CN117946864A - 一株哈茨木霉zm1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株哈茨木霉ZM1及其应用，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23300。本发明所提供的哈茨木霉ZM1，为生防菌株，将其应用于花生病原菌的防治中，能够抑制花生病原菌、防治花生白绢病，同时促进花生生长。该菌株ZM1提高了花生对齐整小核菌、核盘菌、灰霉病菌、群结腐霉、网斑病菌和叶腐病菌的抗性，效果显著，安全、快速，对环境友好，有利于花生的绿色健康生产，为花生病害的综合防治提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种生防真菌哈茨木霉，具体地说，涉及一株对多种花生病原真菌具有抑菌活性的哈茨木霉ZM1的分离鉴定及其在促进花生生长和防治花生致病真菌上的应用。
背景技术
花生在整个生育期会受到多种病原微生物的危害，病害严重威胁花生生产，导致花生产量、品质下降。由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起的白绢病、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核菌、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病、群结腐霉(Pythium myriotylum)引起的烂果病、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的叶腐病和花生茎点霉(Phoma arachidicola)引起的网斑病等均严重影响花生的健康生产。
在花生生产中，当前很大程度上依赖于杀菌剂来防治病害，但其对人类、动物健康和环境安全带来诸多不利后果；因此，生物防治在花生病害防治方面显得尤为重要。
在微生物中，木霉是目前使用最有效的生防因子，因为它们能产生多种抗菌代谢产物，对温度、湿度和pH值的适应性较广，繁殖速度快，腐生性强。木霉是一种普遍存在且易于分离的丝状真菌，常见于土壤中，在防治植物病原真菌的生防制剂中，木霉生防制剂占的比例很大，据统计，2015年占比60％以上。而在商品化的木霉生物制剂中，被研究和应用最多的木霉种类为哈茨木霉，哈茨木霉长时间寄生于植物根系，更有利于改善植物对非生物胁迫和生物胁迫的耐受力，促进植物生长。目前，在花生病原菌的防治方法中，木霉菌株和相关应用产品较少，因此，基于农业可持续发展和生态环境保护的背景，筛选及研发高效拮抗花生病原菌的哈茨木霉及其应用技术十分必要和迫切。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，鉴于生物防治在防治花生病害方面的优势，提出了一株哈茨木霉ZM1及其应用，在花生上应用哈茨木霉，借助生防菌株防治多种花生病原菌，效果显著且对环境友好，同时该菌株还能够促进花生的生长。
本发明的技术方案是：
一株哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ZM1，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23300。
本发明还提供了哈茨木霉ZM1在抑制花生病原菌上的应用，所述花生病原菌为齐整小核菌、核盘菌、灰霉病菌、群结腐霉、网斑病菌或叶腐病菌中的任一种或几种。
进一步的，所述应用形式为菌株ZM1的菌饼或孢子悬浮液。
本发明还提供了哈茨木霉ZM1在防治花生白绢病中的应用；以及哈茨木霉ZM1在促进花生生长中的应用。
进一步的，所述应用形式为菌株ZM1的孢子悬浮液。
本发明又提供了一种防治花生病原菌的菌剂，所述菌剂的活性成分为所述的哈茨木霉ZM1，所述花生病原菌为齐整小核菌、核盘菌、灰霉病菌、群结腐霉、网斑病菌和叶腐病菌中的任一种或几种。
具体的，本发明所提供的哈茨木霉ZM1用于防治由齐整小核菌引起的白绢病、核盘菌引起的菌核菌、灰葡萄孢引起的灰霉病、群结腐霉引起的烂果病、立枯丝核菌引起的叶腐病和花生茎点霉引起的网斑病。
生物材料样品保藏信息：
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ZM1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2021年11月05日，保藏编号为CGMCC No.23300。
本发明的有益效果：
本发明所提供的哈茨木霉ZM1，为生防菌株，将其应用于花生病原菌的防治中，提高了花生对齐整小核菌、核盘菌、灰霉病菌、群结腐霉、网斑病菌和叶腐病菌的抗性，效果显著，同时还能够促进花生生长；该方法属于生物防治的范畴，安全、快速、有效，有利于花生的绿色健康生产，为花生病害的综合防治提供技术支撑。
