CN117947072A - 一种原核细胞分泌表达系统及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本文提供一种原核细胞分泌表达系统及其构建方法和应用。具体地，本文提供一种用于原核细胞的蛋白质分泌表达系统，其包含：(i)目的蛋白表达盒，其含有与第一启动子操作性连接的编码所述目的蛋白的多核苷酸；和(ii)促分泌元件，其含有与第二启动子操作性连接的编码促分泌因子的多核苷酸；其中，所述目的蛋白含有信号肽；并且其中，所述编码促分泌因子的多核苷酸具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。本文还提供了所述分泌表达系统的构建方法、具有该分泌表达系统的载体、细胞，及其用于分泌表达生产蛋白质的用途。本文提供的分泌表达系统能实现蛋白质的高效分泌表达，提高蛋白质产品的纯度和产量，在重组蛋白生产中有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及生物工程领域，具体涉及一种原核细胞分泌表达系统及其构建方法和应用。
背景技术
常见的原核表达宿主具有生长速度快、遗传背景和生理特性清楚、易于改造操作、生长密度高等优点。但是，其在蛋白质表达方面也存在一些缺点：(1)目的蛋白通常在胞内表达，难以规避胞内蛋白酶降解，且胞内缺乏周质空间的氧化还原环境及促进二硫键形成的酶；(2)蛋白质表达后的纯化步骤烦琐、细胞破碎工艺复杂且破碎后会引入大量污染性宿主细胞蛋白。
在原核表达宿主中采用分泌表达策略表达目的重组蛋白，可以更大程度地规避上述缺陷。目前，原核表达宿主(例如大肠杆菌)中常用的分泌表达策略是在目的重组蛋白前端添加合适的信号肽，参见例如，CN103173440A、CN100475965C、CN106589067B、CN109825488A。由此，目的重组蛋白能够从胞内分泌到原核表达宿主周质空间中。但是，由于目的重组蛋白本身性质的不同，只有部分目的重组蛋白能被进一步分泌至胞外培养基。
因此，仍需一种优化的分泌表达策略，其能够使原核表达宿主胞内表达的目的蛋白更高效地分泌至胞外培养基，以提高蛋白质产品(例如重组蛋白)的纯度和产量。
发明内容
发明人经长期研究发现并构建了一种使目的重组蛋白高效分泌表达至胞外培养基的策略，其能够使目的重组蛋白高效分泌表达，简化工艺流程，且能提高蛋白质产品的纯度和产量，具有重要的产业化应用价值。
一方面，本公开提供一种用于原核细胞的蛋白质分泌表达系统，其包含：
(i)目的蛋白表达盒，其含有与第一启动子操作性连接的编码所述目的蛋白的多核苷酸；和
(ii)促分泌元件，其含有与第二启动子操作性连接的编码促分泌因子的多核苷酸；
其中，所述目的蛋白含有信号肽；并且
其中，所述编码促分泌因子的多核苷酸具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
另一方面，本公开提供分泌表达载体，其包含本文所述的蛋白质分泌表达系统。
另一方面，本公开提供一种原核细胞分泌表达系统的构建方法，其包括对原核细胞进行工程改造以使其含有本文所述的蛋白质分泌表达系统。
另一方面，本公开提供一种分泌表达载体的构建方法，其包括对载体进行改造以使其含有：
(i)目的蛋白表达盒，其含有与第一启动子操作性连接的编码所述目的蛋白的多核苷酸；和
(ii)促分泌元件，其含有与第二启动子操作性连接的编码促分泌因子的多核苷酸；
其中，所述目的蛋白含有信号肽；并且
其中，所述编码促分泌因子的多核苷酸具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
另一方面，本公开提供一种经工程改造的原核细胞，其包含本文所述的蛋白质分泌表达系统。
另一方面，本公开提供一种分泌表达生产蛋白质的方法，其包括培养本文所述的经工程改造的原核细胞，以使其表达并分泌目的蛋白。
另一方面，本公开提供本文所述的蛋白质分泌表达系统用于蛋白质生产中的用途。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
图1显示了分泌表达核酸酶的蛋白质电泳图：泳道1为蛋白质梯标，泳道2为胞内表达的核酸酶样品，泳道3为分泌表达到发酵液上清的核酸酶样品。
具体实施方式
