CN117946247A - 一种识别mage-a3抗原短肽的t细胞受体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种识别MAGE‑A3抗原短肽的T细胞受体，所述T细胞受体能够靶向MAGE‑A3抗原表位肽(SEQ ID NO：21)，利用本发明所述T细胞受体构建T细胞受体T细胞(TCR‑T)，对于表达黑色素瘤相关抗原A3(SEQ ID NO：21)的肿瘤具有显著的抑制效果。本发明所述T细胞受体能够制备用于抗肿瘤的药物和抗肿瘤的疫苗，对于表达黑色素相关抗原A3(SEQ ID NO：21)的肿瘤如肺癌、黑色素瘤、肝癌、头颈肿瘤、食管癌和骨肉瘤具有显著的杀伤效果。因此，本发明所述T细胞受体为黑色素瘤相关抗原A3相关的肿瘤的免疫治疗提供了新的途径。
Description
本申请是申请日为2023年2月23日、申请号为2023101687246、发明名称为“一种识别MAGE-A3抗原短肽的T细胞受体及其应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种识别MAGE-A3抗原短肽的T细胞受体及其应用。
背景技术
MAGE-A3是黑色素瘤抗原基因(MAGE)家族中具有独特特征的一个抗原，MAGE家族是原癌抗原，是癌睾丸(cancer/testis antigen)抗原超家族成员之一，其家族成员超过60个，均存在于同一个MAGE同源结构域。主要分为两个亚类：MAGE-I类抗原和MAGE-II类抗原。MAGE-II类抗原的表达普遍存在于正常细胞中，而MAGE-I类抗原为肿瘤特异性抗原，即在人体除睾丸生殖细胞和胎盘字样组织以外的组织中均不表达，而在肿瘤中高表达，是肿瘤研究中的热点。生殖细胞缺乏HLA，因而癌睾丸抗原不能被T细胞识别；但在恶性肿瘤中，癌睾丸抗原和HLA分子同时表达，因而可以被T细胞识别。
MAGE-I类抗原可划分为三个亚类：MAGE-A、MAGE-B和MAGE-C。MAGE-A亚家族具有严格的表达模式，其中MAGE-A3在肿瘤中特异性高表达而成为了焦点，65％的黑色素瘤患者存在MAGE-A3特异性高表达，在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中这一比例高达85％。此外，MAGE-A3还在多种肿瘤中高表达，如肝癌(Zang C，et al.BMC Cancer.2021.21(1):1007)、头颈肿瘤(Cesson V，et al.Cancer Immunol Immunother.2011.60(1):23-35)、骨肉瘤(ConleyAP，et al.Cancers(Basel).2019.11(5):677)及食管癌(Chen X，et al.Int JCancer.2018.143(10):2561-2574)等。对于上述肿瘤，通常采用化疗和放射性治疗等方法，当疗效较差且有验证不良反应。
MAGE-A3抗原在蛋白酶体中被降解成小肽片段，并释放到细胞质中，然后通过于抗原呈递(TAP)相关的转运蛋白转运到内质网(ER)，形成I类MHC(主组织相容性复合体)分子及肽的稳定复合物(pMHC)，然后通过高尔基体将pMHC运输到细胞表面被T细胞表面的抗原识别受体(TCR)识别。LVFGIELMEV是衍生自MAGE-A3抗原的表位肽，是MAGE-A3抗原高表达相关肿瘤治疗的一种靶标。
T细胞是杀伤肿瘤细胞的重要力量，T细胞的活化和杀伤作用是由TCR特异性识别MHC处理递呈的抗原肽来街道的，借助基因改造技术可以研制出高亲和性的TCR。目前，“工程”T细胞技术(T-cell engineering technology)在很大程度上客服了传统肿瘤化疗和放疗的障碍，主要包括嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和T细胞受体T细胞(TCR-T)两大类。CAR-T细胞治疗需要癌细胞表面表达特异性的肿瘤抗原，因此不适用于杀伤MAGE-A3高表达的肿瘤。
TCR-T细胞疗法则是将能识别肿瘤特异性抗原的TCRα和TCRβ链基因转染到T细胞中，使T细胞的TCR抗原结合区发生结构改变，从而能特异性识别相应的肿瘤抗原，然后经过体外扩增并回输到人体内，表达肿瘤抗原特异性TCR的T淋巴细胞(可识别肿瘤细胞表面的HLA-肽复合物)，进而引发T细胞的免疫效应，达到杀伤肿瘤细胞的目的。
因此，筛选出对MAGE-A3抗原表位肽具有特异性的TCR，以及将该TCR转导T细胞以获得对MAGE-A3抗原表位肽具有特异性的T细胞对于细胞免疫治疗有着重大意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种识别MAGE-A3抗原短肽的T细胞受体及其应用。
