CN1179755C - 医用胶原海绵及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种医用胶原海绵及其制备方法，目的是提供一种创面止血与修复效果较好，价格低的医用胶原海绵。本发明的医用胶原海绵，由以下重量百分比的物质组成：胶原95-99.5，甘油0.5-5。本发明提供的医用胶原海绵的制备方法，包括以下步骤：1)将富含胶原蛋白的动物组织去除杂质粉碎；2)用稀碱溶液和醇类物质水溶液洗涤脱脂；3)溶解在稀酸溶液中；4)用复合蛋白酶处理；5)上清中加入NaCl，收集得到的沉淀物；6)溶于乙酸中；7)将98-99%的胶原溶液和1-2%的甘油混合，冷冻得到海绵状材料；8)置于100～150℃下固定60-120分钟，得到医用胶原海绵。
Description
技术领域
本发明涉及一种医用材料及其制备方法，特别是涉及一种胶原蛋白复合海绵及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是细胞外基质(Extracellular Matrix)的主要成分，是动物体内存在量最多的蛋白质。胶原具有抗原性低、与细胞亲合力大、与血小板产生血凝作用等特点，因而在医药领域应用广泛。目前已发现了20种遗传基因不同的胶原分子，其分类命名按发现的顺序用罗马字母表示，依次为I型、II型、----、XIX型、XX型。从一次结构的类似性上，又可分为纤维性胶原(I、II、III、V和XI型)，非纤维性胶原(IV和VI型)和FACIT(fibril associated collagen with interrupted triplehelices)型胶原。胶原分子的氨基酸序列以-Gly-X-Y-形式排列，其中Gly为甘氨酸残基，X、Y为其他类型的氨基酸残基，且脯氨酸/羟脯氨酸残基较多，约占20％。
以胶原为基础的医用产品的研究与开发，已经获得了很多成果，主要是将胶原做成不同剂型，如溶液、凝胶、粉末、海绵、纤维、薄膜等，或进行各种各样的改性，使其具有不同的医用或医疗功能。
市场上现有的止血用胶原海绵柔韧度较差，使其在软组织创面(如脑外科创面的止血填充修复)的应用上受到很大限制。由于胶原三条螺旋链领域缺乏酪氨酸残基，所以胶原本身的抗原性很低，目前市场上胶原产品的抗原性除杂质外主要来自胶原N和C终端的肽链。另外，为提高胶原产品的生物和化学稳定性，通常的办法是用醛类物质进行固定。化学固定剂潜在的毒性作用严重影响胶原产品的生物相容性。
发明内容
本发明的目的是提供一种创面止血与修复效果较好，价格低的医用胶原海绵。
本发明的技术方案是：
一种医用胶原海绵，它由以下重量百分比的物质组成：
胶原95-99.5
甘油0.5-5
其中，所述胶原是采用以下方法制备的：
1)将富含胶原蛋白的动物组织机械去除表皮层、肌肉和脂肪等杂质，粉碎后清洗干净；
2)用pH8.5-10.5的稀碱溶液和醇类物质水溶液洗涤脱脂；
3)溶解在pH5.5-6.5的稀酸溶液中；
4)向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量份数比为100-1000∶1，所述复合蛋白酶由活性比为：胃酶∶胰酶∶木瓜酶＝1∶1∶0.5的三种蛋白酶组成，30-35℃下搅拌培养10-15小时；
5)在离心收集的上清中加入NaCl，使浓度达到2mol/l，0-10℃下搅拌10-20小时，收集得到的沉淀物；
6)将沉淀物溶于0.1-0.5％乙酸溶液中，离心收集上清；
7)上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/l，搅拌得到沉淀物；重复操作3-4次，得到胶原。
其中，步骤2)中的稀碱溶液优选为氢氧化钠∶碳酸氢钠∶水＝0.1-1∶5-10∶89-94.9；所述醇类物质水溶液优选为乙醇∶异丙醇∶水＝5-10∶2-5∶85-93；所述步骤3)中的稀酸溶液优选为甲酸、乙酸、丙酸或盐酸溶液。
本发明的另一目的是提供一种上述医用胶原海绵的制备方法。
为实现这一目的，本发明采取以下技术方案；
一种医用胶原海绵的制备方法，包括以下步骤：
1)将富含胶原蛋白的动物组织机械去除表皮层、肌肉和脂肪等杂质，粉碎后清洗干净；
2)用pH8.5-10.5的稀碱溶液和醇类物质水溶液洗涤脱脂；
3)溶解在pH5.5-6.5的稀酸溶液中；
4)向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量比为100-1000∶1，所述复合蛋白酶由活性比为：胃酶∶胰酶∶木瓜酶＝1∶1∶0.5的三种蛋白酶组成，30-35℃下搅拌培养10-15小时；