本申请中科技术语的含意与本领域技术人员的普遍理解一致，除非另做说明。本申请中，“一”或其与各种量词的组合既包括单数含意也包括复数含意，除非特别说明。本申请中，对于同一参数或变量，当给出多个数值、数值范围、或其组合予以说明时，相当于具体揭示了这些数值、范围端值以及由它们任意组合而成的数值范围。本申请中，任一数值不论是否带有“约”之类的修饰词，一律涵盖本领域技术人员能够理解的约略范围，例如正负10％、5％等。本文中，每一“实施方式”均同等地指代且涵盖了本申请各项方法和各项系统的实施方式。本申请中，任意实施方式中一项或多项技术特征可以与任何一个或多个其他实施方式中的一项或多项技术特征自由组合，由此得到的实施方式同样属于本申请公开的内容。
一方面，本公开提供一种用于原核细胞的蛋白质分泌表达系统，其包含：
(i)目的蛋白表达盒，其含有与第一启动子操作性连接的编码所述目的蛋白的多核苷酸；和
(ii)促分泌元件，其含有与第二启动子操作性连接的编码促分泌因子的多核苷酸；
其中，所述目的蛋白含有信号肽；并且
其中，所述编码促分泌因子的多核苷酸具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
根据本公开的蛋白质分泌表达系统用于原核细胞。在一些实施方式中，所述蛋白质分泌表达系统用于基于原核细胞的蛋白质生产。
术语“原核细胞”是组成原核生物的细胞。这类细胞无典型细胞核结构，主要特征是核质与细胞质之间没有核膜，有位于形状不规则且边界不明显区域的环形DNA分子，细胞质内无任何膜结构的细胞器。
在一些实施方式中，所述原核细胞选自细菌细胞。在一些实施方式中，所述原核细胞选自革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞，及其组合。在一些实施方式中，所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
根据本公开的蛋白质分泌表达系统包含目的蛋白表达盒，其含有编码所述目的蛋白的多核苷酸。
术语“目的蛋白”在本文中是指期望由所述原核细胞表达(例如，大量表达)并分泌至胞外的蛋白质(例如，产品蛋白质)。在一些示例性的实施方式中，所述目的蛋白包括但不限于酶(例如核酸酶等)、细胞因子、抗体及其片段等。
在一些实施方式中，所述目的蛋白可以是异源蛋白。术语“异源蛋白”是指虽然宿主细胞不能天然产生，但用适当的编码此蛋白质的DNA转化后能够产生的蛋白质或多肽。
在一些实施方式中，所述目的蛋白可以是重组蛋白。术语“重组蛋白”是指通过基因重组技术而人工制造的蛋白质。
在一些实施方式中，所述目的蛋白可以是融合蛋白。术语“融合蛋白”在本文中意指通过连接两个或更多个原本独立编码蛋白质的基因(即通过融合两个或更多个基因)而产生的蛋白质。
根据本公开的蛋白质分泌表达系统中，所述目的蛋白含有信号肽。
术语“信号肽”是指能够引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度一般为约5-30个氨基酸)肽链。
在一些实施方式中，信号肽可包括但不限于：来源于Sec途径的信号肽，来源于Tat途径的信号肽，以及来源于Sec-Tat途径的信号肽。在一些示例性的实施方式中，所述来源于Sec途径的信号肽可包括：OmpA、PelB、PhoA、Lpp。在一些示例性的实施方式中，所述来源于Tat途径的信号肽可包括TorA、Fdog。在一些示例性的实施方式中，所述来源于Sec-Tat途径的信号肽可包括FhuD。
在一些实施方式中，编码信号肽的多核苷酸位于编码目的蛋白的多核苷酸的上游。在一些实施方式中，信号肽位于目的蛋白的N端。
术语“表达盒”指的是包含启动子和目的基因(包括编码目的蛋白的多核苷酸)的一组DNA序列，所述表达盒能够在宿主细胞中表达所述目的基因。
根据本公开的蛋白质分泌表达系统包含促分泌元件，其含有编码促分泌因子的多核苷酸。本文所用的促分泌因子表达后能够促进目的蛋白分泌。
根据本公开的蛋白质分泌表达系统中，编码促分泌因子的多核苷酸具有SEQ IDNO:1所示核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述促分泌元件具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
根据本公开的蛋白质分泌表达系统中，编码目的蛋白的多核苷酸与第一启动子操作性地连接，且编码促分泌因子的多核苷酸与第二启动子操作性地连接。
术语“启动子”是指允许与其操作性地连接的目的基因进行转录并调控其表达的多核苷酸序列。所述启动子包括能被RNA聚合酶识别的序列和转录起始位点。
启动子可以是本领域已知的任何合适的启动子。例如，适用于本公开的启动子可选自：组成型启动子和诱导型启动子。