本发明的第一目的是提供一种识别MAGE-A3抗原短肽的T细胞受体。
本发明的第二目的是提供一种TCR-T细胞。
本发明的第三目的是提供一种重组表达载体。
本发明的第四目的是提供一种宿主细胞。
本发明的第五目的是提供一种药物组合物
本发明的第六目的是提供上述T细胞受体、TCR-T细胞、核酸分子、重组表达载体\宿主细胞和/或药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用。
本发明的第七目的是提供上述T细胞受体、TCR-T细胞、核酸分子、重组表达载体\宿主细胞和/或药物组合物在制备抗肿瘤的疫苗中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种识别MAGE-A3抗原短肽的T细胞受体，所述T细胞受体为以下的一种：
包括CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示TCRα肽链和CDR3区氨基酸序列如SEQID NO：6所示的TCRβ肽链；
包括CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示TCRα肽链和CDR3区氨基酸序列如SEQID NO：7所示的TCRβ肽链；
包括CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示TCRα肽链和CDR3区氨基酸序列如SEQID NO：8所示的TCRβ肽链；
包括CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示TCRα肽链和CDR3区氨基酸序列如SEQID NO：9所示的TCRβ肽链；
包括CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示TCRα肽链和CDR3区氨基酸序列如SEQID NO：10所示的TCRβ肽链。
优选地，所述T细胞受体为以下的一种：
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的TCRα肽链和氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的TCRβ肽链；
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示的TCRα肽链和氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示的TCRβ肽链；
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的TCRα肽链和氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示的TCRβ肽链；
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的TCRα肽链和氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的TCRβ肽链；
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示的TCRα肽链和氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示的TCRβ肽链。
优选地，所述T细胞受体为靶向MAGE-A3抗原表位肽的T细胞受体；所述MAGE-A3抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
MAGE-A3抗原表位肽(SEQ ID NO：21)：LVFGIELMEV。
一种TCR-T细胞，所述TCR-T细胞含有上述T细胞受体。
一种TCR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.合成编码上述T细胞受体的TCRα肽链和TCRβ肽链的核苷酸序列，转化至18121质粒中，得到重组质粒；
S2.利用293T细胞对步骤S1得到的重组质粒进行慢病毒包装，得到TCR慢病毒；
S3.利用步骤S3得到的TCR慢病毒感染Jurkat76细胞得到感染后细胞，筛选TCR表达阳性的感染后细胞，即为TCR-T细胞。
一种重组表达载体，所述重组表达载体为包含编码上述TCRα链和TCRβ链的核苷酸序列的表达载体。
优选地，所述表达载体为pHIV-Zsgreen(Plasmid#18121)。
