CN117940444A - 胱天蛋白酶-2抑制剂化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)化合物，所述化合物为式(I)所示化合物：

Description

胱天蛋白酶-2抑制剂化合物
发明领域
本发明涉及新的多肽衍生物、包含它们的药物组合物及其在预防和/或治疗胱天蛋白酶-2(Caspase-2)介导的疾病或紊乱中的用途。
背景技术
胱天蛋白酶(Caspase)是进化保守的半胱氨酸依赖性内切蛋白酶家族，在特定天冬氨酸残基后水解其基质(Lamkanfi，2002年)。胱天蛋白酶与多种生物活动有关，如细胞凋亡(Ramirez和Salvesen，2018年)、炎症(Vande Walle，2016年)、细胞分化(Fernando，2002年)和代谢(Shalini，2015年)。
胱天蛋白酶分为两大类：一类参与炎症过程的调控(-1、-4、-5、-11、-12)，另一类对细胞凋亡的启动和执行起核心作用(2、-3、-7、-8、-9、-10)(Shalini，2015)。根据其在凋亡程序中的作用，凋亡的胱天蛋白酶原酶分为启动胱天蛋白酶或执行胱天蛋白酶。启动胱天蛋白酶(如胱天蛋白酶-2、-8和-9)在上游信号传导中非常重要，它们通过适配蛋白与其前结构域的结合而被激活。这种结合促使它们寡聚成高分子量的蛋白复合物，从而引发它们的二聚化并加工成活性酶。一旦激活，启动子胱天蛋白酶会通过蛋白水解作用激活执行子胱天蛋白酶(如胱天蛋白酶-3和-7)。然后，执行子胱天蛋白酶继续裂解蛋白质基质，导致细胞有组织地解体，最终导致细胞死亡。
细胞凋亡过程中的启动子胱天蛋白酶激活主要由两种途径介导：线粒体或内源性途径以及死亡受体或外源性途径。内源性途径在细胞应激(如ROS、细胞毒性药物、DNA损伤)时被激活，并导致启动子胱天蛋白酶-2的激活(Shalini，2015年)。活性胱天蛋白酶-2会裂解Bid，以及截短的Bid(tBid)通过调节Bax和Bak激活线粒体的通透性(Enoksson，2004年)。线粒体细胞色素c被释放到细胞质中，诱导Apaf-1寡聚化，形成一个被称为凋亡体的大型七聚体复合物(Bao，2007年)。细胞凋亡小体募集并激活启动子胱天蛋白酶，即胱天蛋白酶-9，它可以直接裂解并激活执行子胱天蛋白酶，即胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7(Bao，2007年)。
外源性凋亡途径是通过配体与其细胞外死亡受体(如TNFR、Fas、TRAIL)的结合在质膜上启动的(Gaur，2003年)。这通过由FAS相关死亡结构域蛋白(FADD)和/或TNFR相关死亡结构域蛋白(TRADD)及其他成分组成的死亡诱导信号复合体(DISC)来募集和激活胱天蛋白酶-8或-10。胱天蛋白酶-8还将BID分解成截短形式(tBID)，使其参与线粒体途径以扩大凋亡反应(Li，1998年)。一旦启动子胱天蛋白酶通过外源性或内源性凋亡途径被激活，它们就会介导效应子胱天蛋白酶-3、-6和-7的激活(Bao，2007年)。
胱天蛋白酶-2最初被命名为Need-2(小鼠)或Ich-1(人类)，是跨物种最保守的胱天蛋白酶，与秀丽隐杆线虫(C.elegans)有55％的相似性(Yuan,1993；Wang,1994；Kumar,1994)。胱天蛋白酶-2包含一个N端胱天蛋白酶募集结构域(N-terminal caspaserecruitment domain)(CARD)，然后是一个包含活性位点的大亚基(p19)和一个小亚基(p12)。因此，胱天蛋白酶-2最像胱天蛋白酶-9，后者是细胞凋亡内源性途径的启动子(Li和Yuan，2008年)。然而，与常规的启动子胱天蛋白酶(如胱天蛋白酶-9)或外源性凋亡的顶端胱天蛋白酶(如胱天蛋白酶-8)相比，胱天蛋白酶-2并不处理需要被启动子裂解才能激活的凋亡效应因子，如胱天蛋白酶-3、-6或-7(Guo等人，2002年；Van de Craen等人，1999年)。与其他启动子胱天蛋白酶不同的是，胱天蛋白酶-2在二聚化后会发生自催化裂解，并且不需要裂解来进行初始激活(B.C.Baliga，2004年)。
胱天蛋白酶-2具有几个独特的特征，包括存在核定位信号，在某些细胞模型中，核定位信号在DNA损伤后触发凋亡途径方面发挥着核心作用。此外，据报道，胱天蛋白酶-2也是非凋亡信号通路，包括新生脂肪生成(Kim，2018年)、代谢调节(Nutt，2005年)、肿瘤抑制(Kumar，1995年)、有丝分裂障碍(Vitale，2011年)、细胞周期调节(Sidi，2008年)和DNA修复(Vigneswara，2020年)。
由于细胞凋亡的增加，健康组织中的重要细胞丢失导致许多人类疾病以及环境、医疗毒性和病原体的发展和恶化(Singh，2019)。
在不同的疾病或病理情况下描述了胱天蛋白酶-2诱导的细胞凋亡都会增加。
·视神经损伤后视网膜神经节细胞(RGC)丢失是某些人类眼科疾病(如缺血性视神经病变)的标志。在大鼠视神经横断模型中发现，胱天蛋白酶-2在RGC中表达并被裂解(Ahmed，2011年)。
·在新生儿缺血性脑损伤中，缺血损伤会引发氧化应激、炎症和兴奋性毒性等多种途径，导致缺血区域的细胞在胱天蛋白酶2激活的介导下发生凋亡而大量死亡(Carlsson，2011；Chauvier，2011)。
·中风时，脑神经元凋亡是短暂全脑缺血后梗死周围区域发生的主要病理变化，造成缺血再灌注(I/R)损伤。脑神经细胞凋亡可导致中风后偏瘫、死亡或认知障碍(Turkmen，2011年)。在脑卒中的动物模型中，I/R后胱天蛋白酶2的表达和激活增加。
·在阿尔茨海默病(AD)和tau蛋白病(tauopathies)中，tau蛋白(tauprotein)形成纤维，被认为具有神经毒性。胱天蛋白酶-2会在Asp314处裂解tau，从而导致动物和细胞模型的认知和突触功能受损。截短产物Δtau314能抵抗肌纤维震颤(fibrillation)，并以更高水平存在于认知障碍小鼠和AD患者的大脑中。抵抗胱天蛋白酶-2裂解的tau突变体的表达防止了tau渗入脊柱、使谷氨酸受体脱位，并损害培养神经元的突触功能，还能防止小鼠的记忆缺陷和神经退行性变(Zhao，2016)。
·胱天蛋白酶-2促进肥胖、代谢综合征和非酒精性脂肪肝(Machado，2016年；Kim，2018年)。胱天蛋白酶-2的表达与非酒精性脂肪肝患者肝病的严重程度密切相关(Machado，2015；Kim，2018)。
细胞凋亡的增加在许多疾病中发挥作用的有力证据促使人们努力利用这一途径获得治疗益处。第一代胱天蛋白酶抑制剂是可逆的醛肽，由于缺乏选择性和使用的弹头不同，其治疗效果有限。
在第一代抑制剂中，开发出了几种肽序列，据说可以选择性地抑制不同的胱天蛋白酶，例如Ac-DEVD-CHO(胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7的优先抑制剂)和Ac-VDVAD-CHO(胱天蛋白酶-2、-3和-7的优先抑制剂)。
为了有效抑制细胞凋亡，针对胱天蛋白酶-3的选择性至关重要，因为在几乎所有组织中，这种胱天蛋白酶的浓度都高于其他胱天蛋白酶，而且它具有杂合性(McStay，2008年)。此外，针对胱天蛋白酶2的非选择性抑制剂对直接抑制细胞凋亡的临床疗效有限，因为它们作用于线粒体外膜孔的下游，并且无法逆转胱天蛋白酶-2介导的孔形成对线粒体功能造成的严重损害(Singh，2019年)。此外，在胱天蛋白酶-8(外源性凋亡)也被激活的情况下，选择性也是至关重要的，因此选择性地抑制胱天蛋白酶-2(内源性凋亡)是必要的。
抑制剂Ac-VDVAD-CHO对胱天蛋白酶-3的抑制作用强于胱天蛋白酶-2。这引发了人们对该试剂作为一种“选择性”胱天蛋白酶-2抑制剂在细胞环境中使用时所产生的数据的有效性产生了质疑。一些出版物已经表达了对现有抑制剂特异性的担忧，并强调在胱天蛋白酶领域迫切需要更具选择性的抑制剂(Pereira，2008年；Berger，2006年；McStay，2008年；Benkova，2009年；Yun，2007年；Krumschnabel，2009年；Kitevska，2009年；Schweizer，2007年；Poreba，2019年(“Caspase selective reagents for diagnosing apoptoticmchanisms”Poreba等人，Cell Death and Differentiation。在本文(主要在补充部分)中，我们对提供了基于天然氨基酸序列制成的胱天蛋白酶抑制剂/探针的详细动力学分析)。
用于设计胱天蛋白酶抑制剂的弹头有多种类型，但所有弹头的作用方式都相似。它们的作用机制依赖于活性位点半胱氨酸对亲电中心的亲核攻击，从而形成一种过渡(可逆)或共价(不可逆)的胱天蛋白酶抑制剂复合物(Evans，2006年)。特定弹头的最大特点是只针对活性位点半胱氨酸残基，而忽略了蛋白质组中的其他游离亲核物。因此，靶蛋白水解酶的催化机理在选择合适的弹头时起着重要作用。
重要的是，半胱氨酸蛋白酶中催化半胱氨酸残基上的巯基(thiol)比催化丝氨酸或苏氨酸上的羟基更易极化，因此用作半胱氨酸蛋白酶弹头的亲电体可能比丝氨酸或苏氨酸蛋白酶(threonine proteases)弹头更软(Powers，2002年)。因此，对胱天蛋白酶的研究最广泛的是使用含有例如重氮甲基酮(diazomethylketons)、环氧化物以及卤代和酰氧基甲基酮(halo-and acyloxy-methylketons)等弹头的抑制剂。这些弹头的主要优点是易于合成、生物利用度高以及活性位点Cys选择性反应。最常用、最具商业价值的胱天蛋白酶抑制剂弹头是氟-(FMK或-CH2F)、氯-(CMK或-CH2Cl)或酰氧基甲基酮(AOMK)(Poreba，2015，(“Small molecule active site directed tools for studying human caspases”，Poreba等人，Chemical Reviews，2015年))。这些弹头的主要优点是易于合成、生物利用度高以及活性位点Cys选择性反应(Sanman，2014年；Powers，2002年)。
