分钟后利用小鼠活体成像系统(PE公司IVIS Lumina XR)进行IVI化学发光检测(明场+生物发光成像)。利用Living Image软件进行荧光强度分析，得到荧光强度[p/s]，以此数据体现肿瘤组织在实验动物脑内的大小。
1.5.4动物生存期记录
检测实验动物的生存状态，及时记录动物的死亡日期。
1.6数据统计分析
定量资料表示为均值±标准误，各药效指标采用GraphPad Prism(8.0.1)软件作图和单因素方差分析(one-way ANOVA)或双因素重复测量(two-way repeat ANOVA)再采用Fisher’s LSD test检验组间差异，和Kaplan-Meier生存分析。将P＜0.05定义为具有显著性差异。
2实验结果
2.1 S2抑制裸鼠脑内原位移植U87MG胶质瘤生长
与溶剂组相比，S2给药组-MD(0.5mg/kg，IV)和S2给药组-HD(1mg/kg,IV)均能显著抑制脑内U87MG原位肿瘤生长(图6A和B)。在给药两周后，与溶剂组相比，S2给药组-MD(0.5mg/kg，IV)和S2给药组-HD(1mg/kg，IV)表现出显著地肿瘤生长抑制作用，其中S2给药组-HD(1mg/kg，IV)肿瘤抑制作用最强(图7A和B)。
2.2 S2延长脑原位移植胶质瘤裸鼠的生存期
经生存曲线Log-rank分析，与溶剂组相比，S2给药组-MD(0.5mg/kg，IV)和S2给药组-HD(1mg/kg，IV)显著延长U87MG脑原位癌小鼠的生存率( 图8)，延长中位生存期和总体生存期(表4)。
表4 S2延长U87MG脑原位癌小鼠生存期
实施例5 S2联合替莫唑胺(TMZ)在U87MG-Luc胶质母细胞瘤细胞裸鼠原位移植瘤模型上的药效研究试验
1材料和方法
1.1实验动物
同实施例4。
1.2试剂和耗材
同实施例4。
1.3实验设备
同实施例4。
1.4给药制剂配制
a)S2
溶剂：5％乙醇+0.8％Solutol+5％葡萄糖
配制方法：取适量S2，按比例加入无水乙醇超声溶解，按比例加入Solutol HS-15超声混匀(观察没有一丝一缕现象)，超声过程中缓慢加入纯化水溶解后，按比例加入葡萄糖，超声溶解即得溶液，溶液放置4℃避光保存。
b)TMZ
溶剂：0.9％氯化钠注射液
配制方法：称取适量TMZ，按比例加入0.9％氯化钠注射液稀释，摇晃至混合均匀，溶液-20℃保存。
1.5实验方法
1.5.1 U87MG-Luc胶质母细胞瘤细胞裸鼠原位移植瘤模型制备
同实施例4。
1.5.2动物分组与给药
本次实验共分为4组，分别为模型组、TMZ(3mg/kg)组、S2+TMZ联合给药组-LD(TMZ 3mg/kg和S2 0.25mg/kg)、S2+TMZ联合给药组-MD(TMZ 3mg/kg和S2 0.5mg/kg)和S2+TMZ联合给药组-HD(TMZ 3mg/kg和S2 1mg/kg)。将造模后的动物，机率均等单盲分入各组。接种后第8天始，TMZ：第8天和第15天腹腔给药2次；S2：每天静脉给药一次，持续15天。
1.5.3脑内肿瘤细胞活体成像
分别于接种第7、14、21天，腹腔注射200μL 15mg/mL D-荧光素钾盐溶液(溶液经0.22μm滤膜过滤除菌)，10分钟后利用小鼠活体成像系统(PE公司IVIS Lumina XR)进行IVI化学发光检测(明场+生物发光成像)。利用Living Image软件进行荧光强度分析，得到荧光强度[p/s]，以此数据体现肿瘤组织在实验动物脑内的大小。
1.5.4动物生存期记录
检测实验动物的生存状态，及时记录动物的死亡日期。
1.6数据统计分析
定量资料表示为均值±标准误，各药效指标采用GraphPad Prism(8.0.1)软件作图和单因素方差分析(one-way ANOVA)或双因素重复测量(two-way repeat ANOVA)再采用Fisher’s LSD test检验组间差异，和Kaplan-Meier生存分析。将P＜0.05定义为具有显著性差异。
2实验结果
2.1 S2+TMZ联合用药对裸鼠脑内U87MG胶质瘤生长的影响
与溶剂组相比，TMZ(3mg/kg，IP)单独给药和TMZ+S2(0.25、0.5和1mg/kg IV)联合给药均能显著抑制脑内U87MG原位肿瘤生长(图9A和B)。在给药2周后(第21天)，与TMZ相比，S2+TMZ联合给药组的肿瘤生长抑制作用更强，其中S2(0.5mg/kg)+TMZ联合给药组肿瘤抑制作用显著优于TMZ组(图10A和B)。
2.2 S2+TMZ联合用药对脑原位胶质瘤裸鼠生存的影响
经生存曲线Log-rank分析，与溶剂组相比，TMZ(3mg/kg，IP)单独给药和TMZ+S2(0.25、0.5和1mg/kg IV)联合给药组小鼠的生存时间有显著性差异。与TMZ单独用药相比，S2(0.5mg/kg)+TMZ联合用药和S2(1mg/kg)+TMZ显著延长U87MG脑原位癌小鼠的生存率(图11)，延长中位生存期和总体生存期(表5)。
表5 S2+TMZ联合用药延长U87MG脑原位癌小鼠生存期
实施例6 S2对人脑胶质瘤T98G在NOD SCID小鼠皮下模型上的体内药效学研究
1方法和材料
1.1实验动物
NOD SCID，雌性，6-8周龄，体重18-21克。北京维通利华实验动物技术有限公司
1.2受试药品
替莫唑胺(TMZ)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：B1828132。
