CN117980725A - 与干扰剂兼容的生物分子存储、运输及量化的方法、装置及系统 - Google Patents
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Abstract
一种对靶标分子进行量化的方法，所述方法包含以下步骤：将靶标分子结合到表面，其中靶标分子被呈现用于量化测定；从靶标分子清除掉污染试剂，其中靶标分子保持结合到所述表面；对靶标分子进行直接量化，其中靶标分子保持结合到所述表面，其中靶标分子的直接量化是通过测量靶标分子的内源荧光来实行。
Description
本申请主张在2021年7月13日提出申请的序列号为63/203,221的美国申请的优先权。前述申请的全文并入本文供参考。
技术领域
本发明涉及一种与可能干扰样品稳定性和/或相关分子的量化的剂类的存在兼容的样品存储及量化的方法、装置和/或系统。
背景技术
在生物分子分析领域(包括且不限于生物化学、蛋白质测序、分子生物学、基因组学、蛋白质组学及其他相关领域等等)中，存在的挑战是首先对研究中的生物分子的类别(例如微克级的蛋白质、DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸))进行量化以及确认研究中的生物分子的身份(identity)。由于蛋白质、肽、RNA、DNA及相关分子的线性性质(linearnature)，蛋白质、肽、RNA、DNA及相关分子的身份由其序列定义。已开发了许多用于线性生物分子测序的技术：蛋白质组学及基因组学的主要支柱。
生物样品的调查与研究含有许多步骤。首先必须收集样品，然后通常进行存储和/或运输，通过各种化学、物理、生物化学及其他工艺(例如色谱法(chromatography))进行处理和/或制备，然后才能够通过包括阵列(array)、适配体(aptamer)或者抗体或表面结合(各自可通过种类良多的技术来读取)、质谱法(mass spectrometry)等在内的种类繁多的技术进行分析。现今分析通量(analytical throughput)的进展(在一些情形中现在每个样品只需要几分钟或甚至几秒钟就能对研究中的分子作出鉴定及量化)需要在样品处置及制备方面的相应进步。具体来说，期望简化并理想地消除样品存储、运输、制备及分析工作流程中的任何及所有步骤来提高通量与稳健性(robustness)二者。
出于保证样品可靠性的需求，样品(尤其是生物来源的样品)的存储及装运(shipment)通常在包括-20C、-80C或甚至在液氮中在内的低温下实行。此种策略一是昂贵的，二是容易例如在停电期间经历故障，且三是未必容易使用：冷冻器(freezer)大且难以移动及供电，而冰、干冰、液氮或其他冷却剂会耗尽且装运困难又昂贵。事实上，在药物试验中，样品装运成本可能构成总成本的50％。因此，有必要显著改善以更高效、更便宜的方式(尤其是如果可能在室温下)存储及装运样品的能力。
发明内容
本申请的一个方面涉及一种对靶标分子(target molecule)进行量化的方法，所述方法包含以下步骤：使靶标分子结合到表面，其中所述靶标分子被呈现用于量化测定(quantification assay)；从所述靶标分子清除掉污染试剂(contaminating reagent)，其中所述靶标分子保持结合到所述表面；对所述靶标分子进行直接量化，其中所述靶标分子保持结合到所述表面，其中所述靶标分子的直接量化是通过测量所述靶标分子的内源荧光(intrinsic fluorescence)来实行。
在某些实施方案中，还包含在至少室温下存储或运输所述靶标分子，所述靶标分子在结合到所述表面的同时保持稳定。在某些实施方案中，所述靶标分子对所述表面的亲和力大于由污染试剂表现出的对所述表面的亲和力。在某些实施方案中，通过分光亮度技术(spectrophotometric technique)的使用来进行直接量化。在某些实施方案中，所述方法的每一步骤是自动化的。在某些实施方案中，所述表面为C18疏水表面或者视情况地为C4疏水表面、C8疏水表面或其他适合的疏水表面。在某些实施方案中，所述靶标分子是通过疏水色谱法或亲水色谱法结合到表面。在某些实施方案中，所述靶标分子是通过弱或强的离子交换(阳离子或阴离子)结合到表面。在某些实施方案中，所述靶标分子结合在存在于选自由珠粒(bead)、膜(membrane)、填充柱(packed column)、整体柱(monolithic column)、玻璃珠粒及色谱珠粒所组成的群组的一或多者的表面上。在某些实施方案中，所述靶标分子结合在所述表面上，且被洗涤掉还原剂。在某些实施方案中，所述靶标分子结合在所述表面上，且被洗涤掉苯胺。在某些实施方案中，所述直接量化是使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid)测定来实行。在某些实施方案中，所述直接量化是通过测量蛋白质荧光来实行。在某些实施方案中，所述靶标分子是核酸。在某些实施方案中，所述靶标分子是RNA。在某些实施方案中，所述靶标分子是蛋白质。在某些实施方案中，测量色氨酸的内源荧光(intrinsic fluorescence)。
本申请的另一个方面是一种用于实施本文中所述的方法及系统的装置，其中所述设备包括：蛋白质固定化点(protein immobilization spot)；紫外线(UV)光源；以及检测器(detector)。在某些实施方案中，所述装置包含96孔板(96-well plate)。在某些实施方案中，所述装置是自动化的。
本申请的另一个方面是结合本文中所述的方法来存储或运输靶标分子。
附图说明
尽管现在将结合例示性实施方案详细阐述本说明书，然而本说明书不受各图及随附权利要求书中所例示的特定实施方案所限制。
图1示出主要负责蛋白质的固有荧光的三个氨基酸残基。
图2示出用于蛋白质捕获的S-trap柱。
图3示出在277下进行激发(exc itat i on)以及在360nm下进行发射(emi ss ion)所获得的结果。
图4示出溶液中的牛血清白蛋白(BSA)响应(277/350)
图5示出使用消化缓冲液的S-trap中的BSA响应(277/350)。
图6示出BSA样品的BCA测定。
图7示出消化缓冲液中的BSA响应(277/410)。
图8示出样品的室温稳定性。
具体实施方式