基于FMK的抑制剂是第一种抑制剂，迄今为止，它们在该领域的研究中占据主导地位。FMKs的优点之一是酮试剂能穿透质膜，对细胞相对无毒(VanNoorden，2001年(“Thehistory ofZ-VAD-FMK,atool forunderstanding the significance ofcaspaseinhibition”VanNoorden，Acta Histochemica，2001年))。使用FMK抑制剂也有一些缺点：此类探针会与其他半胱氨酸蛋白酶(如豆蛋白酶(legumains)、酪蛋白酶B(cathepsinB)和酪蛋白H(cathepsin H))产生交叉反应，以及由于FMK组的非特异性结合反应会产生高标记背景(Rozman-Pungercar，2003年；Schotte，1999年)。含有FMK弹头的抑制剂已被证明在体内具有毒性，因为氟乙酸基团会释放出来，特别是在肝脏中会导致抑制乌头酶(aconitase)。因此，带有FMK基团的抑制剂的开发在临床前阶段因其肝毒性而被放弃(Citarella，2020年)。
AOMKs是这组化合物中亲电性最弱的一种，因此它们最适合用于开发胱天蛋白酶抑制剂，因为它们与其他亲核物的交叉反应很少。因此，较弱的亲电性使它们能够更特异地与胱天蛋白酶发生反应，并减少与其他Cys依赖性蛋白酶的交叉反应(Poreba等人，Chemical Reviews(2015)BI-BJ)。
在多种模型中，下调胱天蛋白酶-2的表达已有效防止细胞凋亡：
·在视神经损伤后视网膜神经节细胞(RGC)丧失的模型中，通过siRNA抑制胱天蛋白酶-2的表达具有神经保护作用，可在至少30天内显著提高RGC的存活率(Ahmed，2011年)。
·在新生儿缺血性脑损伤中，通过基因(Carlsson，2011年)或药理学(Chauvier，2011年)抑制胱天蛋白酶2可减少新生儿大脑皮质和白质在兴奋毒性、动脉中风和缺氧后的损伤。
·在脑卒中细胞凋亡中，用一种微RNA(miR-1247-3p)治疗可抑制胱天蛋白酶-2的表达，减轻神经细胞凋亡(Zhang，2019)。
·在阿尔茨海默病(AD)和其他牛磺酸病的动物模型中，降低胱天蛋白酶-2的水平恢复了已有缺陷的小鼠的长期记忆(Zhao，2016)。
·胱天蛋白酶-2消耗保护蛋氨酸/胆碱缺乏(MCD)饮食诱导的脂肪性肝炎小鼠免受肝细胞凋亡和纤维化进展的影响(Machado，2015年)。
例如，WO 2005/105829和EP2670774已经报道了能够抑制胱天蛋白酶-2活性的化合物。然而，这些已知的胱天蛋白酶-2抑制剂对胱天蛋白酶-3也具有过高的活性。它们不能被称为选择性胱天蛋白酶-2抑制剂。最近，有报道称出现了一系列可逆的胱天蛋白酶-2抑制剂。在对人类重组胱天蛋白酶进行体外评估时，发现这些化合物优先抑制胱天蛋白酶-2，但在细胞检测中效果一般，而且其结构特性不适合在体内使用(Maillard，2011年)。WO2017/162674和WO2019/068538公开了含有五个氨基酸单位的多肽化合物作为胱天蛋白酶-2抑制剂。
Poreba等人(2019年)还披露了由L-立体化学中的五个氨基酸单元构成的胱天蛋白酶-2抑制剂。研究发现，化合物NH-23-C2(NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Ser-Asp)在所检测的化合物中具有最高的胱天蛋白酶-2抑制活性，但仍然对胱天蛋白酶-3没有选择性，对胱天蛋白酶-8的选择性有限。
因此，仍然需要有效和/或选择性胱天蛋白酶-2抑制剂，尤其是对胱天蛋白酶-3/胱天蛋白酶-8的活性显著降低的抑制剂。特别是，提供更具选择性和高效的胱天蛋白酶-2抑制剂，用于预防和/或治疗与胱天蛋白酶-2活性有关的疾病和/或损伤，如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝(NAFLD)、肥胖症、代谢综合征、肝硬化、新生儿脑缺血、心脏缺血和慢性退行性疾病(如阿尔茨海默病)，将是非常有利的。
提供更有效、更有选择性的胱天蛋白酶-2抑制剂，用作基于活性的探针来特异性检测胱天蛋白酶-2活性也是非常有利的。
本发明的化合物旨在满足这些需求。
附图说明
图1：针对胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8的P2基质筛选。x轴代表NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-P2-Asp-ACC中P2位的L-氨基酸的缩写名称，y轴代表特定活性或“活性位点滴定”胱天蛋白酶每10nM的基质水解率(RFU/s)。活性胱天蛋白酶的浓度是通过活性位点滴定确定的。
图2：计算NH-23-C2合成抑制剂对胱天蛋白酶-2的kobs/I抑制参数的原始数据。kobs/I参数是在伪一阶动力学条件下测量的([I]>>[E])。NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Ser-Asp-ACC作为基质。使用355nm(激发)和460nm(发射)波长监测ACC荧光。在至少三个独立实验中测定二阶抑制率(kobs/I)，并以平均值表示。使用GraphPadPrism 7软件进行计算。
图3：确定NH-23-C2抑制剂对胱天蛋白酶-2的Ki和IC50参数的原始数据。Ki参数使用莫里森方程(Copeland，2000年)进行测量。NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Ser-Asp-ACC用作胱天蛋白酶-2的ACC荧光基质。使用355nm(激发)和460nm(发射)波长监测ACC荧光。根据Morrison方程计算Ki参数，使用公式计算IC50参数：IC50＝Ki x(1+[S]/Km]，其中[S]是测定中使用的基质浓度，Km是基质的迈克尔-门顿常数。所有测量至少进行三次，并使用GraphPad Prism 7软件对数据进行分析。
图4：HepG2细胞中的脂质积累。以相对荧光法(Fluorescence493，BODIPY/Fluorescence 503，DAPI)测量细胞内脂质积聚。结果以平均值±SEM表示(n＝10)。对照组***p<0,05,***p<0,001vs NASH。
图5：HepG2细胞中的脂质积累。NH-23-C2和化合物1的浓度分别为10、20和25mM。以相对荧光法(Fluorescence493，BODIPY/Fluorescence 503，DAPI)测量细胞内脂质积聚。结果以平均值±SEM表示(n＝10)。与对照组相比，与NASH相比，**p<0,05；***p<0,001。
图6：测试重组胱天蛋白酶-2对5种荧光基质的基质偏好，这些基质的通式为NH-Idc-hGlu-P3-Dab-Asp-ACC，其中P3为Thr(Bzl)、Glu(Chx)、Glu或Val。最佳基质的裂解率(以RFU/s表示，即每秒相对荧光单位)设定为100％，并相应地调整其他基质的裂解率。基质浓度为10μM，胱天蛋白酶2浓度为10nM。
图7：重组胱天蛋白酶-2对25种荧光基质的基质偏好测试，基质通式为NH-Idc-P4-P3-Dab-Asp-ACC，其中P4为Asp、hGlu、Ile、Leu或hLeu，P3为Thr(Bzl)、Glu(Chx)、Glu、Val或Abu。结果以柱状图(变体1)或堆映射(变体2)的形式显示。最佳基质的裂解率(以RFU/s表示，即每秒相对荧光单位)设定为100％，并相应地调整其他基质的裂解率。基质浓度为10μM，胱天蛋白酶2浓度为10nM。
图8：使用P3位天然氨基酸等摩尔混合物的五种组合荧光基质(NH-Idc-P4-Mix-Dab-Asp-ACC，左图)和P3位定义氨基酸的十种单个荧光基质，分析胱天蛋白酶-2在P4和P3位的亚位点合作性：谷氨酸-Glu(NH-Idc-P4-Glu-Dab-Asp-ACC，中)或谷氨酸环己酯-Glu(Chx)(NH-Idc-P4-Glu(Chx)-Dab-Asp-ACC，右)。每个系列中最佳基质的裂解率(以RFU/s表示，即每秒相对荧光单位)设定为100％，并相应地调整该系列中其他基质的裂解率。单个基质的浓度为10μM，组合基质的浓度为100μM。胱天蛋白酶2的浓度为10nM。
发明内容
在本发明中，下列术语的含义详述如下：
术语“C1-6烷基”是指由碳原子和氢原子组成的线性或支链烃基，不含不饱和碳原子，具有1至6个碳原子，优选1至3个碳原子(“C1-3烷基”)，更优选1或2个碳原子(“C1-2烷基”)，并通过单键与分子的其余部分相连，例如，非限制性地包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基等。优选地，“烷基”是指甲基或乙基。
术语“C3-7环烷基”是指具有3至7个，优选3至6个碳原子的饱和或部分饱和的单环或双环脂肪族基团，其通过单键与分子的其余部分结合，例如，非限制性地包括环丙基、环己基或环戊基。
术语“C6-10芳基”是指具有6至10个，优选6或10个碳原子碳原子的芳香基团，包括1或2个芳香核，包括例如非限制性地苯基、萘基等。优选地，“芳基”指苯基。