S2，江苏欧威医药有限公司，批号：D12-20161101-7。
1.3给药制剂配制
TMZ(1.5mg/mL)配制方法：称取18mg的Temozolomide,溶解于12mL的1％HPMC中。
S2给药制剂配制方法同实施例4。
1.4实验方法
1.4.1 T98G胶质母细胞瘤细胞裸鼠皮下移植瘤模型制备
人脑胶质瘤T98G细胞体外培养，培养条件为EMEM培养基中加10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃ 5％CO 2孵箱培养。待细胞数量达到要求后，收取细胞。将0.2mL(10×10 6个)T98G肿瘤细胞(PBS：基质胶＝1:1)皮下接种于每只小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到约147mm 3时开始分组给药。
1.4.2动物分组与给药
第一组实验共分为两组，分别为：溶剂组、TMZ组(15mg/kg，PO)；将造模后的动物机率均等单盲分入各组，每组10只。
第二组实验共分为两组，分别为：溶剂组、S2组(3mg/kg，IV)；将造模后的动物机率均等单盲分入各组，每组9只。
1.4.3肿瘤大小的测量
每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径，在实验结束后称量肿瘤重量并拍照。
1.5数据统计肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b 2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。
抑瘤疗效用TGI(％)的计算：TGI％＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100。
相对肿瘤增殖率T/C(％)：T/C％＝TRTV/CRTV×100(TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为RTV＝V t/V 0，其中V 0是分组给药时(即d 0)测量所得平均肿瘤体积，V t为某一次测量时的平均肿瘤体积，T RTV与C RTV取同一天数据。
统计分析基于实验结束时每组肿瘤体积的平均值和标准误(SEM)。两组间比较用T-test进行分析。用GraphPad Prism(8.0.1)进行所有数据分析，P<0.05认为有显著性差异。
2实验结果
2.1 TMZ对T98肿瘤生长和实验终点肿瘤重量的影响
与溶剂组相比，TMZ 15mg/kg组对肿瘤体积增长没有抑制作用(图12A-C)。实验终点采集肿瘤并称重，TMZ 15mg/kg组肿瘤重量与对照组无明显差异(图12D)，与上述肿瘤体积抑制情况一致。
2.2 S2对T98肿瘤生长和实验终点肿瘤重量的影响
与溶剂组相比，S2 3mg/kg组显著抑制肿瘤体积增长(图13A-C)。实验终点采集肿瘤并称重，S2 3mg/kg组肿瘤重量显著低于对照组(图13D)，与上述肿瘤体积抑制情况一致。

Claims (10)

  1. 一类如式I所示1,4-二氢-萘啶衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用，
    其中，R1或R2为氢、卤素或C1-C6烷基；
    R3选自C1-C6烷基，所述烷基中任意-CH2-可被一个或两个以上的-O-置换；
    R4为氢、卤素。
  2. 1,4-二氢-萘啶衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述化合物选自：
    化合物1：如S1所示；
    化合物2：如S2所示；
    化合物3:如S3所示；
    化合物4：如S4所示；
    化合物5：如S5所示；
    化合物6：如S6所示。
  3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗实体瘤中的应用。
  4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗神经系统肿瘤中的应用。
  5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗脑瘤中的应用。
  6. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗神经胶质瘤中的应用。
  7. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗胶质母细胞瘤的应用。
  8. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述1,4-二氢-萘啶衍生物在治疗肝癌、结肠癌和胃癌中的应用。
  9. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述1,4-二氢-萘啶衍生物与替莫唑胺联合治疗神经胶质瘤中的应用。
  10. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述1,4-二氢-萘啶衍生物与放疗联合治疗神经胶质瘤中的应用。
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