将详细参照本申请的某些方面及例示性实施方案，说明随附结构及附图中的实例。将结合包括方法、材料及实施例在内的例示性实施方案阐述本申请的各方面，此种阐述是非限制性的，且本申请的范围旨在囊括所有等效形式、替代形式及修改形式，而无论这些形式是公知的还是被并入此处的。除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术性及科学性用语都具有与本申请所属领域中的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。所属领域中的技术人员将认识到与此处阐述的技术及材料相似或等效的许多技术及材料可用于本申请的各方面及实施方案的实践中。本申请的所阐述的各方面及实施方案并非仅限于所阐述的方法及材料。
除非内容清楚地另外指明，否则本说明书及随附权利要求书中所使用的单数形式“一个(a/an)”及“所述(the)”包括复数指示物。
范围在本文中可被表达为从“约(about)”一个特定值、和/或到“约”另一个特定值。当表达此种范围时，另一个实施方案包括从所述一个特定值、和/或到所述另一个特定值。相似地，当通过先行词“约”的使用而将值表达为近似值时，应理解，所述特定值构成另一个实施方案。还应理解，无论是和另一个端点有关还是独立于另一个端点，范围中的每一端点都是重要的。还要理解，本文中公开了大量的值，且每一值在本文中除了被公开为所述值本身以外，还被公开为“约”所述特定值。举例来说，如果公开值“10”，则也公开了“约10”。还要理解，当值被公开时，“小于或等于所述值”、“大于或等于所述值”以及各值之间的可能范围也如本领域技术人员所适宜理解地公开了。举例来说，如果公开值“10”，则也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。
样品制备步骤是必要的，这是因为样品(尤其是生物来源的样品)通常是复杂的且含有许多不同的分子类别，每一分子类别可能都需要各自的处理。另外，某些分子的存在可能会扰动对相关分子(molecule of interest)进行量化(和/或分析)的能力或者还可能扰动样品的稳定性。举例来说，分析脂质的步骤及技术不同于分析蛋白质的步骤及技术，且大量脂质的存在可能容易干扰对蛋白质的分析。相似地，我们寻求避免酶或其他分子的存在，这些酶或其他分子会使相关分子改性或破坏相关分子。举例来说，为成功实现转录组学分析(transcriptomics analysis)，必须对RNA酶进行灭活或消除，且非期望的蛋白酶的存在可能会阻碍或阻止对蛋白质的研究。这些仅为例示性实例，且并不用于限制本发明的领域。
在例如蛋白质组学、转录组学、(在一定程度上)基因组学、脂质组学、糖组学及代谢组学(统称为“组学”，不排除其他种类的分析)等组学分析(omics analysis)中，例如蛋白质、RNA、DNA、脂质、聚糖或代谢物浓度等特定类别或分子类别的量化是常见的且经常是必须的步骤：例如血液、裂解物(例如细胞或组织的裂解物)、尿液等样品具有不同的浓度，且我们经常期望分析相同数量的相关分子类别。举例来说，在蛋白质组学中，各调查经常寻求使每一样本中所分析的蛋白质的量标准化或相等。蛋白质或其他分子类别也可能用作替代品(surrogate)以例如在代谢组学或其他种类的组学研究中对其他分子类别的浓度进行求近似。以非限制性实例为例，可能使用体液(如尿液或血清)的蛋白质浓度作为替代品来估计其他分子类别的总浓度。
所属领域中的技术人员将认识到，一般来说，色谱法、薄层色谱法(thin layerchromatography，TLC)、气相色谱法(gas chromatography，GC)及高压液相色谱法(highpressure liquid chromatography，HPLC)、带有或不带有质谱检测(mass spectrometricdetection)的HPLC及GC、以及表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)都可用于对多种类别的分子作出鉴定及量化。在质谱法中，已很好地确立并使用稳定同位素技术(stable isotope technique)以及同量异位素技术(isobaric technique)来进行量化。相似地，对整体物理特性(如密度、电导率及超声波速度)的测量可用于对存在于样品中的分子的量进行量化。同样，对包括对紫外线-可见辐射、红外(infrared，IR)辐射(包括FTIR)、X-射线辐射或核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)的吸收度(absorbance)和/或在这些辐射下的荧光在内的辐射吸收的测量在常规上用于确定浓度及分子身份。也可使用对辐射散射的测量，例如通过浊度(turbidity)的光或超声波散射，或者也可使用超声波速度及超声(ultrasound)的吸收。使用这些技术中的每一者的确切参数取决于相关分子的性质，此是所属领域中的技术人员已知的。
确定生物分子及其他分子的浓度的量化技术已得到很好的确立，且归属于两个广义类别：
确定某种类型或类别的分子的总量的测定，例如总蛋白质测定、总DNA测定、总RNA测定、总脂质测定、总糖基化测定或总代谢物测定；以及
特异于一个分子或一个分子家族的测定。这些测定经常是基于通过抗体、凝集素、DNA或RNA的特异性序列、适配体等所实现的特异性亲和力，且这些测定可为广义类别，例如对于针对蛋白质家族或酶家族中拥有同源性(homology)的保守区(conserved region)所产生的抗体。这些特异性测定也可能是基于分子的特定活性，例如酶的作用。
两种类别的测定对于所属领域中的技术人员来说是众所周知的。举例来说，为了确定RNA或DNA浓度(或蛋白质)，经常使用UV光谱法，其中在260nm下或在260nm左右(代表核酸)及在280nm下或在280nm左右(代表蛋白质；空白组(blank)可能会在更高的波长(如320nm)下测量)测量样品的吸收度，且使用比尔-朗伯定律(Beer-Lambert law)计算核酸浓度或蛋白质浓度。A260读数为1.0等效于～40μg/ml的单链RNA(single-stranded RNA)，且A260/A280比率用于评估RNA纯度；A260/A280比率为1.8 2.1表示高度纯化的RNA。作为另外一种选择，可采用荧光，其中核酸可在260nm-270nm下或在此范围左右被激发，且可在300nm–400nm范围左右发射，所属领域中的技术人员认识到此取决于例如序列及化学环境(包括pH、离子浓度、所存在的其他离子及猝灭剂(quencher)等)等大量因素。其中尤其重要的是要注意，许多许多的分子既进行吸收又发荧光，且这些分子伴随(污染)任何类别的相关分子一起存在会导致不正确的量化。