5)在离心收集的上清中加入NaCl，使浓度达到2mol/l，0-10℃下搅拌10-20小时，收集得到的沉淀物；
6)将沉淀物溶于0.1-0.5％乙酸溶液中，离心收集上清；
7)上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/l，搅拌得到沉淀物；重复操作3-4次，得到胶原；
8)将胶原溶于0.01-0.1％乙酸溶液中，制成1-3％胶原溶液；
9)将重量百分比为98-99％的胶原溶液和重量百分比为1-2％的甘油混合均匀，在-10℃--80℃下冷冻1-5天，冻干得到海绵状材料；
10)将上述海绵状材料置于100～150℃下固定60-120分钟，得到医用胶原海绵。
其中，步骤2)中的稀碱溶液优选为氢氧化钠∶碳酸氢钠∶水＝0.1-1∶5-10∶89-94.9；所述醇类物质水溶液优选为乙醇∶异丙醇∶水＝5-10∶2-5∶85-93；所述步骤3)中的稀酸溶液优选为甲酸、乙酸、丙酸或盐酸溶液。
得到的胶原海绵经灭菌后为成品，灭菌的方法可以是将所述得到的医用胶原海绵用100-200W紫外灯照射30-60分钟后再包装，成为成品，也可以是将所述得到的医用胶原海绵先包装，再用60Co照射灭菌后为成品。
本发明将胶原蛋白与甘油联合运用，使产品的性能明显增强。加热处理和紫外灯照射不仅使本发明的医用胶原海绵具有较强的生物和化学稳定性，同时避免了使用具有潜在毒性的化学固定剂，使胶原海绵的安全性更加可靠。本发明巧妙地利用甘油对胶原蛋白进行处理，使海绵的柔韧度大幅提高，大大减轻操作时硬度刺激对创面和病人造成的损伤和痛苦，产品完全可以适用于软组织创面的止血、填充与修复。本发明的胶原海绵止血时间短，粘附创面组织的能力强，且具有促进成纤维细胞活性，诱发各种生长因子等特性，用作止血急救、创面修复与填充材料，其效果明显优于目前临床上常使用的创面止血与修复材料，如明胶海绵，羧甲基纤维素等。
稀碱和醇类物质水溶液的脱脂处理，使最终产品的脂肪含量降至最低。鉴于胶原产品抗原性主要来自胶原的N和C终端肽链，本发明创造性地用复合酶处理胶原，进一步切掉终端肽链，降低产品的抗原性。
本发明生产工艺简单，产品造价较低，具有广泛的推广应用价值。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
实施例1、生产医用胶原海绵，具体步骤如下：
1、将富含胶原蛋白的组织，如猪皮、牛皮、跟腱等，机械去除表皮层、肌肉和脂肪等杂质，粉碎后分别用自来水和纯水清洗；
2、配制pH9.0的稀碱溶液(重量份数比，氢氧化钠∶碳酸氢钠∶水＝0.5∶7.5∶92)和醇类物质水溶液(重量份数比，乙醇∶异丙醇∶水＝7∶4∶89)；
3、用上述配制的稀碱溶液和醇类物质水溶液洗涤第一步所得到的动物组织，使其脱脂；
4、将其溶解在pH6.0的稀甲酸溶液中；
5、向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量比为800∶1，复合蛋白酶由活性比为：胃酶∶胰酶∶木瓜酶＝1∶1∶0.5的三种蛋白酶组成，33℃下搅拌培养13小时；
6、离心，并收集上清液，在上清液中加入NaCl，使浓度达到2mol/l，5℃下搅拌15小时，收集得到的沉淀物；
7、将沉淀物溶于0.3％乙酸溶液中，离心收集上清；
8、上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/l，搅拌得到沉淀物；重复操作3次，收集沉淀物；
9、将沉淀物溶于0.05％乙酸溶液中，制成2％胶原溶液；
10、将上述得到的胶原溶液以及甘油按重量百分比98.8∶1.2的比例混合，在-70℃下冷冻2天，冻干得到海绵状材料；
11、将上述海绵状材料置于120℃下固定80分钟；
12、然后用100W紫外灯照射50分钟；
13、胶原海绵经包装、灭菌后入库。
用上述方法制得的用于止血与创面修复的胶原海绵中，胶原和甘油的重量百分比约98.5∶1.5。
实施例2、生产医用胶原海绵，具体步骤如下：
1、将富含胶原蛋白的组织，如猪皮、牛皮、跟腱等，机械去除表皮层、肌肉和脂肪等杂质，粉碎后分别用自来水和纯水清洗；
2、配制pH10.0的稀碱溶液(重量份数比，氢氧化钠∶碳酸氢钠∶水＝0.7∶5.5∶90)和醇类物质水溶液(重量份数比，乙醇∶异丙醇∶水＝9∶3∶92)；
3、用上述配制的稀碱溶液和醇类物质水溶液洗涤第一步所得到的动物组织，使其脱脂；
4、将其溶解在pH5.6的稀盐酸溶液中；