一种宿主细胞，包含上述T细胞受体和/或上述重组表达载体。
一种药物组合物，所述药物组合物含有上述T细胞受体、上述TCR-T细胞、上述重组表达载体和/或上述宿主细胞的一种或几种，还含有药学上接受的载体。
本发明还请求保护上述T细胞受体、上述TCR-T细胞、上述重组表达载体、上述宿主细胞和/或上述药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为表达黑色素瘤相关抗原A3的肿瘤(MAGE-A3)。
更优选地，所述黑色素瘤相关抗原A3(MAGE-A3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
更优选地，所述肿瘤为肺癌、黑色素瘤、肝癌、头颈肿瘤、食管癌和/或骨肉瘤。
进一步优选地，所述肿瘤为肺癌。
本发明还请求保护上述T细胞受体、上述TCR-T细胞、上述重组表达载体、上述宿主细胞和/或上述药物组合物在制备抗肿瘤的疫苗中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种识别MAGE-A3抗原短肽的T细胞受体，所述T细胞受体为以下的一种：包括CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的TCRα肽链和CDR3区氨基酸序列如SEQID NO：6所示的TCRβ肽链；包括CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的TCRα肽链和CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的TCRβ肽链；包括CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的TCRα肽链和CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的TCRβ肽链；包括CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的TCRα肽链和CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的TCRβ肽链；包括CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的TCRα肽链和CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的TCRβ肽链。本发明所述T细胞受体能够靶向MAGE-A3抗原表位肽(SEQ ID NO：21)，利用本发明所述T细胞受体构建T细胞受体T细胞(TCR-T)，对于表达黑色素瘤相关抗原A3的肿瘤具有显著的杀伤效果。本发明为黑色素瘤相关抗原A3相关的肿瘤的免疫治疗提供了新的途径。
附图说明
图1为MAGE-A3抗原特异性TCR的筛选与鉴定的流程图；
图2为MAGE-A3抗原表位肽活化CD8+T细胞的结果图；
图3为单细胞转录组谱图对MAGE-A3抗原特异性CD8 T细胞的细胞类型UMAP可视化分析结果图；
图4为Tessa，pMTnet等神经网络框架构建抗原特异性TCR预测模型筛选出的5条候选的TCR的UMAP可视化结果图；
图5为TCR克隆扩增的UMAP可视化结果图；
图6为流式检测Jurkat76细胞中TCRα/β的表达结果图；
图7为流式检测Jurkat76细胞的CD69及CD137表达结果图；A：细胞中CD69活化情况检测结果图；B：细胞中CD137活化情况检测结果图；C：细胞中CD69活化情况检测结果柱状图；D：细胞中CD137活化情况检测结果柱状图；
图8为CCK8检测细胞活力结果图；
图9为Hoechst染色检测PC9细胞存活情况图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明所述MAGE-A3抗原特异性TCR的筛选和鉴定过程如图1所示。
实施例1MAGE-A3抗原表位肽特异性CD8+T细胞的制备
1、实验方法
(1)Tetramer四聚体复合物的制备
合成MAGE-A3抗原表位肽(SEQ ID NO：21)，用DMSO配置成浓度为10mM的抗原表位肽母液，将抗原表位肽母液用PBS稀释至400μM，得到稀释后母液，备用。
MAGE-A3抗原表位肽(SEQ ID NO：21)：LVFGIELMEV。
取20μL稀释后母液和20μL的Flex-T单体(200μg/mL)添加至96孔U形板中，吹打混匀，拿开封板膜，将96孔U形板置于冰上，用UV灯照射30min(UV灯到样本之间的距离保持在2～5cm)，盖上封板膜，置于37℃干暗处孵育30min，得到pMHC复合物单体(MAGE-A3抗原表位肽与Flex-T单体形成)。
