CN117940448A - 用于预防或治疗癌症的新型蛋白质及包含其的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种铁蛋白融合蛋白，其包含连接至铁蛋白的外表面的癌症靶向肽和要在癌细胞中被切割的肽，其通过在癌细胞中特异性释放抗癌药物而实现有效的癌症靶向治疗，具有优异的抗癌效果，并且可以有效地降低对正常细胞的毒性，从而最小化抗癌治疗的副作用。

Description

用于预防或治疗癌症的新型蛋白质及包含其的药物组合物
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗癌症的新型蛋白质及包含其的药物组合物。
背景技术
化疗是利用抗癌药物的全身治疗并且是与手术疗法和放射疗法一起的三类主要的癌症治疗方法之一。给予患者的化疗用抗癌药物通过血管在全身循环，阻止癌细胞增殖或者杀死癌细胞。传统的抗癌药物具有非特异性的细胞毒性，这意味着它们攻击快速增殖的细胞，导致正常细胞和癌细胞都死亡。
化疗仍被广泛应用于治疗大多数癌症，并且存在多种不同类型的化疗。然而，对于化疗的治疗疗程和次数取决于癌症的类型、抗癌药物的类型、治疗的响应和副作用的严重程度。一般来说，抗癌药物影响普遍存在于细胞内的DNA或微管，所以当它们对癌细胞具有一定的治疗效果时，其也具有对正常细胞的不利影响，并且副作用通常严重到足以需要两到三周的平均休息时间从而使得受损的正常细胞恢复。
在本发明中，为了最大化现有的化疗用抗癌药物的癌症治疗效果，将靶向癌细胞中过表达的特定分子(例如表皮生长因子受体(EGFR))的肽遗传引入负载了化疗用抗癌药物的人重链铁蛋白(蛋白质纳米颗粒)的表面，从而实现将化疗用抗癌药物靶向递送至癌症处。此外，通过将在癌细胞中过表达的可被特定酶切割的肽连接至人重链铁蛋白，我们开发了一种工程化的蛋白质纳米颗粒，其可以诱导癌症特异性药物释放并且有效降低对正常细胞的毒性，最小化副作用。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是将特异性靶向癌细胞并具有化疗用抗癌药物的选择性释放功能从而特异性诱导癌细胞死亡并同时降低对正常细胞的细胞毒性由此最小化常规化疗用抗癌药物引起的副作用的蛋白质纳米颗粒组合。
用于解决问题的方案
1.一种铁蛋白融合蛋白，其包含癌症靶向肽和要在癌细胞中被切割的肽，所述癌症靶向肽和所述要在癌细胞中被切割的肽连接至所述铁蛋白的外表面。
2.上述1所述的铁蛋白融合蛋白，其中所述要在癌细胞中被切割的肽是由SEQ IDNO：1的序列组成的肽。
3.上述1所述的铁蛋白融合蛋白，其还包含连接至所述要在癌细胞中被切割的肽的用于负载抗癌药物的肽。
4.上述3所述的铁蛋白融合蛋白,其中所述用于负载抗癌药物的肽是包含氨基酸序列DE的肽。
5.上述4所述的铁蛋白融合蛋白,其中所述用于负载抗癌药物的肽是包含重复2至10次的氨基酸序列DE的寡肽。
6.上述1所述的铁蛋白融合蛋白，其中所述癌症靶向肽包含SEQ ID NO：2的序列。
7.上述1所述的铁蛋白融合蛋白，其中所述铁蛋白由人铁蛋白重链组成。
8.上述1所述的铁蛋白融合蛋白，其中所述癌症靶向肽和所述要在癌细胞中被切割的肽独立地连接至铁蛋白单体的N-末端或C-末端。
9.上述1所述的铁蛋白融合蛋白,其中，所述铁蛋白是通过自组装的由24个铁蛋白单体组成的球状蛋白质。
10.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含上述1至9中任一项所述的铁蛋白融合蛋白和连接至所述铁蛋白融合蛋白上的所述要在癌细胞中被切割的肽的抗癌药物。
11.上述10所述的药物组合物，其中，其中所述抗癌药物通过用于负载所述抗癌药物的肽连接至所述要在癌细胞中被切割的肽。
12.上述10所述的药物组合物，其中，所述抗癌药物是具有抗癌活性的化合物。
13.上述10中的药物组合物，其中所述抗癌药物选自由以下组成的组中：吉西他滨(gemcitabine)、丝裂霉素C(mitomycin C)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、博莱霉素(bleomycin)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、达卡巴嗪(dacarbazine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、培美曲塞(pemetrexed)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、克拉屈滨(cladribine)、羟脲(hydroxycarbamide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、苯达莫司汀(bendamustine)、替莫唑胺(temozolomide)、阿扎胞苷(azacitidine)、氯法拉滨(clofarabine)、地西他滨(decitabine)、奈拉滨(nelarabine)、普拉曲沙(pralatrexate)、表柔比星(epirubicin)、埃里布林(eribulin)、贝沙罗汀(bexarotene)、布舍瑞林(buserelin)、克唑替尼(crizotinib)、达拉非尼(dabrafenib)、地加瑞克(degarelix)、戈舍瑞林(goserelin)、依鲁替尼(ibrutinib)、兰瑞肽(lanreotide)、仑伐替尼(lenvatinib)、亮丙瑞林(leuprorelin)、米伐木肽(mifamurtide)、尼拉帕利(niraparib)、帕唑帕尼(pazopanib)和雷替曲塞(raltitrexed)。
