JP2022536935A - 細胞性免疫及び体液性免疫を誘導するための同種異系t細胞ベースのhivワクチン - Google Patents
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Abstract
本明細書で提供されるのは、CD4+T細胞などの組換え同種異系細胞を含む細胞組成物を投与することを含む、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の患者を治療するための方法である。本発明はさらに、細胞性免疫及び体液性免疫の両方を誘導する同種異系T細胞ベース防御HIVワクチンを作成するための組成物及び方法に関する。【選択図】図1A
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2019年6月17日に出願された米国仮特許出願第62/862,432号に対する優先権を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2019年6月17日に出願された米国仮特許出願第62/862,432号に対する優先権を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供されるのは、CD4+T細胞などの組換え同種異系細胞をさらに含む細胞組成物を投与することを含む、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の患者を治療するための方法である。本発明はさらに、細胞性免疫及び体液性免疫の両方を誘導する同種異系T細胞ベース防御HIVワクチンを作成するための組成物及び方法に関する。
HIVの流行に対しては大きな進歩が見られている。しかし、現在でも年間170万人が新たに感染し、世界中で77万人が死亡している。最も成功した治療法である抗レトロウイルス療法(ART)は、1年あたり18,000ドル~40,000ドルの費用がかかる場合がある。2000年から2016年までにHIVに費やされた合計は、5620億ドルであって、ほぼ1年に500億ドルである。したがって、ワクチン及び治療法がひどく必要とされている。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、CD40L及びCXCL13をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸分子を含む細胞である。
追加の実施形態では、CD40Lは、配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CXCL13は、配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、細胞は、T細胞である。
さらなる実施形態では、細胞は、異種タンパク質をコードする第2及び/または第3の核酸で形質導入またはトランスフェクトされている。
さらなる実施形態では、第2の核酸は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ゲノムを含み、このHIVゲノム核酸は、レトロウイルス逆転写酵素の変異を含み、さらに、このHIVゲノム核酸は、レトロウイルスパッケージングシグナルをコードせず、無効化されたHIVゲノム構築物を作成する。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、CD40L及びCXCL13をコードする1つ以上の異種核酸分子を含むCD4+細胞である。
さらなる実施形態では、CD40Lは、配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CXCL13は、配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、異種CD40Lタンパク質及び異種CXCL13タンパク質を含むCD4+細胞である。
さらなる実施形態では、CD4+細胞はさらに、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ゲノムを含む異種核酸分子を含み、このHIVゲノム核酸は、レトロウイルス逆転写酵素に変異を含み、さらに、HIVゲノム核酸は、レトロウイルスパッケージングシグナルをコードせず、無効化されたHIVゲノム構築物を作成する。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、対象においてHIVを治療する方法であって、組成物を対象に投与することを含み、有効量の本明細書において上記される任意の細胞を投与することを含む方法である。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、免疫応答の増大を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、有効量の本明細書において上記される任意の細胞を投与することを含む方法である。
追加の実施形態では、細胞は対象に対して同種異系である。
追加の実施形態では、細胞は、患者とHLA適合していない。
追加の実施形態では、細胞の投与量は、約1~5×106の範囲である。
追加の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)によって引き起こされる。
さらなる実施形態では、対象において移植片対宿主病(GVHD)が減少または排除される一方で、移植片対ウイルス(GVV)は、増大される。
追加の実施形態では、治療または免疫応答の増大は、対象が改善、減少もしくは検出不可能なウイルス力価を示すか、または安定/非進行性の疾患を示す限り、維持治療として毎週1回から2週間ごとに1回、3週間ごとに1回、月に1回、2ヶ月ごとに1回、3ヶ月ごとに1回、4ヶ月ごとに1回、5ヶ月ごとに1回、6ヶ月ごとに1回、または7ヶ月ごとに1回、または8ヶ月ごとに1回、または9ヶ月ごとに1回、または10ヶ月ごとに1回、または11ヶ月ごとに1回、または毎年1回という時間枠で定期的に繰り返される。
さらなる実施形態では、細胞性及び体液性免疫は、対象において誘導される。
略号:
抗体依存性細胞傷害:ADCC
抗体依存性細胞傷害:ADCC
分化抗原群3:CD3
移植片対腫瘍効果:GVT
移植片対宿主病:GVHD
移植片対ウイルス:GVV
ガンマデルタT細胞:GDT細胞、またγδT細胞。
ヒト免疫不全ウイルス(HIV):後天性免疫不全症候群を引き起こすレンチウイルス。
インバリアントナチュラルキラーT細胞:I型または古典的NKT細胞としても公知のiNK T細胞は、インバリアントのaβT細胞受容体(TCR)及び多くの細胞表面分子をナチュラルキラー(NK)細胞と共通して発現するT細胞の別個の集団である。
ナチュラルキラー細胞:NK細胞
HIVから保護するために十分な免疫応答を誘発するための効果的な努力は限られている。中和抗体の有意な力価を達成し、非ヒト霊長類は感染を防ぎ得るが、これまでのところ、体液性ワクチンのヒトの成功への移行は困難なものであった。細胞応答を促進するワクチンは、いくつかが現在ヒトの治験中であるとおり、動物では有望であることが示されている。しかし、これまでのデータでは、有効性は限られていることが示されている。
強力な体液性応答と細胞性応答を効果的に組み合わせ得るワクチンは、強力なアプローチとなる。そのようなワクチンが防御ワクチンとして失敗したとしても、それは治療ワクチンとしての有効性を持っている場合がある。
本発明は、細胞性免疫及び体液性免疫の両方を誘導する同種異系(または特定の実施形態では自家)T細胞ベースの防御的HIVワクチンを作製するための組成物及び方法に関する。これらの方法及び組成物の一般的な概要は次のとおりである:
ドナーまたは細胞株由来のT細胞は、複製能力のないHIV、または生きた弱毒化HIV株に感染している。
宿主に注入されると、注入された細胞集団が非常に多くない限り、宿主免疫系は、拒絶反応の過程でアロT細胞と係合する機会を体液性免疫系に与えることなく、細胞毒性免疫応答によってのみ、生の弱毒化HIV感染T細胞集団全体を容易に拒絶する。したがって、体液性免疫は誘発されない。宿主B細胞の拒絶プロセスへの動員を確実にするために、感染したアロT細胞は、ウイルスまたは非ウイルスの遺伝子改変ツールによって、ヒトCD40L及びヒトCXCL13を発現するように遺伝子改変される。(図1A、ベクターマップを発現するhCD40L及びhCXCL13の例を参照のこと)。
hCD40L及びhCXCL13分子の発現は、アロT細胞のB細胞特異的拒絶を促進し、アロT細胞及びアロT細胞によって運ばれるHIVゲノムに対する体液性免疫系の活性化を確実にする。
したがって、これらの構築物は、HIVゲノムを同種異系T細胞からピギーバックすることによってHIVに対する体液性免疫及び細胞性免疫を誘発するのに役立ち、ミスマッチの宿主に注入された場合、その拒絶は確実である。
最終的なアロT細胞生成物は、HIVに対する予防ワクチンとして使用される。細胞は数回注入され、初回はプライマーとして機能し、次の1回以上の注入はブースターショットとして機能する。投薬オプション、及び安全な用量/注入された細胞の数の最適化、ならびに注入回数、及びそれらのタイミングは、さらに安全性/有効性研究によって決定されることが期待される。
本発明をより容易に理解できるように、特定の技術的用語及び科学的用語を以下に具体的に定義する。本文書において特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書で使用され、特に明記されていない限り、「約」という用語は、それが修飾する値の±5%ことを意図している。したがって、約100とは95~105を意味する。さらに、「約」という用語は、「約1、2、3、4、または5」などの一連の用語において、ある用語を修飾する。「約」という用語は、リストの各メンバーを修飾することを理解するべきであり、その結果、「約1、2、3、4、または5」とは、「約1、約2、約3、約4、または約5」を意味すると理解され得る。「少なくとも」という用語または「より小さい」、「より大きい」などであるがこれらに限定されない他の定量する修飾子によって修飾されるリストについても同じことが当てはまる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」「an」及び「the」は、文脈が別に指示しない限り複数の言及を含む。
本明細書で使用する場合、用語「含む(comprise)」、「有する(have)」、「有する(has)」及び「含む(include)」ならびにそれらの活用形とは、本明細書において用いる場合、「を含むがこれに限定されるものではない」を意味する。さまざまな組成物及び方法は、さまざまな構成要素またはステップを「含んでいる」という観点で説明されるが(「含むが、これらに限定されない」を意味すると解釈される)、この組成物、方法、及びデバイスはまた、さまざまな構成要素及びステップ「から本質的に構成され」てもよいし、または「からなって」もよく、そのような用語は、本質的にメンバーが制限されているグループを定義するものとして解釈されるべきである。
ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド13(CXCL13)は、Bリンパ球化学誘引物質(BLC)またはB細胞誘引ケモカイン1(BCA-1)とも呼ばれ、ヒトではCXCL13遺伝子によってコードされるタンパク質リガンドである。CXCR5は、CXCL13の受容体である。ケモカインの発現は、リンパ球の動員及び刺激の正のループを開始する。腸上皮細胞でCXCL13を過剰発現させると、固有層のB細胞数の著しい増加、ならびに小腸のリンパ濾胞のサイズ及び数の増加を促進した。これらの結果によって、炎症状態の間の腸におけるCXCL13の過剰発現が、免疫調節及び修復機能を有するB細胞ならびにLTi及びNK細胞の動員に有利に働くことが示唆されている。いくつかの実施形態では、CXCL13は、以下の配列を含む核酸分子によってコードされる:
ATGAAGTTCATCTCGACATCTCTGCTTCTCATGCTGCTGGTCAGCAGCCTCTCTCCAGTCCAAGGTGTTCTGGAGGTCTATTACACAAGCTTGAGGTGTAGATGTGTCCAAGAGAGCTCAGTCTTTATCCCTAGACGCTTCATTGATCGAATTCAAATCTTGCCCCGTGGGAATGGTTGTCCAAGAAAAGAAATCATAGTCTGGAAGAAGAACAAGTCAATTGTGTGTGTGGACCCTCAAGCTGAATGGATACAAAGAATGATGGAAGTATTGAGAAAAAGAAGTTCTTCAACTCTACCAGTTCCAGTGTTTAAGAGAAAGATTCCC(配列番号1)。
ATGAAGTTCATCTCGACATCTCTGCTTCTCATGCTGCTGGTCAGCAGCCTCTCTCCAGTCCAAGGTGTTCTGGAGGTCTATTACACAAGCTTGAGGTGTAGATGTGTCCAAGAGAGCTCAGTCTTTATCCCTAGACGCTTCATTGATCGAATTCAAATCTTGCCCCGTGGGAATGGTTGTCCAAGAAAAGAAATCATAGTCTGGAAGAAGAACAAGTCAATTGTGTGTGTGGACCCTCAAGCTGAATGGATACAAAGAATGATGGAAGTATTGAGAAAAAGAAGTTCTTCAACTCTACCAGTTCCAGTGTTTAAGAGAAAGATTCCC(配列番号1)。
核酸配列のGenbankアクセッション番号はNM_006419.2であり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、CXCL13のアミノ酸配列は、
MKFISTSLLLMLLVSSLSPVQGVLEVYYTSLRCRCVQESSVFIPRRFIDRIQILPRGNGCPRKEIIVWKKNKSIVCVDPQAEWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRKIP(配列番号3)である。
MKFISTSLLLMLLVSSLSPVQGVLEVYYTSLRCRCVQESSVFIPRRFIDRIQILPRGNGCPRKEIIVWKKNKSIVCVDPQAEWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRKIP(配列番号3)である。
遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号1の配列は単に非限定的な例であり、他の核酸配列を使用してCXCL13を発現し得る。いくつかの実施形態では、配列番号3をコードする核酸配列は、配列番号1と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である。いくつかの実施形態では、CXCL13のタンパク質は、配列番号3に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である。この配列は、CXCL13の活性に影響を与えない保存的置換(変異)を含んでもよい。
CD154とも呼ばれるCD40リガンド(CD40L)は、分子のTNFスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質である。これは、抗原提示細胞(APC)のCD40に結合し、標的細胞の種類に応じて多くの効果をもたらす。合計で、CD40Lには3つの結合パートナーがある:CD40、α5β1インテグリン及びαIIbβ3。CD154は共刺激分子として機能し、濾胞ヘルパーT細胞(TFH細胞)と呼ばれるT細胞のサブセットで特に重要である。TFH細胞では、CD40Lは、B細胞表面でCD40と結合することにより、B細胞の成熟及び機能を促進し、それによって細胞間コミュニケーションを促進する。CD40Lの安定した発現により、組換え同種異系CD4+がIL-12を産生して、免疫抑制を克服すること、及びメモリーT細胞の分化を誘発することが可能になる。いくつかの実施形態では、CXCL13は、以下の配列を含む核酸分子によってコードされる:
ATGATCGAAACATACAACCAAACTTCTCCCCGATCTGCGGCCACTGGACTGCCCATCAGCATGAAAATTTTTATGTATTTACTTACTGTTTTTCTTATCACCCAGATGATTGGGTCAGCACTTTTTGCTGTGTATCTTCATAGAAGGTTGGACAAGATAGAAGATGAAAGGAATCTTCATGAAGATTTTGTATTCATGAAAACGATACAGAGATGCAACACAGGAGAAAGATCCTTATCCTTACTGAACTGTGAGGAGATTAAAAGCCAGTTTGAAGGCTTTGTGAAGGATATAATGTTAAACAAAGAGGAGACGAAGAAAGAAAACAGCTTTGAAATGCAAAAAGGTGATCAGAATCCTCAAATTGCGGCACATGTCATAAGTGAGGCCAGCAGTAAAACAACATCTGTGTTACAGTGGGCTGAAAAAGGATACTACACCATGAGCAACAACTTGGTAACCCTGGAAAATGGGAAACAGCTGACCGTTAAAAGACAAGGACTCTATTATATCTATGCCCAAGTCACCTTCTGTTCCAATCGGGAAGCTTCGAGTCAAGCTCCATTTATAGCCAGCCTCTGCCTAAAGTCCCCCGGTAGATTCGAGAGAATCTTACTCAGAGCTGCAAATACCCACAGTTCCGCCAAACCTTGCGGGCAACAATCCATTCACTTGGGAGGAGTATTTGAATTGCAACCAGGTGCTTCGGTGTTTGTCAATGTGACTGATCCAAGCCAAGTGAGCCATGGCACTGGCTTCACGTCCTTTGGCTTACTCAAACTC(配列番号2)。