取30μL的pMHC复合物单体至1.5mL的EP管中，向EP管中加入3.3μL的的链霉亲和素(BioLegend Cat#405203，US)，枪头吹打混匀，4℃避光孵育30min。
孵育结束后，向EP管中加入2.4μL封闭液(1.6μL，50mM的D-biotin(ThermoFisher，Cat#B20656，US)、6μL的10％(w/v)的NaN3和192.4μL的PBS)，吹打终止反应。在4～8℃下孵育过夜，得到Tetramer四聚体复合物(包含MAGE-A3抗原表位肽(SEQ IDNO：21))。
同步制备UV-Tetramer四聚体复合物，和Tetramer四聚体复合物的区别在于：不含有MAGE-A3抗原表位肽，其余相同。
(2)特异性CD8+T细胞的制备
分离健康人1的外周静脉血中的单个核淋巴细胞(PBMC)，并通过磁珠分离，得到CD8+T细胞。
将T2-A2细胞用20μg/mL的丝裂霉素处理30min，接着用CFSE标记20min，然后用MAGE-A3抗原表位肽(SEQ ID NO：21)共孵育4h，得到负荷MAGE-A3抗原表位肽的T2-A2细胞。
MAGE-A3抗原表位肽(SEQ ID NO：21)：LVFGIELMEV。
将0.5×106的CD8+T细胞和0.5×106的负荷MAGE-A3抗原表位肽的T2-A2细胞在培养基中共培养，并用1μg/mL的抗人CD28抗体和50IU/mL的IL-2共刺激。共培养过程中每隔两天向培养基中补充50IU/mL的IL-2和20μM的MAGE-A3抗原表位肽(SEQ ID NO：21)。
共培养7天后，用步骤(1)得到的Tetramer四聚体复合物标记共培养后的细胞，流式分选得到特异性CD8+T细胞(MAGE-A3抗原表位肽特异性CD8+T细胞)。
对健康人2采取同样的实验方法构建负荷MAGE-A3抗原表位肽的T2-A2细胞，利用步骤(1)得到的Tetramer四聚体复合物重复进行一次实验，标记共培养后的细胞，进行流式分选。
控制组设置为不含有MAGE-A3抗原表位肽(SEQ ID NO：21)的UV-Tetramer四聚体复合物共培养细胞，并进行流式分选。
2、实验结果
MAGE-A3抗原表位肽(SEQ ID NO：21)活化CD8+T细胞的结果如图2所示，结果显示：MAGE-A3抗原表位肽(SEQ ID NO：21)在两个不同个体(健康人1和健康人2)中CD8 T细胞活化的比例分别为4.93％和5.64％。
结果说明：经过体外抗原刺激以及Tetramer标记得到MAGE-A3抗原表位肽(SEQ IDNO：21)特异性的CD8+T细胞，经过流式分选后能够用于单细胞转录组及TCR测序。实施例2识别MAGE-A3抗原表位肽的TCR的筛选
1、单细胞转录组(scRNA-seq)测序及TCR组库测序(scTCR-seq)
对实施例1得到的特异性CD8+T细胞进行单细胞转录组测序及TCR测序，具体为：
10x Genomics的Chromium系统利用8通道的微流体“双十字”交叉系统，将含barcode序列的凝胶珠(Gel Beads)、特异性CD8+T细胞和酶的混合物、油三者混合，形成GEMs(油包水的微体系)。形成GEMs后，特异性CD8+T细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量barcode序列。随后mRNA逆转录产生带有10×barcode(细胞条形码)和UMI(分子条形码)信息的cDNA，采用Chromium Single Cell 5’Feature Barcode Library Kit(10×Genomics)构建标准转录组文库，采用Chromium Single Cell V(D)J Enrichment Kit(Human TCell，10×Genomics)构建标准TCR测序文库，最后采用Illumina Novaseq6000平台对转录组文库及TCR文库进行测序，得到scRNA-seq及scTCR-seq原始Fastq数据。
2、单细胞数据分析以及TCR筛选
(1)获取各样品(健康人1和健康人2)中的scRNA-seq原始Fastq数据
基于cell barcode区分每一个特异性CD8+T细胞；基于UMI区分每个mRNA分子；通过已有标志基因对实施例1步骤(2)得到的特异性CD8+T细胞进行分群，并将细胞分群结果进行UMAP可视化，共得到15个Cluster。
