CN117987372A

CN117987372A - 经修饰的免疫细胞及其医药用途

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Publication number: CN117987372A
Application number: CN202211357909.3A
Authority: CN
Inventors: 张柯; 金涛; 黄延周; 卡琳·魏斯基兴; 乌尔丽克·普罗策
Original assignee: Singapore Star Hand Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Singapore Star Hand Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-11-01
Filing date: 2022-11-01
Publication date: 2024-05-07

Abstract

本发明提供了一种经修饰的免疫细胞，其包含能够特异性靶向乙肝表面抗原的嵌合抗原受体(HBV CAR)和嵌合转换受体，所述嵌合转换受体采用共刺激分子的胞内激活信号域替换免疫抑制受体的胞内抑制信号域，将免疫抑制受体与配体结合诱发的抑制性信号转换为活化信号。本发明还提供了编码所述HBV CAR，和/或编码所述嵌合转换受体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体，及其在预防和/或治疗HBV感染及其相关疾病的药物中的应用。

Description

经修饰的免疫细胞及其医药用途

技术领域

本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种经修饰的免疫细胞及其医药用途。

背景技术

虽然目前针对HBV感染有可用的疫苗和直接作用的高效抗病毒药，但在全球范围内，HBV仍造成很大的疾病负担。2015年，全球约2.57亿人携带HBV，因慢性HBV感染并发症导致的死亡人数超过88.4万。流行病学研究表明，与美洲或欧洲相比，亚洲和非洲国家人群感染HBV的比例更高。乙型肝炎病毒(HBV)感染是80％以上亚裔人群肝细胞肝癌(HCC)的主要诱因。

HBV-核苷酸整合见于80-90％的HBV相关肝细胞癌。在分子层面上，HBV病毒会引发肝脏基因表达的变化，从而赋予细胞肿瘤的特征。这些变化是由于核苷酸甲基化的改变、mRNA表达谱的改变以及许多信号转导通路的组合激活。其中，诱发肝癌的主要机制是由免疫反应介导的。病毒利用免疫反应在肝脏中创造的氧化环境，结构性地激活信号通路，阻断细胞凋亡，促进细胞存活，支持HBV复制，从而促进病毒的持续存在；同时病毒也可能抑制或阻断先天免疫，从而影响获得性免疫反应的发展。这种慢性、持续性的免疫反应，在病理层面上表现为肝炎和长期的纤维化反应，最终导致肝硬化和肝癌。

慢性肝炎相关HCC患者需要抗病毒治疗以抑制病毒复制、降低血清病毒负荷以及改善肝硬化的预后。值得注意的是，抗病毒疗法虽然可以高效抑制HBV复制，减轻肝炎症状，却并不能清除病毒或在停止治疗后持续控制病毒。在临床实践中，常常使用核苷、核苷类似物以及干扰素来预防和治疗HBV相关的HCC，但这些产品的实际治疗效果不稳定，在总生存期和疾病复发方面的临床结果具有争议。长期抗病毒应用还与耐药性发生有关，即持续应用可导致这些药物无效。

细胞免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。

T细胞群的有效杀伤能力和抗病毒特性可用于细胞过继免疫疗法，以治疗人类的恶性病(例如白血病)和病毒类疾病(例如CMV和EBV)。然而，从患者中分离和扩增预先存在的病毒或肿瘤特异性T细胞是非常困难和耗时的，在许多慢性乙型肝炎和HBV相关的HCC患者中，HBV特异性T细胞反应受到严重损害。他们的病毒特异性T细胞存在功能缺陷，其中病毒特异性T细胞的产生频率极低。为了克服这些限制，研究人员已经开发了基于基因转移的策略以将患者的循环淋巴细胞重新靶向特定的病毒或肿瘤抗原。这通过嵌合抗原受体(CAR)来实现，所述嵌合抗原受体由与T细胞信号结构域融合的抗体结合结构域组成，这些遗传修饰赋予T细胞明确的抗原特异性。

肝病毒核心蛋白、X蛋白、聚合酶蛋白和乙肝表面抗原(HBsAg)在感染的细胞中合成HBV包膜蛋白，并在内质网中合并组装，在细胞膜上形成(亚)病毒颗粒，或者可以通过膜的生理交换到达细胞表面。由于乙肝表面抗原的表达不受可用的抗病毒药物的控制，并且通常在具有HBV-核苷酸整合的HCC中维持，因此即使在HCC发展的慢性乙型肝炎晚期，在抗病毒治疗下肝细胞和肿瘤细胞仍然表现出HBsAg阳性。

表达HBsAg特异性CAR的外周血T细胞过继转移到患有慢性HBV感染或HBV相关HCC的患者，可迅速赋予其T细胞特异性，靶向HBV感染的肝细胞或表达HBsAg的HCC细胞。现有的靶向HBsAg的CAR-T细胞体外试验，可以将T细胞重定向到HBV感染的肝细胞，并从受感染的细胞培养物中消除HBV，但体内给与CAR-T治疗效果有限，CAR-T细胞在最初的扩增和较好的抗病毒作用后，细胞消失，各项病毒参数再次上升。所以，需要新的CAR-T治疗策略以治疗慢性乙肝和HBV相关HCC等HBV感染相关疾病。

发明内容

鉴于目前存在的技术问题，本申请提供了一种经修饰的免疫细胞，特异的靶向乙肝表面抗原，且能够克服肿瘤微环境免疫抑制导致的免疫细胞耗竭。其能够特异性杀灭由HBV感染所诱发的肝癌细胞，从而治疗HBV感染诱发的肝癌。

本申请的第一方面提供了一种经修饰的免疫细胞，其包含靶向乙肝表面抗原的嵌合抗原受体(HBV CAR)和嵌合转换受体；所述嵌合转换受体包含免疫抑制受体的细胞外结构域(ECD)和介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)；所述ECD与其配体结合在所述经修饰的免疫细胞中产生免疫细胞激活信号而非免疫细胞失活信号。

在一些实施方案中，所述HBV CAR包含乙肝表面抗原(HBsAg)结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激信号域和胞内信号传导结构域；在一些实施方案中，所述HBsAg结合结构域为HBsAg scFv；在一些实施方案中，所述铰链区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的FC CH2CH3铰链区、CD28铰链区或CD8铰链区及其组合；在一些实施方案中，所述跨膜区选自CD28、CD8、CD134、CD137、ICOS或DAP10跨膜区及其组合；在一些实施方案中，所述共刺激结构域选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS或DAP10胞内结构域及其组合；在一些实施方案中，所述胞内信号传导结构域选自CD3ζ，FcεRIγ，CD28，CD137，CD134蛋白的胞内信号域及其组合；且上述结构域序列可以存在至少一个氨基酸突变。