ATGATCGAAACATACAACCAAACTTCTCCCCGATCTGCGGCCACTGGACTGCCCATCAGCATGAAAATTTTTATGTATTTACTTACTGTTTTTCTTATCACCCAGATGATTGGGTCAGCACTTTTTGCTGTGTATCTTCATAGAAGGTTGGACAAGATAGAAGATGAAAGGAATCTTCATGAAGATTTTGTATTCATGAAAACGATACAGAGATGCAACACAGGAGAAAGATCCTTATCCTTACTGAACTGTGAGGAGATTAAAAGCCAGTTTGAAGGCTTTGTGAAGGATATAATGTTAAACAAAGAGGAGACGAAGAAAGAAAACAGCTTTGAAATGCAAAAAGGTGATCAGAATCCTCAAATTGCGGCACATGTCATAAGTGAGGCCAGCAGTAAAACAACATCTGTGTTACAGTGGGCTGAAAAAGGATACTACACCATGAGCAACAACTTGGTAACCCTGGAAAATGGGAAACAGCTGACCGTTAAAAGACAAGGACTCTATTATATCTATGCCCAAGTCACCTTCTGTTCCAATCGGGAAGCTTCGAGTCAAGCTCCATTTATAGCCAGCCTCTGCCTAAAGTCCCCCGGTAGATTCGAGAGAATCTTACTCAGAGCTGCAAATACCCACAGTTCCGCCAAACCTTGCGGGCAACAATCCATTCACTTGGGAGGAGTATTTGAATTGCAACCAGGTGCTTCGGTGTTTGTCAATGTGACTGATCCAAGCCAAGTGAGCCATGGCACTGGCTTCACGTCCTTTGGCTTACTCAAACTC(配列番号2)。
核酸配列のGenbankアクセッション番号は、NM_000074.2であり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、CD40Lのアミノ酸配列は、
MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(配列番号4)である。
MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(配列番号4)である。
遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号2の配列は単に非限定的な例であり、他の核酸配列を使用してCD40Lを発現してもよい。いくつかの実施形態では、配列番号4をコードする核酸配列は、配列番号2と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である。いくつかの実施形態では、CD40Lのタンパク質は、配列番号4に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である。この配列は、CD40Lの活性に影響を与えない保存的置換(変異)を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、細胞内の核酸分子を指す場合の「異種」という用語は、その細胞が同じタンパク質または配列をコードする類似の配列または遺伝子配列を有する場合でも、核酸分子が天然に存在する細胞のゲノムに天然ではないことを意味する。例えば、CD40L及び/またはCXCL13をコードする異種核酸分子を含む細胞は、CD40L及び/またはCXCL13をコードする核酸分子(複数可)を含むように改変された細胞を指す。これは、トランスフェクションもしくは形質導入、またはCRISPRなどであるがこれらに限定されない他のゲノム編集技術によって行ってもよい。「異種」という用語が細胞内のタンパク質に関して使用される場合、それは異種核酸分子によってコードされるタンパク質を指す。したがって、細胞は、同じタンパク質であって、細胞にとって天然であるタンパク質(異種核酸分子によってコードされていないタンパク質である)、及び細胞に対して異種であるタンパク質(異種核酸分子によってコードされているタンパク質である)を含んでもよい。異種核酸分子は、細胞のゲノムに挿入されることによって、または細胞内のエピソームプラスミドの存在によって、細胞内に一時的に存在してもよいし、または細胞内に安定して存在してもよい。異種核酸分子はまた、ウイルス形質導入を介して細胞に導入されてもよく、これはまた、細胞のゲノムに安定して組み込まれてもよい。
異種タンパク質を発現する組換え細胞はまた、免疫応答が生成されることが望まれる標的抗原を発現するように改変されてもよい。例えば、標的抗原は、HIVタンパク質またはその抗原性断片であってもよい。いくつかの実施形態では、CD40L及び/またはCXCL13を異種発現するT細胞またはCD4+T細胞などの細胞はまた、標的抗原を異種発現する。いくつかの実施形態では、追加の核酸分子は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、このHIVゲノム核酸は、レトロウイルス逆転写酵素に変異を含み、さらに、このHIVゲノム核酸は、レトロウイルスパッケージングシグナルをコードせず、無効化されたHIVゲノム構築物を作成する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、1つ以上のHIV Tat(全長または長さが72及び101アミノ酸のアイソフォーム)、Rev、Pol、GP120、GP160、GP41、env、Gag、Gag-Pol、Nef、Vpr、Vpu、Vifなど、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、標的抗原は、任意のHIVタンパク質である。いくつかの実施形態では、CD40L及び/またはCXCL13を異種発現する細胞は、各HIVタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも、または正確に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のHIVタンパク質、またはその断片を異種発現する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HIV Tat(全長または長さが72及び101アミノ酸のアイソフォーム)である。いくつかの実施形態では、標的抗原はHIV Revである。いくつかの実施形態では、標的抗原はHIV Polである。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HIV GP120である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HIV GP160である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HIV GP41である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HIV envである。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HIV Gagである。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HIV Gag-Polである。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HIV Nefである。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HIV Vprである。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HIV Vpuである。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HIV Vifである。これらの抗原はいずれも、CD40L及び/またはCXCL13を異種発現している細胞で異種発現され得る。いくつかの実施形態では、HIV抗原の代わりに、SHIV抗原を使用し、本明細書で提供される抗原の代わりに同等の抗原を使用してもよい。
HIVゲノムが使用される場合、HIVゲノムプラスミドは市販されており、例示的な変異及びシステムは、例えば、Mol Ther.2017 Aug 2;25(8):1790-1804に記載されている。同様に、中国のHIV-1サブタイプC/B=env及びgag遺伝子を1つのプラスミド中に、ならびに融合タンパク質を発現するように設計されたpol及びnef/tat構築物を第2のプラスミド中に保持する市販のプラスミド骨格pVAX1(プラスミドは1:1の比で混合)も利用可能である(参照Advax,San Diego,CA及びClinical and Vaccine Immunology,Volume 20 Number 3,March 2013,p.397-408。)これは非限定的な例であり、他の構築物を使用してもよい。
組換え同種異系CD4+細胞を作製するために使用される例示的な構築物のベクターマップを図1及び図1Bに示しており、及びこれらの構築物を試験するための概要及び概略図を図2、図3、及び図4に示している。
「同時投与(co-administration)」などの用語は、単独の患者への選択した治療剤の投与を包含することを意味し、薬剤を、同一のもしくは異なる投与経路によって、または同一のもしくは異なる時点で投与するという治療レジメンを含むものとする。
本明細書で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、その存在がタンパク質の天然に存在するリガンドの存在から生じる生物学的活性と同じであるタンパク質の生物学的活性をもたらす化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「部分アゴニスト」という用語は、その存在が、タンパク質の天然に存在するリガンドの存在から生じるものと同じタイプだが、その程度がより低い、タンパク質の生物学的活性を生じる化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、その存在がタンパク質の生物学的活性の程度の減少をもたらす化合物を指す。特定の実施形態では、アンタゴニストの存在は、タンパク質の生物学的活性の完全な阻害をもたらす。特定の実施形態では、アンタゴニストは阻害剤である。
治療組成物(例えば、同種異系T細胞ベースの防御HIVワクチン、組換え同種異系CD4+ベースのワクチン及びこれらの生成物を含む組成物)と組み合わせて使用される場合、「投与する」とは、治療剤を直接標的組織に投与するか、または治療剤を患者に投与して、それによって標的となる組織に治療上プラスの影響を与えることを意味する。
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、限定するものではないが、ヒト及び非ヒト脊椎動物、例えば、野生動物、家畜、及び農場動物を含む。いくつかの実施形態では、交換可能に使用することができる対象または患者は、非ヒト霊長類であり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の対象または患者は動物である。特定の実施形態では、対象または患者は哺乳動物である。特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、対象または患者は非ヒト動物である。特定の実施形態では、対象または患者は非ヒト哺乳動物である。特定の実施形態では、対象または患者は、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの家畜である。特定の実施形態では、対象または患者は、犬または猫などのコンパニオンアニマルである。特定の実施形態では、対象または患者は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの家畜である。特定の実施形態では、対象または患者は動物園の動物である。別の実施形態では、対象または患者は、げっ歯類、イヌ、または非ヒト霊長類などの研究動物である。特定の実施形態では、対象または患者は、トランスジェニックマウスまたはトランスジェニックブタなどの非ヒトトランスジェニック動物である。
「阻害する」という用語は、症状の発症を予防する、症状を軽減する、または疾患、状態、もしくは障害を排除するための、本明細書の実施形態の治療剤の投与を含む。
「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤、または賦形剤が、治療剤の他の成分と適合しなければならず、かつそのレシピエントにとって有害ではないことを意味する。
本明細書で使用される「治療する」、「治療される」、または「治療すること」という用語は、治療的な処置及び予防的または防止的措置の両方を指し、この目的は、望ましくない生理学的状態、障害もしくは疾患を阻害、予防もしくは減速(軽減)すること、または改善、阻害、もしくはその他の方法で有益なもしくは望ましい臨床結果を取得することである。本発明の目的に関して、有益または所望の臨床結果としては、限定するものではないが、症状の改善または軽減、状態、障害または疾患の程度の減少、状態、障害もしくは疾患の状態の安定化(すなわち、悪化しないこと)、状態、障害もしくは疾患の発現の遅延または進行の減速、状態、障害もしくは疾患状態の改善、ならびに検出可能または検出不可能にかかわらず状態、障害または疾患の寛解(部分的または完全)、または向上もしくは改善が挙げられる。治療には、過剰なレベルの副作用なしに臨床的に有意な反応を引き出すことを含む。「治療」とはまた、治療を受けない場合の予測生存期間と比較して、生存期間を延長することも含む。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然源または組換え源に由来するインタクトな免疫グロブリンであってもよく、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、Fab及びF(ab)2、ならびに単鎖抗体及びヒト化抗体を含むさまざまな形態で存在し得る。
「抗体フラグメント」という用語は、インタクトな抗体の一部を指し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、限定するものではないが、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFvフラグメント、線状抗体(linear antibodies)、scFv抗体、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答には、抗体産生、もしくは特定の免疫学的コンピテント細胞の活性化のいずれか、またはその両方が含まれ得る。当業者は、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えDNAまたはゲノムDNAに由来し得る。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、したがって、その用語が本明細書で使用される場合、ある「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解する。この実施形態が2つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むがこれに限定されないこと、及びこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を誘発するためにさまざまな組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコード化される必要が全くないことを理解する。抗原は生成して合成されてもよいし、または生物学的試料から誘導されてもよいことは容易に明らかである。そのような生物学的試料としては、限定するものではないが、組織試料、ウイルスを含むことが疑われる組織試料、細胞、または生体液が含まれ得る。
「自己抗原」という用語は、免疫系によって異物であると誤って認識される任意の自己抗原を意味する。自己抗原は、細胞タンパク質、リン酸化タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質、例としては、細胞表面受容体を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「自己、自家(autologous)」という用語は、後に個体に再導入される、同じ個体に由来する任意の材料を指すことを意味する。
本明細書で使用される「同種異系(の)」という用語は、抗原的に異なるHLAまたはMHC遺伝子座を指す。したがって、同じ種から移された細胞または組織は、抗原的に区別され得る。同系マウスは1つ以上の遺伝子座で異なり得(コンジェニック)、同種異系マウスは同じバックグラウンドを有し得る。
本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答には、抗体産生、もしくは特定の免疫学的コンピテント細胞の活性化のいずれか、またはその両方が含まれ得る。