核酸也可借助于结合到DNA和/或RNA的荧光染料进行量化。与其他测定一样，对用于对未知浓度进行反算的浓度已知的样品及一系列标准品进行测定。样品与结合到核酸的染料一起培养，并经历构象变化(conformational change)，从而在特异于所使用的染料的波长下产生增加的荧光。测量荧光，并通过绘制已知标准品的荧光相对于核酸浓度的关系来创建标准曲线(对于板式读取器(plate reader))或参考标准(对于手持荧光计(handheld fluorometer))。然后，使用最佳地描述标准曲线的线性回归方程将未知样品的荧光转换为核酸浓度。使用基于荧光染料的方法进行RNA量化的主要优点是灵敏度；也可使用进行吸收但不发荧光的染料。染料的实例包括溴化乙锭、碘化丙锭、结晶紫、DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole))、7-AAD(7-氨基放线菌素D(7-aminoactinomycin D))、赫斯特(Hoechst)33258(33342、34580)及YOYO-1/DiYO-1/TOTO-1/DiTO-1是提供不同颜色的荧光(激发与发射二者)或吸收度、膜渗透性(membranepermeability)、毒性、灵敏度以及其他性质的染料的实例。
核酸分析在安捷伦2100(Agilent 2100)生物分析仪中实现自动化，所述生物分析仪使用染料及微流体(microfluidics)以及样品专用芯片(sample-specific chip)进行分析。此系统本质上是用于分离核酸与蛋白质来进行分析的琼脂糖及丙烯酰胺凝胶的小型化版本。样品与荧光染料进行组合，并注入到芯片中的孔(well)中。样品移动通过微通道(microchannel)中的凝胶基质(gel matrix)，并通过电泳而分离。然后通过荧光对样品进行检测，并通过数据分析软件创建电泳图及凝胶状图像，以进行大小确定(sizing)及量化
所属领域中的技术人员将会知道，对核酸、DNA或RNA的特异性序列的测定可通过例如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、链置换测定(stranddisplacement assay，SDA)、转录介导的测定(transcription-mediated assay，TMA)或连接酶链式反应(ligase chain reaction)以及其他可能方式等扩增(amplification)方式来完成。随后，可使用对一组预定序列进行量化的微阵列(microarray)及使用高通量测序以记录所有转录物的RNA-Seq来对特异性核酸进行量化。读出(readout)是通过包括454生命科学公司(454Life Sciences)、依诺米那公司(Illumina)、索利德公司(SOLiD)、离子激流公司(Ion Torrent)或太平洋生物科学公司(PacBio)等在内的多个分析平台进行。这些工作流程及技术已得到很好的确立、广泛的传播以及商业可用性。
脂质可使用硫代-磷酸-香草醛(sulfo-phospho-vanillin，SPV)测定来进行测定以得到简单的比色读出(colorimetric readout)；然而，此种测定的灵敏度可能有限，且其需要大量的样品。化学反应是复杂的，且被视为涉及：在初始反应中形成相对稳定的(长达数小时)阳碳离子(carbonium ion)(或碳正离子(carbocation))色原(chromogen)，随后在向反应添加香草醛时产生粉红色的发色团(chromophore)。作为另外一种选择，红外(IR)光谱法、质谱法(MS)或NMR可用于测定脂质的量或浓度。在NMR中，脂质含量是通过测量NMR化学位移谱(NMR chemical shift spectra)中对应于脂质部分的峰下面积来确定。脂质以及其他分子类别也可通过不同的溶解度及重量分析方式进行测定。举例来说，可使用己烷来摇动含水样品，并将己烷移到涂有焦油的容器(tarred container)中。蒸发后，脂质将既可通过其重量进行测量，又与其他分子类别隔离开。也可使用所属领域中的技术人员熟悉的巴布科克(Babcock)方法、盖勃(Gerber)方法或洗涤剂(detergent)方法。
可使用凝集素(包括凝集素阵列及印迹(blot))以及通过色谱方法来对聚糖(glycan)进行量化，色谱方法也使得能够通过计算峰面积来确定特定聚糖的浓度，使得可评估特定类型的寡糖在总聚糖库(total glycan repertoire)中的百分比。也可使用通过荧光团或发色团或联接酶(linked enzyme)(例如，辣根过氧化物酶(HRP))或重同位素(等)来标记或标示的凝集素。所属领域中的技术人员应知道，聚糖可通过质谱技术及色谱技术进行检测、鉴定及量化。用于聚糖量化的其他技术包括例如拉比荧光-MS(RapiFluor-MS)、2-氨基苯甲酰胺(2-aminobenzamide)或普鲁卡因酰胺(procainamide)等的标示试剂(labeling reagent)。因此，经标示的聚糖是通过带有荧光检测的HPLC(经常使用亲水相互作用色谱法(hydrophilic interaction chromatography，HILIC))来检测。也可通过使用同位素标示的完全甲基化(permethylation)来确定量化：使用12C-甲基碘化物或13C-甲基碘化物来标示聚糖，其中对样品进行比较或者一个样品是标准品，并且通过MS来分析所标示的聚糖。此种方法具有高动态范围、足够的线性度(linearity)及高的重现性(reproducibility)。比色测定也是已知的：当使用苯酚及浓硫酸进行处理时，单糖、寡糖、多糖及其衍生物(包括具有游离还原基或潜在游离还原基的甲基醚)会呈现橙黄色。反应是灵敏的，且颜色是稳定的。多种其他试剂及反应(例如对甲氧基苯胺盐酸盐(p-anisidinehydrochloride))也是已知的；参见T.E.蒂梅尔(Timell,T.E.)、C.P.J.格劳德曼斯(C.P.J.Glaudemans)及A.L.库里(A.L.Currie)，糖的分光亮度确定方法(Spectrophotometric methods for determination of sugars)，《分析化学(Analyticalchemistry)》，28.12(1956)：1916-1920。可再次使用色谱法来确定所标示的或所衍生的聚糖、多糖和/或其甲基衍生物的成分。