在一些实施方案中，所述HBV CAR的HBsAg结合结构域为HBsAg scFv，所述铰链区为IgG2 FC CH2CH3突变铰链区，所述跨膜区为CD28跨膜区，所述共刺激信号域为CD28胞内信号域，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；在一些实施方案中，所述HBV CAR氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一些实施方案中，所述嵌合转换受体包含：免疫抑制受体的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合；其中所述免疫抑制受体的细胞外结构域与其配体结合在所述经修饰的免疫细胞中产生免疫细胞激活信号而非免疫细胞失活信号。

在一些实施方案中，所述免疫抑制受体包含PD1、CTLA4，BTLA，TIM3，TIGIT，TGFβ受体以及其他任意具有免疫抑制功能或与免疫抑制信号通路相关的蛋白中的任意一种蛋白及其组合，且所述免疫抑制蛋白的ECD序列可存在至少一个氨基酸突变。

在一些实施方案中，所述ECD为PD1 ECD；在一些实施方案中，所述PD1 ECD序列存在一个氨基酸突变，132位的丙氨酸突变为亮氨酸，所述突变的PD1 ECD氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

在一些实施方案中，所述共刺激分子包含：CD28、4-1BB、ICOS、CD27、IL-12R,CD3,OX40及其组合，且所述共刺激分子ICD序列可存在至少一个氨基酸突变。

在一些实施方案中，所述ICD为CD28 ICD或4-1BB ICD；在一些实施方案中，所述CD28 ICD氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；在一些实施方案中，所述4-1BB ICD氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在一些实施方案中，所述ECD和所述ICD通过跨膜区序列连接；在一些实施方案中，所述跨膜区包含选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α，β或ζ链,CD28，CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154及其组合，且所述跨膜区序列可存在至少一个氨基酸突变；在一些实施方案中，所述跨膜区序列为CD8跨膜区序列或CD28跨膜区序列；在一些实施方案中，所述CD8跨膜区序列如SEQ ID NO:5所示；在一些实施方案中，所述CD28跨膜区序列如SEQ IDNO:6所示。

在一些实施方案中，所述嵌合转换受体为从N端到C端依次为PD1(ECD)、CD28(跨膜区)、CD28(ICD)的融合蛋白，结构形式为PD1(ECD)-CD28(TM)-CD28(ICD)(简写为PD1-28)；在一些实施方案中，PD1-28的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在一些实施方案中，所述嵌合转换受体为从N端到C端依次为PD1(ECD)、CD28(跨膜区)、CD28(ICD)的融合蛋白，结构形式为PD1(ECD)-CD8(TM)-4-1BB(ICD)(简写为PD1-BB)。在一些实施方案中，PD1-BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在一些实施方案中，所述免疫细胞选自淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞；优选地，所述免疫细胞为淋巴细胞，更优选地，所述免疫细胞为T细胞。

本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的HBV CAR核酸序列；和/或，包含编码本发明第一方面所述的嵌合转换受体的核酸序列。

在一些实施方案中，编码所述HBV CAR的核酸序列如SEQ ID NO:7所示；在一些实施方案中，所述嵌合转换受体为PD1-BB，编码其的核酸序列如SEQ ID NO:10所示。

本发明的第三方面，提供一种载体，所述的载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。

本发明的第四方面，提供一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的经修饰的免疫细胞、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述载体。

本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述的经修饰的免疫细胞、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述载体或本发明第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗由HBV感染所引发的相关疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，所述HBV感染相关疾病包含肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌所组成的一种或多种。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

有益技术效果：

一方面，本发明的经修饰的免疫细胞在表达抗原靶向HBV CAR的同时，表达PD1-41-BB,高度竞争性结合肿瘤细胞中的PD-L1分子，阻断PD-1分子诱导的细胞耗竭，转换PD-1抑制性信号为细胞激活信号，多重刺激信号提高效应细胞扩增能力、持续性细胞因子分泌能力，增强对肿瘤细胞杀伤活性；体内外试验表明本发明的经修饰的免疫细胞，有望克服目前肝癌过继细胞免疫治疗所面临的肿瘤异质性、肿瘤屏障难以渗透、作用时间短暂、局部免疫抑制性微环境等一系列难以解决的难题，在实体瘤的细胞免疫治疗领域具有巨大的应用前景。另一方面，本发明优化了载体中关键元件的选择和连接顺序，使得HBV CAR和PD1-41-BB两个分子均能在人类细胞中高效表达。

附图说明

图1为HBV CAR-PD1-41BB作用原理示意图。

图2为HBV CAR-PD1-41BB结构序列示意图。

图3为HBV CAR-PD1-41BB生产工艺流程图。

图4为流式细胞技术检测HBV CAR和HBV CAR-PD1-41BB的CAR和PD-1阳性率。

图5为构建的阳性靶细胞和阴性靶细胞PDL1表达。

图6为HBV CAR-PD1-41BB和HBV CAR对HBsAg⁺PDL1⁺靶细胞杀伤作用。

图7为HBV CAR-PD1-41BB和HBV CAR对靶细胞细胞因子功能。

图8为HBV CAR-PD1-41BB对不同表达靶细胞杀伤和细胞因子功能。

图9为HBV CAR-PD1-41BB添加不同浓度游离HBsAg细胞因子检测。

图10为HBV CAR-PD1-41BB和HBV CAR针对肿瘤耗竭进行的靶细胞重复刺激杀伤试验。

图11为HBV CAR-PD1-41BB和HBV CAR靶细胞重复刺激细胞因子和记忆细胞表型试验。

图12为免疫缺陷小鼠HBsAg⁺人HCC移植瘤模型HBV CAR-PD1-41BB体内药效和扩增。

图13为小鼠体内的HBV CAR-PD1-41BB单剂量毒理学研究。

图14为免疫缺陷小鼠HBsAg⁺PDL1⁺移植瘤模型HBV CAR-PD1-41BB体内长期药效。

具体实施方式

为了更容易理解本发明，描述实施例之前，先对本发明某些技术和科学术语做说明。除显而易见在本发明申请文件中的它处另有明确定义，本发明使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