「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
「ドナー」という用語は、患者のレシピエントではない哺乳動物、例えば、ヒトを指す。ドナーは、例えば、レシピエントとのHLA同一性を有してもよいし、またはレシピエントとの部分的またはより大きなHLA格差を有してもよい。
細胞、細胞型及び/または細胞系統に関して使用される「ハプロタイプ一致」という用語は、本明細書において、ハプロタイプを共有する細胞、または1つの染色体上の密接に関連する遺伝子のセットにおいて実質的に同じ対立遺伝子を有する細胞を指す。ハプロタイプ一致のドナーは、レシピエントとの完全なHLA同一性を有さず、部分的なHLA格差がある。
T細胞及び活性化T細胞(CD3+細胞を含む):T細胞(Tリンパ球とも呼ばれる)は、リンパ球と呼ばれる白血球のグループに属する。リンパ球は一般的に細胞媒介性免疫に関与している。「T細胞」の「T」とは、胸腺(thymus)に由来する細胞、または胸腺の影響を受けて成熟する細胞を指す。T細胞は、T細胞受容体として公知の細胞表面タンパク質の存在によって、B細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞等の他のリンパ球の種類と区別され得る。本明細書で使用される「活性化T細胞」という用語は、クラスII主要組織適合遺伝子(MHC)マーカーの文脈で提示される抗原決定基の認識によって、免疫応答(例えば、活性化T細胞のクローン増殖)を生じるように刺激されたT細胞を指す。T細胞は、抗原決定基、サイトカイン及び/またはリンホカインならびに分化抗原群細胞表面タンパク質(例えば、CD3、CD4、CD8など及びそれらの組み合わせ)の存在によって活性化される。分化抗原群のタンパク質を発現する細胞は、T細胞の表面でのそのタンパク質の発現に対して「陽性」であると言われることが多い(例えば、CD3またはCD4の発現に陽性の細胞は、CD3+またはCD4+と呼ばれる)。CD3及びCD4タンパク質は、細胞表面受容体または補助受容体であり、T細胞のシグナル伝達に直接及び/または間接的に関与し得る。
本明細書で使用される「末梢血」という用語は、血液の循環プールから得られるかまたは調製され、リンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔離されない、血液の細胞成分(例えば、赤血球、白血球、及び血小板)を指す。
「末梢血単核細胞」、「PBMC」または「単核細胞」とは、抗がん免疫療法に通常使用される末梢血から分離された単核細胞を指す。末梢血単核細胞は、Ficoll-Hypaque密度勾配法などの公知の方法を使用して収集されたヒト血液から取得され得る。
本発明の1つの例示的な実施形態によれば、「末梢血単核細胞」は、任意の適切な人から得られ得る。本明細書で使用される末梢血単核細胞などの供給源を含むドナーリンパ球細胞の供給源は、以下を含む所望のリンパ球細胞の単離のために、レシピエント患者に対して同種異系であっても、または自己由来であってもよい:CD4+細胞、NK細胞、γδT細胞、iNKT細胞、CD3 T細胞、または本発明による抗HIV、防御及び/または治療の方法で使用するための他の組み合わせ。特定の実施形態では、組換え細胞は同種異系であり、他の実施形態では、それらは自己由来であってもよい。
本明細書で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、体の「外側」を指す。
「疾患」とは、対象が恒常性を維持することができず、疾患が改善されない場合、動物の健康が悪化し続けるという、対象の健康状態である。対照的に、対象における「障害」とは、その対象が恒常性を維持し得るが、対象の健康状態が、その障害がない場合よりも不利である健康状態である。治療せずに放置すると、障害は必ずしも対象の健康状態をさらに低下させるとは限らない。
本明細書で使用される「有効量」とは、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。
「エンコーディング」とは、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指し、定義されたヌクレオチド(すなわち、rRNA、tRNA及びmRNA)の配列または定義されたアミノ酸配列及びそれから生じる生物学的特性のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のためのテンプレートとして機能する。したがって、その遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳が、細胞または他の生物学的システムにおいてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はそのタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常は配列リストに記載されているコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖との両方とも、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると言ってもよい。
本明細書で使用される場合、「内因性」とは、生物、細胞、組織もしくは系からの、またはその内部で生成される、任意の物質を指す。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織もしくは系から導入されるか、またはその外部で生成された任意の物質を指す。細胞内の異種核酸分子は、外因性の核酸分子である。
本明細書で使用される「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列の、そのプロモーターによって駆動される転写及び/または翻訳として定義される。
「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターとしては、組換えポリヌクレオチドを組み込んだ、コスミド、プラスミド(例えば、裸またはリポソームに含まれる)、及びウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)などの当該分野で公知の全てのベクターが挙げられる。
「相同」とは、2つのポリペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。2つの比較された配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、分子はその位置で相同である。2つの配列間の相同性のパーセントとは、2つの配列によって共有される一致するまたは相同な位置の数を比較した位置の数で割り、100でかけた関数である。例えば、2つの配列の10個の位置のうち6個が一致または相同であるならば、その2つの配列は60%相同である。例として、DNA配列ATTGCCとTATGGCは、50%の相同性を共有している。一般に、比較は、最大の相同性を与えるように2つの配列が整列されているときに行われる。
本明細書で使用される「免疫グロブリン」または「Ig」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスとして定義される。B細胞によって発現される抗体は、BCR(B細胞受容体)または抗原受容体と呼ばれることもある。このクラスのタンパク質に含まれる5つのメンバーは、IgA、IgG、IgM、IgD、及びIgEである。
「単離された」とは、自然の状態から変化または取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形で存在してもよく、または、例えば、宿主細胞などの非天然環境に存在してもよい。「単離された」生物学的構成要素(核酸、タンパク質または細胞など)は、他の生物学的構成要素(細胞破片、他のタンパク質、核酸または細胞型など)から実質的に分離または精製して取り出されている。「単離された」生物学的構成要素としては、標準的な精製方法によって精製された構成要素が挙げられる。
疾患の予防、治療、または改善:疾患の「予防」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「治療すること」とは、疾患または病的状態の徴候または症状をそれが発症し始めた後に改善する治療的介入を指す。「改善する」とは、疾患の徴候または症状の数または重症度の低減を指す。
本明細書で使用される場合、組換え体は一般に以下を指す:組換え核酸またはタンパク質とは、天然に存在しない配列を有するか、または配列の2つの他の方法で分離されたセグメントの人工的な組み合わせによって作製される配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子工学技術によってしばしば達成される。
本明細書で使用される場合、一般的に存在する核酸塩基の以下の略語を使用する。「A」はアデノシン、「C」はシトシン、「G」はグアノシン、「T」はチミジン、「U」はウリジンを指す。
本明細書で使用される「白血球(leukocyte)」または「白血球(white blood cell)」という用語は、単球、好中球、好酸球、好塩基球、及びリンパ球を含む任意の免疫細胞を指す。本明細書で使用される「リンパ球」という用語は、リンパ球に一般的に見られる細胞を指し、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)、T細胞、及びB細胞を含む。上記の免疫細胞型をさらなるサブセットに分割することができることは、当業者によって理解されるであろう。
本明細書で使用される「腫瘍浸潤性白血球」という用語は、固形腫瘍に存在する白血球を指す。
本明細書で使用される「血液試料」という用語は、血漿、血液から単離された血球などの血液から調製された任意の試料を指す。
本明細書で使用される「精製された試料」という用語は、1つ以上の細胞サブセットが濃縮されている任意の試料を指す。試料は、サイズ、タンパク質発現などの特性に基づいて細胞を除去または単離することによって精製され得る。
本開示において有用な薬学的に許容される担体(ビヒクル)は従来のものである。Remington’s Pharmaceutical Sciences,E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,15th Edition(1975)は、1つ以上の治療用組成物、及び追加の薬剤の医薬送達に適した組成物及び製剤について説明している。
本明細書で提供される組成物及び細胞は、任意の適切な方法によって投与され得る。本明細書で提供される実施形態の組成物及び細胞は、さまざまな形態であり得る。これらとしては、例えば、液体及び半固体、例えば、液体溶液(例えば、注射可能及び注入可能な溶液)、分散液または懸濁液、リポソーム及び坐剤が挙げられる。この形態は、意図された投与様式及び治療用途に依存する。いくつかの実施形態では、組成物は、注射可能または注入可能な溶液の形態である。いくつかの実施形態では、投与の様式は、非経口的である(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)。いくつかの実施形態では、治療用組成物(医薬組成物)は、静脈内注入または注射によって投与される。いくつかの実施形態では、治療用分子は、筋肉内注射または皮下注射によって投与される。いくつかの実施形態では、治療用組成物は、例えば、標的部位への注射によって、局所的に投与される。「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という句は、本明細書において用いる場合、通常は注射による、腸内及び局所の投与以外の投与様式を意味し、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内注射ならびに吸入を含む。
一般に、送達に適した担体またはビヒクルの性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどのような薬学的及び生理学的に許容される流体を含む注射可能な流体を含む。固体組成物(例えば、粉末、丸剤、錠剤、またはカプセル形態)の場合、従来の非毒性固体担体としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、及びpH緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウレートなどの少量の非毒性補助物質を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、溶液、懸濁液またはその他の形態のいずれかで、以下のうちの1つ以上を含み得る:DMSO、滅菌希釈液、例えば、注射用水、生理溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、不揮発性油、例えば、合成のモノまたはジグリセリド(溶媒または懸濁媒体として機能し得る)、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒等、抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム、キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸、緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、ならびに等張性調節のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。
本明細書に記載の組成物及び方法が治療し得る疾患としては、ウイルス感染症などの微生物感染症が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ウイルス感染症」とは、体内にウイルスが存在することによって引き起こされる感染症を意味する。ウイルス感染症としては、慢性または持続性のウイルス感染症が挙げられ、これは、宿主に感染し得、致命的となる前に、通常は数週間、数ヶ月、または数年という長期間にわたって宿主の細胞内で増殖し得るウイルス感染症である。慢性感染症を引き起こすウイルスとしては、例えば、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)、単純ヘルペス、及び他のヘルペスウイルス、B型肝炎及びC型肝炎のウイルス、ならびに他の肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、及びはしかウイルス(全てが重要な臨床疾患を生じ得る)が挙げられる。感染が長引くと、最終的には疾患の誘発につながる場合があり、例えば、C型肝炎ウイルスの肝臓癌の場合、患者にとって致命的となり得る。本発明に従って治療され得る他の慢性ウイルス感染症としては、エプスタインバーウイルス(EBV)、ならびに腫瘍に関連し得るウイルスなどの他のウイルスが挙げられる。
組換え同種異系CD4+HIVワクチン細胞または本明細書に記載のそのような細胞を含む組成物及び方法で治療または予防され得るウイルス感染の例としては、限定するものではないが、レトロウイルス(例えば、ヒトT細胞リンパ球栄養性ウイルス(HTLV))によって引き起こされるウイルス感染、特にI型及びII型、ならびにヒト免疫不全ウイルス(HIV)が挙げられる。ウイルス感染の治療及び/または予防には、限定するものではないが、当該感染に関連する1つ以上の症状の緩和、ウイルス複製及び/もしくはウイルス負荷の阻害、減少もしくは抑制、及び/または免疫応答の強化が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「免疫不全」とは、免疫系の少なくとも1つの本質的な機能を欠いていることを意味する。本明細書で使用される場合、「免疫不全対象」(ヒトなど)とは、免疫系の特定の構成要素を欠くか、または免疫系の特定の構成要素(例えば、B細胞、T細胞、NK細胞またはマクロファージなど)の機能を欠く対象である。場合によっては、免疫不全の対象は、機能的な免疫細胞(B細胞、T細胞またはNK細胞など)の発達を防止または阻害する1つ以上の遺伝的変化を含む。いくつかの例では、遺伝的変化はIL17またはIL17受容体にある。
本明細書で使用される場合、「免疫抑制された」とは、免疫系の活性または機能の低下を指す。対象は、例えば、免疫抑制剤化合物による治療に起因して、または疾患もしくは障害の結果として、免疫抑制され得る(例えば、HIV感染または遺伝的欠陥に起因する免疫抑制)。場合によっては、免疫抑制は、T細胞などの機能的な免疫細胞の発達を防止または阻害する遺伝子変異の結果として発生する。
本発明のいくつかの実施形態では、「治療有効量」とは、組換えT細胞(例えば、CD4+T細胞)ワクチン細胞、または本発明のそのような細胞を含む組成物を投与されていない動物または動物のグループ(例えば、2、3、5、10またはそれ以上の動物)におけるウイルス力価または微生物力価と比較して、組換え同種異系CD4+HIVワクチン細胞またはそのような細胞を含む組成物を投与され、本明細書に記載の関連する方法で治療された、対象/患者/動物において、ウイルス力価の少なくとも2.5%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも25%、少なくとも35%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の減少をもたらす、本明細書に記載の標的抗原、例えば、HIVタンパク質、ワクチン細胞、またはそのような細胞を含む組成物を含む、CD4+のような、組換え同種異系または自家T細胞の量である。
