CN117953084A - 基于计算机视觉技术快速检测微生物发酵程度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于计算机应用技术领域，公开了一种基于计算机视觉技术快速检测微生物发酵程度的方法。包括标准比色系列的制备、pH与色盘RGB亮度值之间的回归分析及统计分析、表皮葡萄球菌对不同糖发酵的RGB亮度值结果统计分析、三种菌发酵糖的pH值与通过RGB亮度值预测pH值之间的结果分析。该方法的建立使用起来会更为安全，并且可以达到高通量，将会在食品发酵、益生元的筛选等得到广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于计算机应用技术领域，具体涉及一种基于计算机视觉技术快速检测微生物发酵程度的方法。
背景技术
计算机视觉技术能够重现人类的视觉系统，从单个图像或序列中自动提取信息，并结合人工智能等技术对数据进行分析。其快捷、无损等优势被许多研究人员关注，是目前测色技术领域的研究热点。计算机视觉技术在科技工业中也有成功应用，如DigiEye色牢度评级仪，该仪器通过测定反射率、透射率、色差值、明度值、白度值以及不透明度等参数，表征食品颜色，可弥补色差仪测量质地不均匀或体积较小的物体时的不足；周中帆等将DigiEye色牢度评级仪与全自动色差仪对预制蔬菜颜色的表征结果进行比较，并得出了DigiEye色牢度评级仪表征颜色的最佳参数。近年来计算机视觉技术正在蓬勃发展，从其无损、快捷的检测特点来看，它是符合现代化、容易实现自动化的检测方法。
微生物资源利用中细菌等微生物对碳源的利用比较常见的是发酵，微生物发酵后一般会产生酸将培养基的酸碱度降低，可以通过观察pH的变化来判断，虽然可以采用传统的pH试纸、酸碱指示剂以及pH电极法等方法，但高通量、快速、方便、无污染并且能定量观察反应细菌发酵pH变化程度，上述方法很难满足。通常采用在培养基中加入酸碱指示剂的方式，根据肉眼观察颜色的变化，来判定其是否能够利用其碳源进行发酵。该方法很难定量、快速、高通量。为了解决这一问题，我们发明了一种采用利用酚红作为酸碱指示剂，利用OpenCV视觉图像处理方法能建立一种高通量、方便、快捷、准确的定量测定微生物发酵过程中pH变化程度的方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种基于计算机视觉技术快速检测微生物发酵程度的方法，通过与OpenCV视觉图像处理相结合的方法，解决定量测定微生物的发酵程度。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：基于计算机视觉技术快速检测微生物发酵程度的方法，包括以下步骤：
1.标准比色系列的制备；
2.pH与色盘RGB亮度值之间的回归分析及统计分析；
3.表皮葡萄球菌对不同糖发酵的RGB亮度值结果统计分析；
4.三种菌发酵糖的pH值与通过RGB亮度值预测pH值之间的结果分析。
进一步的，所述步骤1具体为：主要目的是规避掉菌浊度的影响。配制标准比色系列，以酚红作为酸碱指示剂，以营养肉汤作为溶液，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠分别配出0.2M磷酸盐溶液，将表皮葡萄球菌配制成菌悬液，分别加入0.2M磷酸盐溶液使其含菌量为106cuf/ml。按照一定比例将两种溶液混合配制出标准pH系列，用0.1N的NaOH或HCl进行微调，做成pH在4.4-9.0之间的标准酸碱度比色系列(简称标准比色列)，取200ul标准比色列溶液置于U型96孔细胞培养板中，通过扫描仪扫描获得标准比色系列图片，即是标准比色盘。
进一步的，所述步骤2具体为：采用OpenCV视觉图像处理方法对扫描的标准比色盘图片进行图片处理，选取圆心周围范围20*20(像素)大小的正方形，逐像素点读取正方形内的R、G、B值，并分别取其平均值R_mean、G_mean、B_mean，通过公式:brightness＝0.3*R_mean+0.6*G_mean+0.1*B_mean得出每一个标准比色列的亮度值(所有数值均取小数点后两位)。根据RGB亮度值与pH值进行多元回归，绘制出多元回归曲线，利用配对T检验进行显著性分析，选择pH＝6.6-8.4进行线性回归分析，绘制出线性回归曲线。