术语“组成型启动子”指能够使基因在所有组织中都能启动表达的启动子。组成型启动子的调控不受外界条件的影响，所启动基因的表达具有持续性，但不表现时空特异性。合适的组成型启动子的示例包括但不限于：PrpsL、Pgapdh、T5等。
术语“诱导型启动子”指在某些特定的物理或化学信号(例如化学物质、光、温度、胁迫等)的刺激下能大幅提高目的基因的转录水平，准确、持续并且适时适量地表达目的基因的启动子。合适的诱导型启动子的示例包括但不限于：阿拉伯糖诱导型启动子、IPTG诱导型启动子、鼠李糖诱导型启动子等。
本文所述第一启动子和第二启动子可以相同或不同。在一些实施方式中，所述第一启动子和第二启动子各自独立地选自组成型启动子和诱导型启动子。在一些实施方式中，所述第一启动子和第二启动子分别为诱导型启动子。在一些实施方式中，所述第一启动子为受乳糖操纵子调控的PT7启动子。在一些实施方式中，所述第二启动子为受阿拉伯糖操纵子调控的PBAD启动子。
在一个示例性的具体实施方式中，与第二启动子操作性连接的编码促分泌因子的多核苷酸包含在具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的促分泌元件中。具体地，SEQ ID NO:2所示核苷酸序列包含阿拉伯糖操纵子中的调控蛋白araC编码序列和受阿拉伯糖诱导的启动子PBAD。该促分泌元件经阿拉伯糖诱导后能够表达促分泌因子以促进目的蛋白的分泌。
术语“操作性地连接”是指在转录调控序列(例如，启动子、增强子等)或翻译调控序列和第二序列(例如，编码目的蛋白的多核苷酸)之间的功能性连接，而非物理位置上的连接，其允许功能性连接的元件或结构能够完成期望的操作，例如，允许启动子序列启动并介导第二序列对应的DNA的转录。具体地，术语“操作性地连接”意指目的蛋白的基因的表达(操作)位于转录调控序列(例如，启动子、增强子等)或翻译调控序列的控制之下。
根据本公开的蛋白质分泌表达系统包含于同一宿主细胞中。换言之，所述蛋白质分泌表达系统中的目的蛋白表达盒和促分泌元件同时存在于同一宿主细胞中以发挥其相应功能，从而促进目的蛋白的分泌表达。
在一些具体实施方式中，目的蛋白表达盒和促分泌元件可位于一个载体上。例如，可将同时携载目的蛋白表达盒和促分泌元件的载体(例如，分泌表达载体)转入宿主细胞，以使其高效分泌表达目的蛋白。
在另一些具体实施方式中，目的蛋白表达盒和促分泌元件可分别位于多个载体上。例如，可将分别携载目的蛋白表达盒和促分泌元件的多个载体(例如，分泌表达载体)同时或依次转入宿主细胞，以使其高效分泌表达目的蛋白。举例而言，
可使第一载体携载目的蛋白表达盒，第二载体携载促分泌元件，或反之亦然。所述多个载体(例如，第一载体和第二载体)可以是相同或不同种类的载体。
在另一些具体实施方式中，所述目的蛋白表达盒可位于载体上，而所述促分泌元件可位于宿主细胞的基因组中。例如，可将促分泌元件整合进入所述宿主细胞的基因组，并将携载目的蛋白表达盒的载体(例如，分泌表达载体)转入该宿主细胞，以使其高效分泌表达目的蛋白。
另一方面，本公开提供所述原核分泌表达系统的构建方法，其包括对原核细胞进行工程改造以使其具有本文所述的蛋白质分泌表达系统。
在一些具体实施方式中，所述原核分泌表达系统的构建方法包括：构建同时携载本文所述的目的蛋白表达盒和促分泌元件的载体(例如，分泌表达载体)，并将其引入原核细胞。
在另一些具体实施方式中，所述原核分泌表达系统的构建方法包括：构建分别携载目的蛋白表达盒和促分泌元件的多个载体(例如，第一载体和第二载体)，并将其同时或依次引入原核细胞。
在另一些具体实施方式中，所述原核分泌表达系统的构建方法包括：将促分泌元件整合进入原核细胞的基因组，并将携载目的蛋白表达盒的载体引入该原核细胞。
另一方面，本公开提供包含所述蛋白质分泌表达系统的分泌表达载体。
所述分泌表达载体通过将所述蛋白质分泌表达系统中所含的目的蛋白表达盒和促分泌元件整合进入分泌表达载体而产生。
所述分泌表达载体可以是一个载体或多个载体(例如，载体组)。
在一些具体实施方式中，包含本文所述的蛋白质分泌表达系统的分泌表达载体为一个载体，其同时携载所述目的蛋白表达盒和促分泌元件。
在另一些具体实施方式中，包含本文所述的蛋白质分泌表达系统的分泌表达载体为多个载体(载体组)，其中所述目的蛋白表达盒和促分泌元件分别携载于所述载体组的不同载体(例如，第一载体和第二载体)上。所述多个载体(例如，第一载体和第二载体)可以是相同或不同种类的载体。