特定の実施形態では、組換え同種異系または自家CD4+HIVワクチン細胞またはそのような細胞を含む組成物は、抗菌性剤、抗ウイルス剤及び/または他の治療剤と同時に投与してもよい。あるいは、そのような細胞を含む組換え同種異系または自家CD4+HIVワクチン細胞または組成物は、抗菌、抗ウイルス、及び他の治療剤が投与された時間より前の選択された時間で投与され得る。
本明細書で提供されるように、組換えT細胞(例えば、CD4+細胞)は、いくつかの実施形態では、細胞を投与される患者と比較して同種異系であってもよいし、またはそれらは自己であっても、もしくはHLA適合であってもよい。
細胞源
末梢血単核細胞(PBMC)は、廃棄された非特定化白血球減少フィルター(American Red Cross)から得られた試料のFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離、またはインフォームドコンセントを得た健康なボランティアからの献血によって分離され得る。細胞集団、供給源、及び所望の細胞型を選択または濃縮するための方法の説明は、例えば、米国特許第9,347,044号に見出され得る。哺乳動物を治療するための本明細書に記載の方法における使用のための細胞の集団は、ヒト細胞のように、適合した種でなければならない。細胞は、動物、例えば、ヒトの患者から得てもよい。細胞が動物から得られた場合、それらは最初に培養で、例えば形質転換によって樹立された場合があり、またはより好ましくは、それらは予備精製法に供された場合がある。例えば、細胞集団は、細胞表面マーカーの発現に基づく正または負の選択によって操作されてもよく、インビトロもしくはインビボで1つ以上の抗原で刺激されてもよく、インビトロもしくはインビボで1つ以上の生物学的修飾因子で処理されてもよく、またはこれらのいずれかまたは全ての組み合わせであってもよい。例示的な実施形態では、細胞集団は、非T細胞及び/または特定のT細胞サブセットの枯渇のために陰性選択に供する。陰性選択は、CD19及びCD20、単球マーカーCD14、NK細胞マーカーCD56などのB細胞マーカーを含むさまざまな分子の細胞表面発現に基づいて実行され得る。あるいは、細胞集団を、非CD34+造血細胞及び/または特定の造血細胞サブセットの枯渇のために陰性選択に供してもよい。陰性選択は、例えば、MACSまたはカラム分離などを通して他の細胞型の分離に使用され得る、抗体のカクテル(例えば、CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123、及びCD235a)など、さまざまな分子の細胞表面発現に基づいて実行され得る。
末梢血単核細胞(PBMC)は、廃棄された非特定化白血球減少フィルター(American Red Cross)から得られた試料のFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離、またはインフォームドコンセントを得た健康なボランティアからの献血によって分離され得る。細胞集団、供給源、及び所望の細胞型を選択または濃縮するための方法の説明は、例えば、米国特許第9,347,044号に見出され得る。哺乳動物を治療するための本明細書に記載の方法における使用のための細胞の集団は、ヒト細胞のように、適合した種でなければならない。細胞は、動物、例えば、ヒトの患者から得てもよい。細胞が動物から得られた場合、それらは最初に培養で、例えば形質転換によって樹立された場合があり、またはより好ましくは、それらは予備精製法に供された場合がある。例えば、細胞集団は、細胞表面マーカーの発現に基づく正または負の選択によって操作されてもよく、インビトロもしくはインビボで1つ以上の抗原で刺激されてもよく、インビトロもしくはインビボで1つ以上の生物学的修飾因子で処理されてもよく、またはこれらのいずれかまたは全ての組み合わせであってもよい。例示的な実施形態では、細胞集団は、非T細胞及び/または特定のT細胞サブセットの枯渇のために陰性選択に供する。陰性選択は、CD19及びCD20、単球マーカーCD14、NK細胞マーカーCD56などのB細胞マーカーを含むさまざまな分子の細胞表面発現に基づいて実行され得る。あるいは、細胞集団を、非CD34+造血細胞及び/または特定の造血細胞サブセットの枯渇のために陰性選択に供してもよい。陰性選択は、例えば、MACSまたはカラム分離などを通して他の細胞型の分離に使用され得る、抗体のカクテル(例えば、CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123、及びCD235a)など、さまざまな分子の細胞表面発現に基づいて実行され得る。
細胞の集団としては、末梢血単核細胞(PBMC)、混合集団を含む全血またはその画分、脾臓細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤リンパ球、白血球アフェレーシスによって得られた細胞、生検組織、リンパ節、例えば、腫瘍から流入するリンパ節が挙げられる。適切なドナーとしては、免疫化されたドナー、免疫化されていない(ナイーブ)ドナー、治療されたまたは未治療のドナーが挙げられる。「治療された」ドナーとは、1つ以上の生物学的修飾剤に曝露されたドナーである。「未治療」のドナーとは、1つ以上の生物学的修飾剤に曝露されていない。
T細胞を含む細胞の集団を取得する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、末梢血単核細胞(PBMC)は、当該技術分野で公知の方法に従って記載されるように得ることができる。そのような方法の例は、実施例に記載されており、Kim et al.(1992)、Biswas et al.(1990)、Biswas et al.(1991)によって考察されている。
対象から細胞試料を取得し、それを所望の細胞型について濃縮することも可能である。例えば、PBMCは、本明細書に記載されるように血液から単離され得る。向流遠心分離(水簸)を使用して、PBMCからT細胞を濃縮し得る。細胞は、所望の細胞型の細胞表面のエピトープに結合する抗体による分離及び/または活性化などのさまざまな技術を使用して他の細胞から分離され得、例えば、一部のT細胞分離キットでは、抗体結合ビーズを使用して細胞を活性化し、次いで同じビーズでカラム分離を行う。使用され得る別の方法としては、細胞表面マーカーに対する抗体を使用して、受容体の関与によって細胞を活性化することなく特定の細胞型を選択的に濃縮する陰性選択が挙げられる。
骨髄細胞は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、または他の骨髄腔から得てもよい。骨髄は患者から取り出して、さまざまな分離と洗浄手順によって分離し得る。骨髄細胞を分離するための公知の手順は、以下のステップを含む:a)骨髄懸濁液を3つの画分に遠心分離し、中間画分、すなわちバフィーコートを収集すること、b)ステップ(a)のバフィーコート画分を、分離液、通常はFicoll(Pharmacia Fine Chemicals ABの商標))でもう一度遠心分離し、骨髄細胞を含む中間画分を収集する、c)再輸血可能な骨髄細胞の回収のために、ステップ(b)から収集された画分を洗浄すること。
T細胞が豊富な細胞の集団を使用したい場合、そのような細胞の集団は、連続フローセルセパレーターを使用する白血球アフェレーシス及び機械的アフェレーシスによって、細胞の混合集団から得てもよい。例えば、T細胞は、Ficoll-Hypaque(商標)勾配での分離、Percoll勾配での分離、または水簸など、任意の公知の方法でバフィーコートから分離され得る。
ウイルスベクター媒介の遺伝子導入の方法
特定の実施形態では、導入遺伝子は、細胞への遺伝子導入を媒介するためにウイルス粒子に組み込まれる。通常、ウイルスは、生理的条件下で適切な宿主細胞に単にさらされ、ウイルスの取り込みが可能になる。(米国特許第9,089,520号を参照)本発明の方法は、以下に論じられるように、またレンチウイルスベクターも含むさまざまなウイルスベクターを使用して有利に使用される。
特定の実施形態では、導入遺伝子は、細胞への遺伝子導入を媒介するためにウイルス粒子に組み込まれる。通常、ウイルスは、生理的条件下で適切な宿主細胞に単にさらされ、ウイルスの取り込みが可能になる。(米国特許第9,089,520号を参照)本発明の方法は、以下に論じられるように、またレンチウイルスベクターも含むさまざまなウイルスベクターを使用して有利に使用される。
1.アデノウイルス
アデノウイルスは、中型のDNAゲノム、操作の容易さ、高力価、広い標的細胞範囲、及び高い感染力のおかげで、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適している。おおよそ36kbのウイルスゲノムは、100~200塩基対(bp)の逆方向末端反復(ITR)に囲まれており、ウイルスDNAの複製及びパッケージングに必要なシス作用エレメントが含まれている。異なる転写ユニットを含むゲノムの初期(E)及び後期(L)領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される。
アデノウイルスは、中型のDNAゲノム、操作の容易さ、高力価、広い標的細胞範囲、及び高い感染力のおかげで、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適している。おおよそ36kbのウイルスゲノムは、100~200塩基対(bp)の逆方向末端反復(ITR)に囲まれており、ウイルスDNAの複製及びパッケージングに必要なシス作用エレメントが含まれている。異なる転写ユニットを含むゲノムの初期(E)及び後期(L)領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される。
E1領域(E1A及びE1B)は、ウイルスゲノム及びいくつかの細胞遺伝子の転写調節に関与するタンパク質をコードする。E2領域(E2A及びE2B)の発現により、ウイルスDNA複製用のタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、及び宿主細胞の遮断に関与している(Renan,M.J.(1990)Radiother Oncol.,19,197-218)。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子(L1、L2、L3、L4、及びL5)の産物は、主要な後期プロモーター(MLP)によって生じた単一の一次転写産物の有意なプロセシング後にのみ発現される。MLP(16.8マップ単位に位置)は、感染後期に特に効率的であり、このプロモーターから生じる全てのmRNAは、5’三分節リーダー(TL)配列を持っており、翻訳に役立つものとなる。
アデノウイルスを遺伝子治療に最適化するためには、DNAの大きなセグメントを含めることができるように積載能力を最大化する必要がある。特定のアデノウイルス産物に関連する毒性及び免疫反応を低減することも非常に望ましい。2つの目標は、アデノウイルス遺伝子の除去が両方に役立つという点で、ある程度は同じ範囲にある。本発明の方法を実践することにより、比較的容易に治療構築物を操作する能力を保持したままで、これらの両方の目標を達成することが可能である。
ウイルスDNA複製に必要なシスエレメントは全て、線形ウイルスゲノムのどちらかの末端の逆方向末端反復(ITR)(100~200bp)には局在しているので、DNAの大きな置換が可能である。ITRを含むプラスミドは、欠陥のないアデノウイルスの存在下で複製し得る(Hay,R.T.,et al.,J Mol.Biol.1984 Jun.5;175(4):493-510)。したがって、これらの要素をアデノウイルスベクターに含めると、複製が可能になる場合がある。
さらに、ウイルスカプセル化のパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端で194~385bp(0.5~1.1マップ単位)の間に局在している(Hearing et al.,J.(1987)Virol.,67,2555-2558)。このシグナルは、バクテリオファージラムダDNAのタンパク質認識部位を模倣しており、左端に近いが粘着末端配列の外側にある特定の配列が、ヘッド構造へのDNAの挿入に必要なタンパク質への結合を媒介する。AdのE1置換ベクターによって、ウイルスゲノムの左端にある450bp(0~1.25マップ単位)断片が293細胞にパッケージングを指示し得ることが示されている(Levrero et al.,Gene,101:195-202,1991)。
以前には、アデノウイルスゲノムの特定の領域が哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ、それによってコードされる遺伝子が発現され得ることが示されている。これらの細胞株は、この細胞株によってコードされるアデノウイルス機能を欠くアデノウイルスベクターの複製をサポートし得る。野生型ウイルスまたは条件付き欠損変異体などのベクターを「助ける」ことによる複製欠損アデノウイルスベクターの補完の報告もある。
複製欠損アデノウイルスベクターは、ヘルパーウイルスによってトランスで補完され得る。この観察だけでは、複製欠損ベクターの単離は可能ではないが、複製機能を提供するために必要なヘルパーウイルスの存在は、あらゆる調製物を汚染する。したがって、複製欠損ベクターの複製及び/またはパッケージングに特異性を追加する、追加のエレメントが必要であった。そのエレメントは、アデノウイルスのパッケージング機能に由来する。
アデノウイルスのパッケージングシグナルは、従来のアデノウイルスマップの左端に存在することが示されている(Tibbetts et.al.(1977)Cell,12,243-249)。後の研究では、ゲノムのE1A(194~358bp)領域に欠失がある変異体は、初期(E1A)機能を補完する細胞株でも成長が不十分であることが示された(Hearing and Shenk,(1983)J.Mol.Biol.167,809-822)。補償的なアデノウイルスDNA(0~353bp)が変異体の右端に再結合されたとき、ウイルスは正常にパッケージングされた。さらなる突然変異分析により、Ad5ゲノムの左端にある短い繰り返しの位置依存エレメントを特定した。リピートの1つのコピーは、ゲノムのいずれかの端に存在する場合は効率的なパッケージングに十分であることがわかったが、Ad5 DNA分子の内部に向かって移動した場合は十分ではない(Hearing et al.,J.(1987)Virol.,67,2555-2558)。
パッケージングシグナルの変異バージョンを使用することにより、さまざまな効率でパッケージ化されているヘルパーウイルスを作成することが可能である。通常、変異とは点突然変異または欠失である。低効率のパッケージングを伴うヘルパーウイルスが、ヘルパー細胞で増殖する場合、野生型ウイルスと比較して速度は遅いが、ウイルスはパッケージングされ、それによってヘルパーの増殖が可能になる。ただし、これらのヘルパーウイルスが野生型パッケージングシグナルを含むウイルスとともに細胞内で増殖する場合、野生型パッケージングシグナルは、変異バーションよりも優先的に認識される。パッケージングファクターの量が限られていることを考えれば、ヘルパーと比較した場合、野生型シグナルを含むウイルスは選択的にパッケージ化される。選好が十分に大きければ、均質に近いストックが達成され得る。
特定の組織または種に対するADV構築物の向性を改善するために、受容体結合繊維配列をアデノウイルス分離株間で置換し得る場合が多い。例えば、アデノウイルス5に見られるコクサッキー-アデノウイルス受容体(CAR)リガンドは、アデノウイルス35のCD46結合繊維配列の代わりに使用でき、ヒト造血細胞に対する結合親和性が大幅に向上したウイルスになる。結果として生じる「シュードタイプ(pseudotyped)」ウイルス、Ad5f35は、いくつかの臨床的に開発されたウイルス分離株の基礎となっている。さらに、標的細胞へのウイルスの再標的化を可能にするためにファイバーを改変するためのさまざまな生化学的方法が存在する。方法には、二機能性抗体の使用(一端がCARリガンドに結合し、一端が標的配列に結合する)、及びカスタマイズされたアビジンベースのキメラリガンドとの会合を可能にするファイバーの代謝性ビオチン化が含まれる。あるいは、リガンド(例えば、ヘテロ二官能性リンカーによる抗CD205(例えば、PEG含有)を、アデノウイルス粒子に結合させてもよい。
2.レトロウイルス
レトロウイルスとは、逆転写のプロセスによって感染細胞内でRNAを二本鎖DNAに変換する能力を特徴とする一本鎖RNAウイルスの群である(Coffin,(1990)In:Virology,ed.,New York:Raven Press,pp.1437-1500)。次いで、得られたDNAを、プロウイルスとして細胞染色体に安定して組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。組み込みにより、レシピエント細胞とその子孫にウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムには、それぞれ、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、及びエンベロープ成分をコードする3つの遺伝子(gag、pol、及びenv)が含まれている。psiと呼ばれるgag遺伝子の上流に見出される配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。2つのロングターミナルリピート(LTR)配列は、ウイルスゲノムの5’及び3’末端に存在する。これらは強力なプロモーター及びエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である(Coffin,1990)。