用于确定蛋白质的量及蛋白质浓度的技术已得到非常好的确立，且包括荧光蛋白质测定或比色蛋白质测定，例如双缩脲反应(Biuret reaction)、劳里方法(Lowrymethod)、考马斯蓝(Coomassie Blue，CB)G-250染料结合测定(布拉德福德测定(Bradfordassay))及二辛可宁酸(BCA)测定等(例如UV吸收度或荧光策略以及在例如与荧光胺及2-甲氧基-2,4-二苯基-3(2H)-呋喃酮(2-methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanone，MDPF)等的反应之后发荧光的荧光产生试剂(fluorogenic reagent))。除了基于活性(例如酶活性)及基于MS的量化、奥林康(Olink)及索玛罗吉科(Somalogic)策略等以外，存在所属领域中的技术人员所熟悉的用于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、适配体、抗体、阵列及其他基于亲和力的方式对特定蛋白质进行量化的许多技术。
从2022年7月13日起，蛋白质测定的概述能在赛默飞网站(thermofisher.com)处找到并在互联网存档时光机(Internet Archive Wayback Machine)处存档。从2022年7月13日起，核酸浓度测定的概述能在普洛麦格网站(promega.com)处找到并在互联网存档时光机处存档。
蛋白质通过主要负责蛋白质的固有荧光(inherent fluorescence)的三个氨基酸残基而具有内源荧光，所述三个氨基酸残基是色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸(图1)。这些残基具有不同的吸收波长及发射波长，且量子产率(quantum yield)不同(下表1)。因此，蛋白质的内源荧光可用于确定蛋白质浓度。
色氨酸比酪氨酸或苯丙氨酸的荧旋光性大得多。然而，色氨酸的荧旋光性质取决于溶剂。随着溶剂极性的降低，谱向更短的波长位移，且强度增大。由于此原因，隐藏在折叠蛋白质(folded protein)的疏水结构域(hydrophobic domain)中的色氨酸残基表现出10nm到20nm的谱位移。此现象已被用来研究蛋白质变性；参见《荧光光谱原理第2版(Principles of Fluorescence Spectroscopy 2nd Edition)》(1999)，编辑J.R.拉科维兹(Lakowicz,J.R.)，纽约克鲁沃学术/普伦姆出版社(Kluwer Academic/PlenumPublishers,New York)，纽约。色氨酸通常具有280nm的最大吸收波长以及具有溶致变色性(solvatochromic)、范围介于约300nm–350nm的发射峰(取决于局部环境的极性)(参见例如内布拉斯加大学林肯分校网站(dwb.unl.edu)处的“蛋白质及肽的内源荧光(IntrinsicFluorescence of Proteins and Peptides)”，其全文出于全部目的并入本文供参考)。
酪氨酸可在与使色氨酸进行激发的波长相似的波长下被激发，但在明显不同的波长下进行发射。尽管酪氨酸的荧旋光性低于色氨酸，然而酪氨酸可提供重要的信号，这是因为酪氨酸经常大量存在于许多蛋白质中。已观察到酪氨酸荧光因附近色氨酸部分的存在而通过共振能量转移(resonance energy transfer)猝灭以及因酪氨酸的芳族羟基的电离而猝灭。
苯丙氨酸的荧旋光性非常弱，且仅在色氨酸与酪氨酸二者均不存在的情况下才可被观察到。由于色氨酸的更大的吸收率、更高的量子产率以及共振能量转移，包含所述三种氨基酸的蛋白质的荧光谱通常类似于色氨酸的荧光光谱。
表1
所有的量化及鉴定技术都有其自身的局限性及容差(tolerance)。举例来说，蛋白质与核酸二者均可尊敬地通过蛋白质及核酸在280nm及260nm下的吸收度来量化；参见以下的原文：O.沃伯格(Warburg,O.)及W.克里斯蒂安(W.Christian)(1942)，《生物化学学报(Biochem.Z.)》，310：384-421。然而，许多其他分子(缓冲液、洗涤剂以及染料或色素，仅举几例)也在此区中吸收。相似地，用于蛋白质量化的化学测定(例如BCA或布拉德福德测定)会受到特定于其化学性质的各种干扰。举例来说，BCA无法有效地用于还原性溶液中，且布拉德福德无法有效地用于含有洗涤剂的溶液中。(如所属领域中的技术人员已知，干扰剂的浓度可足够低，以至于所述浓度可通过包括含有相同干扰剂的标准曲线来说明。)同样，许多分子发荧光，且如果存在这些分子，则会产生假阳性信号(false positive signal)。尽管这些是两种类型的蛋白质测定的局限性，然而此不是限制性实例，且所属领域中的技术人员将认识到可能导致浓度或量方面的假读数(false reading)的污染类型。
最终，测定通常会牺牲掉一部分样品，会增加成本及时间，且会在96孔板中受到干扰(例如，对于最后两种测定，尊敬地是还原试剂或表面活性剂)及边缘效应(edgeeffect)。事实上，对于例如单细胞研究中的小样品或者来自激光显微捕获切割的样品，样品数量对于几乎任何测定来说均是过少的。因此，期望不再需要进行附加的蛋白质测定或针对不同(生物)分子类别的其他测定，以提高蛋白质组学及其他组学领域的效率。
方法
本发明源于令人惊讶的发现，即分子可结合到表面、清除掉污染试剂、然后使用相关分子的内源荧光直接在所述表面上直接量化(图2)。此结果特别令人惊讶，这是因为所属领域中的技术人员通常会预期经表面结合的分子将会被猝灭，但情况并非如此。本发明使得能够在样品制备期间使用在其他情况下将会干扰随后的蛋白质测定的试剂，例如角蛋白或福尔马林固定-石蜡包埋(FFPE)样品的增溶(solubilization)中的还原剂。本发明是一种通用技术，对于蛋白质分析，此技术使整个范围的裂解缓冲试剂与蛋白质量化兼容；此技术将相似的灵活性扩展到其他组学种类。在使用内源荧光的实施方案中，本发明还使得能够对在其他情况下将会在分子含量测定中被完全用尽的数量非常少的样品进行定量。