5、向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量比为500∶1，复合蛋白酶由活性比为：胃酶∶胰酶∶木瓜酶＝1∶1∶0.5的三种蛋白酶组成，34℃下搅拌培养11小时；
6、离心，并收集上清液，在上清液中加入NaCl，使浓度达到2mol/l，8℃下搅拌12小时，收集得到的沉淀物；
7、将沉淀物溶于0.2％乙酸溶液中，离心收集上清；
8、上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/l，搅拌得到沉淀物；重复操作4次，收集沉淀物；
9、将沉淀物溶于0.08％乙酸溶液中，制成1.5％胶原溶液；
10、将上述得到的胶原溶液以及甘油按重量百分比98.4∶1.6的比例混合均匀，在-30℃下冷冻4天，冻干得到海绵状材料；
11、将上述海绵状材料置于140℃下固定60分钟，得到的医用胶原海绵；
12、得到的医用胶原海绵经包装、60Co照射灭菌后为成品。
用上述方法制得的胶原海绵中，胶原和甘油的比例约97∶3。
Claims (6)
1、一种医用胶原海绵，它由以下重量百分比的物质组成：
胶原95-99.5
甘油0.5-5
其中，所述胶原是采用以下方法制备的：
1)将富含胶原蛋白的动物组织机械去除表皮层、肌肉和脂肪等杂质，粉碎后清洗干净；
2)用pH8.5-10.5的稀碱溶液和醇类物质水溶液洗涤脱脂；
3)溶解在pH5.5-6.5的稀酸溶液中；
4)向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量份数比为100-1000∶1，所述复合蛋白酶由活性比为：胃酶∶胰酶∶木瓜酶＝1∶1∶0.5的三种蛋白酶组成，30-35℃下搅拌培养10-15小时；
5)在离心收集的上清中加入NaCl，使浓度达到2mol/l，0-10℃下搅拌10-20小时，收集得到的沉淀物；
6)将沉淀物溶于0.1-0.5％乙酸溶液中，离心收集上清；
7)上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/l，搅拌得到沉淀物；重复操作3-4次，得到胶原。
2、根据权利要求1所述的医用胶原海绵，其特征在于：所述步骤2)中的稀碱溶液为氢氧化钠∶碳酸氢钠∶水＝0.1-1∶5-10∶89-94.9；所述醇类物质水溶液为乙醇∶异丙醇∶水＝5-10∶2-5∶85-93；所述步骤3)中的稀酸溶液为甲酸、乙酸、丙酸或盐酸溶液。
3、一种医用胶原海绵的制备方法，包括以下步骤：
1)将富含胶原蛋白的动物组织机械去除表皮层、肌肉和脂肪等杂质，粉碎后清洗干净；
2)用pH8.5-10.5的稀碱溶液和醇类物质水溶液洗涤脱脂；
3)溶解在pH5.5-6.5的稀酸溶液中；
4)向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量比为100-1000∶1，所述复合蛋白酶由活性比为：胃酶∶胰酶∶木瓜酶＝1∶1∶0.5的三种蛋白酶组成，30-35℃下搅拌培养10-15小时；
5)在离心收集的上清中加入NaCl，使浓度达到2mol/l，0-10℃下搅拌10-20小时，收集得到的沉淀物；
6)将沉淀物溶于0.1-0.5％乙酸溶液中，离心收集上清；
7)上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/l，搅拌得到沉淀物；重复操作3-4次，得到胶原；
8)将胶原溶于0.01-0.1％乙酸溶液中，制成1-3％胶原溶液；
9)将重量百分比为98-99％的胶原溶液和重量百分比为1-2％的甘油混合均匀，在-10℃--80℃下冷冻1-5天，冻干得到海绵状材料；
10)将上述海绵状材料置于100～150℃下固定60-120分钟，得到医用胶原海绵。
4、根据权利要求3所述的一种医用胶原海绵的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的稀碱溶液为氢氧化钠∶碳酸氢钠∶水＝0.1-1∶5-10∶89-94.9；所述醇类物质水溶液为乙醇∶异丙醇∶水＝5-10∶2-5∶85-93；所述步骤3)中的稀酸溶液为甲酸、乙酸、丙酸或盐酸溶液。
5、根据权利要求3或4所述的一种医用胶原海绵的制备方法，其特征在于：所述得到的医用胶原海绵用100～200W紫外灯照射30-60分钟后再包装，成为成品。
6、根据权利要求3或4所述的一种医用胶原海绵的制备方法，其特征在于：所述得到的医用胶原海绵经包装、60Co照射灭菌后为成品。
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