进一步的，所述步骤3具体为：选取蛋白胨10g、牛肉膏粉10g、NaCl 5g，加水1000ml为基础培养基(pH＝7.4-7.6)，利用不同的糖作为碳源，糖在培养基中的终浓度为2％，用一定浓度活化好的表皮葡萄球菌作为试验菌种，在96孔U型细胞培养板进行培养，观察36±1℃，6小时左右表皮葡萄球菌对不同碳源的发酵情况，以对照无明显颜色变化，表皮葡萄球菌与葡萄糖混合培养组颜色变黄色为标准。将细胞培养板按照步骤1、2方法得到的RGB亮度值，利用配对T检验进行显著性分析，根据统计结果选取表皮葡萄球菌可以发酵的蔗糖、不发酵的甘露醇，进一步试验研究。
进一步的，所述步骤4具体为：利用步骤3的基础培养基，甘露醇、蔗糖作为碳源，以一定浓度活化好的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌为试验菌种，方法同步骤3，观察6小时左右，三个试验菌对两种碳源的发酵情况。将该试验置于24孔细胞培养板，重复进行三种试验菌对两种碳源发酵试验，测pH值，观察pH与RGB亮度值之间的相关性，验证建立该方法是可行的。
本发明与现有技术相比的有益效果是：该方法是在有氧培养条件下，能快速、高通量、无污染的检测某种细菌发酵碳源的情况，同时还可以比较细菌对不同碳源发酵情况的比较，目前未见有该方面的报道。该方法的建立使用起来会更为安全，并且可以达到高通量，将会在食品发酵、益生元的筛选等得到广泛应用。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步说明
图1是标准色盘图；
图2是pH值与色盘RGB亮度值之间的回归分析及统计分析图；
图3是pH＝6.6-8.4与其RGB亮度值之间的线性回归分析图；
图4是表皮葡萄球菌对不同糖发酵的RGB亮度值结果统计分析图；
图5是表皮葡萄球菌对三种糖发酵的pH值与通过RGB亮度值预测pH的结果分析图；
图6是金黄色葡萄球菌对三种糖发酵的pH值与通过RGB亮度值预测pH的结果分析图；
图7是痤疮丙酸杆菌对三种糖发酵的pH值与通过RGB亮度值预测pH的结果分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施例一
1.配制酸碱度标准比色系列
以酚红作为酸碱指示剂，以营养肉汤作为溶液，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠分别配出0.2M磷酸盐溶液，将表皮葡萄球菌配制成菌悬液，分别加入0.2M磷酸盐溶液使其含菌量为106cuf/ml。按照一定比例将两种溶液混合配制出标准pH系列，用0.1N的NaOH或HCl进行微调，做成pH在4.4-9.0之间的标准酸碱度比色系列(简称标准比色列)，取200ul标准比色列溶液置于U型96孔细胞培养板中，通过扫描仪扫描获得标准比色盘的图片(见附图1)。
2.标准比色盘的图像处理
采用OpenCV视觉图像处理方法对扫描的标准比色盘图片进行图片处理，选取圆心周围范围20*20(像素)大小的正方形，逐像素点读取正方形内的R、G、B值，并分别取其平均值R_mean、G_mean、B_mean，通过公式:brightness＝0.3*R_mean+0.6*G_mean+0.1*B_mean得出每一个标准比色列的亮度值(所有数值均取小数点后两位)。根据RGB亮度值与pH值进行多元回归，绘制出多元回归曲线，利用配对T检验进行显著性分析(见附图2)，选择pH＝6.6-8.4进行线性回归分析，绘制出线性回归曲线(见附图3)。
3.表皮葡萄球菌对不同糖源的发酵情况比较
选取蛋白胨10g、牛肉膏粉10g、NaCl 5g，加水1000ml为基础培养基(pH＝7.4-7.6)，利用不同的糖作为碳源，糖在培养基中的终浓度为2％，用一定浓度活化好的表皮葡萄球菌作为试验菌种，在96孔U型细胞培养板进行培养，观察36±1℃，6小时左右表皮葡萄球菌对不同碳源的发酵情况，以对照无明显颜色变化，表皮葡萄球菌与葡萄糖混合培养组颜色变黄色为标准。将细胞培养板按照步骤1、2方法得到的RGB亮度值，利用配对T检验进行显著性分析，根据统计结果选取表皮葡萄球菌可以发酵的蔗糖、不发酵的甘露醇，进一步试验研究(见附图4)。
4.三种菌对两种代表性的糖源发酵情况比较，验证方法的可行性
利用步骤3的基础培养基，甘露醇、蔗糖作为碳源，以一定浓度活化好的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌为试验菌种，方法同步骤3，观察6小时左右，三个试验菌对两种碳源的发酵情况。将该试验置于24孔细胞培养板，重复进行三种试验菌对两种碳源发酵试验，测pH值，观察pH与RGB亮度值之间的相关性，来验证建立该方法是可行的(见附图5-7)。
