CN117987418A - 一种酸响应型核酸纳米屏障及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酸响应型核酸纳米屏障及其制备方法和应用。所述酸响应型核酸纳米屏障由三条DNA单链组装而成，包含DNA适配体部分和DNA三链体部分。其中，DNA适配体精准靶向HER2膜蛋白，酸性pH下DNA三链体发生Hoogsteen碱基互补配对，二者结合后在细胞膜上形成针对HER2的屏障结构。本发明以HER2/HER3二聚化调节细胞生理行为例，展示了DNA纳米屏障因为位阻效应阻止HER2/HER3二聚，从而抑制下游PI3K/AKT信号通路，降低乳腺癌细胞SKBR3的增殖、迁移和侵袭能力。本发明作为一种新型的调节膜蛋白聚类核酸纳米结构，为高精确和高特异性的细胞行为调控提供指导。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种酸响应型核酸纳米屏障及其制备方法和应用。
背景技术
细胞表面受体是调节细胞生理和病理状态的重要靶点，参与细胞分化、增殖等行为。在信号传导过程中，膜受体与配体结合后，选择性激活特定成分，刺激下游信号通路，产生细胞行为。酪氨酸蛋白激酶型膜受体(RTK)包括ErbB受体家族、胰岛素受体家族，是调节细胞正常生理过程的关键因子。RTKs通过受体同源二聚化或异源二聚化触发下游信号通路。如C-Met蛋白与HGF结合后发生同源二聚，刺激细胞生长、运动；PTK7膜蛋白与VEGF-R1膜蛋白异源二聚化后引起细胞增殖和迁移。因此，改变膜受体二聚化现象而导致细胞行为变化已经成为目前研究的热点。
HER2蛋白是乳腺癌、卵巢癌、胃癌等特定肿瘤的生物标志物，与肿瘤的生长、侵袭及预后密切相关。对于HER2阳性的癌症，HER2已被视为基因沉默或蛋白靶向的治疗靶点。HER2又被称为生长因子受体2，也是酪氨酸激酶膜受体。在HER2参与结合的ERbB受体中，最广泛的方式是与HER3(ERbB3)形成异源二聚体后，NGR1配体与HER3结合后激活下游信号通路，引导细胞发生生理行为。目前，针对HER2/HER3二聚体治疗的常用方式主要阻断HER3与NGRI结合的双特异性抗体Zenocutuzumab，或单独阻断HER2或HER3的抗体Seribantumab、Trastuzumab。抗体治疗效果虽然好，但是临床试验产生的副作用和抗体本身制作成本也是一种担忧。
功能核酸可以替代传统的蛋白酶和抗体，作为一类独立的纳米结构，具有特定的生物非遗传功能。由于其与各种靶标高度兼容，性质稳定，可作为良好的DNA纳米材料，在调节膜受体聚类方面广泛应用。考虑到肿瘤细胞独特的酸性环境，将功能核酸的pH响应性运用于肿瘤微环境中，可以起到高精确和高特异性的调控。所以pH响应性的DNA三链体结构避免了肿瘤酸性环境(pH6.5)下膜蛋白二聚化，从而下游信号通路受抑制，肿瘤细胞增殖和迁移能力降低。因此，运用DNA纳米屏障阻断HER2与HER3的接触为HER2/HER3二聚体治疗提供了新工具。
发明内容
发明目的：本发明旨在提供一种。
技术方案：本发明的一种酸响应型核酸纳米屏障，所述酸响应型核酸纳米屏障包括DNA适配体部分和DNA三链体部分，所述DNA适配体部分由S1链提供，所述DNA三链体部分为S1链、S2链和S3链通过Waston-Crick碱基互补配对和Hoogsteen碱基互补配对形成的三链体；其中S1链的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示；S2链的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO；5所示；S3链的序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示。
其中，SEQ ID NO：1:
5’-TCTTTCTTCTTTTTAGCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGTTTTTTGAGTCTTTCTTCT-3’
SEQ ID NO：2:
5’-AGAAGAAAGA-3’
SEQ ID NO：3:
5’-TCTTCTTTCTTGACTACAAT-3’
SEQ ID NO：4:
BHQ2-5’-TCTTTCTTCTTTTTAGCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGTTTTTTGAGTCTTTCTTCT-3’
SEQ ID NO：5:
5’-AGAAGAAAGA-3’-Cy5
SEQ ID NO：6:
5’-TCTTCTTTCTTGACTACAAT-3’-Cholesteryl。
上述技术方案中，所述酸响应型核酸纳米屏障由三条DNA单链组装而成，包含DNA适配体部分和DNA三链体部分。其中，DNA适配体精准靶向HER2膜蛋白，酸性pH下DNA三链体发生Hoogsteen碱基互补配对，二者结合后在细胞膜上形成针对HER2的屏障结构。
优选地，DNA适配体部分为HER2适配体部分。
优选地，S1链、S2链和S3链的摩尔比为1：2：2。
另一方面，本发明提供一种酸响应型核酸纳米屏障的制备方法，包括以下步骤：
将三条DNA单链S1链、S2链和S3链分别溶解后，混合，得到混合溶液；其中，S1链的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示；S2链的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO；5所示；S3链的序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示；
对混合溶液进行梯度退火处理，获得的产物过夜，即得到酸响应型核酸纳米屏障。
优选地，S1链、S2链和S3链的摩尔比为1：2：2。
优选地，梯度退火处理的程序为：95℃5min，65℃20min，40℃20min，20℃30min，4℃30min。
优选地，S1链、S2链和S3链溶解所用溶液为Tris-HCL缓冲溶液。
优选地，Tris-HCL缓冲溶液的pH为6.5-7.5。更优选地，Tris-HCL缓冲溶液的pH为6.5-7.0。
另一方面，本发明提供一种上述的酸响应型核酸纳米屏障在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为乳腺癌。酸响应型核酸纳米屏障用于降低肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力。
优选地，所述肿瘤为与PI3K/AKT信号通路有关的肿瘤。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)本发明构建了一种含适配体靶向和酸响应的核酸纳米屏障，利用位阻效应，靶向HER2膜蛋白，形成屏障，阻止HER2/HER3二聚化，抑制下游信号通路的激活，改变细胞生理行为。
(2)肿瘤微环境的pH为微酸性，可作为肿瘤治疗的切入点。DNA纳米屏障中的三链体结构具有pH响应性，在不同pH下可逆形成和解离，这就有利于该结构该在肿瘤细胞上的特异性组装。
(3)DNA特异性适配体对膜受体HER2蛋白的靶向和pH响应性下DNA三链体结构转换的双重帮助，使核酸纳米屏障具有高特异性调控能力。
(4)这项策略具有一定的普适性，适合所有具有DNA适配体的膜受体蛋白调控事件，拓宽了癌症治疗的机会，在未来的生物和医学工程中具有广阔的前景。
附图说明
图1为本发明实施例的酸响应型核酸纳米屏障结构示意图；
图2为本发明实施例的酸响应型核酸纳米屏障在pH7.5(A)和pH6.5(B)的逐步组装PAGE凝胶电泳图；
图3为本发明实施例的酸响应型核酸纳米屏障在不同pH下荧光光谱图(A)和荧光变化曲线(B)；
图4为本发明实施例的酸响应型核酸纳米屏障在pH7.5和pH6.5循环下的荧光变化图；
图5为本发明实施例的酸响应型核酸纳米屏障对PI3K-AKT信号通路相关蛋白表达水平的蛋白免疫印记图；
图6为本发明实施例的酸响应型核酸纳米屏障(pH6.5)降低SKBR3细胞增殖能力的效果图；
图7为本发明实施例的酸响应型核酸纳米屏障(pH6.5)降低SKBR3细胞迁移能力的划痕实验图；
图8为本发明实施例的酸响应型核酸纳米屏障(pH6.5)降低SKBR3细胞侵袭能力的Transwell实验图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例以HER2/HER3二聚化调节细胞生理行为例，展示了DNA纳米屏障因为位阻效应阻止HER2/HER3二聚，从而抑制下游PI3K/AKT信号通路，降低乳腺癌细胞SKBR3的增殖、迁移和侵袭能力。
如图1所示，本发明实施例提供一种酸响应型核酸纳米屏障，所述酸响应型核酸纳米屏障包括DNA适配体部分和DNA三链体部分，所述DNA适配体部分由S1链提供，所述DNA三链体部分由S1链、S2链和S3链通过Waston-Crick碱基互补配对和Hoogsteen碱基互补配对形成的三链体。