14.上述10中的药物组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组中：脑癌、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、血管肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、喉癌、腮腺癌、胆道癌、甲状腺癌、光化性角化病、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺样鳞状细胞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形细胞瘤、前庭大腺癌(ganglion adenocarcinoma)、基底细胞癌、胆管癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺瘤、类癌、胆管癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊性腺瘤、消化系统癌、十二指肠癌、内分泌系统癌、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜腺癌、内皮细胞癌、室管膜细胞癌、上皮细胞癌、眼眶癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、眼睑癌、胃基底癌、胃泌素瘤、胶质母细胞瘤、胰高血糖素瘤、心脏癌、血管母细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝脏腺瘤、肝胆管癌、肝细胞癌、霍奇金病、回肠癌、胰岛素瘤、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞癌变、肝内胆道癌、侵袭性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、骨盆癌、巨细胞癌、结直肠癌、淋巴瘤、恶性间皮细胞肿瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移癌、口腔癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻导管癌、神经系统癌、非上皮皮肤癌、非霍奇金淋巴瘤、软细胞癌、少突神经胶质瘤、口癌、骨肉瘤、乳头状浆液性腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌、视网膜母细胞瘤、浆液性癌、窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、生长抑素分泌瘤、脊椎癌、上皮鳞状细胞癌、横纹肌肉癌、间皮下癌、T细胞白血病、舌癌、输尿管癌、尿道癌、宫颈癌、子宫体癌、阴道癌、VIPoma、外阴癌、高分化癌和Wilm瘤。
发明的效果
本发明的铁蛋白融合蛋白可以包含连接至铁蛋白的外表面的癌症靶向肽和要在癌细胞中被切割的肽，以及连接至要在癌细胞中被切割的肽的抗癌药物，从而提高抗癌功效并最小化副作用。
附图说明
图1示出用于表达huHF(+)(蛋白质纳米颗粒)、huHF(-)(不含huHF(+)中的组织蛋白酶E切割诱导肽的蛋白质纳米颗粒)和huHF(+/-)(不含huHF(+)中的作为癌症靶向肽的GE11的蛋白质纳米颗粒)的载体。
图2A示出蛋白质纳米颗粒huHF(+)及其抗癌药物缀合物的透射电镜(TEM)图像、尺寸和模型。
图2B示出蛋白质纳米颗粒huHF(-)及其抗癌药物缀合物的透射电镜(TEM)图像、尺寸和模型。
图2C示出蛋白质纳米颗粒huHF(+/-)及其抗癌药物缀合物的透射电镜(TEM)图像、尺寸和模型。
图3A示出使用组织蛋白酶E的蛋白质纳米颗粒-化疗用抗癌药物缀合物的选择性药物释放能力验证实验的结果。
图3B示出使用溶酶体蛋白酶混合物(LPM)的蛋白质纳米颗粒-化疗用抗癌药物缀合物的选择性药物释放能力验证实验的结果。
图4示出蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物的细胞毒性验证结果，展示了抗癌药物在每种细胞中的毒性降低程度。
图5示出蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物的胞内选择性药物释放实验的结果。更具体地，图5A、5B和5C分别示出其中抗癌药物为吉西他滨(GEM)、丝裂霉素C(MMC)和阿霉素(DOX)的结果。
图6A示出注射PBS、huHF(+)、huHF(+/-)、抗癌药物和蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物后在不同时间的近红外(NIR)图像分析。
图6B示出注射PBS、huHF(+)、huHF(+/-)、抗癌药物和蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物后在肝、肺、肾、脾、心脏和肿瘤中的近红外(NIR)图像分析。
图6C示出为了验证蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物的肝毒性进行的AST活性测定的结果。
图7A示出为了验证蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物的癌症特异性抗癌效果的实验的示意图，和作为实验结果的肿瘤尺寸。
图7B示出作为利用器官组织分析进行毒性验证的结果的各组织的的光学显微图像。
图8示出本发明的一个实施方案的癌细胞特异性抗癌药物的激活过程的示意图。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。
本发明涉及铁蛋白融合蛋白，其中癌症靶向肽和要在癌细胞中被切割的肽被连接至其外表面。
所述铁蛋白不限来源，可以来源于包括人的多种动物或微生物。