细胞分群可视化结果如图3所示，其中Cluster0、Cluster1、Cluster6和Cluster8被定义为CCR7high CD8 T；Cluster2、Cluster4、Cluster5、Cluster7、Cluster9、Cluster10和Cluster13被定义为效应CD8 T细胞群(effector CD8 T cells)；Cluster3、Cluster11、Cluster12和Cluster14被定义为增值中CD8 T细胞群(cycling CD8 T cells)。
(2)基于scTCR-seq获取各样品TCR的alpha和beta链的信息。
通过对每个样品TCR的apha和beta链的出现频率进行统计，并通过细胞条形码将每个样品的TCR对应到步骤(1)得到的单细胞转录组数据中，得到MAGE-A3抗原表位肽特异性的TCR信息以及该TCR所在细胞的转录组信息，并进行UMAP可视化。UMAP可视化结果如图4所示，其中双链配对的TCR数量为3029条，占TCR总数的44.92％；具有克隆扩增的TCR(clonotype frequency＞1)数量为1752条，占TCR总数的25.92％。
(3)参照现有技术(https://doi.org/10.1038/s41592-020-01020-3)中所示方法，通过生物序列-数字转换表(Atchley factor)，将所有TCRβ链的CDR3β序列转换成具有极性、二级结构、分子体积、密码子多样性等氨基酸属性的等长的30维TCR数字矩阵，随后运用tessa技术和pMnet技术构建抗原特异性TCR预测模型。
(4)基于步骤(1)得到的细胞分群结果、步骤(2)中的TCRapha和beta链统计结果以及步骤(3)构建的抗原特异性TCR预测模型，筛选得到5条候选的MAGE-A3抗原特异性TCR；对筛选得到的5条候选的MAGE-A3抗原特异性TCR进行UMAP可视化处理。
5条候选的MAGE-A3抗原特异性TCR的可视化处理结果如图5所示，结果显示：5条候选的MAGE-A3抗原特异性TCR位于效应CD8 T细胞群(effector CD8 T cells)和增殖中CD8T细胞群(cycling CD8 T cells)；其中TCR-A3-1是扩增频率最高的双链TCR；TCR-A3-2是扩增频率第二高的TCR。
基于tessa深度学习模型和pMnet深度学习模型的预测结果，TCR-A3-2的rank值为0.043，TCR-A3-2是两个样品(健康人1和健康人2)中均存在并且扩增频率最高的TCR。
基于tessa深度学习模型预测结果，TCR-A3-103在所有发生克隆扩增(TCR频率≥2)的TCR和所有未发生克隆扩增(TCR频率≤2)的TCR中，均为最大网络的中心TCR；基于pMnet深度学习模型预测结果，TCR-A3-207是在所有rank值≤2％的TCR中克隆扩增最高的克隆型，rank值为0.0033。
候选的MAGE-A3抗原特异性TCR的α链和β链的信息如表1所示，以TCR-A3-1的α链为例，CAVMDSNYQLIW为TCR-A3-1的α链CDR3区域的氨基酸序列，CDR3区域的上游为TCR的V区，CDR3区域的下游为TCR的J区(β链还包括C区)。
表1候选的MAGE-A3抗原特异性TCR的α链和β链信息
实施例3TCR-T细胞的制备
1、实验方法
(1)确定TCR的α链和β链序列
按照表1所述候选的MAGE-A3抗原特异性TCR的α链和β链的信息，利用IMGT数据库(http：//www.imgt.org/)寻找TCR的α链和β链的V区、J区及C区的氨基酸序列，并根据uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)查询结果(各个TCR对应的氨基酸序列)将V区、J区与CDR3区域拼接，得到TCR的α链和β链的氨基酸序列，如表2所示。
表2TCR的α链和β链的氨基酸序列
(2)重组质粒的构建
以TCR-A3-1为例，构建重组质粒，具体如下：
合成编码步骤(1)表2中所示TCR-A3-1的α链和β链的核酸序列，将TCR-A3-1的α链和β链的核酸序列通过2A自剪切肽(SEQ ID NO：22)连接，得到连接片段，并通过酶切位点5’EcoRI(GAATTC)和3’BamHI(GGATCC)将连接片段同步亚克隆至载体：18121质粒(https://www.addgene.org/18121/)中，得到4μg质粒干粉，瞬时离心3min，加入40μL的灭菌水得到100ng/μL的质粒稀释液，震荡混匀后室温下静止备用。
取1μL质粒稀释液和50μL的Stbl3感受态细胞在EP管中混合，混匀后冰上静止30min，然后在42℃水浴锅中水浴60s，水浴结束后将EP管插入冰上，静止3min，得到装有重组菌株的EP管。