レトロウイルスとは、逆転写のプロセスによって感染細胞内でRNAを二本鎖DNAに変換する能力を特徴とする一本鎖RNAウイルスの群である(Coffin,(1990)In:Virology,ed.,New York:Raven Press,pp.1437-1500)。次いで、得られたDNAを、プロウイルスとして細胞染色体に安定して組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。組み込みにより、レシピエント細胞とその子孫にウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムには、それぞれ、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、及びエンベロープ成分をコードする3つの遺伝子(gag、pol、及びenv)が含まれている。psiと呼ばれるgag遺伝子の上流に見出される配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。2つのロングターミナルリピート(LTR)配列は、ウイルスゲノムの5’及び3’末端に存在する。これらは強力なプロモーター及びエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である(Coffin,1990)。
レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損しているウイルスを生成する。ビリオンを生成するために、gag、pol、及びenv遺伝子を含むが、LTR及びpsi成分を含まないパッケージング細胞株を構築する(Mann et al.,(1983)Cell,33,153-159)。ヒトcDNAを含む組換えプラスミドが、レトロウイルスLTR及びpsi配列とともにこの細胞株に導入されると(例えばリン酸カルシウム沈殿により)、psi配列によって、組換えプラスミドのRNA転写物をウイルス粒子にパッケージングすることが可能になり、これは、その後、培養培地に分泌される(Nicolas,J.F., and Rubenstein,J.L.R.,(1988)In:Vectors:a Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Rodriquez and Denhardt,Eds.)。Nicolas and Rubenstein;Temin et al.,(1986)Gene Transfer,Kucherlapati(ed.),New York:Plenum Press,pp.149-188;Mann et al.,1983)。組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、必要に応じて濃縮し、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞型に感染し得る。しかし、多くの種類のレトロウイルスの組み込み及び安定した発現には、宿主細胞の分裂が必要である(Paskind et al.,(1975)Virology,67,242-248)。レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするように設計されたアプローチは、最近、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて開発された。この改変は、アシアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞などの細胞の特異的感染を可能にする場合があり、これが望ましい場合がある。
組換えレトロウイルスを標的とする別のアプローチを設計し、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び特定の細胞受容体に対するビオチン化抗体を使用した。ストレプトアビジンを使用することにより、ビオチン成分を介して抗体を結合させた(Roux et al.,(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,86,9079-9083)。主要組織適合遺伝子複合体クラスI及びクラスII抗原に対する抗体を使用して、これらの表面抗原を保有するさまざまなヒト細胞の感染を、インビトロでのエコトロピックウイルスで実証した(Roux et al.,1989)。
3.アデノ随伴ウイルス
AAVは、約4700塩基対の直鎖の一本鎖DNAを利用する。逆方向末端反復はゲノムに隣接している。ゲノム内には2つの遺伝子が存在し、多くの異なる遺伝子産物を生み出す。最初のcap遺伝子は、VP-1、VP-2、及びVP-3と呼ばれる3つの異なるビリオンタンパク質(VP)を生成する。第2のrep遺伝子は、4つの非構造タンパク質(NS)をコードする。これらのrep遺伝子産物のうち1つ以上は、AAV転写のトランス活性化を担う。
AAVは、約4700塩基対の直鎖の一本鎖DNAを利用する。逆方向末端反復はゲノムに隣接している。ゲノム内には2つの遺伝子が存在し、多くの異なる遺伝子産物を生み出す。最初のcap遺伝子は、VP-1、VP-2、及びVP-3と呼ばれる3つの異なるビリオンタンパク質(VP)を生成する。第2のrep遺伝子は、4つの非構造タンパク質(NS)をコードする。これらのrep遺伝子産物のうち1つ以上は、AAV転写のトランス活性化を担う。
AAVの3つのプロモーターは、ゲノム内のマップ単位での位置によって指定される。これらは、左から右に、p5、p19、及びp40である。転写は6つの転写物を生じ、2つは3つのプロモーターのそれぞれで開始され、各ペアの1つがスプライシングされる。マップ単位42~46から派生したスプライス部位は、各転写産物で同じである。4つの非構造タンパク質は長い方の転写物に明らかに由来し、3つのビリオンタンパク質は全て最小の転写物から生じる。
AAVはヒトの病的状態とは関係ない。興味深いことに、効率的な複製のために、AAVは、単純ヘルペスウイルスI及びII、サイトメガロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、そしてもちろんアデノウイルスなどのウイルスからの「ヘルプ」機能を必要とする。ヘルパーの最も特徴的な特徴はアデノウイルスであり、このウイルスの多くの「初期」機能が、AAV複製を支援することが示されている。AAV repタンパク質の発現が低レベルであれば、AAVの構造的発現を抑制していると考えられており、ヘルパーウイルス感染はこのブロックを取り除くと考えられている。
AAVベクターの末端反復は、AAVまたは改変されたAAVゲノムを含むp201などのプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化によって(Samulski et al.,J.Virol.,61:3096-3101(1987))、またはAAVの公開された配列に基づく末端反復の化学的または酵素的合成を含むがこれらに限定されない他の方法によって、得てもよい。その末端反復は、例えば、欠失分析によって、機能、すなわち、安定した部位特異的組み込みを可能にするために必要とされるAAV ITRの最小配列または一部が決定され得る。また、安定した部位特異的組み込みを指示する末端反復の能力を維持しながら、配列のどの小さな変更を許容できるかを決定することも可能である。
AAVベースのベクターは、インビトロでの遺伝子送達のための安全かつ効果的なビヒクルであることが証明されており、これらのベクターは、エキソビボ及びインビボの両方で、潜在的な遺伝子治療における幅広い応用について、前臨床及び臨床段階で開発及び試験されている。(Carter及びFlotte,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.,770;79-90;Chatteijee,et al.,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.,770,79-90;Ferrari et al.,(1996)J.Virol.,70,3227-3234;Fisher et al.,(1996)J.Virol.,70,520-532;Flotte et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,90,10613-10617,(1993);Goodman et al.(1994),Blood,84,1492-1500;Kaplitt et al.,(1994)Nat’l Genet.,8,148-153;Kaplitt,M.G.,et al.,Ann Thorac Surg.1996 December;62(6):1669-76;Kessler et al.,(1996)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,93,14082-14087;Koeberl et al.,(1997)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,94,1426-1431;Mizukami et al.,(1996)Virology,217,124-130)。
肺におけるAAVを介した効率的な遺伝子導入及び発現は、嚢胞性線維症の治療のための臨床試験につながっている(Carter and Flotte,1995;Flotte et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,90,10613-10617,(1993))。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のAAV媒介遺伝子送達による筋ジストロフィーの治療、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の治療、肝臓への第IX因子遺伝子送達による血友病Bの治療、及び可能性として心臓への血管内皮増殖因子遺伝子による心筋梗塞の治療についての見込みは、これらの臓器におけるAAVを介した導入遺伝子の発現が非常に効率的であることが最近示されたため、有望であるように思われる(Fisher et al.,(1996)J.Virol.,70,520-532;Flotte et al.,1993;Kaplitt et al.,1994;1996;Koeberl et al.,1997;McCown et al.,(1996)Brain Res.,713,99-107;Ping et al.,(1996)Microcirculation,3,225-228;Xiao et al.,(1996)J.Virol.,70,8098-8108)。
4.レンチウイルスベクター
特定の実施形態では、CXCL13及びCD40Lは、CD4 T細胞、T細胞サブセット及び/またはT細胞前駆細胞に、レンチウイルス、ガンマレトロウイルス、アルファレトロウイルスまたはアデノウイルスを用いて、エレクトロポレーションにより、または核酸、タンパク質、部位特異的ヌクレアーゼ、自己複製RNAウイルスもしくは組み込み欠損レンチウイルスベクターのトランスフェクションによって、形質導入される。(そのようなベクターについては、米国特許第10,131,876号を参照のこと)。
特定の実施形態では、CXCL13及びCD40Lは、CD4 T細胞、T細胞サブセット及び/またはT細胞前駆細胞に、レンチウイルス、ガンマレトロウイルス、アルファレトロウイルスまたはアデノウイルスを用いて、エレクトロポレーションにより、または核酸、タンパク質、部位特異的ヌクレアーゼ、自己複製RNAウイルスもしくは組み込み欠損レンチウイルスベクターのトランスフェクションによって、形質導入される。(そのようなベクターについては、米国特許第10,131,876号を参照のこと)。
特定の実施形態では、CD4 T細胞、T細胞サブセット及び/またはT細胞前駆細胞の組換え改変は、形質導入、トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって実施され得る。
好ましくは、形質導入は、レンチウイルス、ガンマ、アルファレトロウイルスもしくはアデノウイルスを用いて、あるいは核酸(DNA、mRNA、miRNA、拮抗薬、ODN)、タンパク質、部位特異的ヌクレアーゼ(ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、CRISP/R)、自己複製RNAウイルス(例えば、馬脳症ウイルス)または組み込み欠損レンチウイルスベクターによるエレクトロポレーションもしくはトランスフェクションを用いて行われる。
より優先的には、CD4 T細胞、T細胞サブセット及び/またはT細胞前駆体の組換え改変は、このような細胞を、レンチウイルスベクターを用いて形質導入することによって行ってもよい(Cockrell Adam S et al.,“Gene delivery by lentivirus vectors”,Molecular Biotechnology,vol.36,No.3,Jul.2007を参照のこと。)
VSVGのシュードタイプを有するレンチウイルスベクターは、自動化された製造方法の下で効率的な形質導入を可能にする。しかし、本発明の方法は、あらゆるタイプのレンチウイルスベクター(例えば、はしかウイルス(ML-LV)、テナガザル白血病ウイルス(GALV)、ネコ内在性レトロウイルス(RD114)、ヒヒ内在性レトロウイルス(BaEV)由来シュードタイプエンベロープ)の使用に完全に適している。ガンマまたはアルファレトロウイルスベクターなどの他のウイルスベクターを使用してもよい。形質導入エンハンサー試薬を、本発明に記載の自動製造を使用して、必要に応じて加えてもよい。
5.その他のウイルスベクター
他のウイルスベクターを、本発明の方法及び組成物における発現構築物として使用してもよい。ワクシニアウイルスなどのウイルスに由来するベクター(Ridgeway,(1988)In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses,pp.467-492;Baichwal and Sugden,(1986)In,Gene Transfer,pp.117-148;Coupar et al.,Gene,68:1-10,1988)カナリア痘ウイルス、及びヘルペスウイルスが採用されている。これらのウイルスは、さまざまな哺乳動物細胞への遺伝子導入に使用するためのいくつかの機能を提供する。
他のウイルスベクターを、本発明の方法及び組成物における発現構築物として使用してもよい。ワクシニアウイルスなどのウイルスに由来するベクター(Ridgeway,(1988)In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses,pp.467-492;Baichwal and Sugden,(1986)In,Gene Transfer,pp.117-148;Coupar et al.,Gene,68:1-10,1988)カナリア痘ウイルス、及びヘルペスウイルスが採用されている。これらのウイルスは、さまざまな哺乳動物細胞への遺伝子導入に使用するためのいくつかの機能を提供する。
構築物が細胞に一旦送達されれば、導入遺伝子をコードする核酸は、異なる部位に配置され、発現される。特定の実施形態では、導入遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。この組み込みは、相同組換え(遺伝子置換)を介して同族の位置及び方向にあるか、またはランダムな非特異的な位置に組み込まれる(遺伝子増強)。さらに別の実施形態では、核酸は、DNAの別個のエピソームセグメントとして細胞内で安定に維持される。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期とは独立して、またはそれと同期して、維持及び複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞にどのように送達されるか、及び細胞内のどこに核酸が残るかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。
異種核酸分子を細胞に導入するこれらの方法は、非限定的であり、任意の方法を使用してもよい。これらを用いて、CD40L、CXCL13、及び/または標的抗原(本明細書で提供されるようなHIVタンパク質であり得る)を非相同的に発現してもよい。
疾患を治療するための方法
本発明の方法はまた、例えば、注入による細胞の投与が有益であり得る疾患の治療または予防の方法を包含する。いくつかの実施形態では、この疾患はウイルス感染である。いくつかの実施形態では、感染は、HIV感染である。いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に提供されるような組成物または細胞を、ウイルス感染を有する対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、体液性免疫応答及び/または細胞性免疫応答などの免疫応答を増大させる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、HIV感染に対する。