术语“卤素”是指溴、氯、碘或氟。
术语“C1-C6卤代烷基”是指如上定义的烷基，其中至少一个氢原子已被卤素原子取代，例如CF3、CCl3、CHF2、CH2F、CF2CF3。
术语“C1-6烷氧基”是指式-O-C1-6烷基的基团，其中C1-6烷基是如上定义的烷基，优选C1-3烷基。C1-6烷氧基的例子包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基和仲丁氧基，优选甲氧基。
术语“(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基”是指如上定义的芳基，其通过如上定义的烷基连接到分子的其余部分。优选地，所述(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基是(C6)芳基(C1-C3)烷基，例如苄基。
“5-10元杂环基”指稳定的5-10元环基团，优选是5元或6元环，其由碳原子和1-5个杂原子组成，优选是1-4个，杂原子选自氮、氧和硫组成的组，并且基团可以部分饱和或完全饱和。就本发明而言，杂环可以是单环或双环系统。此类杂环的实例包括但不限于吡咯烷、哌啶、四氢吡啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、二氮杂环庚烷(diazepane)、四氢呋喃、四氢吡喃、八氢吡咯并吡嗪。
“5-10元杂芳基”是指稳定的5-10元芳香环基，优选是5或6元芳香环，由碳原子和1-5个杂原子组成，优选是1-4个，杂原子选自氮、氧和硫组成的组。就本发明而言，杂芳基可以是单环或双环系统。此类杂芳基的实例包括但不限于：噻吩、呋喃、吡咯、噻唑、噁唑、异噻唑、异噁唑、咪唑、吡唑、三唑噁二唑、噻二唑、四唑、氧化四唑、噁二唑酮、吡啶、嘧啶、二氢吲哚酮、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并呋喃、吲哚、嘌呤、喹啉。
正如本技术领域所理解的那样，在先前定义的基团可以有一定程度的取代。因此，本发明的任何基团都可以被取代。本文献中提及的本发明基团中的取代基团表示指定基团可以在一个或多个可用位置上被一个或多个取代基取代。所述取代基包括，例如且在非限制性意义上，卤素、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-10元杂环基、5-10元杂芳基、-CN、-NO2、-OR、-SR、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-C(O)NR2、-NR2和-SO2R；其中每个R独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-7环烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-10元杂环基和5-10元杂芳基。
本发明的化合物可以是盐、溶剂化物或立体异构体的形式，最好是药学上可接受的盐、溶剂化物或立体异构体。
如前所述，本发明还提供了本文所述化合物的“盐”。举例说明，所述盐可以是酸加成盐、碱加成盐或金属盐，并且可以通过本领域技术人员已知的常规化学工艺从含有碱性或酸性分子的母体化合物中合成。具体参见G.S.Paulekuhn等人，“Trends in ActivePharmaceutical Ingredient Salt Selection based onAnalysis ofthe Orange BookDatabase”，J.Med.Chem.，2007，50：6665-72，S.M.Berge等，“Pharmaceutical Salts”，JPharm Sci.，1977，66：1-19，以及Handbook ofPharmaceutical Salts，Properties，Selection，and Use，Stahl andWermuth，Eds.，Wiley-VCH andVHCA，Zurich，2002。此类盐通常是通过将上述化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的合适碱或酸在水中或有机溶剂中或两者的混合物中进行反应而制备的。非水性介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、丙酮、异丙醇或乙腈通常是优选的。酸加成盐的示例性实例包括无机酸加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、焦硫酸盐、二硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐等、有机酸加成盐，例如醋酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、铂磺酸盐、樟脑磺酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙二醇盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、琥珀酸酯、癸二酸盐、1,4-丁炔二酸酯、1,6-己炔二酸酯、苯甲酸酯、氯苯甲酸酯、甲氧基苯甲酸酯、苯丙酸盐、甲基苯甲酸酯、二硝基苯甲酸酯、羟基苯甲酸酯、邻苯二甲酸酯、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丁酸盐、乳酸盐、Y-羟基丁酸盐、乙二醇盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐等。碱加成盐的示例性实例包括无机碱盐，例如铵盐和有机碱盐，例如乙二胺、乙醇胺、N,N-二烷基乙醇胺、三乙醇胺、谷氨酰胺、氨基酸碱盐等。金属盐的示例包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铝盐和锂盐等。
根据本发明，术语“溶质”应理解为根据本发明的活性化合物通过非共价键连接到另一个分子(很可能是极性溶剂)的任何形式。溶质的例子包括水合物和醇化物。溶解方法在现有技术中是众所周知的。
如本文所用，术语“立体异构体”是指单个分子的所有异构体的总称，这些异构体仅在原子的空间取向上存在差异。因此，立体异构体化合物是互为不可叠加镜像的分子，包括对映体和非对映体。
术语“手性中心”指一个碳原子上连接有四个不同的基团。
术语“对映异构体”和“对映体形式”是指一种化合物的两种立体异构体之一，它们互为镜像，不可叠加。对映体化合物具有光学活性，其中一种对映体可使偏振光平面朝一个方向旋转，另一种对映体可使偏振光平面朝相反方向旋转，并在等量存在时形成外消旋化合物。
术语“外消旋体”或“外消旋物”指具有等量对映体的混合物，并且该混合物在光学上是无活性的。
术语“非对映体”和“非对异构体形式”指具有一个以上手性中心的化合物的立体异构体，它们彼此不是镜像。
如将要理解的，术语对映体富集或非对映体富集描述了两种对映体的混合物或非对映异构体的混合物，其中一种对映异构物或非对异构体的存在量高于另一种对映体或非对映异构体。
本发明的化合物具有手性中心，因此可以不同的立体异构体形式存在，如对映异构体或非对映异构体形式。因此，本文中提到的任何特定化合物都意在代表外消旋体、一种或多种对映异构体和一种或多种非对映异构体中的任何一种。本文提及的所有立体异构体(包括对映体和非对映异构体)及其混合物(包括外消旋混合物、对映体富集混合物和非对映异构体富集混合物)均属于本发明的范围。
术语“药学上可接受的”是指分子实体和组合物在生理上可耐受，在给人用药时通常不会引起过敏反应或类似的不良反应，如胃部不适、头晕等。优选地，如本说明书中所使用的，术语“药学上可接受”是指经政府监管机构批准或在美国药典或其他公认药典中列出的用于动物，尤其是用于人类的药物。
本文中使用的“荧光团”是指在光激发下能重新发光的分子或分子团。
本文所用术语“弹头”是指存在于本发明化合物上的部分，它能够与目标酶(胱天蛋白酶-2)的活性位点共价结合，从而达到不可逆的抑制效果。本领域的普通技术人员会认识到，某些活性官能团可以充当弹头。需要注意的是，“共价结合”并不等于“不可逆抑制”。例如，醛类共价但可逆地结合。甚至某些AOMK也可以作为可逆抑制剂：
1)Brady KD.Bimodal inhibition of caspase-1by aryloxymethyl andacyloxymethyl ketones.Biochemistry.1998；37:8508–15.
2)Brady KD,Giegel DA,Grinnell C,Lunney E,Talanian RV,Wong W,et al.Acatalytic mechanism for caspase-1and for bimodal inhibition of caspase-1byactivated aspartic ketones.Bioorg Med Chem.1999；7:621–31.
Poreba等.Caspase selective reagents for diagnosing apoptoticmechanisms,CDD 2019.
本发明的化合物
第一方面，本发明涉及一种式(I)化合物：
P5-P4-P3-AA-P1-R1
(I)
元素P5、P4、P3、AA、P1和R1中的每个元素在本发明中都有详细描述。需要指出的是，本发明包括上述式I中这六个元素(亚基)的任意组合，因为这些元素的定义贯穿于本说明书的始终。