2.实施例二
1.配制酸碱度标准比色系列
以酚红作为酸碱指示剂，以营养肉汤作为溶液，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠分别配出0.1M磷酸盐溶液，将表皮葡萄球菌配制成菌悬液，分别加入0.1M磷酸盐溶液使其含菌量为106cuf/ml。按照一定比例将两种溶液混合配制出标准pH系列，用0.1N的NaOH或HCl进行微调，做成pH在4.4-9.0之间的标准酸碱度比色系列(简称标准比色列)，取200ul标准比色列溶液置于U型96孔细胞培养板中，通过扫描仪扫描获得标准比色盘的图片(见附图1)。
2.标准比色盘的图像处理
采用OpenCV视觉图像处理方法对扫描的标准比色盘图片进行图片处理，选取圆心周围范围20*20(像素)大小的正方形，逐像素点读取正方形内的R、G、B值，并分别取其平均值R_mean、G_mean、B_mean，通过公式:brightness＝0.3*R_mean+0.6*G_mean+0.1*B_mean得出每一个标准比色列的亮度值(所有数值均取小数点后两位)。根据RGB亮度值与pH值进行多元回归，绘制出多元回归曲线，利用配对T检验进行显著性分析(见附图2)，选择pH＝6.6-8.4进行线性回归分析，绘制出线性回归曲线(见附图3)。
3.表皮葡萄球菌对不同糖源的发酵情况比较
选取蛋白胨10g、牛肉膏粉10g、NaCl 5g，加水1000ml为基础培养基(pH＝7.4-7.6)，利用不同的糖作为碳源，糖在培养基中的终浓度为2％，用一定浓度活化好的表皮葡萄球菌作为试验菌种，在96孔U型细胞培养板进行培养，观察36±1℃，6小时左右表皮葡萄球菌对不同碳源的发酵情况，以对照无明显颜色变化，表皮葡萄球菌与葡萄糖混合培养组颜色变黄色为标准。将细胞培养板按照步骤1、2方法得到的RGB亮度值，利用配对T检验进行显著性分析，根据统计结果选取表皮葡萄球菌可以发酵的蔗糖、不发酵的甘露醇，进一步试验研究(见附图4)。
4.三种菌对两种代表性的糖源发酵情况比较，验证方法的可行性
利用步骤3的基础培养基，甘露醇、蔗糖作为碳源，以一定浓度活化好的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌为试验菌种，方法同步骤3，观察6小时左右，三个试验菌对两种碳源的发酵情况。将该试验置于24孔细胞培养板，重复进行三种试验菌对两种碳源发酵试验，测pH值，观察pH与RGB亮度值之间的相关性，来验证建立该方法是可行的(见附图5-7)。
实施例三
1.配制酸碱度标准比色系列
以酚红作为酸碱指示剂，以营养肉汤作为溶液，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠分别配出0.2M磷酸盐溶液，将表皮葡萄球菌配制成菌悬液，分别加入0.2M磷酸盐溶液使其含菌量为106cuf/ml。按照一定比例将两种溶液混合配制出标准pH系列，用0.1N的NaOH或HCl进行微调，做成pH在4.4-9.0之间的标准酸碱度比色系列(简称标准比色列)，取200ul标准比色列溶液置于U型96孔细胞培养板中，通过扫描仪扫描获得标准比色盘的图片(见附图1)。
2.标准比色盘的图像处理
采用OpenCV视觉图像处理方法对扫描的标准比色盘图片进行图片处理，选取圆心周围范围20*20(像素)大小的正方形，逐像素点读取正方形内的R、G、B值，并分别取其平均值R_mean、G_mean、B_mean，通过公式:brightness＝0.3*R_mean+0.6*G_mean+0.1*B_mean得出每一个标准比色列的亮度值(所有数值均取小数点后两位)。根据RGB亮度值与pH值进行多元回归，绘制出多元回归曲线，利用配对T检验进行显著性分析(见附图2)，选择pH＝6.6-8.4进行线性回归分析，绘制出线性回归曲线(见附图3)。
3.表皮葡萄球菌对不同糖源的发酵情况比较
选取蛋白胨10g、牛肉膏粉10g、NaCl 5g，加水1000ml为基础培养基(pH＝7.4-7.6)，利用不同的糖作为碳源，糖在培养基中的终浓度为2％，用一定浓度活化好的表皮葡萄球菌作为试验菌种，在96孔U型细胞培养板进行培养，观察36±1℃，6小时左右表皮葡萄球菌对不同碳源的发酵情况，以对照无明显颜色变化，表皮葡萄球菌与葡萄糖混合培养组颜色变黄色为标准。将细胞培养板按照步骤1、2方法得到的RGB亮度值，利用配对T检验进行显著性分析，根据统计结果选取表皮葡萄球菌可以发酵的蔗糖、不发酵的甘露醇，进一步试验研究(见附图4)。