如本文所使用的，术语“经修饰的”是指本发明的分子或细胞状态或结构的改变。分子可以以多种方式进行修饰，包括化学地、结构地和功能地。细胞可以通过引入核酸来进行修饰。

如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工T细胞受体，其经工程化以在免疫细胞上表达，并与抗原特异性结合。CAR可用作过继性细胞转移疗法。从患者体内移出T细胞并进行修饰，使其表达对抗原或抗原的特定形式具有特异性的受体；在一些实施例中T细胞也可以源自健康供者；在一些实施例中，T细胞也可以由多种干细胞分化而来，比如造血干细胞或iPS细胞等；在一些实施例中，可以直接修饰干细胞，然后再诱导分化为T细胞等免疫细胞；在一些实施例中，可以加入或不加入分子开关，使干细胞在分化为免疫细胞之前或之后表达所述CAR。在一些实施例中，也可以直接对其他类型的免疫细胞进行修饰，使其表达对抗原或抗原的特定形式具有特异性的受体。在一些实施例中，CAR对选定的靶标具有特异性，如表达前列腺特异性膜抗原的细胞。CAR还可以包括胞内活化结构域、跨膜结构域和胞外结构域，胞外结构域包括肿瘤相关的抗原结合结构域。

抗原结合结构域可以与CAR的另一个结构域可操作地连接，诸如本文其他地方描述的跨膜结构域或胞内结构域，用于在细胞中表达。在一个实施方式中，编码抗原结合结构域的第一核酸序列与编码跨膜结构域的第二核酸可操作地连接，并且进一步可操作地连接至编码胞内结构域的第三核酸序列。

本文描述的抗原结合结构域可以与本文描述的任何跨膜结构域、本文描述的任何胞内结构域或细胞质结构域、或本文描述的可以包括在本发明的CAR中的任何其他结构域组合。本发明的主题CAR还可包括如本文所述的间隔子结构域。在一些实施方式中，抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域通过接头分开。

CAR的抗原结合结构域是CAR的胞外区，用于结合特异性靶抗原，包括蛋白质、碳水化合物和糖脂。靶抗原可包括与靶细胞相关的任何类型的蛋白质或其表位。在示例性实施方式中，靶细胞抗原是乙肝表面抗原。

乙肝表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎病毒(HBV)衣壳蛋白。HBV基因组是部分双链的环状DNA，具有重叠阅读框。基于大小，存在由HBV基因组编码的四个转录物(在本文中可称为“基因”或“开放阅读框”)。这些包含称为C、X、P和S的开放阅读框。核心蛋白由基因C编码(HBcAg)。乙肝e抗原(HBeAg)通过前核心(pre-C)蛋白的蛋白水解加工而产生。DNA聚合酶由基因P编码。基因S是编码表面抗原(HBsAg)的基因。HBsAg基因是一个长的开放阅读框，其含有三个框内“起始”(ATG)密码子，从而产生三种不同大小的多肽，称为大、中和小S抗原，即大表面抗原、中表面抗原和小表面抗原，pre-S1+pre-S2+S、pre-S2+S或S。表面抗原除了装饰HBV的包膜外，也是亚病毒颗粒的部分，其与病毒颗粒相比，以大得多的量产生，并在免疫耐受和隔离抗HBsAg抗体中发挥作用，从而使感染性颗粒逃避免疫检测。

在一些实施例中，抗原结合结构域选自抗体、抗原结合片段(Fab)、和单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，本发明的HBsAg结合结构域选自HBsAg-特异性抗体、HBsAg特异性Fab、和HBsAg特异性scFv。在一个实施例中，HBsAg结合结构域是HBsAg特异性抗体。在一个实施例中，HBsAg结合结构域是HBsAg特异性Fab。在一个实施例中，HBsAg结合结构域是HBsAg特异性scFv。

本发明实施例的HBV CAR包含乙肝表面抗原(HBsAg)结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激信号域和胞内信号传导结构域；在一些实施例中，所述HBsAg结合结构域为HBsAgscFv；在一些实施例中，所述铰链区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的FC CH2CH3铰链区、CD28铰链区或CD8铰链区及其组合；在一些实施例中，所述跨膜区选自CD28、CD8、CD134、CD137、ICOS或DAP10跨膜区及其组合；在一些实施例中，所述共刺激结构域选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS或DAP10胞内结构域及其组合；在一些实施例中，所述胞内信号传导结构域选自CD3ζ，FcεRIγ，CD28，CD137，CD134蛋白的胞内信号域及其组合；在一些实施例中，上述各结构域序列可以存在至少一个氨基酸突变。

在一些实施例中，所述HBV CAR的HBsAg结合结构域为HBsAg scFv，所述铰链区为IgG2 FC CH2CH3突变铰链区，所述跨膜区为CD28跨膜区，所述共刺激信号域为CD28胞内信号域，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；在一些实施例中，所述HBVCAR氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

嵌合转换受体

本发明的嵌合转换受体包含免疫抑制受体的细胞外结构域(ECD)，ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合；其中所述免疫抑制受体的细胞外结构域与其配体结合在所述经修饰的免疫细胞中产生免疫细胞激活信号而非免疫细胞失活信号。

免疫抑制受体包含PD1、CTLA4，BTLA，TIM3，TIGIT，TGFβ受体以及其他任意具有免疫抑制功能或与免疫抑制信号通路相关的蛋白中的任意一种蛋白及其组合，且所述免疫抑制蛋白的ECD序列可存在至少一个氨基酸突变。

在一些实施例中，所述ECD为PD1 ECD；在一些实施例中，所述PD1 ECD序列存在一个氨基酸突变，132位的丙氨酸突变为亮氨酸，所述突变的PD1 ECD氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

嵌合转换受体的共刺激分子可以包含：CD28、4-1BB、ICOS、CD27、IL-12R,CD3,OX40及其组合，且所述共刺激分子ICD序列可存在至少一个氨基酸突变。

在一些实施例中，所述ICD为CD28 ICD或4-1BB ICD；在一些实施例中，所述CD28ICD氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；在一些实施例中，所述4-1BB ICD氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。

在一些实施例中，嵌合转换受体的ECD和ICD可以通过跨膜结构域连接，例如通过跨膜区段连接。在一些实施方案中，跨膜区段包含多肽。跨膜多肽可以具有任何合适的多肽序列。在一些情况下，跨膜多肽包含内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分的多肽序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分相比具有至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)氨基酸取代、缺失和插入的多肽序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含非天然多肽序列，如多肽接头的序列。多肽接头可以是柔性的或刚性的。多肽接头可以是结构化的或非结构化的。在一些实施方案中，跨膜多肽将信号(例如指示配体结合的信号)从ECD传递至ICD。

在一些实施例中，所述跨膜区可以包含选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α，β或ζ链,CD28，CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154及其组合，且所述跨膜区序列可存在至少一个氨基酸突变；在一些实施例中，所述跨膜区序列为CD8跨膜区序列或CD28跨膜区序列；在一些实施例中，所述CD8跨膜区序列如SEQ ID NO:5所示；在一些实施例中，所述CD28跨膜区序列如SEQ ID NO:6所示。