值得注意的是，每个亚基P5至P1通过一个氨基酸亚基的a-氨基与相邻氨基酸a-羧基之间的共价肽键与其相邻亚基相连。在基质中，通过R1亚基的氨基与P1氨基酸的a-羧基之间的共价肽键与P1连接。在抑制剂中，P1通过P1氨基酸的a-羧基与R1分子之间的共价键连接，其中R1可以是大量的分子，如本说明书所述，例如酰氧基甲基酮(在AOMK中)或只是一个简单的氢原子(在醛中)。
1.AA
本发明任一式，特别是式I所表示的AA是一种碱性氨基酸，可任选与至少一个选自C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-10-元杂环基、5-10元杂芳基、-NO2、-C(O)R、-C(O)OR和-SO2R的基团进行N取代；其中R各自独立地选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-至10-元杂环基和5-至10-元杂芳基。
在一个优选的实施方案中，AA上的任选取代基选自卤素、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、-C(O)R和-C(O)OR；其中R各自独立地选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基(C1-6)烷基；例如卤素、甲基、环己基、苄基、-C(O)OMe、-C(O)OPh和-C(O)OBn或-C(O)OBzl。
本文所用术语“碱性氨基酸”是指天然存在或合成的氨基酸，其侧链在生理条件下能够接受质子并带正电。
根据本发明，碱性氨基酸的例子包括组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、精氨酸同源物、赖氨酸(Lys)、乙酰赖氨酸(Lys(Ac))、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、4-氨基环己基丙氨酸(Aca)、4-氨基苯丙氨酸(Apa)、氨甲基环己基丙氨酸(Ama)、4-氨基甲基苯丙氨酸(Amp)、4-胍基苯丙氨酸(Gpa)、4-胍基环己基丙氨酸(Gca)、瓜氨酸(Cit)、4-哌啶基丙氨酸(Pia)、3-(2-吡啶基)丙氨酸(2-Pal)、3-(3-吡啶基)丙氨酸(3-Pal)、3-(4-吡啶基)丙氨酸(4-Pal)，或其同系物和/或beta衍生物，其中如果存在酸性基团，则可被去质子化，成为带负电荷的实体。
尽管如此，AA也可以由脯氨酸衍生物形式的氨基酸表示，这些脯氨酸衍生物选自下列任何式子：
在本发明的某些方面，化合物中可能存在酸性或碱性残留物。本领域技术人员会明白，碱性残留物可能以非质子化形式或质子化形式存在，质子化形式带正电荷，酸性残留物可能以去质子化形式或非去质子化形式存在，去质子化形式带负电荷。
这里使用的术语“同源物”最好是指在侧链中添加或删除了亚甲基(-CH2-)的氨基酸。
β衍生物是指氨基与羧基的β碳而不是与羧基相邻的碳结合的氨基酸。
在一个优选的实施方案中，AA是指式(II)化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体：
其中，
n选自0、1、2、3、4、5和6，
m选自0、1、2和3，
p选自0和1，
X不存在或选自C3-7环烷基和C6-10芳基，
Y选自–NRaRb， 其中Ra、Rb和Rc独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基、5至10元杂芳基、-NO2、-C(O)R、-C(O)OR和-SO2R；其中R各自独立地选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基和5至10元杂芳基。
根据本发明的一个优选实施方案，p为0，AA为如下式所示基团：
其中n、m、X和Y如上文所定义。
根据本发明的一个实施方案，n选自1、2和3。
在一个优选的实施方案中，m+n为1、2、3、4、5或6；更优选为1、2、3、4和5。
优选地，X不存在或选自环己基和苯基。
根据另一个实施方案，AA是如下式所示基团：
其中，
n选自0、1、2、3、4、5和6，
p选自0和1，
Y选自–NRaRb， 其中Ra、Rb和Rc独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基、5至10元杂芳基、-NO2、-C(O)R、-C(O)OR和-SO2R；其中R各自独立地选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基和5至10元杂芳基。
根据本发明的一个实施方案，n选自1、2、3、4和5。
在一个优选的实施方案中，p为0。
根据本发明的一个实施方案，Ra、Rb和Rc独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、-C(O)R和-C(O)OR；其中R各自独立地选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基(C1-6)烷基。在一个特定的实施方案中，Ra、Rb和Rc独立选自H、甲基、环己基、苄基、-C(O)OMe、-C(O)OPh或-C(O)OBn。在另一个实施方案中，Ra、Rb和Rc均为H。
在一个实施方案中，AA是一种任选取代的氨基酸，选自组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、4-氨基环己基丙氨酸(Aca)、4-氨基苯丙氨酸(Apa)、氨甲基环己基丙氨酸(Ama)、4-氨基甲基苯丙氨酸(Amp)、4-胍基苯丙氨酸(Gpa)、4-胍基环己基丙氨酸(Gca)、瓜氨酸(Cit)、4-哌啶基丙氨酸(Pia)、3-(2-吡啶基)丙氨酸(2-Pal)、3-(3-吡啶基)丙氨酸(3-Pal)、3-(4-吡啶基)丙氨酸(4-Pal)或其同系物和/或beta衍生物。
还应注意的是，AA也可以是Ser，如下文“P5”部分所述。
在一个优选的实施方案中，AA是一种氨基酸，选自组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、4-氨基环己基丙氨酸(Aca)、4-氨基苯丙氨酸(Apa)、氨甲基环己基丙氨酸(Ama)、4-氨基甲基苯丙氨酸(Amp)、4-胍基苯丙氨酸(Gpa)、4-胍基环己基丙氨酸(Gca)、瓜氨酸(Cit)、4-哌啶基丙氨酸(Pia)、3-(2-吡啶基)丙氨酸(2-Pal)、3-(3-吡啶基)丙氨酸(3-Pal)、3-(4-吡啶基)丙氨酸(4-Pal)，或其同系物和/或beta衍生物，这些衍生物可以任选地被至少一个基团取代(例如N-取代)，该基团为选自卤素、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-至10元杂环烷基、5-至10元杂芳基、-CN、-NO2、-OR、-SR、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-C(O)NR2、-NR2和-SO2R；其中R各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-7环烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-10元杂环基和5-10元杂芳基。优选地，卤素、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、-C(O)R和-C(O)OR；其中R各自独立地选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基(C1-6)烷基。更优选卤素、甲基、环己基、苄基、-C(O)OMe、-C(O)OPh和-C(O)OBn。
AA可以被一个或多个如上定义的基团取代，优选被一个、两个或三个基团取代，更优选被一个或两个基团取代，甚至更优选被一个基团取代。
优选地，当AA被取代时，最好是被N取代。也就是说，在氨基酸侧链中存在的一个或多个氮原子上被取代。
在一个实施方案中，AA被至少一个选自C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-至10元杂环烷基、5-至10元杂芳基、-NO2、-C(O)R、-C(O)OR和-SO2R中的基团任选地N-取代；其中R各自独立地选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基和5至10元杂芳基。优选地，C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、-C(O)R和-C(O)OR；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基(C1-6)烷基。更优选为卤素、甲基、环己基、苄基、-C(O)OMe、-C(O)OPh和-C(O)OBn。
2.P5
P5在式I中优选为下式(III)的化合物：
其中A、B、C和D独立选自H、卤素、OR'、NHR'、C1-6烷基、C3-7环烷基、-OR'、-SR`、-OC(O)R'、-C(O)R'、-C(O)OR'和-C(O)NR'2，其中R'独立地选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基；A、B、C或D中的一个代表肽键形式的羧酰胺基，如式(I)所示，将P5连接到最终分子的其余部分(至P4位置)，以及
其中H、I、J和K独立地为碳原子或氮原子，优选为碳原子。