向装有重组菌株的EP管加入300μL的LB液体培养基，置于摇床中，以37℃，225rpm的条件摇60min，得到菌液。
其中LB液体培养基包括：5g的NaCl、5g的胰蛋白胨、2.5g的酵母粉和500mL的UP水；将上述物质混合后，高压降温后4℃保存，得到LB液体培养基。
将100μL的菌液接种至LB平板上，利用涂布棒将菌液均匀涂布于LB平板上，封口后倒置，于37℃的培养箱中过夜培养12～16h，得到长满单菌的平板。
其中LB平板包括：5g的NaCl、5g胰蛋白胨、5g酵母粉、10g琼脂粉和500mL的UP水；将上述物质混合加热后，高压冷却至50℃，加入Amp至终浓度为50μg/mL，摇匀后倒入无菌培养皿中，4℃保存，得到LB平板。
取200mL的LB液体培养基，加入Amp至Amp终浓度为50μg/mL，混合均匀后分装至无菌摇菌管(10mL/管)，得到Amp抗性的LB液体培养基。
挑取长满单菌的平板上的单菌，置于含有10mL的Amp抗性的LB液体培养基的摇菌管中，将添加有单菌的摇菌管置于摇床中，以37℃，225rpm的条件振摇过夜12～16h，得到振摇后菌液。
将振摇后菌液分装至EP管中，以1300rpm的条件离心1min，收集细菌沉淀，用EndoFree Plasmid Midi Kit(Cwbio，Cat#CW2105S)提取细菌沉淀中的质粒，得到重组质粒(TCR-A3-1)，用分光光度计检测重组质粒(TCR-A3-1)的浓度，置于-80℃保存备用。
对步骤(1)中的TCR-A3-2、TCR-A3-12、TCR-A3-103和TCR-A3-207进行同等处理，制备得到重组质粒(TCR-A3-2)、重组质粒(TCR-A3-12)、重组质粒(TCR-A3-103)和重组质粒(TCR-A3-207)，并用分光光度计检测各个重组质粒的浓度。
(3)慢病毒包装
以重组质粒(TCR-A3-1)为例，进行慢病毒包装，具体如下：
取5×106个293T细胞铺10cm培养皿中，置于37℃，5％CO2(v/v)培养箱中培养至汇合度为70～90％，更换培养基为新鲜DEME高糖培养基，得到待转染293T细胞。
在EP管1中加入28μL的Lipo8000转染试剂(Beyotime，Cat#C0533)和272μL的Opti-MEM培养基(Gibco，Cat#31985070)，室温静置5min。
在EP管2中加入3μg的pCMV-VSV-G质粒、3μg的pMDLg pRRE质粒、3μg的pRSV-Rev质粒、9μg的步骤(2)得到的重组质粒(TCR-A3-1)，并加入Opti-MEM培养基(Gibco，Cat#31985070)补充至总体为300μL，室温静置5min。
将EP管1中液体加入EP管2中，混合均匀，室温静置20min，得到混合液。将混合液逐滴均匀地加入含有待转染293T细胞的DEME高糖培养基中，摇匀后置于37℃，5％CO2(v/v)培养箱中培养6h，接着在生物安全柜将培养基更换为新的DMEM高糖培养基，进行转染。
转染24h后，观察细胞状态，细胞无污染且生长状态良好(不污染，细胞不大片脱落)；转染48h后，收集细胞上层液体，得到病毒液1；转染72h后，收集细胞上层液体，得到病毒液2。将病毒液1和病毒液2混合后在3500rpm下离心10min，收集上清液并用0.45μm过滤器过滤到新的离心管中，得到过滤液，用通用型病毒浓缩试剂盒(Beyotime，Cat#C2901L)进行浓缩，得到病毒浓缩液(TCR-A3-1)，置于1.5mL的EP管中备用。
对步骤(2)得到的重组质粒(TCR-A3-2)、重组质粒(TCR-A3-12)、重组质粒(TCR-A3-103)和重组质粒(TCR-A3-207)进行同等处理得到病毒浓缩液(TCR-A3-2)、病毒浓缩液(TCR-A3-12)、病毒浓缩液(TCR-A3-103)和病毒浓缩液(TCR-A3-207)。
(4)慢病毒感染细胞
以步骤(3)得到的病毒浓缩液(TCR-A3-1)为例，感染Jurkat76细胞，具体如下：
取对数生长期的Jurkat76细胞，用RPMI-1640完全培养基制备400μL的Jurkat76细胞(2.5×105个/mL)，向其中加入100μL步骤(3)得到的病毒浓缩液(TCR-A3-1)，按RPMI-1640完全培养基：Polybrene＝1mL：0.5μL加入10mg/mL的Polybrene，得到转染后细胞。
将转染后细胞接种至24孔板中，1000×g离心60min，接着置于37℃，5％CO2(v/v)培养箱中培养12～16h后换液。感染4天后，将24孔板中细胞收集到1.5mL的EP管中，以200×g离心5min，弃上清，将沉淀用100μL的1％BSA(1g BSA+100mL PBS)重悬得到重悬液，向重悬液中加入2μL的TCRα/β-APC抗体(BioLegend，Cat#306718)进行染色，接着流式上机观察TCR-A3-1的表达结果，表达阳性的细胞即为TCR-T细胞(TCR-A3-1)。