实施例1核酸纳米屏障在pH7.5和pH6.5的逐步组装制备
将3条DNA单链用Tris-HCL缓冲溶液(10mM Tris-HCl、10mM Bis-Tris、10mM乙酸钠、6mM MgCl2，pH＝6.5/pH＝7.5)溶解，每条链的终浓度均为100μM，3条链的体积分别为14.5μL(S1)、82.1μL(S2)、54.4μL(S3)。将溶解后的3条DNA单链按物质的量为1:2:2混合，混合后的溶液体积为0.5μL，加入Tris-HCL缓冲溶液。利用梯度PCR仪对混合溶液进行梯度退火，退火的程序为：95℃5min，65℃20min，40℃20min，20℃30min，4℃过夜。得到终浓度为0.5μM，终体积为20μL的核酸纳米屏障。
三条DNA单链的序列如SEQ ID NO：1-3：
SEQ ID NO：1:
5’-TCTTTCTTCTTTTTAGCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGTTTTTTGAGTCTTTCTTCT-3’
SEQ ID NO：2:
5’-AGAAGAAAGA-3’
SEQ ID NO：3:
5’-TCTTCTTTCTTGACTACAAT-3’
核酸纳米屏障的合成采用15％的天然PAGE凝胶电泳分析，结果如图2A和图2B所示。将三条DNA单链加在一起时，pH6.5处观察到位于75bp-100bp间，出现分子量更大的DNA杂交带，且凝胶底部没有低分子量单链。而pH7.5条件下的凝胶底部出现了低分子量的S3单链。这一结果证实DNA纳米屏障仅可在pH6.5下形成。
实施例2核酸纳米屏障的pH响应性验证
(1)DNA单链含荧光序列如SEQ ID NO：4-6：
SEQ ID NO：4:
BHQ2-5’-TCTTTCTTCTTTTTAGCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGTTTTTTGAGTCTTTCTTCT-3’
SEQ ID NO：5:
5’-AGAAGAAAGA-3’-Cy5
SEQ ID NO：6:
5’-TCTTCTTTCTTGACTACAAT-3’-Cholesteryl
(2)将三条DNA单链按1:2:2的比例混合，制备方法如实施例1所示，调节混合液pH分别为5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5。分别制得上述pH的核酸纳米屏障终体积100μL，终浓度0.5μM。将各pH溶液置于荧光分光光度计中测量。
实验结果如图3A和图3B所示，当溶液pH达6.5时，DNA纳米屏障的荧光强度迅速下降，说明核酸纳米屏障由双链互补配对形成三链互补配对，表明pH6.5是其发生构象变化的转折点。
(3)将三条DNA单链按1:2:2的比例混合，制备方法如实施例1所示，制得pH6.5的核酸纳米屏障终体积100μL，终浓度0.5μM。将该溶液置于荧光分光光度计中测量后记录荧光结果，再用1mol/L NaOH调节溶液pH至7.5，再测量荧光；上述操作重复三次。
实验结果如图4所示，荧光强度发生有规律的先升后降，显示了DNA纳米屏障的多次循环构象变化。
实施例3核酸纳米屏障对PI3K-AKT信号通路相关蛋白表达水平的影响
(1)细胞培养：使用含有10％胎牛血清(Gibco)的DMEM培养基培养SKBR3细胞；
(2)SKBR3密度达90％以上后，用无血清DMEM在培养箱中孵育过夜；
(3)将实验组别设计为空白、S1、S2、S3、S1+S2、S1+S3、S2+S3、S1+S2+S3，按每组终浓度为5μM，终体积100μL制备；
(4)将不同样品加入细胞中，孵育时间为60min；
(5)倒掉培养液，每孔细胞加2mL 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把细胞培养板置于冰上；
(6)按1mL裂解液加10μL PMSF(苯甲基磺酰氟，100mM)、20μL磷酸酶抑制剂，摇匀置于冰上(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合)。每孔细胞加200μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解50min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动；
(7)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5mL离心管中(整个操作在冰上进行)；