(在此也称为虚线)代表一种可能存在或不存在的键。当存在时，它与已存在的单键结合形成双键。需要注意的是，当双键与已存在的单键结合时，AA除了上文“AA”部分所述的其他选择外，还可以是Ser(丝氨酸)。
需要指出的是，P5的其他示例可衍生自下列Idc衍生物中的任意一种，这些Idc衍生物可从以下清单中选出：
/>
5，7-二氯-1H-吲哚-2-羧酸
这些衍生物与P4的结合是通过P5的每个衍生物中的羧酸与P4的a-胺基形成肽键来实现的。
3.P4
P4是式I内的具有下式(IV)的化合物：
其中a选自0、1、2、3、4、5和6，
Y和X独立选自H、氟、C1-6烷基、C3-7环烷基、-OR'、-SR`、-OC(O)R'、-C(O)R'、-C(O)OR'和-C(O)NR'2，其中R'各自独立地选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基，
R2和R3独立选自H、C1-3烷基和C3-7环烷基或-CO(OR9)、
W是S或不存在，在W不存在的情况下，-CH2(R2R3)基团直接与-CH2(XY)基团相连，
Z是NH或CH2，
b是0或1，
C是0或1，以及
R9是H、C1-6烷基或C3-7环烷基。R9也可以不存在，这样R2和R3就以CO(O-)的去质子化形式存在。
4.P1
P1是式I中的式(V)化合物：
其中a选自0、1、2、3、4、5和6，
X和Y独立选自H、氟C1-6烷基、C3-7环烷基、-OR'、-SR、-OC(O)R'、-C(O)R'、-C(O)OR'和-C(O)NR'2，其中R'各自独立地选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基，
b为0或1，以及
R2独立选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基。R2也可以不存在，这样-CO(OR2)就是去质子化形式的CO(O-)。
另一方面，在另一个实施方案中，我们在此进一步展示了Asp(天冬氨酸)掩蔽抑制剂的合成方案。
因此，P1也可以是式I中另一种式(V)的化合物，如下所示：
其中
X和Y独立选自H、氟、C1-6烷基、C3-7环烷基、-OR'、-SR、-OC(O)R'、-C(O)R'、-C(O)OR'和-C(O)NR'2，其中每个R'独立选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基，
b为0或1，以及
R*是选自氢、甲基或乙基的化学基团，构成酯酶的靶标，酯酶是一种水解酶，在与水的化学反应中将酯分成酸和醇，这种化学反应称为水解。值得注意的是，对于这种特定的替代物，不存在式(I)中所述的R1亚基，因为这种结构被R*所取代。
5.P3
P3选自谷氨酸环己酯、Glu(尤其是L-Glu)、Thr(Bzl)(苏氨酸苄基醚)或Glu类似物，如L-Glu(o-Me)、L-Glu(o-CHX)或L-Glu(o-Bzl)，或选自式(VI)化合物的衍生物：
其中R4至R6可独立选自H、氟、羟基(-OH)、-SH或C1-6烷基，优选甲基，而R7和R8可独立选自H、氟和甲基。
特别是，P3选自谷氨酸环己酯(Glu(Chx))、L-谷氨酸甲酯(Glu(me))、氨基丁酸(Abu)、Thr(Bzl)(苏氨酸苄基醚)或选自由：Ala(丙氨酸)、Arg(精氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Lys(赖氨酸)、Nle(诺亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Ser(丝氨酸)、Thr(苏氨酸)、Trp(色氨酸)、Tyr(酪氨酸)和Val(缬氨酸)组成的列表中的任意的天然氨基酸。
6.R1
R1最好是化学活性基团。如Gehringer等人(J.Med.Chem.2019,62,(12)5673-5724)所述，在药物分子中加入化学反应基团能够赋予药物分子某些优势，特别是在酶抑制领域，基团可以在药物和酶之间形成共价键，从而增强抑制作用。R1可以是荧光团(用于基质)，也可以是弹头(用于抑制剂)。
值得注意的是，在下面举例说明的基质(如包含荧光团的基质)的情况下，R1通过R1亚基的氨基(或任何其他表示为W的基团)与P1氨基酸的a-羧基之间的共价肽键与P1亚基相连。优选地，R1是一个分子，如式ACC中的荧光团：
更具体地说，R1可以是一个分子，如荧光团(用于基质)，选自式中所示基团：
其中
W选自-NH-和-O-、
R10-R13独立选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基、芳基、杂芳基、CF3、-CH2COOH、-CH2CONHR14和CH2OR14，以及
R14选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基。
作为荧光团的R1分子可以选自以下清单中的任意一个：
其他可用作荧光团的潜在有用分子可从以下清单中选出：
或者
在本发明中，荧光团(或荧光色团，类似于发色团)是可以在光激发时重新发光的荧光化合物。荧光团或基质通常含有几个组合的芳香基团，或含有几个π键的平面分子或环状分子。荧光团主要用于在各种分析方法中对组织、细胞或材料进行染色，即荧光成像和光谱学。其中上式的W应表示-NH-，例如在ACC中。R1中的其他荧光团可以选自常见的荧光团，包括Indo-1,Ca饱和Indo-1 Ca2+Cascade Blue BSApH 7.0Cascade Blue LysoTrackerBlue Alexa 405LysoSensorBlue pH 5.0LysoSensorBlue DyLight 405DyLight 350BFP(蓝色荧光蛋白(Blue Fluorescent Protein))Alexa 3507-氨基-4-甲基香豆素(7-Amino-4-methylcoumarin)pH 7.0,氨基香豆素(AminoCoumarin)AMCA偶联物香豆素(AMCAconjugateCoumarin)7-羟基-4-甲基香豆素(7-Hydroxy-4-methylcoumarin)7-羟基-4甲基香豆素pH9.06,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素(6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)pH 9.0Hoechst 33342Pacific Blue Hoechst 33258Hoechst 33258-DNA太平洋蓝抗体偶联物(Pacific Blue antibody conjugate)pH 8.0PO-PRO-1PO-PRO-1-DNAPOPO-1 433nm POPO-1-DNA DAPI-DNA DAPI MarinaBlue SYTOX Blue-DNA CFP(青色荧光蛋白(Cyan Fluorescent Protein))eCFP(增强型青色荧光蛋白(Enhanced CyanFluorescent Protein))1-苯胺邻苯二甲酸-8-磺酸(1-Anilinonaphthalene-8-sulfonicacid)(1,8-ANS)Indo-1,Ca free 1,8-ANS(1-苯胺邻苯二甲酸-8-磺酸)BO-PRO-1-DNABOPRO-1 BOBO-1-DNA SYTO 45-DNA evoglow-Pp1 evoglow-Bs1 evoglow-Bs2 Auramine ODiO LysoSensor GreenpH 5.0Cy 2LysoSensor Green Fura-2,high Ca Fura-2 Ca2+sup>SYTO 13-DNA YO-PRO-1-DNA YOYO-1-DNA eGFP(增强型绿色荧光蛋白(Enhanced GreenFluorescentProtein))LysoTracker Green GFP(S65T)BODIPY FL,MeOHSapphireBODIPYFL conjugate MitoTracker Green MitoTracker Green FM Fluorescein 0.1MNaOH CalceinpH 9.0荧光素(Fluorescein)pH 9.0Calcein Fura-2,no Ca Fluo-4 FDADTAF荧光素(Fluorescein)荧光素抗体偶联物(Fluorescein antibody conjugate)pH8.0CFDA FITC Alexa Fluor 488hydrazide-waterDyLight 488 5-FAM pH 9.0FITC抗体偶联物pH 8.0Alexa488 Rhodamine 110Rhodamine 110pH 7.0吖啶橙(Acridine Orange)AlexaFluor488抗体偶联物pH 8.0BCECF pH 5.5PicoGreendsDNA定量试剂SYBR GreenIRhodaminen Green pH 7.0CyQUANT GR-DNANeuroTrace 500/525,绿色荧光Nissl stain-RNA DansylCadaverineRhodol Green抗体偶联物pH 8.0Fluoro-EmeralNisslFluorescein dextranpH 8.0Rhodamine Green5-(和-6)-羧基-2',7'二氯荧光素(5-(and-6)-Carboxy-2',7'dichlorofluorescein)pH 9.0DansylCadaverine,MeOH eYFP(增强型黄色荧光蛋白(EnhancedYellow Fluorescent Protein))Oregon Green 488Oregon Green488抗体偶联物pH 8.0Fluo-3 BCECF pH 9.0SBFI-Na+Indo-1,Ca saturated Indo-1 Ca2+Cascade Blue BSApH 7.0Cascade Blue LysoTrackerBlue Alexa405 LysoSensorBlue pH5.0LysoSensor Blue DyLight405 DyLight 350BFP(蓝色荧光蛋白(Blue FluorescentProtein))Alexa 3507-氨基-4-甲基香豆素(7-Amino-4-methylcoumarin)pH 7.0,氨基香豆素(AminoCoumarin)AMCA共轭香豆素(conjugateCoumarin)