本発明の方法はまた、例えば、注入による細胞の投与が有益であり得る疾患の治療または予防の方法を包含する。いくつかの実施形態では、この疾患はウイルス感染である。いくつかの実施形態では、感染は、HIV感染である。いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に提供されるような組成物または細胞を、ウイルス感染を有する対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、体液性免疫応答及び/または細胞性免疫応答などの免疫応答を増大させる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、HIV感染に対する。
いくつかの実施形態では、対象においてHIVを治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、組成物を対象に投与することを含み、有効量の本明細書で提供される任意の細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、医薬組成物と呼んでもよい。本明細書で示すとおり、この組成物は、任意の適切な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、この組成物は、静脈内にまたは注入によって投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、対象に対して同種異系であるか、またはHLA適合ではない。いくつかの実施形態では、この細胞は、対象に対して自系である。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の投与量は、約1×106~約5×106である。
いくつかの実施形態では、免疫応答の増大を必要とする対象においてそれを行う方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、有効量の本明細書で提供される任意の細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この免疫応答の増大は、標的抗原に対するものである。いくつかの実施形態では、この免疫応答の増大は、体液性免疫応答及び/または細胞性免疫応答である。いくつかの実施形態では、この免疫応答の増大は、NK細胞における増大である。いくつかの実施形態では、この免疫応答の増大は、NKT細胞における増大である。いくつかの実施形態では、この免疫応答の増大は、活性化NK細胞における増大である。いくつかの実施形態では、この免疫応答の増大は、活性化B細胞における増大である。いくつかの実施形態では、この免疫応答の増大は、活性化CD8T細胞における増大である。いくつかの実施形態では、免疫応答の増大は、CD3+及びCD38+細胞のパーセントによって測定されるとおり、活性化されたT細胞の増大である。いくつかの実施形態では、免疫応答の増大は、CD3+及びCD25+細胞のパーセントによって測定されるとおり、活性化されたT細胞の増大である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HIVタンパク質である。いくつかの実施形態では、HIVタンパク質は、HIV Tat(全長または長さが72及び101アミノ酸のアイソフォーム)、Rev、Pol、GP120、GP160、GP41、env、Gag、Gag-Pol、Nef、Vpr、Vpu、もしくはVif、またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つ以上である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、異種核酸分子からのものなど、HIVゲノム全体として発現される。いくつかの実施形態では、HIVゲノム核酸は、変異をレトロウイルス逆転写酵素に含み、さらに、HIVゲノム核酸は、レトロウイルスパッケージングシグナルをコードせず、無効化されたHIVゲノム構築物を作成する。いくつかの実施形態では、HIVゲノムは、複製可能なHIVウイルス粒子を生成しない。いくつかの実施形態では、HIVゲノムは、T細胞に感染し得るHIVウイルス粒子を産生しない。いくつかの実施形態では、細胞は対象に対して同種異系である。いくつかの実施形態では、細胞は、患者とHLA適合していない。いくつかの実施形態では、細胞の投与量は、約1×106~約1×106細胞である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ウイルス感染に対するものであり、ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症であってもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は、組成物を2回以上投与することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、毎週1回から、2週間ごとに1回まで、3週間ごとに1回まで、1ヶ月に1回まで、2ヶ月ごとに1回まで、3ヶ月ごとに1回まで、4ヶ月ごとに1回まで、5ヶ月ごとに1回まで、6ヶ月ごとに1回まで、または7ヶ月ごとに1回、または8ヶ月ごとに1回、または9ヶ月ごとに1回、または10ヶ月ごとに1回、または11ヶ月ごとに1回、または毎年1回、維持療法として投与される。この組成物は、例えば、対象がウイルス力価、または治療されている安定/非進行性疾患の改善、低下または検出不能を示す限り、投与されてもよい。
例えば、組換え同種異系または自家CD4+HIVワクチン細胞などの細胞またはそのような細胞を含む組成物は、細胞治療に使用してもよい。細胞は、ドナー由来のものであってもよいし、または患者から得られた細胞であってもよい。細胞は、例えば、再生において、例えば、罹患細胞の機能を置き換えるために使用され得る。細胞はまた、異種遺伝子を発現するように改変されてもよく、その結果、生物学的因子が、例えば、罹患した骨髄または転移性沈着物などの特定の微小環境に送達され得る。間葉系間質細胞はまた、例えば、免疫抑制活性を提供するために使用されており、移植片対宿主病及び自己免疫障害の治療に使用されてもよい。
他の実施例では、組換え同種異系または自家CD4+HIVワクチン細胞またはそのような細胞を含む組成物を使用して、さまざまな疾患及び状態を治療する。
「単位剤形」という用語は、接種材料に関連する場合、哺乳動物のための、単位の投薬(unitary dosages)として適した物理的に個別的な単位を指し、ここで各単位は、必要とされる希釈液に関連して所望の免疫原性効果を生み出すように算出された、既定量の医薬組成物を含有する。接種材料の単位用量の仕様は、医薬組成物の固有の特性及び達成される特定の免疫原性効果によって決定され、それらに依存している。
組換え同種異系または自家CD4+HIVワクチン細胞を含む医薬組成物またはそのような細胞を含む組成物の有効量は、HIV感染細胞の60%、70%、80%、85%、90%、95%、または97%超が殺滅されるような量である。この用語は「十分な量」とも同義である。
任意の特定の適用に関する有効量は、治療される疾患または状態、投与される特定の組成物、対象のサイズ、及び/または疾患もしくは状態の重症度などの要因に応じて変化し得る。過度の実験を必要とせずに、有効量の本明細書に提示される特定の組成物を経験的に決定し得る。
「接触される」及び「曝露される」という用語は、細胞、組織または生物体に適用される場合、医薬組成物及び/または別の薬剤、例えば、化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞、組織もしくは生物に送達されるか、または標的細胞、組織もしくは生物体と直接並置されるプロセスを説明するために本明細書では使用される。細胞の殺滅または停滞を達成するために、医薬組成物及び/または追加の薬剤(複数可)は、細胞(複数可)を殺すか、またはそれらが分裂するのを防ぐのに有効な合計量で1つ以上の細胞に送達される。医薬組成物の投与は、他の薬剤(複数可)に先行してもよく、同時であってもよく、及び/または数分から数週間の間隔でその後であってもよい。医薬組成物及び他の薬剤(複数可)が細胞、組織または生物に別々に適用される実施形態では、一般に、各送達の時間の間に有意な期間が満了しないことを確実にし、その結果、医薬組成物及び薬剤(複数可)がそれでも、細胞、組織、または生物体に対して有利に組み合わされた効果を発揮し得る。例えば、そのような場合、細胞、組織または生物体を、医薬組成物と実質的に同時に(すなわち、約1分以内に)2、3、4、またはそれ以上の様式で接触させ得ると考えられる。他の態様では、1つ以上の薬剤は、実質的に同時に、約1分から、約24時間から、約7日から、約1~約8週間以上、及びその中で導出可能な任意の範囲の範囲内で、発現ベクター投与前に及び/または投与した後に投与されてもよい。さらに、本明細書に提示される医薬組成物と1つ以上の薬剤とのさまざまな組み合わせレジメンを使用してもよい。
患者への投与のための処方及び経路
臨床応用が企図される場合、意図された適用に適切な形態で、医薬組成物(発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、トランスフェクトまたは形質導入細胞)を調製する必要がある。一般に、これは、本質的にパイロジェン、及びヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を含まない組成物を調製することを伴う。
臨床応用が企図される場合、意図された適用に適切な形態で、医薬組成物(発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、トランスフェクトまたは形質導入細胞)を調製する必要がある。一般に、これは、本質的にパイロジェン、及びヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を含まない組成物を調製することを伴う。
組換え同種異系または自家CD4+HIVワクチン細胞またはそのような細胞を含む組成物は、例えば、1用量あたり約1~5百万個の細胞という用量で送達されてもよい。例えば、約0.25ml~約10ml、例えば、約0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、または10ml、例えば約2mlという1バイアルあたりの容量で組換え細胞を含むバイアルまたは他の容器を提供してもよい。
組換え細胞が患者に導入されるとき、一般に適切な塩及び緩衝液を使用することが望ましい場合がある。フレーズ「薬学的にまたは薬理的に許容し得る」とは、動物またはヒトに投与される際に、有害反応、アレルギー反応、または他の不必要な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体としては、任意及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的活性物質のためにこのような媒体及び薬剤を使用することは、公知である。任意の従来の媒体または剤は、ベクターまたは細胞と適合性がない場合を除き、治療組成物で使用されることが企図される。補助的な有効成分もまた、組成物中に組み込んでもよい。
溶液は、配合されたら、その剤形と適合した様式により、治療上有効な量で、投与される。その製剤は、注射液、薬物放出カプセル剤などのようなさまざまな剤形で容易に投与される。水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液を必要に応じて好適に緩衝化してもよく、最初に十分な生理食塩水またはグルコースで液体希釈剤を等張にしてもよい。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の投与に特に好適である。これに関連して、滅菌水性媒体を使用してもよい。例えば、1用量を1mlのNaCl等張液中に溶解し、1000mlの皮下注射液に加えてもよいし、予定注射部位に注射してもよい(例えば、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」 15th Edition,pages 1035-1038及び1570-1580を参照のこと)。治療がなされる対象の状態に応じて、用量には、ある程度の変動が必然的に生じる。いずれにせよ、投与を担当する者が個々の対象に適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与の場合、調製物は、FDA生物製剤評価オフィス(FDA Office of Biologics standards)が要求する、無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度の基準を満たし得る。
さらに、特定の患者では、この治療が定期的に繰り返され、残りのウイルス/ビリオンに対する免疫系の反応をブーストすることが期待される。このような定期的な治療は、患者の疾患が安定または検出不能であることを達成する必要がある限り、維持療法として毎週1回から、2週間ごとに1回、3週間ごとに1回、1ヶ月に1回、2ヶ月ごとに1回まで、3ヶ月ごとに1回まで、4ヶ月ごとに1回まで、5ヶ月ごとに1回まで、6ヶ月ごとに1回まで、または7ヶ月ごとに1回、または8ヶ月ごとに1回、または9ヶ月ごとに1回、または10ヶ月ごとに1回、または11ヶ月ごとに1回、または毎年1回に変化してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、CD40L及びCXCL13をコードするヌクレオチド配列を含む核酸でトランスフェクトまたは形質導入された単離された細胞である。
いくつかの実施形態では、CD40Lは、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CXCL13は、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、T細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞は、異種タンパク質をコードする第2及び/または第3の核酸で形質導入またはトランスフェクトされる。
いくつかの実施形態では、第2の核酸は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ゲノムを含み、このHIVゲノム核酸は、レトロウイルス逆転写酵素の変異を含み、さらに、HIVゲノム核酸は、レトロウイルスパッケージングシグナルをコードせず、無効化されたHIVゲノム構築物を作成する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、CD40L及びCXCL13をコードする1つ以上の異種核酸分子を含むCD4+細胞である。
いくつかの実施形態では、CD40Lは、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CXCL13は、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、異種CD40Lタンパク質及び異種CXCL13タンパク質を含むCD4+細胞である。
いくつかの実施形態では、CD4+細胞はさらに、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ゲノムを含む異種核酸分子を含み、このHIVゲノム核酸は、レトロウイルス逆転写酵素に変異を含み、さらに、HIVゲノム核酸は、レトロウイルスパッケージングシグナルをコードせず、無効化されたHIVゲノム構築物を作成する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、対象においてHIVを治療する方法であって、組成物を対象に投与することを含み、有効量の本明細書において上記される任意の細胞を投与することを含む方法である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、免疫応答の増大を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、有効量の本明細書において上記される任意の細胞を投与することを含む方法である。
いくつかの実施形態では、細胞は対象に対して同種異系である。
いくつかの実施形態では、細胞は、患者とHLA適合していない。
いくつかの実施形態では、細胞の投与量は、約1~5×106の範囲である。
いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)によって引き起こされる。
いくつかの実施形態では、対象において移植片対宿主病(GVHD)が減少または排除される一方で、移植片対ウイルス(GVV)は、増大される。
いくつかの実施形態では、治療または免疫応答の増大は、対象が改善、減少もしくは検出不可能なウイルス力価を示すか、または安定/非進行性の疾患を示す限り、維持治療として毎週1回から、2週間ごとに1回まで、3週間ごとに1回まで、月に1回まで、2ヶ月ごとに1回まで、3ヶ月ごとに1回まで、4ヶ月ごとに1回まで、5ヶ月ごとに1回まで、6ヶ月ごとに1回まで、または7ヶ月ごとに1回、または8ヶ月ごとに1回、または9ヶ月ごとに1回、または10ヶ月ごとに1回、または11ヶ月ごとに1回、または毎年1回という時間枠で定期的に繰り返される。