附图说明
图1为哈茨木霉ZM1菌株的形态特征；
图2为哈茨木霉ZM1基于tef1和rpb2基因片段构建的系统发育树；
图3为哈茨木霉ZM1对6种病原菌的拮抗作用结果示意图；其中，图3A为ZM1对6种花生病原菌的拮抗效果图；图3B为6种花生病原菌的菌落生长情况统计；图3C为ZM1对6种花生病原菌的抑菌率统计；**或大写字母表示在0.01水平差异极显著。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
哈茨木霉ZM1的分离鉴定
(1)菌株ZM1的分离：从莱西市花生白绢病严重发生的地块采集距离地表5～10cm的根际土壤约100g，带回实验室，4℃保存。采用稀释涂布平板法分离木霉菌：取土壤样品10g加到90mL无菌水中，25℃，140rpm振荡10min，静置5min，取上清液，采用10倍系列稀释法，依次稀释到10-2、10-3、10-4和10-5，每个浓度吸取100μL分别涂于PDA培养基上，每个浓度重复3次，25℃暗培养。待培养基上出现真菌菌落时，喷施花生冠腐病菌孢子悬浮液。培养3d后，选取周围出现明显抑菌圈的菌落，用移菌环挑取单菌落，在PDA培养基上进行纯化培养。挑选得到一株抑菌圈明显且菌体呈绿色的菌株，如图1所示，命名为ZM1。将纯化后的ZM1菌株转接至PDA斜面保存备用。
(2)菌株ZM1的鉴定：收集ZM1的孢子和菌丝，提取基因组，以其为模板，分别利用tef1基因的引物EF1-728F(5’CATCGAGAAGTTCGAGAAGG 3’)(SEQ ID NO：3)、EF1-986R(5’TACTTGAAGGAACCCTTACC 3’)(SEQ ID NO：4)和rpb2基因引物RPB2-5F(5’GAYGAYMGWGATCAYTTYGG 3’)(SEQ ID NO：5)、RPB2-7cR(5’CCCATRGCTTGYTTRCCCAT 3’)(SEQID NO：6)进行PCR扩增。PCR产物送北京擎科生物科技有限公司测序。tef1基因序列全长为330bp，序列如SEQ ID NO：1所示；rpb2基因序列全长为1044bp，序列如SEQ ID NO：2所示。
所获得的序列进行BLAST分析比对，联合tef1基因和rpb2基因片段用MEGA7软件构建系统发育树，如图2所示，结果表明菌株ZM1与哈茨木霉Trichoderma afroharzianum在同一分支上，说明菌株ZM1为哈茨木霉。将菌株ZM1保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23300。
实施例2
菌株ZM1菌饼对6种花生病原菌菌丝生长的抑制作用
分别取ZM1、花生齐整小核菌、核盘菌、灰霉病菌、群结腐霉、网斑病菌和叶腐病菌的菌饼接种到PDA培养基中央，25℃暗培养7d，备用。PDA培养基中央接种直径为5mm的病原菌的菌饼，菌饼两侧约20mm处放置直径为5mm的ZM1菌饼，以不接种ZM1菌饼作为对照，每个处理重复6次，25℃恒温培养。
如图3A所示为ZM1对6种花生病原菌的拮抗效果；对菌丝生长情况进行测量，如图3B为6种花生病原菌的菌落生长情况统计结果，从该纵坐标上可以得出其菌落增长直径大小；采用菌丝生长速率法计算抑菌率：抑菌率(％)＝(对照菌落增长直径－处理菌落增长直径)/对照菌落增长直径×100。结果发现，菌株ZM1对6种病原菌均具有显著的抑菌效果(见图3)。如图3C所示，ZM1对齐整小核菌、核盘菌、灰霉病菌、群结腐霉、网斑病菌和叶腐病菌的菌丝生长抑制率分别为78.83％、74.21％、86.71％、82.60％、86.47％和86.98％。
实施例3
菌株ZM1孢子悬浮液对盆栽花生生长和白绢病抗性的影响
花生品种花育33号经消毒后播种于花盆中，25℃光照良好的温室中培养，2周后用菌株ZM1孢子悬浮液(1×106孢子/mL，5mL/株)灌根，以接种等体积PDB液体培养基为对照组。对照组(CK)和处理组(ZM1)各20盆，重复3次，4周后每个重复取10盆处理组花生，称量植株总鲜质量，烘干后称量植株总干质量。剩余的花生茎基部接种布满齐整小核菌菌丝的燕麦粒，6周后调查白绢病发生情况，计算防治效果。
花生白绢病苗期病情指数分级标准：0级：无病斑；1级：仅茎上有病斑，根系健康；2级：茎和根系产生病斑，地上部正常；3级：地上部出现萎蔫症状，主要表现为侧枝萎蔫或枯死；4级：主茎出现萎蔫或枯死的症状。病情指数＝∑(各级级值×各级病株数)/(最高级数×调查总株数)×100，发病率(％)＝发病株数/调查总株数×100％，防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％。
统计结果如下表1所示，统计发现，同对照组相比，菌株ZM1能够极显著促进花育33号的生长，提高对白绢病的抗性；同对照组相比，菌株ZM1孢子悬浮液能够极显著增加花育33号植株的鲜质量和干质量，比对照组分别增加27.45％和24.57％；白绢病的死亡率，处理组比对照组降低79.59％；菌株ZM1对白绢病的防治效果为56.80％(表1)。