本发明还源于令人惊讶的发现，即令人惊奇地发现此类样品一旦经表面结合，会在至少室温下稳定数月，且可在无冷却或特殊调适的情况下存储及装运，如以下实施例中所述。
与所有固相色谱法一样，施加到S-Trap柱的样品首先在柱或孔的头部(head)上样(图2)。随着亲和位点被占用，柱上样带(band of column loading)向蛋白质陷阱(proteintrap)的更深处前进。内源荧光色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸残基的此种经表面浓缩呈现形式使得能够通过顶部激发及顶部发射检测进行荧光蛋白质量化。蛋白质量化发生在下游样品处理所使用的完全相同的板中，从而使得不再需要单独的蛋白质测定且使得不再为所述测定牺牲样品。所属领域中的技术人员将会认识到，尽管本文中阐述了蛋白质荧光团，且尽管此实施例阐述了蛋白质，然而此实施例并非是限制性的，能够对可被物理固定化、清除掉(而不释放相关分子)污染物并被展示的任何分子进行分析。本发明的关键在于：第一，相关分子对不同于污染物的固体支持物具有亲和力；以及第二，如此固定化的相关分子例如通过(但不限于)分光亮度技术而呈现用于测定。
此外，尽管内源荧光由于方便(此处，样品实际上与典型的S-Trap样品处理处于完全相同的位置(参见美国专利第11,009,510号，其并入本文供参考)；除了通过荧光测量蛋白质浓度以外，无增加额外的步骤)、具有非破坏性、且可变参数仅为激发和发射的波长(或者为吸收的波长，如果分子是使用某种透明物质进行固定化、或如果分子本身具有颜色，所有设定在适宜的板式读取器上容易地改变)而极为有用，也可使用适宜于研究中的分子种类的任何测定。继续阐述以上蛋白质测定的实例，含有应用于容许洗涤的适宜捕获机制的还原剂与表面活性剂二者的蛋白质溶液接着可通过BCA测定或布拉德福德测定、或者通过劳里测定或基于荧光染料的测定，以及荧光产生胺衍生化(fluorogenic aminederivatization)(或在其他基团的衍生化)等进行测定。
所属领域中的技术人员将立即认识到，可进行与随后的洗涤兼容的任何形式的物理捕获。举例来说，C18疏水表面、或者其他疏水色谱法或亲水色谱法、或者弱或强的离子交换(阳离子或阴离子)(珠粒、膜、填充柱、整体柱等)、玻璃珠粒或色谱珠粒等可捕获及固定化相关分子，进而使得可从相关分子洗涤掉污染物，所述污染物为例如还原试剂(在BCA测定的情形中)或蛋白质荧光情形中的苯胺。
所属领域中的技术人员将认识到，存在多种方式来进行以下：首先将研究中的(生物)分子贴附或固定化到固相或表面或珠粒或颗粒，从而以留下所期望分子的方式洗涤掉污染物，然后对数量及身份进行分析。此种附着可为通过吸附或亲和力或色谱方式实现的非共价附着；参见DS杨(Yeo DS)、RC潘奇克(Panicker RC)、LP谭(Tan LP)、SQ姚(Yao SQ)，“生物分子在微阵列中的固定化策略(Strategies for immobilization of biomoleculesin a microarray)”，《组合化学与高通量筛选(Combinatorial chemistry&highthroughput screening)》，2004年5月1日，7(3)：213-21。被所属领域中的技术人员视为对生物分子进行贴附或固定化的方式的生物分子色谱法在由苏珊R.米科尔森(SusanR.Mikkelsen)、爱德华多·卡顿(Eduardo Cortón)于2004年在约翰·威利跨学科出版公司(John Wiley Interscience)出版的《生物分析化学(Bioanalytical Chemistry)》中发表的第14章“生物分子色谱法(Chromatography of Biomolecules)”中作出了综述(参考文献：SR米科尔森(Mikkelsen SR)、E.卡顿(Cortón E.)，《生物分析化学》，约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons)，2016年3月7日)。作为另外一种选择，可采用所属领域中的技术人员众所周知的共价化学来对生物分子进行贴附或固定化。综述及概述包括以下内容以及许多许多的其他内容：
SK瓦希斯特(Vashist SK)、JH梁(Luong JH)，“用于免疫诊断的抗体固定化及表面功能化化学(Antibody immobilization and surface functionalization chemistriesfor immunodiagnostics)”，在《免疫测定技术手册(Handbook of ImmunoassayTechnologies)》中，2018年1月1日(第19-46页)，学术出版社(Academic Press)。
DW格兰杰(Grainger DW)、CH格雷夫(Greef CH)、P巩(Gong P)，MJ洛克海德(Lochhead MJ)，“当前微阵列表面化学(Current microarray surface chemistries)”，在《微阵列(Microarrays)》中，2007(第37-57页)，胡玛娜出版社(Humana Press)。
S托特(Todt S)、DH布洛姆(Blohm DH)，“固定化化学(Immobilizationchemistries)”，《用于生物医学调查的DNA微阵列(DNA Microarrays for BiomedicalResearch)》，2009：81-100。
MD索纳维恩(Sonawane MD)、SB尼姆斯(Nimse SB)，“用于生物分子诊断平台的材料的表面改性化学(Surface modification chemistries of materials used indiagnostic platforms with biomolecules)”，《化学杂志(Journal of Chemistry)》，2016年1月1日；2016。