合适的载体的示例包括但不限于通用型表达质粒。在一些实施方式中，合适的载体可以是融合型表达载体。在一些具体实施方式中，合适的载体的示例可包括但不限于pET28a、pACYCDuet-1、pETDuet-1等。
在一个示例性的实施方式中，所述目的蛋白表达盒和促分泌元件整合在pET28a载体上。具体地，所述促分泌元件整合在pET28a载体的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4之间。
另一方面，本公开提供一种分泌表达载体的构建方法，其包括对载体进行改造以使其含有：
(i)目的蛋白表达盒，其含有与第一启动子操作性连接的编码所述目的蛋白的多核苷酸；和
(ii)促分泌元件，其含有与第二启动子操作性连接的编码促分泌因子的多核苷酸；
其中，所述目的蛋白含有信号肽；并且
其中，所述编码促分泌因子的多核苷酸具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述促分泌元件具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
构建的分泌表达载体可以是一个载体或多个载体(例如，载体组)。
在一些具体实施方式中，可对一个载体进行改造，以使其同时携载目的蛋白表达盒和促分泌元件。
在另一些具体实施方式中，可对多个载体(例如，第一载体和第二载体)进行改造，以使其分别携载目的蛋白表达盒和促分泌元件。所述多个载体(例如，第一载体和第二载体)可以是相同或不同种类的载体。
可用的载体的示例包括但不限于通用型表达质粒。在一些实施方式中，合适的载体可以是融合型表达载体。在一些具体实施方式中，合适的载体的示例可包括但不限于pET28a、pACYCDuet-1、pETDuet-1等。
在一个示例性的实施方式中，所述目的蛋白表达盒和促分泌元件被整合在同一pET28a载体上。具体地，所述促分泌元件整合在pET28a载体的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4之间。
另一方面，本公开提供一种经工程改造的原核细胞，其包含本文所述的蛋白质分泌表达系统。
在一些实施方式中，所述经工程改造的原核细胞选自细菌细胞。在一些实施方式中，所述经工程改造的原核细胞选自革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞，及其组合。在一些实施方式中，所述经工程改造的原核细胞是大肠杆菌细胞。
在一些实施方式中，通过将本公开所述的分泌表达载体导入(例如转化至)原核细胞来制备所述经工程改造的原核细胞。在采用多个分泌表达载体(例如载有目的蛋白表达盒的第一载体和载有促分泌元件的第二载体)的实施方式中，可将多个分泌表达载体(例如第一载体和第二载体)同时或依次导入(例如转化至)所述原核细胞。
另一方面，本公开提供一种分泌表达蛋白质的方法，其包括培养所述经工程改造的原核细胞，以使其分泌表达目的蛋白。
在一些实施方式中，在约30℃至约37℃(例如，约30℃或约37℃)的温度培养所述经工程改造的原核细胞。
在一些实施方式中，所述经工程改造的原核细胞在诱导剂的存在下培养，以激活相应的诱导型启动子。在一些实施方式中，所述诱导剂可包括，例如，阿拉伯糖、IPTG、鼠李糖等。
另一方面，本公开提供所述蛋白质分泌表达系统用于蛋白质生产中的用途。
实施例
实施例1：促分泌元件设计及合成
本实施例提供了通过基因合成手段获得的受阿拉伯糖操纵子调控的促分泌元件。该元件中含有阿拉伯糖操纵子中的调控蛋白araC及受阿拉伯糖诱导的启动子PBAD。该元件经阿拉伯糖诱导后能够表达促分泌因子促进重组蛋白的分泌表达。该元件中所含的编码促分泌因子的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1。该元件的DNA序列示于SEQ ID NO:2。
实施例2：分泌表达载体的构建
本实施例提供了本发明提及的原核细胞分泌表达载体的示例性构建方法。具体步骤为：采用大肠杆菌作为示例性原核细胞，以通用型表达质粒pET28a作为出发质粒，利用基因合成手段将实施例中1中合成的分泌表达元件整合入pET28a序列的SEQ ID NO:3和SEQID NO:4之间，以获得可用于蛋白分泌表达的分泌表达载体。
实施例3：核酸酶NucA分泌表达载体的构建
(1)通过基因合成的手段，合成包含ompA信号肽编码基因及核酸酶编码基因的序列SEQ ID NO:5。
(2)将实施例2中获得的分泌表达载体，使用限制性核酸内切酶BamHI和NcoI线性化，并进行胶回收。