在一些实施例中，所述嵌合转换受体为从N端到C端依次为PD1(ECD)、CD28(跨膜区)、CD28(ICD)的融合蛋白，结构形式为PD1(ECD)-CD28(TM)-CD28(ICD)(简写为PD1-28)；在一些实施方案中，PD1-28的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在一些实施例中，所述嵌合转换受体为从N端到C端依次为PD1(ECD)、CD8(跨膜区)、4-1BB(ICD)的融合蛋白，结构形式为PD1(ECD)-CD8(TM)-4-1BB(ICD)(简写为PD1-BB)。在一些实施方案中，PD1-BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

本发明的PD1-41BB，PD1-CD8-41BB、PD1-BB如无特殊说明具有相同含义，均指含有依次连接的PD1胞外域、CD8跨膜区、41-BB共刺激域的融合蛋白，也即嵌合转换受体的一种具体形式，能够将PD1介导的阴性信号转换为阳性信号用于刺激表达所述嵌合转换受体的T细胞。在一些实施例中，PD1-41BB氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明的HBV CAR-PD1-41BB指同时包含所述HBV CAR和所述PD1-41BB的T细胞。在一些实施例中，HBV CAR和PD1-41BB在CAR-PD1-41BB细胞中通过P2A融合表达，从N端到C端依次为PD1-41BB-P2A-HBV CAR。在一些实施例中，PD1-41BB-P2A-HBV CAR融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

核酸分子

本发明的多核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的核酸密码子可以是简并的，即编码同一氨基酸序列的多种简并核酸序列都包含在本发明的范围之中。编码对应氨基酸的简并核酸密码子是本领域公知的。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。在一些实施例中，HBV CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。在一些实施例中，PD1-41BB的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。在一些实施例中，PD1-41BB-P2A-HBVCAR融合蛋白的编码序列如：SEQ ID NO.12所示。

应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，允许在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的融合蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。

载体

本发明也涉及载体，该载体含有本文所述的核酸分子序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的核酸分子可以多种方式被操作以保证所述融合蛋白的表达。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本申请。

本申请的核酸分子可被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，MolecularCloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO 01/96584和美国专利号6,326,193)。

例如，在某些实施方案中，本发明使用慢病毒载体，该慢病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估目的基因的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。

将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法还包括使用病毒载体，特别是慢病毒载体，这已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。

免疫细胞

本申请的免疫细胞选自淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞。

在一些实施例中，免疫细胞为淋巴细胞；在一些实施例中，免疫细胞为NK细胞；在一些实施例中，免疫细胞为B细胞；在一些实施例中，免疫细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)细胞。在一些实施例中，免疫细胞为T细胞，所述T细胞可衍生自从受试者分离的T细胞，或者可以是从受试者中分离的混合细胞群，诸如外周血淋巴细胞(PBL)群的一部分。如，该细胞可以分离自外周血单核细胞(PBMC)，可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。该细胞可在CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群中。一般地，该细胞可以用抗体(如，抗-CD3抗体)活化，以便使它们能够更容易接受转染。

在一些实施例中，TIL是已经从受试者的血流迁移到肿瘤中的白细胞。TIL可以是例如T细胞、B细胞、单核细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一些情况下，经修饰的TIL包含CD8⁺细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀伤细胞、树突细胞或M1巨噬细胞。包含TIL的免疫细胞群可以是混合的细胞群。TIL群体可以包含不同表型的细胞、不同分化程度的细胞、不同谱系的细胞或其任何组合。TIL通常可以使用细胞表面标记在生物化学上进行定义，或者可以通过其浸润肿瘤和实现治疗的能力在功能上进行定义。可以基于以下生物标记中的一种或多种的表达对TIL进行分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD25、CD27、CD28、CD56、CD137、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和TIM-3。在一些实施例中，经修饰的TIL表达PD-1、CD137和TIM-3中的至少一种。在一些情况下，TIL可以通过在重新引入患者体内后其侵润实体瘤的能力在功能上进行定义。在一些情况下，经修饰的TIL包含“原代TIL”，其是指从患者组织样品中获得的TIL。在一些情况下，经修饰的TIL包含“次级TIL”，其是指已经扩增或增殖的TIL。TIL可以展现出与新抗原的特异性结合。

本文经修饰的免疫细胞，为包含所述HBV CAR分子和嵌合转换受体的免疫细胞；在一些实施例中，通过向分离的免疫细胞导入编码上述HBV CAR分子和上述嵌合转换受体的编码序列或包含上述编码序列的载体构建经修饰的免疫细胞；在一些实施例中，向体内的免疫细胞导入编码上述HBV CAR分子和上述嵌合转换受体的编码序列或包含上述编码序列的载体构建经修饰的免疫细胞；在一些实施例中，HBV CAR分子和嵌合转换受体的编码序列串联表达，且处于同一个阅读框中。

组合物

本申请还提供了包含本发明的经修饰的免疫细胞、核酸或载体的组合物。在一些实施例中，所述组合物是药物组合物。在一些实施方式中，所述组合物是适合用于研究、治疗、预防和/或诊断的组合物。

在一些实施例中，本申请的经修饰的免疫细胞、核酸或载体优选与本领域技术人员公知的一种或多种其它可药用成分一起配制成药剂或药物，所述可药用成分包括但不限于可药用载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。术语“可药用”用于本文中时涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，它们在合理的医学判断范围内、适合用于接触所讨论的对象(例如人类)的组织而没有过度的毒性、刺激、变态反应或者其它问题或并发症、与合理的效益/风险比相称。每种载体、佐剂、赋形剂等在与制剂的其它成分相容的意义上，也必须是“可接受的”。合适的载体、佐剂，赋形剂等可以在标准的药物教科书中找到，例如，《雷氏药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)；以及《药用赋形剂手册》(Hand bookof Pharmaceutical Excipients)。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以E4至E9个细胞/kg体重的剂量，优选E5至E7个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。

医药用途

在另一方面，提供了本申请的经修饰的免疫细胞、核酸、载体或药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的应用。

在一些实施例中，本申请的经修饰的免疫细胞、核酸、载体或药物组合物可用于预防或治疗由HBV感染所引发的相关疾病。由HBV感染所引发的相关疾病包括急性肝炎(包括暴发性肝衰竭)、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌如肝细胞癌(HCC)、或胰腺癌。

治疗和预防方法

可以通过分离患有与HBV相关疾病的病人或志愿者的免疫细胞，并将本申请的核酸分子或载体导入上述免疫细胞中，随后将这些基因工程修饰的细胞回输到病人体内来进行治疗。因此，本申请提供了一种治疗HBV相关疾病的方法，包括将分离的表达本申请HBVCAR和嵌合转换受体的免疫细胞，优选地，该免疫细胞来源于病人本身，输入到病人体内。一般地，包括(1)分离病人的免疫细胞，(2)用本申请核酸分子或载体，体外转导免疫细胞，(3)将基因工程修饰的免疫细胞输入到病人体内。分离、转染及回输的细胞的数量可以由医师决定。另外，可以修饰同种异体的免疫细胞，然后输入患者体内治疗对应疾病。