いくつかの実施形態では、細胞性免疫及び体液性免疫は、対象において誘導される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される実施形態はまた、以下を含むが、これらに限定されない:
1. CD40L及びCXCL13をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸分子を含む細胞。
2.実施形態1の細胞であって、前記CD40Lが、配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記CXCL13が、配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記細胞。
3. CD40L及びCXCL13を異種発現する、実施形態1に記載の細胞。
4. 単離された細胞である、実施形態1に記載の細胞。
5. CD4+T細胞などのT細胞である、実施形態1に記載の細胞。
6.異種タンパク質または標的抗原をコードする第2の及び/または第3の核酸で形質導入またはトランスフェクトされている、実施形態1に記載の細胞。
7.実施形態6に記載の細胞であって、前記第2の核酸は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ゲノムを含み、前記HIVゲノム核酸は、レトロウイルス逆転写酵素の変異を含み、さらに、前記HIVゲノム核酸が、レトロウイルスパッケージングシグナルをコードせず、無効化されたHIVゲノム構築物を作成する、前記細胞。
8. 前記標的抗原がHIVタンパク質である、実施形態6に記載の細胞。
9. 実施形態8に記載の細胞であって、前記HIVタンパク質が、HIV Tat(全長または長さが72及び101アミノ酸のアイソフォーム)、Rev、Pol、GP120、GP160、GP41、env、Gag、Gag-Pol、Nef、Vpr、Vpu、もしくはVif、またはそれらの任意の組み合わせである、前記細胞。
10.CD4+T細胞である、実施形態1~9のいずれか1項に記載の細胞。
11.配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列及び/または配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする1つ以上の異種核酸分子を含むCD4+T細胞。
12.CD40Lを発現する、実施形態11に記載のCD4+T細胞。
13.CXCL13を発現する、実施形態11及び12に記載のCD4+T細胞。
14.CD40L及びCXCL13を発現する、実施形態11に記載のCD4+T細胞。
15.単離されたCD4+T細胞である、実施形態11に記載のCD4+T細胞。
16.異種CD40Lタンパク質及び異種CXCL13タンパク質を含むCD4+T細胞。
17.実施形態16に記載のCD4+T細胞であって、さらにヒト免疫不全ウイルス(HIV)ゲノムを含む異種核酸分子を含み、前記HIVゲノム核酸は、レトロウイルス逆転写酵素に変異を含み、さらに、前記HIVゲノム核酸は、レトロウイルスパッケージングシグナルをコードせず、無効化されたHIVゲノム構築物を作成する、前記CD4+T細胞。
18.標的抗原をコードする異種核酸分子をさらに含む、実施形態16に記載のCD4+T細胞。
19.前記標的抗原がHIVタンパク質である、実施形態18に記載のCD4+T細胞。
20.実施形態19に記載のCD4+T細胞であって、前記HIVタンパク質が、HIV Tat(全長または長さが72及び101アミノ酸のアイソフォーム)、Rev、Pol、GP120、GP160、GP41、env、Gag、Gag-Pol、Nef、Vpr、Vpu、もしくはVif、またはそれらの任意の組み合わせである、前記CD4+T細胞。
21.対象においてHIVを治療する方法であって、組成物を前記対象に投与することを含み、有効量の実施形態1~20のいずれか1項の任意の細胞を投与することを含む、前記方法。
22.前記組成物が、医薬組成物である、実施形態22に記載の方法。
23.前記組成物が、静脈内にまたは注入によって投与される、実施形態21に記載の方法。
24.前記細胞が前記対象に対して同種異系であるか、または前記対象に対してHLA適合していない、実施形態21~23のいずれか1項に記載の方法。
25.前記細胞が前記対象に対して自系である、実施形態21~23のいずれか1項に記載の方法。
26.実施形態21~25のいずれか1項に記載の方法であって、前記組成物中の細胞の投与量が、約1×106~約5×106である、前記方法。
27.有効量の実施形態1~20のいずれか1項に記載の任意の細胞を投与することを含む、免疫応答の増大を必要とする対象においてそれを行うための方法。
28.前記増大した免疫応答が標的抗原に対するものである、実施形態27に記載の方法。
29.前記標的抗原がHIVタンパク質である、実施形態28に記載の方法。
30.実施形態29に記載の方法であって、前記HIVタンパク質が、HIV Tat(全長または長さが72及び101アミノ酸のアイソフォーム)、Rev、Pol、GP120、GP160、GP41、env、Gag、Gag-Pol、Nef、Vpr、Vpu、もしくはVif、またはそれらの任意の組み合わせである、前記方法。
31.前記細胞が対象に対して同種異系である、実施形態27~29のいずれかに記載の方法。
32.前記細胞が患者とHLA適合されていない、実施形態27~29のいずれかに記載の方法。
33.前記細胞の投与量が約1~5×106の範囲である、実施態様27~32のいずれかに記載の方法。
34.実施形態27~33のいずれかに記載の方法であって、前記免疫応答は、ウイルス感染に対するものであり、前記ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症であり得る、前記方法。
35.実施形態21~34のいずれかに記載の方法であって、前記治療または免疫応答の増大は、前記対象が改善、減少もしくは検出不可能なウイルス力価を示すか、または安定/非進行性の疾患を示す限り、維持治療として、毎週1回から、2週間ごとに1回まで、3週間ごとに1回まで、月に1回まで、2ヶ月ごとに1回まで、3ヶ月ごとに1回まで、4ヶ月ごとに1回まで、5ヶ月ごとに1回まで、6ヶ月ごとに1回まで、または7ヶ月ごとに1回、または8ヶ月ごとに1回、または9ヶ月ごとに1回、または10ヶ月ごとに1回、または11ヶ月ごとに1回、または毎年1回という時間枠で定期的に繰り返される、前記方法。
36.細胞性免疫及び体液性免疫が前記対象において誘導される、実施形態21~35のいずれかに記載の方法。
以下の実施例は、本明細書に記載の化合物、及び方法の例示であるが、限定されない。当業者に公知の他の適切な修正及び適合は、以下の実施形態の範囲内である。
実施例1
CD40L及びCXCL13で形質導入されたCD4+細胞を構築し、HIVゲノムをさらにロードする
ステップ 1:CD4細胞(または他のT細胞)を、CD40L及びCXCL13(B細胞誘引分子)を過剰発現するレンチウイルス/アデノウイルスで形質導入し、CD40L及びCXCL13を発現する組換え同種異系CD4+T細胞を産生する。この組換え同種異系CD4+細胞は、宿主内で機能して、CD4細胞の前の領域にB細胞を誘引する。
ステップ2:CD4+CD40L+CXCL13+細胞へのHIVゲノムのプラスミドトランスフェクション及び/またはトランスポゾン送達。CD4+CD40L+CXCL13+細胞には、無機能のHIV(複製能力のない、または生の弱毒化されたゲノム)をロードする。好ましい実施形態では、逆転写酵素(RT)が少なくとも1つの突然変異(または欠失)を含み、それを機能しないようにし、さらにパッケージングシグナルに変異(または完全な欠失)がある(複製能力のないHIVゲノムを作成するが、そうでなければ完全なゲノムを作成する)、完全なHIVゲノムを利用する。
複製能力のないHIVゲノム構築物を作成するために、次の理論的根拠及びオプションが利用される(RT変異及びパッケージングシグナル変異)
・RTは感染を無能にする
・パッケージングシグナル変異(パッケージングシグナル変異がない場合でも、CD4はビリオンを生成する)。組換えCD4細胞は、空のビリオンを出芽させる-エンベロープ糖タンパク質は、中和抗体を誘導する(体液性応答を生み出す)ゲノムの一部である。
・特定の実施形態では、構築物は、異なるエンベロープタンパク質の異なる株をコードする核酸をさらに含み得る。
・特定の実施形態では、構築物は、複数の可変エンベロープ領域を担持し得る。複数の糖タンパク質(gp)構造を作成する(糖タンパク質の多様性を作成する)。
・したがって、CD4+CD40L+CXCL13+細胞には次のものをロードする:
〇HIVプラスミド、RT変異あり、パッケージングシグナルなしまたは無効化、複数のエンベロープタンパク質、CD40L+CXCL13+を発現し、HIVエンベロープ及び糖タンパク質を発現して、患者による体液性免疫応答を生成するCD4+細胞の作成。
〇HIVワクチンビヒクルとして同種異系CD4細胞を作成する。
・RTは感染を無能にする
・パッケージングシグナル変異(パッケージングシグナル変異がない場合でも、CD4はビリオンを生成する)。組換えCD4細胞は、空のビリオンを出芽させる-エンベロープ糖タンパク質は、中和抗体を誘導する(体液性応答を生み出す)ゲノムの一部である。
・特定の実施形態では、構築物は、異なるエンベロープタンパク質の異なる株をコードする核酸をさらに含み得る。
・特定の実施形態では、構築物は、複数の可変エンベロープ領域を担持し得る。複数の糖タンパク質(gp)構造を作成する(糖タンパク質の多様性を作成する)。
・したがって、CD4+CD40L+CXCL13+細胞には次のものをロードする:
〇HIVプラスミド、RT変異あり、パッケージングシグナルなしまたは無効化、複数のエンベロープタンパク質、CD40L+CXCL13+を発現し、HIVエンベロープ及び糖タンパク質を発現して、患者による体液性免疫応答を生成するCD4+細胞の作成。
〇HIVワクチンビヒクルとして同種異系CD4細胞を作成する。
実施例2
HIVの予防及び治療ワクチン候補としてのマカクにおけるENOB HV-11及びENOB HV-12の評価
概念実証として、2つの発現カセット(CD40L&CXCL13)のヒト及び非ヒト霊長目(NHP)の両方の配列を、レンチウイルスベクター(LV)を使用して試験し、非ヒト霊長類(マカク)に対するENOB HV-11予防HIVワクチン及びENOB HV-12治療HIVワクチンの生物活性を調査し、概念実証データを提供する。
同種異系細胞は、免疫応答の強力な刺激である。高レベルのB細胞プロモーターCD40L及びCXCL13を発現するように遺伝子改変されたHIV抗原を発現する同種異系T細胞は、防御または治療ワクチンとして有効な強力な細胞性及び体液性応答を誘導すると期待される。そのような組換え同種異系細胞は、宿主の免疫系によって急速に死滅し、十分に少ない数で提供された場合、移植片対宿主の疾患を誘発しないはずである。
概念実証(POC)として本明細書に記載されている実施例では、非ヒト霊長類に、非複製の弱毒化SHIVを含むプラスミドでトランスフェクトされている、ヒトまたはマカクいずれかの配列CD40L及びCXCL13で遺伝子改変された数百万(例えば1~5×106)の同種異系T細胞を連続的に皮下注射する。サル/ヒト免疫不全ウイルス(SHIV)は、実験室で作成された一連のキメラであり、その遺伝物質は、サル免疫不全ウイルス(SIV)遺伝子及びHIV遺伝子の組み合わせである。このウイルスは、SIVに感染する可能性のあるほぼあらゆる種類の非ヒト霊長類に感染し得る。
中和抗体の力価を測定する。保護レベルが一旦達成されれば、動物の粘膜でSHIVを用いて惹起する。動物が感染から保護されていない場合、それらは静脈内で惹起する。対照コホートを含め、感染したマカクは、複製しない弱毒化SHIVに感染した同じカセット(すなわち、ヒト対マカク)で改変されたT細胞による治療的ワクチン接種を受ける。(ヒトCXCL13及びヒトCD40Lを形質導入するための)HV-11のベクター構築物を、図1Aに示す。(マカクCXCL13及びマカクCD40Lを形質導入するための)HV-12のベクター構築物を図1Bに示す。
研究デザインの投薬及びスケジュールの詳細(図2~4を参照のこと):
9匹のマカク;n=1群ごとに3匹;ENOB HV-11及びENOB HV-12にまたがる潜在的に2段階の調査:
⇒3匹は、弱毒化され複製能のないSHIVを含むプラスミドでトランスフェクトされ、ヒトベクターで形質導入された、完全MLA/HLAミスマッチ(CD4+)T細胞を受け取る(コホートA)(図1A)。
⇒3匹は、弱毒化され複製能のないSHIVを含むプラスミドでトランスフェクトされ、マカクベクターで形質導入された、完全ミスマッチCD4+T細胞を受け取る(コホートB)(図1B)。
⇒3匹は、対照群(生成物を受け取っていない)(コホートC)になる。
9匹のマカク;n=1群ごとに3匹;ENOB HV-11及びENOB HV-12にまたがる潜在的に2段階の調査:
⇒3匹は、弱毒化され複製能のないSHIVを含むプラスミドでトランスフェクトされ、ヒトベクターで形質導入された、完全MLA/HLAミスマッチ(CD4+)T細胞を受け取る(コホートA)(図1A)。
⇒3匹は、弱毒化され複製能のないSHIVを含むプラスミドでトランスフェクトされ、マカクベクターで形質導入された、完全ミスマッチCD4+T細胞を受け取る(コホートB)(図1B)。
⇒3匹は、対照群(生成物を受け取っていない)(コホートC)になる。
ENOB HV-11(図3)
注射/投与/評価スケジュール(コホートA及びB)
・1週あたり500万個の細胞を4週間にわたって皮下に;最初の注射後に反応がある場合は、用量を1週あたり200万個の細胞に減らす。
・4回目の注射後、その4回目の注射の7日後に中和抗体価を測定する。
・所望の力価が達成されない場合は、10日ごとに200万個の細胞を用いる4回のs.c.注射で第2のサイクルの投与を行い、次いで、必要であれば、15日ごとに200万個の細胞を用いる4回のs.c.注射で第3のサイクルの投与を行う。
・所望の力価が一旦達成されれば、SHIVウイルスを用いて粘膜で惹起を行う。粘膜での惹起が感染を引き起こさない場合は、静脈内での惹起を行う。
・各試験の対象ごとに、毎週のモニタリング、抗体価及び安全性ラボがある。
注射/投与/評価スケジュール(コホートA及びB)
・1週あたり500万個の細胞を4週間にわたって皮下に;最初の注射後に反応がある場合は、用量を1週あたり200万個の細胞に減らす。
・4回目の注射後、その4回目の注射の7日後に中和抗体価を測定する。
・所望の力価が達成されない場合は、10日ごとに200万個の細胞を用いる4回のs.c.注射で第2のサイクルの投与を行い、次いで、必要であれば、15日ごとに200万個の細胞を用いる4回のs.c.注射で第3のサイクルの投与を行う。
・所望の力価が一旦達成されれば、SHIVウイルスを用いて粘膜で惹起を行う。粘膜での惹起が感染を引き起こさない場合は、静脈内での惹起を行う。
・各試験の対象ごとに、毎週のモニタリング、抗体価及び安全性ラボがある。
ENOB HV-12(図4)
コホートA、B、Cの感染したマカクは、3ヶ月間、ウイルス抑制(<50コピー/ml)を達成するまでARTを受ける。抑制を達成した後、それらのマカクは、以下及び図2~4に示すように、複製能力のない弱毒化SHIV及びマッチングベクター(すなわち、コホートAはヒトベクターを受け取り、コホートBはマカクベクターを受け取る)でパルスされた完全MLAミスマッチのCD4+T細胞による治療ワクチン接種を受ける。選択肢は、HV-11に使用されたのと同じ投与計画をHV-12に利用することである。
コホートA、B、Cの感染したマカクは、3ヶ月間、ウイルス抑制(<50コピー/ml)を達成するまでARTを受ける。抑制を達成した後、それらのマカクは、以下及び図2~4に示すように、複製能力のない弱毒化SHIV及びマッチングベクター(すなわち、コホートAはヒトベクターを受け取り、コホートBはマカクベクターを受け取る)でパルスされた完全MLAミスマッチのCD4+T細胞による治療ワクチン接種を受ける。選択肢は、HV-11に使用されたのと同じ投与計画をHV-12に利用することである。
コホートA及びBの場合、T細胞は、予防ワクチンとは異なる、ミスマッチのドナーからのものになる。
・注射/投与/評価スケジュール(コホートA、B及びC)
〇4週間にわたる皮下の1週あたり500万個の細胞は、最初の注射後に反応がある場合は、用量を1週あたり200万個の細胞に減らす。選択肢は、ウイルス血症のピーク時に投薬を開始することである。(例えば、n-3の対照動物におけるピークウイルス血症、防御ワクチンなしであるが惹起した)。
〇4回目の注射から7日後に血漿ウイルス血症を測定する。1mlあたり1コピー未満でない場合、4週間ごとに200万個の細胞の皮下注射を開始する
〇4回目(合計8回目)の注射後、血漿ウイルス血症を測定する。1mlあたりコピー未満でない場合、4週間にわたって毎週200万個の細胞のサイクルを繰り返す
〇6ヶ月間の毎週のモニタリング
〇血漿ウイルス血症、リンパ球サブセット及び安全性ラボ
〇各サイクルの最後の皮下注射から7日後
〇血漿ウイルス血症、リンパ球サブセット、安全性ラボ、GALT生検
・注射/投与/評価スケジュール(コホートA、B及びC)