人铁蛋白由重链(21kDa)和轻链(19kDa)组成，并且构成铁蛋白的单体具有通过自组装形成球状纳米颗粒的特性。所述铁蛋白可以形成24个单体的自组装体，具有球状三维结构。
人铁蛋白具有约12nm的外径和约8nm的内径。所述铁蛋白单体的结构为5种α-螺旋结构(即A螺旋、B螺旋、C螺旋、D螺旋和E螺旋)顺序连接的形式，并且包括称为环的、连接各α-螺旋的多肽的非典型多肽。
环是即使肽或者小蛋白抗原插入铁蛋白时也不会被结构破坏的区域。通过使用克隆融合肽，可以制备出肽位于铁蛋白单体中的肽-铁蛋白融合蛋白单体。连接A螺旋和B螺旋的环被称为A-B环，连接B螺旋和C螺旋的环被称为B-C环，连接C螺旋和D螺旋的环被称为C-D环，连接D螺旋和E螺旋的环被称为D-E环。
对于铁蛋白的信息在NCBI(GenBank登记号：NM_000146、NM_002032等)公开提供。
铁蛋白可以由铁蛋白重链构成，更具体地，人铁蛋白重链。人铁蛋白重链可以是源于人的由SEQ ID NO:3的氨基酸序列表示的蛋白，并且术语“铁蛋白”可以与“人铁蛋白重链”或“huHF”在本文中互换使用。
铁蛋白由自组装以形成有组织的结构或模式的几个单体构成。本发明的铁蛋白融合蛋白可以是纳米级蛋白。例如24个铁蛋白单体可以自组装形成铁蛋白。
本发明的铁蛋白融合蛋白可以是球状的。如果其是球状的，其直径可以为8至50nm。更具体地，铁蛋白融合蛋白的直径可以为8nm至50nm、8nm至45nm、8nm至40nm、8nm至35nm、8nm至30nm、8nm至25nm、8nm至20nm或8nm至15nm。
本发明的铁蛋白融合蛋白是通过将癌症靶向肽和要在癌细胞中被切割的肽连接至其外表面获得的。
所述融合位置没有特别限制，只要其不干扰铁蛋白单体的自组装并且可以暴露在铁蛋白单体的表面即可。例如，所述肽可以连接在相邻的α-螺旋之间、在N-末端、在C-末端、在A-B环中、在B-C环中、在C-D环中、在D-E环中、在N-末端和A螺旋之间、在E螺旋和C-末端之间或在螺旋内部等。
尽管铁蛋白单体中有向内的凹陷部分，但其可以通过与肽的结合向外突出，使得肽暴露在外。
具体来说，所述肽可以连接于相邻α-螺旋之间的至少一个位点上。具体来说，所述肽也可以连接于铁蛋白单体的N-末端或C-末端。具体来说，所述肽也可以连接于铁蛋白单体的N-末端和A-螺旋之间或E-螺旋和C-末端之间。具体来说，所述肽也可以连接至铁蛋白单体的螺旋中的至少一个的内部。
术语“癌症靶向肽”是指在体内和体外都能够特异性结合至癌细胞或癌症组织的肽，并且其将本发明的蛋白导向待治疗的癌细胞。
本领域技术人员可以适当选择癌症靶向肽。例如，癌症靶向肽可以是诱导与在靶癌细胞中过表达的受体结合的肽。
在一个实施方案中，癌症靶向肽包含SEQ ID NO:2的序列，其可以通过结合至癌细胞中过表达的上表皮生长因子受体(EGFR)而靶向癌症。
如果癌症靶向肽暴露于铁蛋白的外表面，癌症靶向肽可以连接至铁蛋白单体的任意位置。癌症靶向肽可以连接至不干扰铁蛋白单体自组装的位置。
术语“要在癌细胞中被切割的肽”是指包含在癌细胞中可被切割的切割位点的肽。所述要在癌细胞中被切割的肽允许对癌细胞的治疗效果是特异性的。
如果该肽在癌细胞中能被特异性切割，其切割方法不受限制，并且该肽可以由本领域技术人员适当选择。例如，要在癌细胞中被切割的肽可以是要被癌细胞中特异性过表达的酶切割的肽，但不限于此。
在一个实施方案中，要在癌细胞中被切割的肽可以是要在癌细胞中被作为在癌细胞中过表达的酶的组织蛋白酶E(CTSE)切割的肽。
例如，要在癌细胞中被切割的肽可以是由SEQ ID NO:1的序列组成的肽。
此外，本发明的铁蛋白融合蛋白可以另外与用于负载抗癌药物的肽连接。
术语“用于负载抗癌药物的肽”是指被用来将抗癌药物负载到本发明的铁蛋白融合蛋白的肽。所述肽可以连接至要在癌细胞中被切割的肽。
所述肽和抗癌药物之间的键可以是离子键、共价键、配位键、氢键、静电吸引、范德华力或疏水键等，但不限于此。优选地，所述肽和抗癌药物之间的键可以是共价键。
一旦本领域技术人员选择适用于治疗的抗癌药物，则本领域技术人员可以适当选择用于负载抗癌药物的肽并将其连接至铁蛋白。例如，用于负载抗癌药物的肽可以是具有能够与所选的抗癌药物结合的官能团的肽。
具体来说，例如，如果选择具有氨基的抗癌药物用于治疗，用于负载所选抗癌药物的肽可以具有多个羧基来负载抗癌药物。所述抗癌药物可以通过EDC-NHS结合反应(EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺)-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺))与所述肽结合。
此外，具有能够与抗癌药物结合的官能团的肽、修饰以具有所述官能团的肽或修饰以具有所述官能团的抗癌药物可以用于对所述肽负载抗癌药物。
用于负载抗癌药物的肽可以包含氨基酸序列DE。
用于负载抗癌药物的肽可以包含氨基酸序列DE，其重复多次以负载多个抗癌药物。例如，氨基酸序列DE可以重复2至10次、2至8次、2至6次、2至5次或2至4次。在一方面，用于负载多个抗癌药物的肽可以具有重复2至4次的氨基酸序列DE。
术语“抗癌药物”是指包含用于治疗或预防诸如癌症等过度增殖疾病的化疗剂。
抗癌药物可以直接连接至要在癌细胞中被切割的肽或可以通过用于负载抗癌药物的肽间接连接至要在癌细胞中被切割的肽。如上所述，抗癌药物可以通过离子键合或共价键合等负载。
所述抗癌药物可以是具有抗癌活性的化合物。
例如，抗癌药物可以选自由以下组成的组中：吉西他滨、丝裂霉素C、多柔比星、甲氨蝶呤、博莱霉素、美法仑、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪、阿糖胞苷、氟达拉滨、培美曲塞、放线菌素D、柔红霉素、伊达比星、克拉屈滨、羟脲、硫鸟嘌呤、苯达莫司汀、替莫唑胺、阿扎胞苷、氯法拉滨、地西他滨、奈拉滨、普拉曲沙、表柔比星、埃里布林、贝沙罗汀、布舍瑞林、克唑替尼、达拉非尼、地加瑞克、戈舍瑞林、依鲁替尼、兰瑞肽、仑伐替尼、亮丙瑞林、米伐木肽、尼拉帕利、帕唑帕尼和雷替曲塞，但不限于此。