在本发明的一些实施方案中，本发明的经修饰的免疫细胞、核酸、载体或药物组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗、免疫抑制剂和病毒抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗HBV诱发的疾病的核苷酸类似物或干扰素进行治疗，核苷酸类似于物包括拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦、替诺福韦酯和克拉夫定。

“患者”、“对象”、“个体”等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。

具体实施例

下面将结合具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。

下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)(第三版)(2001))中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1：表达HBV CAR和HBV CAR-PD1-41BB慢病毒载体构建

HBV CAR-PD1-41BB结构原理如图1所示，HBV CAR和HBV CAR-PD1-41BB序列结构如图2所示，首先全基因合成HBV CAR核苷酸片段(SEQ ID NO：7)、HBV CAR-PD1-41BB核苷酸片段(SEQ ID NO：12)。

克隆目的基因到骨架质粒：为了提高基因的表达效率，选择合适的骨架质粒至关重要。我们以慢病毒骨架载体原始序列为基础，将其氨苄青霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因后进行了骨架质粒的全基因合成。再分别设计目的基因序列两端引物引入EcoRI和SalI酶切位点，对目的基因片段进行PCR扩增获得扩增产物，根据PCR产物电泳结果选择目的基因条带进行纯化回收。同时将回收的PCR产物和慢病毒骨架质粒用EcoRI和SalI双酶切回收，2个片段利用T4 DNA连接酶连接，连接产物利用Stbl3感受态细胞进行转化，挑单克隆培养，提取质粒后通过双酶切、电泳和测序对目的质粒进行鉴定。构建完成的目的质粒包括5'LTR(长末端重复序列)、HIV-1(包装整合信号)、RRE(Rev反应元件)、cPPT/CTS(中心多嘌呤管道/中心终止序列)、MNDU3 promoter(MNDU3启动子)、3'LTR-SIN(自灭活型的长末端重复序列)等主要功能元件，以及HBV CAR或HBV CAR-PD1-41BB基因。

实施例2：慢病毒包装

D10细胞完全培养基配制：DMEM(Gibco,11965092-092)、10％ FBS(Gibco,10099141)、1％Sodium Pyruvate(Gibco,11360070)、置于4℃冰箱中备用。

Day 0：293T细胞小于20代，不过分长满；以2×107铺150mm皿(Corning,430599)，20mL D10培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜。

Day 1：293T细胞融合度达到60-80％时进行转染，铺板到转染的时间不大于24h。

慢病毒包装按表1准备质粒复合物。

表1质粒复合物所需材料

主质粒	RRE	REV	VSVG	PEIpro	OptiMEM
						18ug	10ug	7ug	7ug	70uL	1mL+1mL

一边轻轻涡旋质粒，一边将PEIpro滴加进去，充分混匀并在室温下静置15min，形成质粒-PEI复合物；将复合物缓缓加入到150mm皿293T细胞中，充分混匀，置二氧化碳培养箱37℃培养6h。

Day 1：将转染6h的293T细胞，轻轻换液成20mL新鲜D10培养基。

Day 3：收集转染48h的病毒上清，暂存于4℃冰箱中，继续添加D10培养基20mL。

Day 4：收集转染72h的病毒上清，与收集转染48h的病毒上清混合；4度，3000g离心10min，过0.45um滤器去除碎片保留上清，使用100K的超滤杯进行病毒浓缩。

4℃，3000g离心至所需病毒浓缩的体积，离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的过滤液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上；4℃，1000g离心2min，样品收集杯中的即为病毒浓缩液，收集浓缩液，分装，-70℃保存。

病毒液滴度检测：准备24孔贴壁板，按5*10^4/孔铺板293T细胞，500ul/孔，加入一定量病毒浓缩液，梯度稀释，培养72H后消化293T，流式检测病毒滴度。

病毒滴度检测：

流式缓冲液配制：DPBS、2％FBS，置于4℃冰箱中备用。

取消化后的293T细胞，每组1×10⁶细胞，400g 5min离心弃上清，用流式缓冲液洗涤2次。

FITC-Anti-HBsAg按1:100比例用流式缓冲液稀释，每个样本加入100ul抗体稀释液，4℃避光孵育30分钟，加入流式缓冲液洗涤细胞，400g 5min离心弃上清，重复2次。

用100ul流式缓冲液重悬细胞，上样流式检测。

载体感染滴度(TU/mL)＝每孔细胞铺板数×阳性率(％)×稀释倍数/滴定体积(mL)。

实施例3：制备HBV CAR-T和HBV CAR-PD1-41BB

T细胞培养基配制：PRIME-XV-T cell CDM、400IU/mlIL-2。

T细胞冻存液配制：75％CS10+25％HAS。

Day0：从单采血中分离获得较纯的CD3+T细胞，用T细胞培养基调整细胞浓度至1×10⁶/mL，按Transact(CD3/CD28微球)：细胞悬液＝1:30加入激活剂，轻轻充分混匀，再加入终浓度为400IU/mL的白细胞介素2，刺激培养24h后病毒感染。

Day1：计数细胞，调整T细胞的密度在5×10⁵/mL，加入病毒液。

Day2-11：细胞感染后，每天观察细胞状态，适时补加含IL-2 400IU/mL的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在5×10⁵/mL，使细胞扩增。

Day12：300g离心5分钟收获细胞，用含5％人血白蛋白的生理盐水溶液清洗细胞，用T细胞专用冻存液按照适当的密度进行冻存，经程序降温仪冷冻后保存于液氮中。HBVCAR-PD1-41BB成品制剂前将基于指定的剂量水平、受试者的体重、总活细胞中的CD3+CAR+活细胞比例，计算得出细胞回输所需的细胞总数(图3)。

实施例4：流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的比例及表面CAR蛋白的表达

T细胞阳性率检测

流式缓冲液配制：DPBS、2％FBS，置于4℃冰箱中备用。

取成品制剂的CAR-T细胞和NT细胞(对照组)各1×10⁶细胞，400g 5min离心弃上清，用流式缓冲液洗涤2次。

FITC-Anti-HBsAg和BV421-Anti-PD1抗体按1:100比例用流式缓冲液稀释，每个样本加入100ul抗体稀释液，4℃避光孵育30分钟，加入流式缓冲液洗涤细胞，400g 5min离心弃上清，重复2次。