〇4週間にわたる皮下の1週あたり500万個の細胞は、最初の注射後に反応がある場合は、用量を1週あたり200万個の細胞に減らす。選択肢は、ウイルス血症のピーク時に投薬を開始することである。(例えば、n-3の対照動物におけるピークウイルス血症、防御ワクチンなしであるが惹起した)。
〇4回目の注射から7日後に血漿ウイルス血症を測定する。1mlあたり1コピー未満でない場合、4週間ごとに200万個の細胞の皮下注射を開始する
〇4回目(合計8回目)の注射後、血漿ウイルス血症を測定する。1mlあたりコピー未満でない場合、4週間にわたって毎週200万個の細胞のサイクルを繰り返す
〇6ヶ月間の毎週のモニタリング
〇血漿ウイルス血症、リンパ球サブセット及び安全性ラボ
〇各サイクルの最後の皮下注射から7日後
〇血漿ウイルス血症、リンパ球サブセット、安全性ラボ、GALT生検
経過観察期間:
HV-11またはHV-12のいずれかを最後に注射してから1年。SHIVの存在とリンパ腫などの毒性の全身評価のためにマカクを屠殺する。
HV-11またはHV-12のいずれかを最後に注射してから1年。SHIVの存在とリンパ腫などの毒性の全身評価のためにマカクを屠殺する。
概念実証(POC)研究中の毒性モニタリング
〇使用されたROAによる毒性。
〇注射された生成物及び関連する発現の持続性。
〇注射された生成物の生体内分布。
〇注入された生成物に対する免疫応答(体液性及び細胞性)
〇腫瘍形成性。
〇体重及び行動などの巨視的観察。
〇顕微鏡的な組織病理。
〇その他
〇使用されたROAによる毒性。
〇注射された生成物及び関連する発現の持続性。
〇注射された生成物の生体内分布。
〇注入された生成物に対する免疫応答(体液性及び細胞性)
〇腫瘍形成性。
〇体重及び行動などの巨視的観察。
〇顕微鏡的な組織病理。
〇その他
実施例3:CD40L及びCXCL13で形質導入されたT細胞は、細胞毒性を増強し、免疫細胞の活性化を増大する。標的抗原であるCD40L及びCXCL13を発現する操作された同種異系エフェクター細胞と組み合わせたワクチン接種は、抗原に対する細胞毒性活性を増強する。インビトロのモデルは、インビボの細胞毒性を模倣するために開発された。Jurkat-GFP発現株は、エフェクターの特定の殺滅活性を定量的に測定するための細胞毒性の標的として機能するように作成された。次に、正常なドナーPBMCを取得して、3セットの細胞をワクチン接種し、Jurkat細胞に対する特異的な免疫応答を作成した。簡単に言うと、PBMCは組換え体で「ワクチン接種」される。(a)PBMCに非形質導入Jurkat細胞(「UTD Jurkat」)をワクチン接種し、(b)PBMCにGFP形質導入Jurkat細胞(非特異的ベクター形質導入対照として機能する)をワクチン接種し、(c)PBMCに、CD40L及びCXCL13を形質導入したJurkat細胞(HV11)をワクチン接種した。この実施例での「ワクチン接種」とは、PBMCを上記のJurkat細胞と混合することを指す。これは、組換えCD4 T細胞にCD40L及びCXCL13を注入し、HIVを有するまたはHIVのリスクがある患者に注入することに類似しており、ここでは、GFPを、PBMCのトレーニング抗原となるHIVタンパク質に置き換える。Jurkat特異的T細胞の増殖を可能にするPBMCワクチン接種の9日後、Jurkat-GFP発現標的細胞を「ワクチン接種」PBMC細胞(エフェクター細胞)と18時間共培養して、特異的細胞溶解活性をアッセイした。細胞溶解機能をフローサイトメトリー(FACS)分析で測定し、共培養後のGFP陽性細胞の変化を確認した。このデータによって、GFP発現細胞が、非形質導入Jurkat及びGFPのみ形質導入のJurkat T細胞の両方と比較して、GFP及びCD40L及びCXCL13を発現するT細胞でワクチン接種されたPBMCでより効果的に殺滅されたことが示されている。このデータは図5に示されている。このデータは細胞溶解機能の増強を示しており、用量依存性であることがわかった。すなわち、PBMCにCD40L及びCXCL13細胞の量を増やしてワクチンを接種すると、PBMCの細胞毒性が増大した。さまざまな種類の免疫細胞への影響も測定された。図6に示されるように、CD40L及びCXCL13を異種発現するT細胞でワクチン接種されたPBMCは、NK細胞(図6)、NKT細胞(図7)、NK細胞活性化(図8)、NK細胞体液性活性化(図9)、B細胞活性化(図10)、図10)、CD3+及びCD38+細胞のパーセントによって測定されるT細胞活性化(図11)、CD3+及びCD25+細胞のパーセントによって測定されるT細胞活性化(図12)、及びCD8T細胞活性化(図13)における有意かつかなりの増大を示した。細胞及び活性化は、図に示されている表面マーカーを使用してフローサイトメトリーによって測定された。したがって、これらの実施形態及びデータによって、T細胞にCD40L及びCXCL13、またはそれらの活性断片とともに抗原を発現させることにより、特定の抗原に対する細胞毒性を増強し得るT細胞を作製する能力の驚くべき予想外の結果が実証される。
実施例4:標準的な方法
分子生物学の標準的な方法は、Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982 & 1989 2nd Edition,2001 3rd Edition)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY、Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY、Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)に記載されている。標準的な方法は、Ausbel,et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY(細菌細胞におけるクローニングを記載(Vol.1))、(哺乳細胞及び酵母におけるクローニングを記載(Vol.2))、(複合多糖及びタンパク質発現を記載(Vol.3))、及び(バイオインフォマティクスを記載(Vol.4))にも見られる。
分子生物学の標準的な方法は、Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982 & 1989 2nd Edition,2001 3rd Edition)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY、Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY、Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)に記載されている。標準的な方法は、Ausbel,et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY(細菌細胞におけるクローニングを記載(Vol.1))、(哺乳細胞及び酵母におけるクローニングを記載(Vol.2))、(複合多糖及びタンパク質発現を記載(Vol.3))、及び(バイオインフォマティクスを記載(Vol.4))にも見られる。
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、及び結晶化を含むタンパク質精製の方法は記載されている(Coligan,et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、タンパク質のグリコシル化は説明されている(例えば、Coligan,et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,New York、Ausubel,et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17、Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO;pp.45-89、Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391を参照のこと)。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の産生、精製、及び断片化は記載されている(Coligan,et al.(2001)Current Protcols in Immunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York;Harlow and Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY、Harlow and Lane,上記)。リガンド/受容体相互作用を特徴付けるための標準的な技術が利用可能である(例えば、Coligan,et al.(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New Yorkを参照のこと)。
本明細書に記述される全ての参照は、あたかも各々の個々の刊行物、データベース入力(例えば、Genbank配列またはGeneIDエントリ)、特許出願または特許が明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度まで、参照により組み込まれる。参照によるこの組み込みの声明は、米国特許法第1.57条(b)(1)に従って、出願人が各々のかつあらゆる個々の刊行物、データベースエントリ(Genbank配列またはGeneIDエントリ)、特許出願、または特許に関連することを意図しており、そのような引用が参照による特化した組み込みの声明に直接隣接していなくても、そのそれぞれが米国特許法第1.57条(b)(2)に準拠して明確に識別されている。参照による組み込みの特化した声明を含めることは、本明細書内にもしあっても、参照によるこの一般的な組み込み声明を決して弱めるものではない。本明細書での参考文献の引用は、この参考文献が関連する先行技術であることを認めることを意図するものではなく、これらの出版物または文書の内容または日付に関するいかなる承認を構成するものでもない。
本発明の実施形態は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際には、本明細書中に記載される改変に加えて本発明のさまざまな改変が、上記の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。かかる改変は、本明細書に示される実施形態及び添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。
Claims (36)
- CD40L及びCXCL13をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸分子を含む細胞。
- 請求項1に記載の細胞であって、前記CD40Lが、配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記CXCL13が、配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記細胞。
- CD40L及びCXCL13を異種発現する、請求項1に記載の細胞。
- 単離された細胞である、請求項1に記載の細胞。
- CD4+T細胞などのT細胞である、請求項1に記載の細胞。
- 異種タンパク質または標的抗原をコードする第2の及び/または第3の核酸で形質導入またはトランスフェクトされている、請求項1に記載の細胞。
- 請求項6に記載の細胞であって、前記第2の核酸は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ゲノムを含み、前記HIVゲノム核酸は、レトロウイルス逆転写酵素の変異を含み、さらに、前記HIVゲノム核酸が、レトロウイルスパッケージングシグナルをコードせず、無効化されたHIVゲノム構築物を作成する、前記細胞。
- 前記標的抗原がHIVタンパク質である、請求項6に記載の細胞。
- 請求項8に記載の細胞であって、前記HIVタンパク質が、HIV Tat(全長または長さが72及び101アミノ酸のアイソフォーム)、Rev、Pol、GP120、GP160、GP41、env、Gag、Gag-Pol、Nef、Vpr、Vpu、もしくはVif、またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つ以上である、前記細胞。
- CD4+T細胞である、請求項1~9のいずれか1項に記載の細胞。
- 配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列及び/または配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする1つ以上の異種核酸分子を含むCD4+T細胞。
- CD40Lを発現する、請求項11に記載のCD4+T細胞。
- CXCL13を発現する、請求項11及び12に記載のCD4+T細胞。
- CD40L及びCXCL13を発現する、請求項11に記載のCD4+T細胞。
- 単離されたCD4+T細胞である、請求項11に記載のCD4+T細胞。
- 異種CD40Lタンパク質及び異種CXCL13タンパク質を含むCD4+T細胞。
- 請求項16に記載のCD4+T細胞であって、さらにヒト免疫不全ウイルス(HIV)ゲノムを含む異種核酸分子を含み、前記HIVゲノム核酸は、レトロウイルス逆転写酵素に変異を含み、さらに、前記HIVゲノム核酸は、レトロウイルスパッケージングシグナルをコードせず、無効化されたHIVゲノム構築物を作成する、前記CD4+T細胞。
- 標的抗原をコードする異種核酸分子をさらに含む、請求項16に記載のCD4+T細胞。
- 前記標的抗原がHIVタンパク質である、請求項18に記載のCD4+T細胞。
- 請求項19に記載のCD4+T細胞であって、前記HIVタンパク質が、HIV Tat(全長または長さが72及び101アミノ酸のアイソフォーム)、Rev、Pol、GP120、GP160、GP41、env、Gag、Gag-Pol、Nef、Vpr、Vpu、もしくはVif、またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つ以上である、前記CD4+T細胞。
- 対象においてHIVを治療する方法であって、組成物を前記対象に投与することを含み、有効量の請求項1~20のいずれか1項の任意の細胞を投与することを含む、前記方法。
- 前記組成物が、医薬組成物である、請求項22に記載の方法。
- 前記組成物が、静脈内にまたは注入によって投与される、請求項21に記載の方法。
- 前記細胞が前記対象に対して同種異系であるか、または前記対象に対してHLA適合していない、請求項21~23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が前記対象に対して自系である、請求項21~23のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項21~25のいずれか1項に記載の方法であって、前記組成物中の細胞の投与量が、約1×106~約5×106である、前記方法。
- 有効量の請求項1~20のいずれか1項に記載の任意の細胞を投与することを含む、免疫応答の増大を必要とする対象においてそれを行うための方法。
- 前記増大した免疫応答が標的抗原に対するものである、請求項27に記載の方法。
- 前記標的抗原がHIVタンパク質である、請求項28に記載の方法。
- 請求項29に記載の方法であって、前記HIVタンパク質が、HIV Tat(全長または長さが72及び101アミノ酸のアイソフォーム)、Rev、Pol、GP120、GP160、GP41、env、Gag、Gag-Pol、Nef、Vpr、Vpu、もしくはVif、またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つ以上である、前記方法。
- 前記細胞が前記対象に対して同種異系である、請求項27~29のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が患者とHLA適合されていない、請求項27~29のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞の投与量が約1~5×106の範囲である、請求項27~32のいずれかに記載の方法。
- 請求項27~33のいずれかに記載の方法であって、前記免疫応答は、ウイルス感染に対するものであり、前記ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症であり得る、前記方法。
- 請求項21~34のいずれかに記載の方法であって、前記治療または免疫応答の増大は、前記対象が改善、減少もしくは検出不可能なウイルス力価を示すか、または安定/非進行性の疾患を示す限り、維持治療として、毎週1回から、2週間ごとに1回まで、3週間ごとに1回まで、月に1回まで、2ヶ月ごとに1回まで、3ヶ月ごとに1回まで、4ヶ月ごとに1回まで、5ヶ月ごとに1回まで、6ヶ月ごとに1回まで、または7ヶ月ごとに1回、または8ヶ月ごとに1回、または9ヶ月ごとに1回、または10ヶ月ごとに1回、または11ヶ月ごとに1回、または毎年1回という時間枠で定期的に繰り返される、前記方法。
- 細胞性免疫及び体液性免疫が前記対象において誘導される、請求項21~35のいずれかに記載の方法。
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