本发明的蛋白可以另外包含连接子。
连接子可以包含例如甘氨酸。具体来说，连接子可以是G3SG3TG3SG3，但不限于此。
例如，要在癌细胞中被切割的肽可以通过连接子连接至铁蛋白。在这种情况下，所述肽通过暴露在外部而更易在癌细胞内被切割，并且抗癌药物和用于负载抗癌药物的肽之间的结合效率可以得到提高。
另外，在本发明中，癌症靶向肽和要在癌细胞中被切割的肽可以独立地连接至铁蛋白的N-末端或C-末端。例如，如果癌症靶向肽被引入铁蛋白单体的N-末端，要在癌细胞中被切割的肽可以被引入铁蛋白的C-末端。例如，如果要在癌细胞中被切割的肽被引入铁蛋白的N-末端，癌症靶向肽可以被引入铁蛋白的C-末端。例如，如果连接子等被另外包含，癌症靶向肽可以被引入铁蛋白的N-末端，并且连接子等可被另外包含在铁蛋白的C-末端和要在癌细胞中被切割的肽之间。或者，连接子等可被另外包含在铁蛋白的N-末端和要在癌细胞中被切割的肽之间，并且癌症靶向肽可被引入铁蛋白的C-末端。
在本发明中，铁蛋白单体可以自组装以形成有组织的结构或模式。本发明的铁蛋白融合蛋白可以是纳米级颗粒。例如，24个铁蛋白单体可以自组装而形成球状铁蛋白蛋白。
本发明也提供了用于预防或治疗癌症的包含铁蛋白融合蛋白的药物组合物。
本发明的药物组合物可以包含铁蛋白融合蛋白和连接至要在癌细胞中被切割的肽的抗癌药物。关于铁蛋白融合蛋白的上述所有事项都适用于本发明的药物组合物中的作为活性成分的铁蛋白融合蛋白。此外，术语“抗癌药物”是指用于治疗或预防诸如上述癌症等过度增殖疾病的治疗剂，如上所述。
本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。如本文中所用的，术语“药学上可接受的载体”是指不会显著刺激机体并且不会抑制所给予的成分的生物活性和性质的载体或稀释剂。本发明中的药学上可接受的载体可以是盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇等中的一种，也可以是其中一种或多种的混合物。另外，其它常规添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂，需要时可以加入以配制适合注射到组织或器官中的注射剂。其也可以被制成等渗无菌溶液，或在某些情况下被制成可以通过加入无菌水或生理盐水而成为可注射溶液的干制剂(特别是冻干制剂)。此外，靶器官特异性抗体或其它配体可以与所述载体结合，从而特异性作用于靶器官。
本发明的组合物可以另外包含填料、赋形剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂。本发明的组合物也可以通过本领域已知的方法配制，在给药至哺乳动物后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
在一个实施方案中，所述药物组合物可以是可注射制剂且可以静脉注射给药，但不限于此。
如本文中所用的，术语“有效量”是指足以延迟或预防要治疗的特定疾病的发作或进展或者足以减轻要治疗的病症的量。
在本发明中，所述组合物可以以药学上的有效量给药。对本领域技术人员显而易见的是，所述药物组合物的适当的总每日剂量可以由从业者在合理的医学判断的范围内确定。
本发明组合物的药学上的有效量可以根据包含以下的多种因素而变化，：要实现的生物响应的类型和程度；患者的年龄、体重、一般健康情况、性别和饮食；给药的时间和途径；所述组合物的释放速率和组成比；治疗的持续时间；是否任何其它药物与所述组合物一起或同时使用；和药学领域中其它众所周知的因素。
如本文中所用的，术语“给药”(administration或administering)是指以任何合适的方法向患者引入本发明的组合物。本发明的组合物可以经多种途径例如口服或肠胃外途径给药，只要其可以到达靶组织即可。本发明的组合物可以通过腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内或直肠给药，但给药途径不限于此。
在本发明中，药物组合物可以按照负责药物制造、使用和销售的政府机构指导的形式包装，并且可以附有与其相关的说明书。例如说明书可以注明私人组织对组合物的形式或对人或动物给药的批准，或者可以注明例如美国食品药物管理局对药物处方的批准。
本发明中可以包含的抗癌药物如上所述。
包含抗癌药物的本发明的蛋白允许靶向治疗，因为其在癌细胞中特异性地释放抗癌药物，即其杀死癌细胞而对正常细胞具有低的细胞毒性。
具体来说，如图8所示，给药本发明的组合物的在癌细胞和正常细胞中的抗癌活性显著不同。癌症靶向肽、要在癌细胞中被切割的肽和用于负载抗癌药物的肽可被连接至人铁蛋白重链(huHF)的表面。例如，连接至huHF表面的“癌症靶向肽”、“要在癌细胞中被切割的肽”和“用于负载抗癌药物的肽”可以分别是靶向癌细胞中过表达的表皮生长因子受体(EGFRs)的肽、可被作为癌细胞中过表达的酶的组织蛋白酶E(CTSE)切割的肽(例如由SEQID NO:1的序列组成的肽)和具有重复3次的氨基酸序列DE并被连接至要在癌细胞中被切割的肽的寡肽。后文中，术语“huHF(+)-抗癌药物缀合物”是指与所述的肽和抗癌药物连接的铁蛋白蛋白。
huHF(+)-抗癌药物缀合物可以通过靶向癌细胞中过表达的表皮生长因子受体(EGFRs)的癌症靶向肽被转运至癌细胞，并且通过内吞作用被引入癌细胞。之后，所述肽可被作为癌细胞中过表达的酶的组织蛋白酶E(CTSE)切割。连接要在癌细胞中被切割的肽的抗癌药物可以从huHF(+)-抗癌药物缀合物中被切割并释放，并被激活。然后释放的抗癌药物可以最终被转运至细胞核以发挥抗癌活性，例如染色体DNA损伤和/或DNA复制干扰。