4.三种菌对两种代表性的糖源发酵情况比较，验证方法的可行性
利用步骤3的基础培养基，甘露醇、蔗糖作为碳源，以一定浓度活化好的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌为试验菌种，方法同步骤3，观察8小时左右，三个试验菌对两种碳源的发酵情况。将该试验置于24孔细胞培养板，重复进行三种试验菌对两种碳源发酵试验，测pH值，观察pH与RGB亮度值之间的相关性，来验证建立该方法是可行的(见附图5-7)。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (5)
1.基于计算机视觉技术快速检测微生物发酵程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.标准比色系列的制备；
S2.pH与色盘RGB亮度值之间的回归分析及统计分析；
S3.表皮葡萄球菌对不同糖发酵的RGB亮度值结果统计分析；
S4.三种菌发酵糖的pH值与通过RGB亮度值预测pH值之间的结果分析。
2.根据权利要求1所述的基于计算机视觉技术快速检测微生物发酵程度的方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：配制标准比色系列，以酚红作为酸碱指示剂，以营养肉汤作为溶液，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠分别配出0.2M磷酸盐溶液，将表皮葡萄球菌配制成菌悬液，分别加入0.2M磷酸盐溶液使其含菌量为106cuf/ml；将两种溶液混合配制出标准pH系列，用0.1N的NaOH或HCl进行微调，做成pH在4.4-9.0之间的标准酸碱度比色系列即标准比色列，取200ul标准比色列溶液置于U型96孔细胞培养板中，通过扫描仪扫描获得标准比色系列图片，即是标准比色盘。
3.根据权利要求2所述的基于计算机视觉技术快速检测微生物发酵程度的方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：采用OpenCV视觉图像处理方法对步骤S1扫描的标准比色盘图片进行图片处理，选取圆心周围范围20*20像素大小的正方形，逐像素点读取正方形内的R、G、B值，并分别取其平均值R_mean、G_mean、B_mean，通过公式:brightness＝0.3*R_mean+0.6*G_mean+0.1*B_mean得出每一个标准比色列的亮度值，所有数值均取小数点后两位；根据RGB亮度值与pH值进行多元回归，绘制出多元回归曲线，利用配对T检验进行显著性分析，选择pH＝6.6-8.4进行线性回归分析，绘制出线性回归曲线。
4.根据权利要求3所述的基于计算机视觉技术快速检测微生物发酵程度的方法，其特征在于，所述步骤S3具体为：选取蛋白胨10g、牛肉膏粉10g、NaCl 5g，加水1000ml为基础培养基，培养基pH＝7.4-7.6，利用不同的糖作为碳源，糖在培养基中的终浓度为2％，用一定浓度活化好的表皮葡萄球菌作为试验菌种，在96孔U型细胞培养板进行培养，观察36±1℃，6小时左右表皮葡萄球菌对不同碳源的发酵情况，以对照无明显颜色变化，表皮葡萄球菌与葡萄糖混合培养组颜色变黄色为标准。将细胞培养板按照步骤S1、S2方法得到的RGB亮度值，利用配对T检验进行显著性分析，根据统计结果选取表皮葡萄球菌可以发酵的蔗糖、不发酵的甘露醇，进一步试验研究。
5.根据权利要求1所述的基于计算机视觉技术快速检测微生物发酵程度的方法，其特征在于，所述步骤S4具体为：利用步骤S3的基础培养基，甘露醇、蔗糖作为碳源，以一定浓度活化好的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌为试验菌种，方法同步骤S3，观察6小时左右，三个试验菌对两种碳源的发酵情况。将该试验置于24孔细胞培养板，重复进行三种试验菌对两种碳源发酵试验，测pH值，观察pH与RGB亮度值之间的相关性，验证建立该方法是可行的。
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