表1温室中ZM1对花生生长及白绢病的防治效果
| 鲜质量(g) | 干质量(g) | 死亡率(％) | 病情指数(％) | 防效(％) | |
| CK | 10.51±0.79A | 1.45±0.13A | 68.06±6.36A | 84.38±2.76A | / |
| ZM1 | 14.49±1.54B | 1.92±0.20B | 13.89±2.41B | 36.16±1.04B | 56.80±1.23 |
实施例4
菌株ZM1孢子悬浮液对田间花生抗白绢病能力的影响
在花生白绢病严重发生的地块设置3个处理，即ZM1孢子悬浮液(1×106孢子/mL)灌根处理(ZM1)、30％吡唑醚菌酯2000倍水液灌根处理(吡唑醚菌酯)和清水对照(CK)。采用随机区组设计，每小区10m2，重复4次。花育33号于5月中旬播种，7月初，分别用ZM1孢子悬浮液、30％吡唑醚菌酯2000倍水液和清水(10mL/株)灌根，间隔2周灌根一次，共灌根2次，9月中旬收获花生时调查白绢病的发病情况。
花生白绢病收获期病情指数分级标准：0级：植株无病斑；1级：仅地上部或根系有病斑且植株未枯死；2级：植株未枯死，荚果病斑≤10％，或者植株枯死，荚果无病斑；3级：植株未枯死，荚果病斑≤30％，或者植株枯死，荚果病斑≤10％；4级：植株未枯死，荚果病斑＞30％，或者植株枯死，荚果病斑＞10％，或者无产量。病情指数＝∑(各级级值×各级病株数)/(最高级数×调查总株数)×100，发病率(％)＝发病株数/调查总株数×100％，防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％。
统计结果如下表2所示，统计发现，同对照相比，菌株ZM1、吡唑醚菌酯能够极显著提高花生对白绢病的抗性。清水、吡唑醚菌酯、ZM1处理后，花生死亡率分别为83.33％、10.83％、12.50％；病情指数分别为94.79％、41.67％、44.38％；吡唑醚菌酯、ZM1对白绢病的防治效果分别为56.24％、53.39％，二者差异不显著(表2)。
表2田间ZM1对花生白绢病的防治效果
| 处理 | 死亡率(％) | 病情指数(％) | 防效(％) |
| CK | 83.33±2.72A | 94.79±2.19A | / |
| 吡唑醚菌酯 | 10.83±3.19B | 41.67±3.04B | 56.24±3.20A |
| ZM1 | 12.50±1.67B | 44.38±2.29B | 53.39±2.41A |
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一株哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ZM1，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23300。
2.权利要求1所述的哈茨木霉ZM1在抑制花生病原菌上的应用，其特征在于，所述花生病原菌为齐整小核菌、核盘菌、灰霉病菌、群结腐霉、网斑病菌或叶腐病菌中的任一种或几种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用形式为菌株ZM1的菌饼或孢子悬浮液。
4.权利要求1所述的哈茨木霉ZM1在防治花生白绢病中的应用。
5.权利要求1所述的哈茨木霉ZM1在促进花生生长中的应用。
6.根据权利要求4或5任一项所述的应用，其特征在于，所述应用形式为菌株ZM1的孢子悬浮液。
7.一种防治花生病原菌的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的哈茨木霉ZM1，所述花生病原菌为齐整小核菌、核盘菌、灰霉病菌、群结腐霉、网斑病菌或叶腐病菌中的任一种或几种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310535440.6A CN117946864A (zh) | 2023-05-12 | 2023-05-12 | 一株哈茨木霉zm1及其应用 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN117946864A true CN117946864A (zh) | 2024-04-30 |
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2023
- 2023-05-12 CN CN202310535440.6A patent/CN117946864A/zh active Pending
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