与之相反，huHF(+)-抗癌药物缀合物极少通过内吞作用被带入正常细胞。此外，所述肽不会在正常细胞中通过组织蛋白酶E(CTSE)活性切割。因此，抗癌药物不会被释放并且保持非激活，并且其不会被转运至细胞核进而不展示抗癌活性。
因此，本发明的药物组合物可以被用于治疗或预防癌症。
例如所述癌症可以选自由以下组成的组中：脑癌、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、血管肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、喉癌、腮腺癌、胆道癌、甲状腺癌、光化性角化病、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺样鳞状细胞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形细胞瘤、前庭大腺癌、基底细胞癌、胆管癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺瘤、类癌、胆管癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊性腺瘤、消化系统癌、十二指肠癌、内分泌系统癌、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜腺癌、内皮细胞癌、室管膜细胞癌、上皮细胞癌、眼眶癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、眼睑癌、胃基底癌、胃泌素瘤、胶质母细胞瘤、胰高血糖素瘤、心脏癌、血管母细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝脏腺瘤、肝胆管癌、肝细胞癌、霍奇金病、回肠癌、胰岛素瘤、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞癌变、肝内胆道癌、侵袭性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、骨盆癌、巨细胞癌、结直肠癌、淋巴瘤、恶性间皮细胞肿瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移癌、口腔癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻导管癌、神经系统癌、非上皮皮肤癌、非霍奇金淋巴瘤、软细胞癌、少突神经胶质瘤、口癌、骨肉瘤、乳头状浆液性腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌、视网膜母细胞瘤、浆液性癌、窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、生长抑素分泌瘤、脊椎癌、上皮鳞状细胞癌、横纹肌肉癌、间皮下癌、T细胞白血病、舌癌、输尿管癌、尿道癌、宫颈癌、子宫体癌、阴道癌、VIPoma、外阴癌、高分化癌和Wilm瘤，但不限于此。
在下文中，将参照以下实施例详细描述本发明。提供这些实施例只是为了更好地理解本发明，这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。
实施例
1.用于人铁蛋白衍生的纳米颗粒的生物合成的表达载体的构建
根据下表1所示的载体示意图，使用PCR制备huHF(+)和两个对照例huHF(-)和huHF(+/-)，其中huHF(+)是人铁蛋白衍生的蛋白，其中连接和表达了GE11、组织蛋白酶E切割诱导肽和化疗用抗癌药物结合诱导肽，huHF(-)是不具有组织蛋白酶E切割诱导肽的huHF(+)，并且huHF(+/-)是不具有GE11的huHF(+)。所有制备的质粒表达载体在琼脂糖凝胶上纯化，然后通过总DNA测序鉴定其各自的序列。
PCR产物被按顺序插入pT7-7表达载体以构建能够表达每种蛋白质纳米颗粒的表达载体。
用于表达每种蛋白质纳米颗粒的载体是pT7-huHF(+)、pT7-huHF(-)和pT7-huHF(+/-)(图1)。
[表1]用于每种纳米颗粒的表达载体构建体
2.候选蛋白质纳米颗粒的生物合成和纯化
用如上所述制备的每种表达载体转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)[F-ompThsdSB(rB-mB-)]，并选择氨苄西林抗性转化子。将经转化的大肠杆菌在含有50mL Luria-Bertani(LB)培养基(含有100mg·L-1氨苄西林)的烧瓶(250mL锥形瓶(Erlenmeyer flask)，37℃，150rpm)中培养。当培养基的浑浊度(O.D600)达到约0.4至0.5时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)(1.0mM)以诱导重组基因的表达。在20℃培养16至18小时后，将经培养的大肠杆菌以4,500rpm离心10分钟以得到细菌沉淀。之后，将得到的细菌沉淀悬浮于5mL的裂解液中(10mM Tris-盐酸缓冲液，pH 7.5，10mM EDTA)并利用超声波仪(BransonUltrasonics Corp.，Danbury，CT，USA)裂解。将裂解物以13,000rpm离心10分钟以分离上清液和不溶性聚集体。利用镍与连接至重组蛋白的组氨酸的结合，对分离的上清液进行Ni2+-NTA亲和层析，然后浓缩重组蛋白并置换缓冲液以获得纯化的重组蛋白。下文详细描述每个步骤。
1)Ni2+-NTA亲和层析