分别使用步骤(3)得到的病毒浓缩液(TCR-A3-2)、病毒浓缩液(TCR-A3-12)、病毒浓缩液(TCR-A3-103)和病毒浓缩液(TCR-A3-207)感染Jurkat79细胞，并流式上机观察TCR表达结果，得到TCR-T细胞(TCR-A3-2)、TCR-T细胞(TCR-A3-12)、TCR-T细胞(TCR-A3-103)和TCR-T细胞(TCR-A3-207)。
空白组(WT)设置为Jurkat76野生型细胞(WT，自身不表达TCR)；对照组(18121)设置为在转染18121空质粒的Jurkat76细胞。
分别对空白组(WT)和对照组(18121)进行流式上机观察TCR表达结果。
2、实验结果
各个重组质粒的分光光度计检测结果如表3所示。
表3重组质粒的分光光度计检测结果
| 重组质粒名称 | 浓度(μg/μL) | A260/A280 |
| 重组质粒(TCR-A3-1) | 223.1 | 1.89 |
| 重组质粒(TCR-A3-2) | 472.4 | 1.87 |
| 重组质粒(TCR-A3-12) | 274.5 | 1.88 |
| 重组质粒(TCR-A3-103) | 199.5 | 1.89 |
| 重组质粒(TCR-A3-207) | 199.3 | 1.89 |
结果显示：5个重组质粒的A260/A280的数值在1.80～2.0之间，可以用于慢病毒包装。
流式上机检测结果如图6所示，结果显示：空白组(WT)的TCR阳性率为0％，对照组(18121)的TCR阳性率为0.8％，说明Jurkat76细胞和18121质粒不表达TCR；TCR-T细胞(TCR-A3-1)的TCR阳性率为93.2％，TCR-T细胞(TCR-A3-2)的TCR阳性率为94％，TCR-T细胞(TCR-A3-12)的TCR阳性率为94.7％，TCR-T细胞(TCR-A3-103)的TCR阳性率为93.2％，TCR-T细胞(TCR-A3-207)的TCR阳性率为92.9％。结果说明：各个重组质粒构建的TCR-T细胞可以有效表达TCR。
实施例4TCR-T细胞功能
1、实验方法
取处于对数生长期的PC9细胞(人非小细胞肺癌细胞)，用20μg/mL的丝裂霉素处理30min，接着以0.75×105个/孔的数量铺48孔板，置于37℃，5％CO2(v/v)的培养箱中培养12h，待细胞贴壁后，加入实施例3构建得到的TCR-T细胞进行共培养(细胞比例为1：1)。
分别在不同的培养基中设置实验组和对照组，具体如下：
Blank组：PC9细胞单独培养；
18121ctrl组：PC9细胞和转染18121空质粒的Jurkat76细胞共培养；
Flu ctrl组：PC9细胞和Jurkat76-flu-TCR细胞共培养；其中Jurkat76-flu-TCR细胞为将流感的双链TCR(Flu-TCR)转入Jurkat76细胞得到；
TCR-A3-1组：PC9细胞和TCR-T细胞(TCR-A3-1)共培养；
TCR-A3-2组：PC9细胞和TCR-T细胞(TCR-A3-2)共培养；
TCR-A3-12组：PC9细胞和TCR-T细胞(TCR-A3-12)共培养；
TCR-A3-103组：PC9细胞和TCR-T细胞(TCR-A3-103)共培养；
TCR-A3-207组：PC9细胞和TCR-T细胞(TCR-A3-207)共培养。
以TCR-A3-1组为例，进行检测，具体如下：
用1μg/mL的抗人CD28抗体和50IU/mL的IL-2共刺激，进行细胞培养，培养过程中每隔两天向培养基中补充50IU/mL的IL-2。
1.1流式细胞仪检测细胞活化情况
培养16h后，用CD69-PerCP(BioLegend，Cat#310928)以及CD137-APC(BioLegend，Cat#309810)抗体染色，流式检测Jurkat76细胞活化情况。
1.2CCK8检测靶细胞存活情况
培养72h后，各孔细胞分别加入10μL CCK8检测试剂(Beyotime，Cat#C0038)，在培养箱中孵育1h后于450nm波长检测吸光度。
1.3Hoechst染色检测对靶细胞的杀伤作用
培养72h后，吸去细胞培养上清液，加入200μL的Hoechst 33342染色液(5μg/mL)，常温避光染色10min，除去染色液，用PBS洗2次，置于荧光显微镜下观察拍照，记录PC9细胞存活情况。
对各组进行同等处理，进行检测观察。
2、实验结果
2.1细胞活化情况