用100ul流式缓冲液重悬细胞，上样流式检测。

流式细胞仪检测靶向HBV的CAR表达情况，结果如图4所示。HBV CAR-PD1-41BB的CAR和PD-1阳性率在45％以上，同时HBV CAR的阳性率在60％以上，说明HBV CAR-T都可以成功稳定表达。

实施例5：HBV CAR-PD1-41BB对HBsAg⁺PD-L1⁺肝癌细胞的杀伤

HBV CAR-PD1-41BB就是在HBV CAR的基础上增加了PD1-41BB嵌合受体。我们对比了抗耗竭型HBs-CAR T细胞(HBV CAR-PD1-41BB)和HBV CAR杀伤HBsAg⁺PD-L1⁺靶细胞的能力。我们使用实时细胞分析(RTCA)技术对靶细胞的杀伤效果进行观察。

M10细胞完全培养配制：DMEM、10％ FBS、1％ Sodium Pyruvate、1％HEPES、1％NEAA置于4℃冰箱中备用。

D0：取分化好的HepAD38-PD-L1、HepG2细胞消化后调整细胞密度至4×10⁵/ml备用，取一块Collagen包被好的RTCA用96孔板，加入50ul/孔M10培养基进行仪器基线测定，再每孔加入密度为4×10⁵/ml对应的细胞50ul，静置约5min后上机约16h连续检测生长曲线；

D1：取已测好CAR％和细胞活率的HBV CAR-PD1-41BB、HBV CAR、UT，按照阳性活细胞数4×10⁵/ml、0.8×10⁵/ml进行效应细胞准备，按照效靶比1:1、1:5，加入效应细胞50ul/孔，上机连续检测杀伤曲线。

D3：拷贝RTCA的生长和杀伤曲线，停机，收集共培养上清进行细胞因子检测。

细胞因子检测：

取CBA试剂盒(Human Th1/Th2 Cytokine Cytometric Bead Array Kit II，BD,551809)平衡至室温。

吸取2ml Assay Diluent复溶标准品至浓度5000pg/ml，室温平衡30min。

标准品配制：取标准品，标记为S1，依次2倍稀释标准品S2-S9，S10为空白。

配置Human Th1/Th2 Cytokine Capture Beads混合液：取微球溶液A1-A6，震荡混匀后按相同体积混合。

取96孔U形底板，加入50ul的Human Th1/Th2 Cytokine Capture Beads混合液，再加入50ul的Human Th1/Th2 PE Detection Reagent。

细胞因子检测样本400g 5min离心，按每个样本50ul加入样本检测孔，标曲孔加入50ul配制S10-S1。

室温避光孵育180min，加入100ul Wash buffer，300g 5min离心，弃上清。

用100ul流Wash buffer重悬，上样流式检测。

结果显示：HBV CAR和HBV CAR-PD1-41BB均表现出对HepAD38(HBsAg⁺)HCC细胞的显著的特异性杀伤作用，但HBV CAR-PD1-41BB对靶细胞的杀伤作用比HBV CAR更加优异。具体表现为在实验进行到10h时，HBV CAR-PD1-41BB已经造成了HepAD38(HBsAg⁺)靶细胞50％的杀伤，而HBV CAR的杀伤效果仅为22％。而当HBV CAR-PD1-41BB完成了阳性靶细胞的全部杀伤时，HBV CAR仍保留有约18％的靶细胞存活，表明HBV CAR-PD1-41BB比HBV CAR有更强的杀伤作用。

细胞因子检测发现，HBV CAR-PD1-41BB与HepAD38-PD-L1共培养时产生干扰素(IFN-γ)、TNF的量明显高于HBV CAR(图7)，且当三种T细胞(HBV CAR、HBV CAR-PD1-41BB、UT)与HepG2(HBsAg^-PD-L1^-)对照细胞共同培养时，观察显示HBV CAR-PD1-41BB并未对HBsAg-对照细胞有非特异性杀伤作用。

实施例6：HBV CAR-PD1-41BB对不同表达靶细胞杀伤

我们接下来对HBV CAR-PD1-41BB的抗肿瘤效应也进行了分析。因为HBV CAR-PD1-41BB所携带的激活信号包含有HBsAg和PD-L1两种，为了验证HBV CAR-PD1-41BB对于肿瘤细胞表达HBsAg和PD-L1的差异是否具有不同的杀伤能力，我们构建了HBsAg⁺/PD-L1⁺、HBsAg⁺/PD-L1^-、HBsAg^-/PD-L1⁺、HBsAg^-/PD-L1^-四种肝癌细胞系进行功能评估。

D0：取分化好的HepAD38-PD-L1、HepAD38、HepG2-PD-L1、HepG2细胞消化后调整细胞密度至4×10⁵/ml备用，取一块Collagen包被好的RTCA用96孔板，加入50ul/孔M10培养基进行仪器基线测定，再每孔加入密度为4×10⁵/ml对应的细胞50ul，静置约5min后上机约16h连续检测生长曲线。

D1：取已测好CAR％和细胞活率的HBV CAR-PD1-41BB、UT，按照阳性活细胞数4×10⁵/ml、0.8×10⁵/ml进行效应细胞准备，按照效靶比1:1、1:5，加入效应细胞50ul/孔，上机连续检测杀伤曲线。

细胞因子检测按照实施例5细胞因子的检测步骤进行。结果显示，未转染T细胞并未对四种靶细胞起到明显的杀伤作用，而HBV CAR-PD1-41BB对HBsAg⁺/PD-L1⁺靶细胞的杀伤作用显著强于对HBsAg⁺/PD-L1^-靶细胞的杀伤作用(图8)，这表明HBV CAR-PD1-41BB对于PD-L1⁺肝癌细胞的杀伤能力优于对PD-L1-肝癌细胞的杀伤能力。此外，细胞因子检测结果显示，HBV CAR-PD1-41BB与HBsAg^-/PD-L1⁺或HBsAg^-/PD-L1^-靶细胞培养时几乎不分泌细胞因子，与HBsAg⁺/PD-L1⁺靶细胞共同培养时分泌的IFN-γ显著高于HBsAg⁺/PD-L1^-组。

上述实验表明，HBV CAR-PD1-41BB能够靶向消除表达HBsAg的肝癌细胞，对于高表达PD-L1的HBsAg⁺肝癌细胞，HBV CAR-PD1-41BB的抗肿瘤作用更加突出，表现为分泌更多量的细胞因子、肿瘤杀伤能力更强。此外，HBV CAR-PD1-41BB仅靶向杀伤表达HBsAg的肝癌细胞，针对只表达PD-L1而不表达HBsAg的肿瘤细胞，HBV CAR-PD1-41BB并未产生非特异作用。