7-羟基-4-甲基香豆素(7-Hydroxy-4-methylcoumarin)7-羟基-4-甲基香豆素pH9.0 6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素(6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)pH9.0Hoechst 33342Pacific Blue Hoechst 33258Hoechst 33258-DNA Pacific Blue抗体偶联物pH 8.0PO-PRO-1PO-PRO-1-DNA POPO-1 433nm POPO-1-DNADAPI-DNA DAPIMarinaBlue SYTOX Blue-DNA CFP(青色荧光蛋白)eCFP(增强型青色荧光蛋白)1-苯胺邻苯二甲酸-8-磺酸(1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid)(1,8-ANS)Indo-1,Ca free 1,8-ANS(1-苯胺邻苯二甲酸-8-磺酸)BO-PRO-1-DNA BOPRO-1 BOBO-1-DNA SYTO 45-DNAevoglow-Pp1 evoglow-Bs1 evoglow-Bs2 Auramine O DiO LysoSensor GreenpH 5.0Cy2LysoSensor GreenLysoSensorYellowpH 9.0Indo-1,Ca saturated Indo-1 Ca2+CascadeBlue BSApH 7.0Cascade Blue LysoTrackerBlue Alexa405 LysoSensorBlue pH5.0LysoSensor Blue DyLight405 DyLight 350BFP(蓝色荧光蛋白)Alexa 3507-氨基-4-甲基香豆素pH 7.0,氨基香豆素AMCA共轭香豆素7-羟基-4-甲基香豆素7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0 6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0Hoechst 33342Pacific Blue Hoechst33258Hoechst 33258-DNA Pacific Blue抗体偶联物pH 8.0PO-PRO-1PO-PRO-1-DNA POPO-1 433nm POPO-1-DNADAPI-DNA DAPI MarinaBlue SYTOX Blue-DNACFP(青色荧光蛋白)eCFP(增强型青色荧光蛋白)1-苯胺邻苯二甲酸-8-磺酸(1,8-ANS)Indo-1,Ca free 1,8-ANS(1-苯胺邻苯二甲酸-8-磺酸)BO-PRO-1-DNA BOPRO-1BOBO-1-DNA SYTO 45-DNAevoglow-Pp1 evoglow-Bs1 evoglow-Bs2 Auramine O DiO LysoSensor GreenpH 5.0Cy2LysoSensor Green。
另一方面，在抑制剂中，P1通过P1氨基酸的a-羧基和R1分子之间的共价键与R1相连，其中R1可以是许多分子，例如酰氧基甲基酮(acyloxymethyl ketone)(在AOMK中)或只是一个简单的氢原子(在醛类中)。
因此，在另一个实施方案中，R1可以是弹头，特别是，R1可以是选自以下基团的弹头(用于抑制剂)或其盐类、溶剂化物或立体异构体：
其中，
q为0、1、2、3、4或5，
Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN、-NO2和C1-6烷氧基，
Z2是卤素，和
Z3选自C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基(C1-6)烷基。
对本发明有用的弹头的具体例子可选自以下任意一种(以下所有化合物都直接与P1亚基的a-COOH基团结合)：
/>
/>
优选地，R1是式中的弹头：
其中，
q是0、1、2、3或4，以及
Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN和C1-6烷氧基。
在一个实施方案中，Z1独立选自卤素、甲基和-OMe；优选选自F、Cl和Me(甲基)。
另一个实施方案中，R1选自下式基团
其中，Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN和C1-6烷氧基；优选选自卤素、甲基和-OMe；更优选选自F、Cl和Me(甲基)。
在一个优选的实施方案中，R1具有式
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下面，我们将提及本发明中包含式(I)化合物或其盐类、溶剂化物或立体异构体的特定实施方案：
P5-P4-P3-AA-P1-R1
(I)
在一个优选的实施方案中，式(I)化合物的特征在于AA如上文所定义，优选AA是指式(II)化合物：
其中，
n选自0、1、2、3、4、5和6，
m选自0、1、2和3，
p选自0和1，
X不存在或选自C3-7环烷基和C6-10芳基，
Y选自-NRaRb， 其中Ra、Rb和Rc独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基、5至10元杂芳基、-NO2、-C(O)R、-C(O)OR和-SO2R；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基和5至10元杂芳基。
根据本发明的一个优选实施方案，p为0，并且AA为式所示基团：
其中n、m、X和Y如上文所定义。
根据本发明的一个实施方案，n选自1、2和3。
在一个优选的实施方案中，m+n为1、2、3、4、5或6；更优选为1、2、3、4和5。
优选地，X不存在或选自环己基和苯基。
根据另一个实施方案，AA为下式所示基团：
其中，
n选自0、1、2、3、4、5和6，
p选自0和1，
Y选自–NRaRb， 其中Ra、Rb和Rc独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基、5至10元杂芳基、-NO2、-C(O)R、-C(O)OR和-SO2R；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基和5至10元杂芳基。
根据本发明的一个实施方案，n选自1、2、3、4和5。
在一个优选的实施方案中，p为0。
根据本发明的一个实施方案，Ra、Rb和Rc独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、-C(O)R和-C(O)OR；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基(C1-6)烷基。在一个特定的实施方案中，Ra、Rb和Rc独立选自H、甲基、环己基、苄基、-C(O)OMe、-C(O)OPh或-C(O)OBn。在另一个实施方案中，Ra、Rb和Rc均为H。
在一个实施方案中，AA是一种任选取代的氨基酸，选自组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、精氨酸同源物、赖氨酸(Lys)、乙酰赖氨酸、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、4-氨基环己基丙氨酸(Aca)、4-氨基苯丙氨酸(Apa)、4-氨基甲基环己基丙氨酸(Ama)、4-氨基甲基苯丙氨酸(Amp)、4-胍基苯丙氨酸(Gpa)、4-胍基环己基丙氨酸(Gca)、瓜氨酸(Cit)、4-哌啶基丙氨酸(Pia)、3-(2-吡啶基)丙氨酸(2-Pal)、3-(3-吡啶基)丙氨酸(3-Pal)、3-(4-吡啶基)丙氨酸(4-Pal)或其同系物和/或beta衍生物。