(8)于4℃下12000rpm离心5min(提前开离心机预冷)，离心后的上清即为培养细胞的全蛋白；
(9)将上述制得的蛋白样品加入Loading Buffer在水中煮沸10分钟；
(10)Marker孔加入10μL，其余将上述变形蛋白总上样量30μg；
(11)接上电源后，先用80V恒压电泳至溴酚蓝指示剂到浓缩胶与分离胶交界处后改为恒压120V直至溴酚蓝电泳到凝胶底部；
(12)取出凝胶，根据Marker切下目的条带，裁剪与SDS-PAGE凝胶相同大小的PVDF膜，滤纸应与纤维垫相同大小；在200mA横流下转膜90分钟；
(13)将转膜完成的PVDF膜取出后，用含5wt％牛血清白蛋白(BSA)的TBST(封闭液)浸泡60分钟；
(13)封闭完成后进行目标蛋白HER2、P-AKT、AKT的特异性一抗4℃恒温摇床下过夜孵育；
(14)一抗孵育完毕后，在室温下二抗孵育150分钟；
(15)孵育完毕后，将PVDF膜放置于成像仪上，均匀滴加ECL工作液，排出气泡，开始曝光。
实验结果见图5，只有核酸纳米屏障完全组装且处于pH6.5时，磷酸化AKT蛋白的表达量会降低，而AKT总蛋白的表达量为正常水。与此同时，DNA屏障靶向的HER2蛋白表达量也不会被改变。上述的实验结果表明，本发明所设计的核酸纳米屏障可以阻止HER2/HER3二聚，抑制下游PI3K/AKT信号通路。
实施例4核酸纳米屏障对SKBR3细胞增殖能力的影响
(1)细胞培养：使用含有10％胎牛血清(Gibco)的DMEM培养基培养SKBR3细胞；
(2)SKBR3密度达90％以上后，用无血清DMEM在培养箱中孵育过夜；
(3)将实验组别设计为空白、S1、S2、S3、S1+S2、S1+S3、S2+S3、S1+S2+S3，按每组终浓度为5μM，终体积10μL制备；
(4)将不同样品加入细胞中，孵育时间为60min；
(5)弃去培养液后，每孔细胞加200μL PBS(0.01M pH7.2～7.3)，平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，洗细胞三次以洗去培养液；
(6)每孔细胞加入无血清培养基DMEM 200μL，培养72h；
(7)弃去培养液后，PBS洗三次，再向每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育2h，在酶联免疫检测仪测量各孔的吸光值OD450nm。
实验结果见图6，结果表明完全组装后的DNA纳米屏障在pH6.5下处理时，72h后的细胞增殖能力达48％左右，与对照组处理的组别相比增殖能力显著降低，证明了本发明设计的核酸纳米屏障确实能够降低乳腺癌细胞SKBR3的增殖能力。
实施例5核酸纳米屏障对SKBR3细胞迁移能力的影响
(1)细胞培养：使用含有10％胎牛血清(Gibco)的DMEM培养基培养SKBR3细胞；
(2)SKBR3密度达90％以上后，用无血清DMEM在培养箱中孵育过夜；
(3)将实验组别设计为空白、S1、S2、S3、S1+S2、S1+S3、S2+S3、S1+S2+S3，按每组终浓度为5μM，终体积100μL制备；
(4)将不同样品加入细胞中，孵育时间为60min；
(5)弃去培养液后，每孔细胞加2mL PBS(0.01M pH7.2～7.3)，平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，洗细胞三次以洗去培养液；
(6)用200μL无菌移液管的尖端划伤每一层细胞。划痕后，用PBS轻轻地冲洗两次，以去除脱落细胞；
(7)每组加入含有10％胎牛血清(Gibco)的DMEM培养基2mL，显微镜(5x)记录0实验组和对照组的细胞创面宽度；
(8)培养24h后，显微镜(5x)记录24h实验组和对照组的细胞创面宽度。
实验结果如图7所示，pH6.5下的DNA纳米屏障与SKBR3细胞孵育24h后，划痕之间的距离较对照组相比增大，伤口愈合程度大幅度降低。阴性实验组和对照组的划痕距离随时间延长而缩小，证明了本发明设计的核酸纳米屏障确实能够降低乳腺癌细胞SKBR3的迁移能力。
实施例6核酸纳米屏障对SKBR3细胞侵袭能力的影响
(1)细胞培养：使用含有10％胎牛血清(Gibco)的DMEM培养基培养SKBR3细胞；
(2)SKBR3密度达90％以上后，用无血清DMEM在培养箱中孵育过夜；
(3)将Matrix-GelTM基质胶(标准型)置于冰中并在4℃融化，使用预冷的移液管混合基质胶至均匀状态。在冰上，将基质胶用无血清培养液按照1:8的比例进行稀释；