实施例7：不同浓度游离HBsAg对HBV CAR-PD1-41BB激活作用

为了验证游离的HBsAg对HBV CAR-PD1-41BB的激活作用，我们将HBV CAR-PD1-41BB细胞与HBsAg进行共培养。HBsAg抗原稀释：0.5mg/ml原液取100ul+900ul TCM＝1000ul50ug/ml；再依次稀释至2ug/ml、200ng/ml、2ng/ml各1ml备用。

D0:取已测好CAR％和细胞活率的HBV CAR-PD1-41BB不同阳性率细胞共7组，按照阳性活细胞数4×10⁵/ml进行效应细胞准备，在准备好的96孔U底板中加入对应的HBV CAR-PD1-41BB细胞2E4/50ul/孔；再按照终浓度1000ng/ml、100ng/ml、1ng/ml、0进行添加对应的HBsAg50ul/孔；混匀后放入培养箱过夜。D1：收集共培养上清进行细胞因子检测。

细胞因子检测按照实施例5细胞因子的检测步骤进行。

结果显示：高浓度和中浓度的游离HBsAg存在下，共培养时产生干扰素(IFN-γ)、TNF的量均显著高于低浓度和对照组(图9)，表明HBV CAR-PD1-41BB与HBsAg共孵育可进一步激活T细胞功能，分泌细胞因子跟CAR阳性率以及HBsAg浓度相关。

实施例8：HBV CAR-PD1-41BB针对肿瘤耗竭的靶细胞重复刺激实验

D0：取已测好细胞活率的HBV CAR-PD1-41BB、HBV CAR、UT，按照活细胞数5×10⁵/ml共4ml加入HepAD38-PD-L1汇合度约90％的6孔板中进行第一次刺激。

D4：取2E6的HepAD38-PD-L1加入到T细胞第一次刺激的6孔板中，并调整细胞浓度值5E5/ml在进行5天的第二轮刺激。

D9：取分化好的HepAD38-PD-L1、HepAD38、HepG2细胞消化后调整细胞密度至4×10⁵/ml备用，取一块Collagen包被好的RTCA用96孔板，加入50ul/孔M10培养基进行仪器基线测定，再每孔加入密度为4×10⁵/ml对应的细胞50ul，静置约5min后上机约16h连续检测生长曲线。

D10：取重复刺激的T细胞按照阳性活细胞数2×10⁵/ml、进行效应细胞准备，按照效靶比1:2，加入效应细胞50ul/孔，上机连续检测杀伤曲线。

D11：拷贝RTCA的生长和杀伤曲线，停机，收集共培养上清进行细胞因子检测。

实验数据表明，两轮肿瘤细胞刺激后，只有HBV CAR-PD1-41BB对HBsAg⁺/PD-L1⁺靶细胞仍有明显杀伤作用，而HBV CAR已经没有功能，这表明HBV CAR-PD1-41BB在接受两轮肿瘤细胞刺激后仍然能够保持抗肿瘤作用，且在48小时仍可杀伤80％的肿瘤细胞，表明其杀伤能力并未遭到影响和减弱。我们同时使用HBsAg⁺/PD-L1^-和HBsAg^-/PD-L1^-肝癌细胞进行对照实验，发现HBV CAR-PD1-41BB对于高表达PD-L1的HBsAg⁺肝癌细胞的抗肿瘤作用更加突出，并且没有出现接受PD-1信号改造而产生过度激活造成非特异性杀伤的现象。综上分析，HBV CAR-PD1-41BB能够在多轮肿瘤刺激后仍维持其抗肿瘤作用、保持杀伤能力，因为HBV CAR-PD1-41BB能够将肿瘤细胞系表面的刹车信号(PD-L1)转变成为刺激信号，防止细胞提早进入耗竭状态，从而具有抗耗竭能力并起到持续杀伤作用。

实施例9：HBV CAR-PD1-41BB重复刺激细胞因子和记忆细胞表型试验

此外，我们还深入比较了多轮刺激后T细胞抗肿瘤活性的另两个重要的指标：细胞因子的释放和记忆型T细胞的比例。

细胞因子检测按照实施例5细胞因子的检测步骤进行。

T细胞在经过两轮肿瘤细胞的刺激后，我们对肿瘤细胞和T细胞共培养的上清进行分析，发现HBV CAR-PD1-41BB细胞在与HBsAg⁺/PD-L1⁺细胞共培养时分泌的INF-γ明显高于HBsAg⁺/PD-L1^-细胞组；而对HBV CAR和未转染T细胞几乎都没有分泌细胞因子(图11)这预示着HBV CAR-PD1-41BB有在人体内持续存在并打击靶细胞的潜能。

记忆细胞表型检测：

流式缓冲液配制：DPBS、2％FBS，置于4℃冰箱中备用。

取HBV CAR-PD1-41BB和HBV CAR各1×10⁶细胞，400g 5min离心弃上清，用流式缓冲液洗涤2次。

PE-Cy7-CD4/PerCP-Cy5.5-CD8/BV605-CD45RA/APC-CD62L抗体按1:100比例用流式缓冲液稀释，每个样本加入100ul抗体稀释液，4℃避光孵育30分钟，加入流式缓冲液洗涤细胞，400g 5min离心弃上清，重复2次。

用100ul流式缓冲液重悬细胞，上样流式检测。

两轮刺激后对记忆型T细胞比例进行了检测。采用CD45RA和CD62L两种生物标记物对T细胞进行分选，发现HBV CAR-PD1-41BB在与靶细胞共培养后所含有的记忆性T淋巴干细胞(Tscm，CD45 RA+、CD62L+)比例相比HBV CAR更有优势有在体内持续存在遇到靶细胞再次激活的潜能。

实施例10：免疫缺陷小鼠HBsAg+人HCC移植瘤模型HBV CAR-PD1-41BB体内药效和扩增试验

为评估HBV CAR-PD1-41BB在动物模型体内的抗实体瘤功能，试验选用NCG雌性小鼠(上海南方模式生物科技股份有限公司)在Day-9皮下接种2×10⁷的HepAD38-PDL1-LG-G5肿瘤细胞(HBsAg⁺人肝癌细胞)，Day0，将小鼠分为三组，分别从尾静脉注射Vehicle、HBVCAR-PD1-41BB及未转染T细胞(Mock T)。

结果显示：Day7可见HBV CAR-PD1-41BB组动物体内肿瘤体积增长受到明显抑制，仅为阴性对照组(Mock T)以及空白对照组(Vehicle)的1/3。采用未转染T细胞的动物组在过继移植后T细胞数量迅速减少，HBV CAR-PD1-41BB在第14天扩增至平均约10000个拷贝(图12)，表明HBV CAR-PD1-41BB在移植之后能明显抑制肿瘤生长，并且能继续扩增，未出现耗竭的情况。