为了纯化重组蛋白，收集根据上述方法培养的大肠杆菌，并且将细胞沉淀重悬于5mL裂解液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑、0.2mM CuSO4、pH 8.0)中，接着用超声波仪裂解。将裂解物以13,000rpm离心10分钟以分离上清液，并且利用Ni2+-NTA柱(Quiagen，Hilden，Germany)分离每种重组蛋白(洗涤缓冲液：50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑，pH8.0/洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mM咪唑，pH 8.0)。
2)浓缩和缓冲液置换
将2mL通过Ni2+-NTA亲和层析洗脱的重组蛋白置于超滤离心过滤器(Amicon Ultra100K,Millipore,Billerica,MA)并以5,000rpm离心直至1mL的溶液残留在柱中。之后将缓冲液置换为PBS缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4，pH 7.4)。
3.制备的蛋白质纳米颗粒与化疗用抗癌药物的结合的形成及其结构的分析
上述步骤之后，进行EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺)-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)反应，从而形成经纯化的重组蛋白质纳米颗粒和例如吉西他滨(GEM)、丝裂霉素C(MMC)和阿霉素(DOX)等的含有氨基的化疗用抗癌药物之间的结合。EDC-NHS反应缓冲液是通过向1mL 2-[吗啉代]乙磺酸(0.1M，pH 6.0)缓冲液中加入0.4mg EDC和1.1mg磺基-NHS配制的。在室温下加入基于每1mL重组蛋白质纳米颗粒为22μL的EDC-NHS的反应缓冲液15分钟后，在室温下分别按照288:1，720:1和144:1的摩尔比(化疗用抗癌药物的摩尔浓度:重组蛋白质纳米颗粒的摩尔浓度)使化疗用抗癌药物GEM、MMC和DOX反应2小时。之后，为了去除保持未结合的化疗用抗癌药物，将反应所得物置于超级离心过滤器(Amicon Ultra 100K,Millipore,Billerica,MA)中以将反应缓冲液用PBS缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mMNa2HPO4、1.8mM KH2PO4，pH 7.4)置换。用透射电镜(TEM)对如上所述制备的经纯化的重组蛋白质纳米颗粒和重组蛋白质纳米颗粒-化疗用抗癌药物缀合物拍照用于结构分析。将含有经空气干燥的样品的电镜铜网和2％(w/v)醋酸铀酰水溶液在室温下孵育1小时以得到蛋白质纳米颗粒的染色图像。使用以200kV操作的Tecnai 20(FEI，Hillsboro，Oregon，U.S.A.)电镜观察它们，以确定蛋白质纳米颗粒和蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物都形成球状纳米颗粒。此外，DLS(动态光散射)分析示出huHF(+)形成尺寸为12.32±2.88nm的球状纳米颗粒，huHF(+)-GEM形成尺寸为12.48±2.37nm的球状纳米颗粒，huHF(+)-MMC形成尺寸为12.67±2.80nm的球状纳米颗粒，huHF(+)-DOX形成尺寸为12.78±2.27nm的球状纳米颗粒，huHF(-)形成尺寸为12.09±2.05nm的球状纳米颗粒，huHF(-)-GEM形成尺寸为12.36±1.62nm的球状纳米颗粒,huHF(-)-MMC形成尺寸为12.56±1.03nm的球状纳米颗粒,huHF(-)-DOX形成尺寸为12.70±1.98nm的球状纳米颗粒，huHF(+/-)形成尺寸为12.14±2.74nm的球状纳米颗粒，huHF(+/-)-GEM形成尺寸为12.40±2.45nm的球状纳米颗粒，huHF(+/-)-MMC形成尺寸为12.34±1.87nm的球状纳米颗粒，huHF(+/-)-DOX形成尺寸为12.69±2.70nm的球状纳米颗粒(图2A、2B和2C)。
4.蛋白质纳米颗粒-化疗用抗癌药物缀合物的选择性药物释放能力的验证
为了验证重组蛋白质纳米颗粒-化疗用抗癌药物缀合物是否能被组织蛋白酶E切割以选择性释放药物，利用是天然荧光的阿霉素构建了实验。如上所述使重组蛋白质和阿霉素缀合，并将蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物与组织蛋白酶E酶(10U/mL)随时间在40℃，pH 5.0，组织蛋白酶E酶的最适反应条件下反应。之后对经反应的蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物进行利用12％Tris-甘氨酸预制凝胶(Invitrogen，California，U.S.A.)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)。利用考马斯蓝染色液(Coomassie blue stainingsolution)对所述凝胶进行染色以定量蛋白质纳米颗粒。染色后3小时，目视观察到缀合物中结合抗癌药物的部分被组织蛋白酶E有效切割。通过测量其紫外吸光度绘制出阿霉素的强度图(图3A)。
作为除了利用已知分布在溶酶体中的组织蛋白酶B、D、L、H和PrCP(脯氨酰羧肽酶))的多种酶的混合物LPM(溶酶体蛋白酶混合物)代替组织蛋白酶E以外，以与上述相同的方式进行实验，观察到所述肽没有被特异性切割，从而药物没有被选择性释放(图3B)。
5.蛋白质纳米颗粒-化疗用抗癌药物缀合物的无细胞毒性的验证