更优选地，AA是选自组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、4-氨基环己基丙氨酸(Aca)、4-氨基苯丙氨酸(Apa)、氨甲基环己基丙氨酸(Ama)、4-氨基甲基苯丙氨酸(Amp)、4-胍基苯丙氨酸(Gpa)、4-胍基环己基丙氨酸(Gca)、瓜氨酸(Cit)、4-哌啶基丙氨酸(Pia)、3-(2-吡啶基)丙氨酸(2-Pal)、3-(3-吡啶基)丙氨酸(3-Pal)、3-(4-吡啶基)丙氨酸(4-Pal)，或其同源物和/或beta衍生物的氨基酸，其可任选地被选自卤素、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-至10元杂环烷基、5-至10元杂芳基、-CN、-NO2、-OR、-SR、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-C(O)NR2、-NR2和-SO2R；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-7环烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-10元杂环基和5-10元杂芳基。优选地，卤素、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、-C(O)R和-C(O)OR；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基(C1-6)烷基。更优选的是卤素、甲基、环己基、苄基、-C(O)OMe、-C(O)OPh和-C(O)Obn组成的组取代(例如N-取代)。
更优选的是，AA是选自赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)或二氨基丙酸(Dap)的氨基酸；
P5是式(III)的化合物：
其中A和B是氢原子，H、I、J和K是碳原子，以及
(在此也称为虚线)代表一种可能存在或不存在的键。当存在时，它与已存在的单键结合形成双键；
P4选自异亮氨酸、亮氨酸、高亮氨酸、Glu、hGlu(高谷氨酸)和Asp，在某些情况下，氨基酸的侧链中含有酸性基团，在这种情况下，这些氨基酸残基中的任意一个都可以是去质子化形式或质子化形式；
P1是Asp或天冬氨酸，其中该氨基酸残基可以是去质子化形式或质子化形式；
P3选自Thr(Bzl)(苏氨酸苄基醚)或选自式(VI)化合物的衍生物：
其中R4至R6可独立选自H、F或甲基，R7和R8可独立选自H、F和甲基。另外，P3也可以选自谷氨酸环己酯(Glu(Chx))、L-谷氨酸甲酯(Glu(me))、氨基丁酸(Abu)，或选自由：Ala(丙氨酸)、Arg(精氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Lys(赖氨酸)、Nle(诺亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Ser(丝氨酸)、Thr(苏氨酸)、Trp(色氨酸)、Tyr(酪氨酸)和Val(缬氨酸)组成的列表中的任意天然氨基酸；和
R1可以是一种弹头(用于抑制剂)，选自以下式所示基团或基团的盐类、溶剂化物或立体异构体：
其中
q为0、1、2、3、4或5、
Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN、-NO2和C1-6烷氧基，
Z2是卤素，和
Z3选自C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基(C1-6)烷基；
优选地，R1是式中的弹头：
其中
q是0、1、2、3或4，以及
Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN和C1-6烷氧基。
在一个实施方案中，Z1独立选自卤素、甲基和-OMe；优选选自F、Cl和Me。
在另一个实施方案中，R1选自下式所示基团：
其中Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN和C1-6烷氧基；优选选自卤素、甲基和-OMe；更优选选自F、Cl和Me。
在一个优选的实施方案中，R1的式子为(Me是甲基)。
更具体地说，R1可以是一个分子，如荧光团(用于基质)，选自下式所示基团：
其中
W选自-NH-和-O-，
R10-R13独立选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基、芳基、杂芳基、CF3、-CH2COOH、-CH2CONHR14和CH2OR14，以及
R14选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基。
在另一个优选的实施方案中，R1是ACC。
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■
在一个优选的实施方案中，式(I)的化合物是式VII所示的化合物或其盐类、溶剂化物或立体异构体：
其中
-n是1、2、3或4；
-A选自–NRaRb， 其中，Ra、Rb和Rc独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基、5至10元杂芳基、-NO2、-C(O)R、-C(O)OR和-SO2R；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-至10元杂环基和5-至10元杂芳基，优选A选自-COOH基团或-NH2基团；
P1、P3、P4、P5和R1如上述任一实施例中所定义，其中优选这些化合物各自的特征如下：
P5是式(III)所示的化合物：
其中，A和B是氢原子，H、I、J和K独立地是碳原子或氮原子，以及
(在这里也称为虚线)代表一种键，这种键可能存在也可能不存在，当存在时，它与已经存在的单键结合形成双键；
P4选自异亮氨酸、亮氨酸、高亮氨酸、hGlu(高谷氨酸)、Glu、去甲亮氨酸(Nle)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、去甲缬氨酸(Nva)、叔亮氨酸(Tle)、以及天冬氨酸或Asp，在某些情况下，氨基酸的侧链中含有酸性基团，在这种情况下，这些氨基酸残基可以是去质子化形式或质子化形式；
P1是Asp或天冬氨酸，其中该氨基酸残基可以是去质子化形式或质子化形式；
P3选自Thr(Bzl)(苏氨酸苄基醚)或选自式(VI)化合物的衍生物：
其中R4至R6可独立选自H、F或甲基，R7和R8独立选自H、F和甲基。或者，P3选自谷氨酸环己酯(Glu(Chx))、L-谷氨酸甲酯(Glu(me))、氨基丁酸(Abu)或选自由：Ala(丙氨酸)、Arg(精氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Lys(赖氨酸)、Nle(诺亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Ser(丝氨酸)、Thr(苏氨酸)、Trp(色氨酸)、Tyr(酪氨酸)和Val(缬氨酸)组成的列表中的任意天然氨基酸；以及
R1可以是一种弹头(用于抑制剂)，选自以下基团或其盐类、溶剂化物或立体异构体：
其中
q为0、1、2、3、4或5、
Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN、-NO2和C1-6烷氧基，
Z2是卤素，和
Z3选自C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基(C1-6)烷基。
优选地，R1是式中的弹头：
其中
q是0、1、2、3或4，以及
Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN和C1-6烷氧基。
在一个实施方案中，Z1独立选自卤素、甲基和-OMe；优选选自F、Cl和Me。
在另一个实施方案中，R1选自下式基团
其中Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN和C1-6烷氧基；优选选自卤素、甲基和-OMe；更优选选自F、Cl和Me。
在一个优选的实施方案中，R1具有或由式组成。
更具体地说，R1可以是一个分子，如荧光团(用于基质)，选自下式基团：
其中
W选自-NH-和-O-，
R10-R13独立选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基、芳基、杂芳基、CF3、-CH2COOH、-CH2CONHR14和CH2OR14，以及
R14选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基。
在另一个优选的实施方案中，R1是ACC。
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在一个优选的实施方案中，式(I)的化合物是式VII所示的化合物或其盐类、溶剂化物或立体异构体：
其中
-n是2、3或4；
-A是如上定义的-NRaRb基团，优选是胺基；
P5是式(III)的化合物：
其中，A和B是氢原子，H、I、J和K独立地为碳原子，以及代表一种键，这种键可能存在，也可能不存在，当存在时，它与已存在的单键结合形成双键；
P4选自异亮氨酸、亮氨酸、高亮氨酸、hGlu(高谷氨酸)、Glu和Asp或天冬氨酸，在某些情况下，氨基酸的侧链中含有酸性基团，在这种情况下，这些氨基酸残基中的任意一个都可以是去质子化形式或质子化形式；
P1是Asp或天冬氨酸，其中该氨基酸残基可以是质子化或去质子化形式；
P3选自Thr(Bzl)(苏氨酸苄基醚)或选自式(VI)化合物的衍生物：
其中，R4至R6可独立选自H、F或甲基，R7和R8独立选自H、F和甲基。或者，P3选自谷氨酸环己酯(Glu(Chx))、L-谷氨酸甲酯(Glu(me))、氨基丁酸(Abu)或选自由：Ala(丙氨酸)、Arg(精氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Lys(赖氨酸)、Nle(诺亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Ser(丝氨酸)、Thr(苏氨酸)、Trp(色氨酸)、Tyr(酪氨酸)和Val(缬氨酸)组成的列表中的任意天然氨基酸；以及