H朱(Zhu H)，M.施耐德(Snyder M.)，“蛋白质芯片技术(Protein chiptechnology)”，《化学生物学当前观点(Current opinion in chemical biology)》，2003年2月1日；7(1)：55-63。
SJ吴(Oh SJ)、BJ洪(Hong BJ)、KY崔(Choi KY)、JW朴(Park JW)，“DNA及蛋白质微阵列的表面改性(Surface modification for DNA and protein microarrays)”，《组学：综合生物学杂志》，2006年9月1日；10(3)：327-43。
LS王(Wong LS)、F罕(Khan F)、J.米克尔菲尔德(Micklefield J.)，“选择性共价蛋白质固定化：策略及应用(Selective covalent protein immobilization:strategiesand applications)”，《化学综述(Chemical reviews)》，2009年9月9日；109(9)：4025-53。
在一个实施例中，我们展示了此种使用内源蛋白质荧光对S-Trap 96孔板上经清除、经表面结合的蛋白质进行直接量化的新发明。S-Trap板及柱专门设计用于陷获(trap)蛋白质以及从蛋白质清除掉污染物(例如缓冲液、还原剂、洗涤剂及其他小分子)。如以上所详述，这些小分子常常干扰蛋白质测定：对于布拉德福德来说是洗涤剂，对于BCA来说是还原剂，对于吸收来说是在280nm下进行吸收的任何物质，以及对于通过荧光进行量化来说是任何发荧光的物质。
本领域中的技术人员将快速认识到，尽管本文中阐述的实施例使用了商业板式读取器，然而本发明的实施方案也包括专用于本发明任务的设备、装置及系统。举例来说，所属领域中的技术人员将快速理解到，使分子捕获、清除及量化实现自动化和/或对分子捕获、清除及量化进行组合的效用，其中设备含有样品固定化的靶标或位置、用于从所述样品清除掉污染物的工具、用于量化相关分子的工具及用于测量来自所述量化的信号的工具。作为非限制性实施例，旨在使用荧光激发及发射进行蛋白质分析的此种设备含有蛋白质固定化点、对所述蛋白质进行洗涤(尽管此也可在线下进行)的潜在自动化工具、UV光源及检测器。理想情况下，所述设备是自动化的，进而使得可并行地(如板式读取器)或串行地(如自动进样器(autosampler))分析多个样品。如上所述，可使用包括SPR在内的其他测定种类。
所属领域中的技术人员将会认识到，96孔板仅为无数可能形式中的一种，此为必要的，因为假定具有充足的灵敏度，本发明从大规模下至单一分子都会起作用。
本说明书通过以下实施例来进一步阐释，这些实施例不应被解释为限制性的。在本申请通篇中引用的所有参考文献、专利及公开的专利申请的内容、以及图与表格都并入本文供参考。
实施例
实施例1：
按照标准实验流程(protocol)制作出并使用了S-Trap 96孔板。按照标准实验流程将样品结合到板上并进行了洗涤；也以相同的方式加载了标准BSA曲线(如下)。
对于分成四个等分样品(aliquot)的50ug、100ug、200ug及300ug的人血清，将通过BCA确定的蛋白质浓度稀释到46uL的含有50mM四乙基溴化铵(TEAB)的5％十二烷基硫酸钠(SDS)中。将此溶液在添加了2uL的120mM的情况下于55C下还原了10分钟，使用2uL在异丙醇溶液中的500mM甲基硫代磺酸甲酯(MMTS)进行烷基化，然后添加了5uL的12％磷酸以使蛋白质变性，随后添加了350uL在90％ MeOH结合缓冲液中的100mM TEAB(最终)。使用350uL的结合缓冲液将蛋白质洗涤了三次。然后添加了100uL的50mM TEAB(在测量干状态下的蛋白质之后)，且使用泰坎斯巴克板式读取器(Tecan Sparc plate reader)以顶部读取发射模式在介于269nm与280nm之间的激发以及325nm到475nm的发射下对板荧光进行测量。
使用泰坎斯巴克将结合蛋白在S-Trap 96孔板上进行荧光蛋白质浓度量化的最佳z位置(z-position)通过实验确定为2100μm。使用泰坎斯巴克板式读取器以顶部读取发射模式在介于269nm与280nm之间的激发以及325nm到475nm的发射下对湿状态与干状态二者下的蛋白质荧光进行测量。就检测限制(limit of detection)、重现性及动态范围对通过蛋白质荧光确定的蛋白质浓度与BCA进行了比较。实验发现，最佳的激发及发射是在277下进行的激发及在360nm下进行的发射。
使用泰坎斯巴克将结合蛋白在S-Trap 96孔板上进行荧光蛋白质浓度量化的最佳z位置通过实验确定为2100μm。使用泰坎斯巴克板式读取器以顶部读取发射模式在介于269nm与280nm之间的激发以及325nm到475nm的发射下对湿状态与干状态二者下的蛋白质荧光进行测量。就检测限制、重现性及动态范围对通过蛋白质荧光确定的蛋白质浓度与BCA进行了比较。一般来说，然而实验发现，最佳的激发及发射是在277下进行的激发及在360nm下进行的发射，尽管410nm提供了额外的灵敏度(参见下文)。
对于放置在消化缓冲液(50mM TEAB，pH 8)中(此为S-Trap样品处理的下一步骤)的如上制备的上样量为50ug、100ug、200ug及300ug的经还原及烷基化的血清，在277下进行激发及在360nm下进行发射的情况下获得了以下结果(图3)。
(BSA的曲线看起来非常相似于图3，此事实容易通过HSA人血清白蛋白是血清中最普遍的蛋白质且HSA与BSA非常相似此一事实来理解。)
一直到每孔～100μg为止，响应合理地呈线性。在此之后，响应的线性度显著跌落(即此曲线的“钩(hook)”)，此是一种预期的现象，这是因为荧光部分将在对于UV来说不透明的陷阱中结合得更深。与其他固相一样，S-Traps首先在其树脂顶部上样，在此种情形中会在其树脂顶部捕获到且能够检测到蛋白质，且随着向光线无法到达的柱内部进一步深入，上样量增大。应注意，使相关分子固定化的透明工具将不会经历此限制；参见下面的玻璃珠粒的实施例。
有趣的是，在干状态下，色氨酸荧光可能由于猝灭而与高达300μg的蛋白质结合量呈负相关。随着缓冲液pH变为酸性，荧光被猝灭，最终达到近背景水平(near-backgroundlevel)。