为了验证蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物由于如上所述的选择性药物释放而对正常细胞无毒，在多种正常细胞中进行CCK(细胞计数试剂盒)测试。正常肺细胞WI-38和IMR-90和正常结肠细胞CCD-18co在96孔微孔板中以1x104个细胞/孔生长36小时，并且比较仅加入抗癌药物时的细胞毒性和加入蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物时的细胞毒性。通过将抗癌药物或蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物的浓度逐渐由500μM增加至2000μM，得到了细胞活力达到50％的药物浓度IC50，并且发现当抗癌药物与蛋白质纳米颗粒缀合时，细胞毒性被有效降低。计算抗癌药物的药物毒性降低值(DTR)，在WI-38细胞中的GEM、MMC和DOX的DTR分别为3162、56234和263；在IMR-90细胞中的GEM、MMC和DOX的DTR分别为7244、31623和316；在CCD-18co细胞中的GEM、MMC和DOX的DTR分别为8913、95499和91(图4)。
6.蛋白质纳米颗粒-化疗用抗癌药物缀合物在癌细胞和正常细胞中的选择性药物释放的观察
为了验证蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物对于向癌细胞的选择性药物递送是有效的，用huHF(+)-DOX(图5C)、huHF(+)-GEM(图5A)和huHF(+)-MMC(图5B)处理癌细胞PANC-1以及正常细胞WI-38、IMR-90和CCD-18co，以观察药物随时间的释放，其中使用huHF(+)-DOX是因为阿霉素是天然的荧光团，而吉西他滨和丝裂霉素C通过外接荧光材料进行观察。结果证实，药物在癌细胞中被特异性释放并且进入细胞核，而药物在所有正常细胞中未被释放。此外，当以与实施例5中同样的方式进行CCK测试时，证实了与单独加入抗癌药物相比，蛋白质纳米颗粒缀合物的引入提高了对癌细胞的细胞毒性并且没有引发对正常细胞的细胞毒性。
7.蛋白质纳米颗粒-化疗用抗癌药物缀合物的NIR图像分析及它们对于肝的无毒性的验证
以与实施例6相同的方式，将具有天然荧光性质的DOX以及具有外接有荧光材料的GEM和MMC分别结合到纳米颗粒的表面，之后将它们的荧光调整至相同，并注射入5周龄的裸鼠中，从而证明huHF(+)-GEM、huHF(+)-MMC和huHF(+)-DOX缀合物均可以靶向癌症，并且观察到通过保留在肿瘤中24小时而有效提高癌症靶向效率。与之相反，观察到去除了癌症靶向肽GE11的huHF(+/-)-GEM、huHF(+/-)-MMC和huHF(+/-)-DOX具有显著降低的癌症靶向效率(图6A和6B)。
蛋白质纳米颗粒-化疗用抗癌药物缀合物不仅靶向癌症，而且还会被转运至肝脏。AST(天冬氨酸转氨酶)主要存在于肝脏，并且在健康人中，血液AST浓度低。当出现肝毒性时，肝脏不会正常工作并且AST会大量释放到血流中。
将蛋白质纳米颗粒-化疗用抗癌药物缀合物、抗癌药物和单独的PBS缓冲液分别给予裸鼠，在24小时后采集裸鼠血液并进行AST活性测试以测量肝毒性。结果观察到，与单独的抗癌药物相比，结合至蛋白质纳米颗粒的抗癌药物显著降低了AST的活性(图6C)。这证实了蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物可被大量转运到肝脏但不会引发毒性。
8.通过长期组织分析的蛋白质纳米颗粒-化疗用抗癌药物缀合物的癌症特异性抗癌效果及无毒性的验证
实施例7证明了缀合至蛋白质纳米颗粒的化疗用抗癌药物如huHF(+)-GEM、huHF(+)-MMC和huHF(+)-DOX有效靶向癌症并且在长时间存在于肿瘤中。因此，我们预期将这些蛋白质纳米颗粒-化疗用抗癌药物缀合物的体内注射将因为它们特异性靶向癌症而展现出优异的抗癌效果，所以我们进行了体内实验，从而验证与单独注射缓冲液、蛋白质纳米颗粒和抗癌药物相比，以三天的间隔静脉注射缀合物后裸鼠的肿瘤尺寸的减少。注射中蛋白质和抗癌药物的浓度相同。在42天内测量肿瘤的体积，与单独的抗癌药物相比，当抗癌药物结合至蛋白质纳米颗粒并注射时，肿瘤生长得到有效抑制。此外，在42天后，取出各实验组的肿瘤并测量其尺寸，结果，当通过与蛋白质纳米颗粒结合来递送抗癌药物时，它们均显示出优异的抗癌效果(图7A)。
如实施例4和6所示，蛋白质纳米颗粒huHF(+)展现出表面上的肽，通过组织蛋白酶E选择性诱导药物释放，因此预期其对正常细胞没有毒性，并且作为使用细胞系WI-38、IMR-90和CCD-18co测试对正常细胞的毒性的结果，证实了对正常细胞的毒性显著低。在静脉注射42天后，取出各实验组的肝、肺、肾、脾、心脏和肿瘤并利用H&E(苏木精&伊红)染色，通过光学显微镜下观察每个组织(图7B)。结果证实了，仅抗癌药物给药时，它们对所有器官和肿瘤具有零星的毒性。与之相反，当蛋白质纳米颗粒-抗癌药物缀合物给药时，它们对肿瘤有特异性毒性，并且其它器官中没有发现毒性诱导的组织损伤。

Claims (14)

1.一种铁蛋白融合蛋白，其包含：
癌症靶向肽；和
要在癌细胞中被切割的肽，
其中所述癌症靶向肽和所述要在癌细胞中被切割的肽连接至所述铁蛋白的外表面。
2.根据权利要求1所述的铁蛋白融合蛋白，其中，所述要在癌细胞中被切割的肽是由SEQ ID NO:1的序列组成的肽。
3.根据权利要求1所述的铁蛋白融合蛋白，其还包含连接至所述要在癌细胞中被切割的肽的用于负载抗癌药物的肽。
4.根据权利要求3所述的铁蛋白融合蛋白，其中，所述用于负载抗癌药物的肽是包含氨基酸序列DE的肽。
5.根据权利要求4所述的铁蛋白融合蛋白，其中，所述用于负载抗癌药物的肽是包含重复2至10次的所述氨基酸序列DE的寡肽。
6.根据权利要求1所述的铁蛋白融合蛋白，其中，所述癌症靶向肽包含SEQ ID NO:2的序列。
7.根据权利要求1所述的铁蛋白融合蛋白，其中，所述铁蛋白由人铁蛋白重链组成。