(3)采用无缝克隆的方法，将(1)和(2)中的片段进行连接，即获得用于核酸酶分泌表达的载体。
实施例4：核酸酶的分泌表达
本实施例提供了核酸酶的分泌表达生产方法。
(1)将实施例3中获得的用于核酸酶分泌表达的载体转化入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，置于37℃倒置培养，直至有单克隆长出。
(2)挑取上述单克隆，接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，置于恒温摇床中过夜震荡培养(37℃、220rpm)。
(3)按照1％的接种比例，将上述过夜培养物转接入50mL含卡那霉素的LB液体培养基中，置于恒温摇床(37℃、220rpm)中震荡培养直至OD600达到目标值(0.7±0.1)。加入终浓度为10mM的L-阿拉伯糖及0.1mM的IPTG，继续振荡培养5h。
(4)培养结束后，吸取8μL的发酵液上清加入2μL 4×上样缓冲液，95℃处理10min后进行SDS-PAGE检测，分析发酵液上清中核酸酶的分泌表达。
图1显示了分泌表达核酸酶的蛋白质电泳图：泳道1为蛋白质梯标，泳道2为胞内表达的核酸酶样品，泳道3为分泌表达到发酵液上清的核酸酶样品。结果显示，发酵液上清中核酸酶的纯度可达50.5％，产量为65.2mg/L；而同等条件下胞内表达的核酸酶的纯度仅为17.4％，产量为55.8mg/L。
含有本公开的蛋白质分泌表达系统的原核细胞(例如大肠杆菌)能够使目的蛋白更加高效地分泌到培养基中，其能够使目的蛋白高效分泌表达，在简化工艺流程的同时能够提高蛋白质产品的纯度和产量，具有重要的产业化应用价值。
Claims (10)
1.一种用于原核细胞的蛋白质分泌表达系统，其包含：
(i)目的蛋白表达盒，其含有与第一启动子操作性连接的编码所述目的蛋白的多核苷酸；和
(ii)促分泌元件，其含有与第二启动子操作性连接的编码促分泌因子的多核苷酸；
其中，所述目的蛋白含有信号肽；并且
其中，所述编码促分泌因子的多核苷酸具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的蛋白质分泌表达系统，其中，所述促分泌元件具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的蛋白质分泌表达系统，其中，所述信号肽选自：来源于Sec途径的信号肽，来源于Tat途径的信号肽，和来源于Sec-Tat途径的信号肽。
4.如权利要求1所述的蛋白质分泌表达系统，其中，所述第一启动子和第二启动子各自独立地选自：组成型启动子和诱导型启动子；具体地，所述第一启动子和第二启动子各自独立地选自诱导型启动子；更具体地，所述诱导型启动子选自阿拉伯糖诱导型启动子、IPTG诱导型启动子和鼠李糖诱导型启动子。
5.如权利要求1所述的蛋白质分泌表达系统，其中，所述目的蛋白表达盒与所述促分泌元件位于同一原核细胞中；在一些具体实施方式中，所述目的蛋白表达盒与所述促分泌元件位于一个载体上；在另一些具体实施方式中，所述目的蛋白表达盒与所述促分泌元件分别位于多个载体上；在另一些具体实施方式中，所述目的蛋白表达盒位于载体上，而所述促分泌元件位于所述原核细胞的基因组中。
6.包含如权利要求1所述的蛋白质分泌表达系统的分泌表达载体。
7.一种分泌表达载体的构建方法，其包括对载体进行改造以使其含有：
(i)目的蛋白表达盒，其含有与第一启动子操作性连接的编码所述目的蛋白的多核苷酸；和
(ii)促分泌元件，其含有与第二启动子操作性连接的编码促分泌因子的多核苷酸；
其中，所述目的蛋白含有信号肽；并且
其中，所述编码促分泌因子的多核苷酸具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
8.一种经工程改造的原核细胞，其包含如权利要求1所述的蛋白质分泌表达系统。
9.一种分泌表达生产蛋白质的方法，其包括培养如权利要求8所述的经工程改造的原核细胞，以使其表达并分泌目的蛋白。
10.如权利要求1所述的蛋白质分泌表达系统用于蛋白质生产中的用途。
Priority Applications (1)
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- 2022-10-31 CN CN202211348036.XA patent/CN117947072A/zh active Pending
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