所属领域中的技术人员将会认识到，给定的荧光可根据此单一曲线来确定蛋白质浓度。蛋白质固定化及洗涤系统会移除对于荧光来说的污染物(例如(简单举例来说)苯胺)以及对于其他蛋白质测定来说的污染物(如对于可能直接在板上实行的BCA来说是还原剂)。本发明使用内源清理(intrinsic cleanup)来提供对蛋白质浓度的直接确定。在通过化学步骤、酶步骤或色谱步骤等将蛋白质固定化在表面上以进行进一步处理的情形中，本发明使得不再需要进行蛋白质测定，从而使样品分析加速且使通量提高。
此直接测定发明在与BCA测定相比显著减少的时间内提供了蛋白质量化。在结合、洗涤、添加消化试剂及培养以产生肽的正常工作流程期间，没有样品被损耗，且样品被确实地测量到位。动态范围及灵敏度与标准的自下而上及自上而下的蛋白质组学工作流程兼容。本发明在蛋白质浓度确定之前成功地移除了基质污染物，而无需额外的步骤。此种板上蛋白质浓度确定(on-plate protein concentration determination)有助于其自身直接用于使用自动化流体处置器的高通量临床环境(high-throughput clinical setting)中。
实施例2A：与溶液中的荧光相当
在5％ SDS、50mM TEAB中制备出了含有不同量的蛋白质的BSA溶液。与实施例1中完全一样，首先在溶液中测量了蛋白质溶液的荧光，然后将蛋白质溶液结合到S-Trap板。用一条直线或二阶多项式拟合得到荧光测量值(参见下文)。
此新的板上(on-plate)发明的结果合适地与相同样品在溶液中的荧光测量值进行比较：曲线拟合(R2)与变异系数(CV)是相当的(comparable)(图4及图5)。
实施例2B：与溶液中的BCA测定相当
按照制造商的说明(皮尔斯(Pierce))及直线拟合(line fit)对与实施例2相同的缓冲液中的BSA的相同等分样品进行了测定，如在同一实施例中一样。通过板上荧光读数进行的蛋白质量化具有与相同样品在溶液中的BCA相当的准确度，而使得不再不必要地产生样品损耗、不再有必要进行培养或甚至比上样到S-Trap 96孔板上更进一步的操纵。同样，标准BCA测定与此新发明之间的曲线拟合和CV二者是相当的(图5到图6)。
实施例3：灵敏度
如实施例1及实施例2中一样，溶解从0ug到10ug的BSA。如实施例1中一样，将蛋白质样品结合到S-Trap板。无蛋白质陷获基质的背景荧光读数随着发射波长的增大而降低。在277nm激发及410nm发射下，可检测到少至1μg的蛋白质。此种小的数量实际上不可能通过比色测定来量化，但是又常常会在激光捕获显微切割(laser capture microdissection)中遇到(图7)。
实施例4：玻璃珠粒
在5％ SDS、50mM TEAB中以1mg/mL制备出了经异硫氰酸荧光素(FITC)标示的酪蛋白(内部自行制备(prepared in house)且等效于西格玛公司(Sigma))。将100mg的9μm-13μm玻璃球体/珠粒(色谱科440345(Supelco 440345))悬浮于1mL水中，并进行涡旋直至悬浮为止。使用强的永久钕磁体移除了任何磁性物质。将珠粒在1000g下沉淀了1分钟，且丢弃了漂浮的珠粒。在三次洗涤之后，珠粒的总量(volume)被设定成使得所述珠粒为50ug/uL。将2uL此种珠粒悬浮液添加到10ug(10uL)FTIC溶液。向混合物添加了48uL乙腈，将试管涡旋了5秒，在12,000g下进行了5分钟的离心，在谨慎地不扰动珠粒/沉淀物(pellet)的情况下移除了上清液，将200uL的80％乙醇(EtOH)轻轻移液到珠粒但不使珠粒重新悬浮，再次进行了离心，重复了三次，每次移除了～95％的洗涤液(wash)。保留所有上清液及洗涤液，并使用标准手持实验室UV源对包括现在与珠粒结合的蛋白质在内的所有部分进行了成像。所有或几乎所有的荧光都在珠粒上。此实施例表明，在本发明中可使用清透的底物(substrate)来实现扩展的量化动态范围。
实施例5：RNA
自西格玛公司购得酵母tRNA，且以10个胺基中大致1个的比例对酵母tRNA部分地进行FITC标示(标准FITC标示实验流程，但是在稍微更中性的8.5的pH下进行)。通过多次乙醇沉淀及多次洗涤从tRNA清除掉过量的FITC，直至上清液清透为止，然后将tRNA以1mg/mL重新悬浮在50mM TEAB中。除了使用冰冷的乙醇及异丙醇(在单独的试管中)代替乙腈且在冰上预冷80％ EtOH洗涤液以外，如实施例4中一样将10ug此样品结合到玻璃珠粒。同样，保留所有部分并通过UV对所有部分进行监测，且同样，所有或几乎所有的荧光都在珠粒上。
此实施例本来可使用DNA和/或RNA的在267nm左右激发且在330nm左右发射的内源荧光。在此种情形中，将会需要谨慎地对待所使用的玻璃，这是因为玻璃对UV具有不同的透明度。此外，样品本来可同样容易地被施加到过滤器或色谱树脂(例如，离子交换树脂)顶上以实现物理固定化，在此之后使用所属领域中的技术人员已知的不会使核酸溶解但会使小分子溶解的溶液(例如，75％乙醇)对样品进行了洗涤。然后可通过荧光对如此固定化的核酸进行量化，且在柱中将会经历与在实施例1及实施例2中所见到的相同的“钩”效应。此实施例证明，本发明对核酸起作用；同样，本文中的实施例不旨在进行限制。
实施例6：还原剂的移除(以抗体为例)
在50mM的TEAB中以1mg/mL制备出了山羊IgG溶液。将还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)添加到此溶液，直到最终浓度为10mM，并将100ug(100uL)的所述溶液放置在标准ELISA的多个孔中。对照孔(control well)具有完全相同的缓冲液，但没有IgG。将板在4C下培养过夜，然后将孔清空并使用200uL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤了三次。向此所得物添加了工作BCA试剂(working BCA reagent)。如预期的那样，对照孔中没有显现出颜色，这是因为TCEP不结合到ELISA板，以及含有现在吸附的抗体的孔变成紫色。如果有包括标准曲线，则此实验将会对ELISA板的结合能力进行量化。
实施例7：酶固定化