8.根据权利要求1所述的铁蛋白融合蛋白，其中，所述癌症靶向肽和所述要在癌细胞中被切割的肽独立地连接至所述铁蛋白的单体的N-末端或C-末端。
9.根据权利要求1所述的铁蛋白融合蛋白，其中，所述铁蛋白是通过自组装的由24个铁蛋白单体组成的球状蛋白质。
10.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含：
根据权利要求1至9中任一项所述的铁蛋白融合蛋白；和
连接至所述铁蛋白融合蛋白上的所述要在癌细胞中被切割的肽的抗癌药物。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述抗癌药物通过所述用于负载抗癌药物的肽连接至所述要在癌细胞中被切割的肽。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述抗癌药物是具有抗癌活性的化合物。
13.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述抗癌药物选自由以下组成的组中：吉西他滨(gemcitabine)、丝裂霉素C(mitomycin C)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、博莱霉素(bleomycin)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、达卡巴嗪(dacarbazine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、培美曲塞(pemetrexed)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、克拉屈滨(cladribine)、羟脲(hydroxycarbamide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、苯达莫司汀(bendamustine)、替莫唑胺(temozolomide)、阿扎胞苷(azacitidine)、氯法拉滨(clofarabine)、地西他滨(decitabine)、奈拉滨(nelarabine)、普拉曲沙(pralatrexate)、表柔比星(epirubicin)、埃里布林(eribulin)、贝沙罗汀(bexarotene)、布舍瑞林(buserelin)、克唑替尼(crizotinib)、达拉非尼(dabrafenib)、地加瑞克(degarelix)、戈舍瑞林(goserelin)、依鲁替尼(ibrutinib)、兰瑞肽(lanreotide)、仑伐替尼(lenvatinib)、亮丙瑞林(leuprorelin)、米伐木肽(mifamurtide)、尼拉帕利(niraparib)、帕唑帕尼(pazopanib)和雷替曲塞(raltitrexed)。
14.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组中：脑癌、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、血管肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、喉癌、腮腺癌、胆道癌、甲状腺癌、光化性角化病、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺样鳞状细胞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形细胞瘤、前庭大腺癌、基底细胞癌、胆管癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺瘤、类癌、胆管癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊性腺瘤、消化系统癌、十二指肠癌、内分泌系统癌、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜腺癌、内皮细胞癌、室管膜细胞癌、上皮细胞癌、眼眶癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、眼睑癌、胃基底癌、胃泌素瘤、胶质母细胞瘤、胰高血糖素瘤、心脏癌、血管母细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝脏腺瘤、肝胆管癌、肝细胞癌、霍奇金病、回肠癌、胰岛素瘤、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞癌变、肝内胆道癌、侵袭性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、骨盆癌、巨细胞癌、结直肠癌、淋巴瘤、恶性间皮细胞肿瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移癌、口腔癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻导管癌、神经系统癌、非上皮皮肤癌、非霍奇金淋巴瘤、软细胞癌、少突神经胶质瘤、口癌、骨肉瘤、乳头状浆液性腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌、视网膜母细胞瘤、浆液性癌、窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、生长抑素分泌瘤、脊椎癌、上皮鳞状细胞癌、横纹肌肉癌、间皮下癌、T细胞白血病、舌癌、输尿管癌、尿道癌、宫颈癌、子宫体癌、阴道癌、VIPoma、外阴癌、高分化癌和Wilm瘤。
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