各组细胞活化情况检测结果如图7所示，其中细胞中CD69的表达结果如图7A和图7C所示，结果显示：与18121ctrl组相比，TCR-A3-1组、TCR-A3-2组、TCR-A3-12组、TCR-A3-103组和TCR-A3-207组中，表达CD69的细胞比例极显著增加(P＜0.001)；细胞中CD137的表达结果如图7B和图7D所示，结果显示：与18121ctrl组相比，TCR-A3-1组、TCR-A3-2组、TCR-A3-12组、TCR-A3-103组和TCR-A3-207组中，表达CD137的细胞比例极显著增加(P＜0.001)；并且图7结果显示：与18121ctrl组相比，Flu ctrl组中表达CD69和表达CD137的细胞比例并没有显著性变化。
结果说明：表2所示5条TCR构建得到的TCR-T细胞可以特异性地识别PC9细胞(靶细胞)表面的MAGE-A3抗原表位肽，并且均可被靶细胞(PC9细胞)活化。
2.2靶细胞存活情况
CCK8检测各孔细胞吸光度的结果如图8所示，结果显示，与18121ctrl组相比，Fluctrl组中OD值没有显著差异，而TCR-A3-1组、TCR-A3-2组、TCR-A3-12组、TCR-A3-103组和TCR-A3-207组OD值显著降低(P<0.01)，说明PC9细胞的存活数量显著减少。
2.3靶细胞杀伤情况
Hoechst染色检测观察的结果如图9所示，结果显示：与18121ctrl组相比，Fluctrl组中PC9细胞的存活数量没有显著差异，而TCR-A3-1组、TCR-A3-2组、TCR-A3-12组、TCR-A3-103组和TCR-A3-207组中PC9细胞的存活数量显著减少(P<0.001)。
结果说明：表2所示5条TCR构建得到的TCR-T细胞可以特异性地识别PC9细胞(靶细胞)表面的MAGE-A3抗原表位肽，并且可以对PC9细胞起到明显的杀伤作用。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种识别MAGE-A3抗原短肽的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体为以下的一种：
包括CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示TCRα肽链和CDR3区氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示的TCRβ肽链。
2.根据权利要求1所述T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体为以下的一种：
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的TCRα肽链和氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的TCRβ肽链。
3.一种TCR-T细胞，其特征在于，所述TCR-T细胞含有权利要求1～2任一所述T细胞受体。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为包含编码权利要求1～2中所述TCRα链和TCRβ链的核苷酸序列的表达载体。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求1～2任一所述T细胞受体和/或权利要求4所述的重组表达载体。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1～2任一所述T细胞受体、权利要求3所述TCR-T细胞、权利要求4所述的重组表达载体和/或权利要求5所述宿主细胞的一种或几种，还含有药学上接受的载体。
7.权利要求1～2任一所述T细胞受体、权利要求3所述TCR-T细胞、权利要求4所述的重组表达载体、权利要求5所述宿主细胞和/或权利要求6所述药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为表达黑色素瘤相关抗原A3的肿瘤。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述黑色素瘤相关抗原A3的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
10.权利要求1～2任一所述T细胞受体、权利要求3所述TCR-T细胞、权利要求4所述的重组表达载体、权利要求5所述宿主细胞和/或权利要求6所述药物组合物在制备抗肿瘤的疫苗中的应用。
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