向商业山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)提供了少量考马斯亮蓝(Coomassiebrilliant blue)以对溶液进行着色来实现可视化，并向一组样品添加了0.25％ NaN3(一种HRP抑制剂)。对对照珠粒进行了相同的处理，但使用BSA代替了HRP。如实施例4及实施例5中一样，将样品结合到珠粒，然而使珠粒在洗涤之后进行干燥并在室温下放置两天。(如所预期，所有的蓝色都被移除。)随后，使珠粒在40uL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，TMB)HRP底物中进行再水合。对照珠粒未显现出任何颜色，且HRP的蓝色暴露于NaN3。此实施例表明，在蛋白质固定化之后，酶活性可保持不变，且此活性在室温下是稳定的。
实施例8：样品稳定性
按照针对TCEP及MMTS的S-Trap实验流程的建议，对在5％ SDS、50mM TEAB中的100ug血清的多个等分样品进行还原及烷基化。在S-Trap小型旋转柱上按照标准实验流程对10个此种等分样品进行了固定化及洗涤。将一根柱放置在-80C下。将其他柱在室温下留在工作台(benchtop)上，其中唯一需要额外留意的是，将所述其他柱保持在拉链锁头袋(zip-lock bag)中以防灰尘。在6个月中的每个月，将一个旋转柱放置在-80C下，进而使得有7个柱在室温下“老化”0个月到6个月。根据标准S-Trap样品处理实验流程(1:10重量:重量胰蛋白酶，在47C下2小时)处理了这些样品，并在安捷伦6546(Agilent 6546)上在正电离模式(positive ionization mode)下以60分钟梯度(60min gradient)在2.1mm柱上对这些样品进行了分析。所鉴定的肽的数目如图8中所示。
这些结果表明样品在室温下是稳定的。
实施例9：样品及蛋白酶稳定性
与实施例8同时，在酸化及结合之前立即添加了10ug胰蛋白酶。除了在实施例8的所有消化发生的当天将这些样品简单地在100uL的50mM TEAB中再水合以外，对这些样品进行了与实施例8相同的处理。肽鉴定率与实施例8在统计学上没有区别，此表明蛋白酶及样品在室温下稳定至少6个月。
尽管以上已阐述各种实施方案，然而应理解，此类公开内容仅通过举例的方式呈现，且不是限制性的。因此，本申请的组合物及方法的广度及范围不应受上述例示性实施方案中的任一者所限制，而应仅根据随附的权利要求书及其等效形式来定义。
以上说明是为了教示本领域技术人员如何实践本发明，且不旨在详细阐述在阅读本说明后将对技术工作者变得显而易见的本发明的所有显见的修改及变化。然而，旨在使所有此类显见的修改及变化都包括在由随附的权利要求书所界定的本发明的范围内。除非上下文特别指出相反的情况，否则权利要求书旨在涵盖有效地满足预期目标的任何顺序的部件及步骤。
Claims (20)
1.一种对靶标分子进行量化的方法，其特征在于，包含以下步骤：
使靶标分子结合到表面，其中所述靶标分子被呈现用于量化测定；
从所述靶标分子清除掉污染试剂，其中所述靶标分子保持结合到所述表面；
对所述靶标分子进行直接量化，其中所述靶标分子保持结合到所述表面，其中所述靶标分子的直接量化是通过测量所述靶标分子的内源荧光来实行。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包含在至少室温下存储或运输所述靶标分子，其中所述靶标分子在结合到所述表面的同时保持稳定。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标分子对所述表面的亲和力大于由所述污染试剂表现出的对所述表面的亲和力。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过分光亮度技术的使用来进行所述直接量化。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的每一步骤是自动化的。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面为C18疏水表面或者视情况地为C4疏水表面、C8疏水表面或其他适合的疏水表面。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标分子是通过疏水色谱法或亲水色谱法结合到表面。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标分子是通过弱或强的离子交换（阳离子或阴离子）结合到表面。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标分子结合在存在于选自由珠粒、膜、填充柱、整体柱、玻璃珠粒及色谱珠粒所组成的群组的一或多者的表面上。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标分子结合在所述表面上，且被洗涤掉还原试剂。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标分子结合在所述表面上，且被洗涤掉苯胺。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述直接量化是使用二辛可宁酸测定来实行。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述直接量化是通过测量蛋白质荧光来实行。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标分子是核酸。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述靶标分子是RNA。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标分子是蛋白质。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，测量色氨酸的内源荧光。
18.一种用于实施如权利要求1所述的方法的装置，其特征在于，所述设备包含：
蛋白质固定化点；
紫外线光源；以及
检测器。
19.如权利要求17所述的装置，其特征在于，所述装置包含96孔板。
20.如权利要求18所述的装置，其特征在于，所述装置是自动化的。
Applications Claiming Priority (3)
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