(4)取60μl上述混合溶液垂直加入Transwell小室中，使其均匀平铺在底部。随后置于37℃孵育3小时。
(5)吸出未结合的基质胶；加入100μl不含血清的DMEM培养基，将培养板置于37℃培养箱孵育30分钟，进行水化；去除小室中液体，检查是否有液体穿过小室进入到下室中，若没有，则可用于接种细胞；
(6)将实验组别设计为空白、S1、S2、S3、S1+S2、S1+S3、S2+S3、S1+S2+S3，按每组终浓度为5μM，终体积100μL制备；
(7)将不同样品加入细胞中，孵育时间为60min；
(8)取500μL含10％ FBS的DMEM培养基加入24孔板下室，用镊子将Transwell小室置于24孔板内；再取200μL细胞悬液加入Transwell小室；
(9)将24孔板置于培养箱中培养24小时；
(10)24h后取出Transwell小室，去除培养液，用棉签轻轻擦拭基质胶及细胞；
(11)在24孔板干净的孔中加入600μL 4％多聚甲醛固定液，将小室放入固定30分钟；
(12)弃固定液，PBS洗涤小室1次；
(13)在24孔板干净的孔中加入600μL结晶紫染色液，将小室放入染色15分钟；
(14)取出小室，PBS洗涤3次；适当风干后，显微镜(20x)下观察并计数。
实验结果如图8所示，DNA纳米屏障处理的SKBR3细胞24小时后侵袭至下室的细胞数量明显低于对照组和空白组。证明了本发明设计的核酸纳米屏障确实能够降低乳腺癌细胞SKBR3的侵袭能力。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种酸响应型核酸纳米屏障，其特征在于，所述酸响应型核酸纳米屏障包括DNA适配体部分和DNA三链体部分，所述DNA适配体部分由S1链提供，所述DNA三链体部分为S1链、S2链和S3链通过Waston-Crick碱基互补配对和Hoogsteen碱基互补配对形成的三链体；其中S1链的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示；S2链的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO；5所示；S3链的序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示。
2.根据权利要求1所述的酸响应型核酸纳米屏障，其特征在于，DNA适配体部分为HER2适配体部分。
3.根据权利要求1所述的酸响应型核酸纳米屏障，其特征在于，S1链、S2链和S3链的摩尔比为1：2：2。
4.一种酸响应型核酸纳米屏障的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将三条DNA单链S1链、S2链和S3链分别溶解后，混合，得到混合溶液；其中，S1链的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示；S2链的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO；5所示；S3链的序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示；
对混合溶液进行梯度退火处理，获得的产物过夜，即得到酸响应型核酸纳米屏障。
5.根据权利要求4所述的酸响应型核酸纳米屏障的制备方法，其特征在于，S1链、S2链和S3链的摩尔比为1：2：2。
6.根据权利要求4所述的酸响应型核酸纳米屏障的制备方法，其特征在于，梯度退火处理的程序为：95℃5min，65℃20min，40℃20min，20℃30min，4℃30min。
7.根据权利要求4所述的酸响应型核酸纳米屏障的制备方法，其特征在于，S1链、S2链和S3链溶解所用溶液为Tris-HCL缓冲溶液。
8.根据权利要求7所述的酸响应型核酸纳米屏障的制备方法，其特征在于，Tris-HCL缓冲溶液的pH为6.5-7.5。
9.一种根据权利要求1-3中任一所述的酸响应型核酸纳米屏障在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为乳腺癌。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为与PI3K/AKT信号通路有关的肿瘤。
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