采用免疫缺陷小鼠HBsAg(+)HCC CDX安全模型，发现即使大剂量HBV CAR-PD1-41BB注射后所有脏器未见损伤。无肾脏损伤：肾小球结构完整，近曲小管和远曲小管结构清晰，细胞形态正常，未见明显损伤特征；无肝脏损伤：肝脏组织完整，肝小叶结构清晰，组织间隙和血管内可见少量红细胞,未见明显损伤特征(图13)。

实施例11：为免疫缺陷小鼠HBsAg⁺PDL1⁺移植瘤模型HBV CAR-PD1-41BB体内长期药效

实验目的：对受试CAR-T细胞在人源肝癌HepAD38-PDL1-LG-G5细胞株皮下异种移植NCG雌性小鼠模型中的药效学评价。

实验动物：NCG小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22克。

肿瘤细胞接种：目的细胞株皮下接种于NCG小鼠的右侧前腿腋窝，接种量为10x10⁶个细胞(PBS with Matrigel，1:1，0.2ml)。平均肿瘤体积达到100～150mm3分组开始给药

给药方案如下：

结果显示HBV CAR-PD1-41BB高剂量组(2X10⁷)已完全清除小鼠体内肿瘤，且持续到42天没有复发，低剂量组(0.2X10⁷)也具有一定的抑瘤作用，而两个对照组都没有看到肿瘤抑制作用(图14)。

临床前体外数据表明，在HBV CAR基础上增加了PD1-41BB，在杀伤HBsAg+肝癌细胞上：抗肿瘤强度提高1倍以上；杀伤作用特异性进一步提高，对HBsAg-细胞非特异性杀伤降低；抗肿瘤的持久性极大提高，多轮与肿瘤细胞的共培养后，HBV CAR的抗肿瘤活性已然非常微弱，而HBV CAR-PD1-41BB依然能保持强劲的抗肿瘤活性。与过表达PD-L1的HBsAg+肝癌细胞株共同培养后，HBV CAR-PD1-41BB分泌INF-r和TNF的能力比明显高于HBV CAR，HBVCAR-PD1-41BB和HBV CAR所含有的记忆性T淋巴细胞的比例类似，但是HBV CAR-PD1-41BB所含有的记忆性T淋巴干细胞的比例却大幅升高，这提示HBV CAR-PD1-41BB在体内可以保持更长的扩增时间和抗原识别能力。

临床前动物实验数据显示HBV CAR-PD1-41BB在移植之后能明显抑制肿瘤生长，并且能继续扩增，未出现耗竭的情况。临床前试验结果已初步证实HBV CAR-PD1-41BB在体外和动物体内的安全性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种经修饰的免疫细胞，其特征在于，所述经修饰的免疫细胞包含靶向乙肝表面抗原的嵌合抗原受体(HBV CAR)和嵌合转换受体；所述嵌合转换受体包含免疫抑制受体的细胞外结构域(ECD)和介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)；所述ECD与其配体结合在所述经修饰的免疫细胞中产生免疫细胞激活信号而非免疫细胞失活信号。

2.根据权利要求1所述的经修饰的免疫细胞，其特征在于，所述HBV CAR包含乙肝表面抗原(HBsAg)结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激信号域和胞内信号传导结构域；

所述HBsAg结合结构域为抗HBsAg scFv；和/或

所述铰链区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 FC的CH2CH3铰链区、CD28铰链区或CD8铰链区及其组合；和/或

所述跨膜区选自CD28、CD8、CD134、CD137、ICOS或DAP10跨膜区及其组合；和/或

所述共刺激结构域选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS或DAP10胞内结构域及其组合；和/或

所述胞内信号传导结构域选自CD3ζ，FcεRIγ，CD28，CD137，CD134蛋白的胞内信号域及其组合。

3.根据权利要求2所述的经修饰的免疫细胞，其特征在于，所述乙肝表面抗原(HBsAg)结合结构域为HBsAg scFv，所述铰链区为IgG2 FC CH2CH3突变铰链区，所述跨膜区为CD28跨膜区，所述共刺激信号域为CD28胞内信号域，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域。

4.根据权利要求3所述的经修饰的免疫细胞，其特征在于，所述HBV CAR氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述的经修饰的免疫细胞，其特征在于，所述免疫抑制受体包含PD1、CTLA4，BTLA，TIM3，TIGIT，TGFβ受体以及其他任意具有免疫抑制功能或与免疫抑制信号通路相关的蛋白中的任意一种蛋白及其组合，且所述免疫抑制蛋白的ECD序列可存在至少一个氨基酸突变；

和/或

所述共刺激分子包含：CD28、4-1BB、ICOS、CD27、IL-12R,CD3,OX40及其组合，且所述共刺激分子ICD序列可存在至少一个氨基酸突变。

6.根据权利要求5所述的经修饰的免疫细胞，其特征在于，所述ECD为PD1 ECD；优选地，所述PD1 ECD序列存在一个氨基酸突变，132位的丙氨酸突变为亮氨酸，所述突变的PD1 ECD氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

7.根据权利要求5所述的经修饰的免疫细胞，其特征在于，所述ICD为CD28 ICD或4-1BBICD；优选地，所述CD28 ICD氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述4-1BB ICD氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

8.根据权利要求5所述的经修饰的免疫细胞，其特征在于，所述ECD和所述ICD通过跨膜区序列连接；优选地，所述跨膜区包含选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α，β或ζ链,CD28，CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154及其组合，且所述跨膜区序列可存在至少一个氨基酸突变。

9.根据权利要求8所述的经修饰的免疫细胞，其特征在于，所述跨膜区序列为CD8跨膜区序列或CD28跨膜区序列；优选地，所述CD8跨膜区序列如SEQ ID NO:5所示，所述CD28跨膜区序列如SEQ ID NO:6所示。

10.根据权利要求1所述的经修饰的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞选自淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞；优选地，所述免疫细胞为T细胞。

11.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1-10任一项所述的HBV CAR核酸序列；和/或

包含编码权利要求1-10任一项所述的嵌合转换受体的核酸序列；

12.一种载体，其特征在于，所述的载体包含权利要求11所述的核酸分子。

13.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1-10任一项所述的经修饰的免疫细胞、权利要求11所述的核酸分子、权利要求12所述载体。

14.权利要求1-10任一项所述的经修饰的免疫细胞、权利要求11所述的核酸分子、权利要求12所述载体或权利要求13所述的药物组合物在制备用于预防或治疗由HBV感染所引发的相关疾病的药物中的用途。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述HBV感染相关疾病包含肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌所组成的一种或多种。