R1选自如下式所示基团：
其中，Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN和C1-6烷氧基；优选选自卤素、甲基和-OMe；更优选选自F、Cl和Me。
在一个实施方案中，R1具有式或ACC。
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在一个优选的实施方案中，式(I)的化合物是如式VIII的化合物或其盐类、溶剂化物或立体异构体：
其中
R2和R3独立地为H、C1-6烷基或C3-7环烷基，其中R2和/或R3也可以不存在，从而形成去质子化形式CO(O-)；
(虚线)代表一个可能存在也可能不存在的键，当存在时，它与已经存在的单键结合形成双键；
其中AA是如上定义的任选N-取代的碱性氨基酸，特别是AA指式(II)化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体：
其中
n选自0、1、2、3、4、5和6，
m选自0、1、2和3，
p选自0和1，
X不存在或选自C3-7环烷基和C6-10芳基，
Y选自–NRaRb， 其中，Ra、Rb和Rc独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基、5至10元杂芳基、-NO2、-C(O)R、-C(O)OR和-SO2R；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基和5至10元杂芳基。
根据本发明的一个优选实施方案，p为0，AA为下式所示基团：
其中n、m、X和Y如上文所定义。
根据本发明的一个实施方案，n选自1、2和3。
在一个优选的实施方案中，m+n为1、2、3、4、5或6；更优选为1、2、3、4和5。
优选地，X不存在或选自环己基和苯基。
根据另一个实施方案，AA是下式所示基团：
其中
n选自0、1、2、3、4、5和6，
p选自0和1，
Y选自–NRaRb， 其中Ra、Rb和Rc独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基、5至10元杂芳基、-NO2、-C(O)R、-C(O)OR和-SO2R；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基和5至10元杂芳基。
根据本发明的一个实施方案，n选自1、2、3、4和5。
在一个优选的实施方案中，p为0。
根据本发明的一个实施方案，Ra、Rb和Rc独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、-C(O)R和-C(O)OR；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基(C1-6)烷基。在一个特定的实施方案中，Ra、Rb和Rc独立选自H、甲基、环己基、苄基、-C(O)OMe、-C(O)OPh或-C(O)OBn。在另一个实施方案中，Ra、Rb和Rc均为H。
在一个实施方案中，AA是选自组氨酸(His)、精氨酸同源物、赖氨酸(Lys)、乙酰赖氨酸、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)、二氨丙酸(Dap)、4-氨基环己基丙氨酸(Aca)、4-氨基-苯丙氨酸(Apa)、氨基甲基环己基丙氨酸(Ama)、4-氨基甲基苯丙氨酸(Amp)，4-胍基苯丙氨酸(Gpa)，4-胍-环己基丙氨酸(Gca)、瓜氨酸(Cit)、4-哌啶基丙氨酸(Pia)、3-(2-吡啶基)丙氨酸(2-Pal)、3-(3-吡啶基)丙氨酸(3-Pal)、3-(4-吡啶基)丙氨酸(4-Pal)或其同系物和/或beta衍生物。
更优选地，AA是选自组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、4-氨基环己基丙氨酸(Aca)、4-氨基苯丙氨酸(Apa)、氨甲基环己基丙氨酸(Ama)、4-氨基甲基苯丙氨酸(Amp)、4-胍基苯丙氨酸(Gpa)、4-胍基环己基丙氨酸(Gca)、瓜氨酸(Cit)、4-哌啶基丙氨酸(Pia)、3-(2-吡啶基)丙氨酸(2-Pal)、3-(3-吡啶基)丙氨酸(3-Pal)、3-(4-吡啶基)丙氨酸(4-Pal)，或其同系物和/或beta衍生物中的氨基酸，这些氨基酸可以任选地被至少一个选自卤素、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-至10元杂环烷基、5-至10元杂芳基、-CN、-NO2、-OR、-SR、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-C(O)NR2、-NR2和-SO2R的基团取代(例如g.N-取代)；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-7环烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-10元杂环基和5-10元杂芳基。优选地，卤素、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、-C(O)R和-C(O)OR；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基(C1-6)烷基。更优选的是卤素、甲基、环己基、苄基、-C(O)OMe、-C(O)OPh和-C(O)Obn。
更优选地，AA是选自赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)或二氨基丙酸(Dap)的氨基酸；
R1可以是弹头(用于抑制剂)，其选自如下基团或其盐类、溶剂化物或立体异构体：
其中
q为0、1、2、3、4或5，
Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN、-NO2和C1-6烷氧基，
Z2是卤素，以及
Z3选自C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基(C1-6)烷基；
优选地，R1是式中的弹头：
其中
q是0、1、2、3或4，以及
Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN和C1-6烷氧基。
在一个实施方案中，Z1独立选自卤素、甲基和-OMe；优选选自F、Cl和Me。
在另一个实施方案中，R1选自下式基团：
其中，Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN和C1-6烷氧基；优选选自卤素、甲基和-OMe；更优选选自F、Cl和Me。
在一个优选的实施方案中，R1具有式
在另一个实施方案中，R1可以是选自下式基团的基质分子：
其中
W选自-NH-和-O-，
R10-R13独立选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基、芳基、杂芳基、CF3、-CH2COOH、-CH2CONHR14和CH2OR14，以及
R14选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基。
在另一个优选的实施方案中，R1是ACC。
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在一个优选的实施方案中，式(I)的化合物是式IX所示化合物或其盐类、溶剂化物或立体异构体：
其中
R2和R3独立地为H、C1-6烷基或C3-7环烷基，其中R2和R3也可以不存在，以实现去质子化形式CO(O-)，
代表一种可能存在也可能不存在的键，当存在时，它与已存在的单键结合形成双键，
其中
R1如上述任意一个实施例中所定义，R1优选选自下式基团：
其中Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN和C1-6烷氧基；优选选自卤素、甲基和-OMe；更优选选自F、Cl和Me。
在一个优选的实施方案中，R1具有式或ACC。
-n是1、2、3或4；以及
-A选自–NRaRb，-COORa， 其中，Ra、Rb和Rc独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5至10元杂环基、5至10元杂芳基、-NO2、-C(O)R、-C(O)OR和-SO2R；其中每个R独立选自H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6卤代烷基、C6-10芳基、(C6-10)芳基(C1-6)烷基、5-至10元杂环基和5-至10元杂芳基，优选A选自-COOH基团或-NH2基团。
在一个优选的实施方案中，式(I)的化合物是式IX所示的化合物或其盐类、溶剂化物或立体异构体：
其中
R2和R3独立地为H、C1-6烷基或C3-7环烷基，其中R2和R3也可以不存在，从而形成去质子化形式CO(O-)、
(虚线)代表一种可能存在也可能不存在的键，当存在时，它与已存在的单键结合形成双键；以及
其中
-n是2、3或4；以及
-A选自-COOH基团或-NRaRb基团，优选为胺基，R1如上文所定义，最好R1具有式或ACC。
值得注意的是，上述式IX涵盖了所有可能的形式(例如，一种酸去质子化，两种酸一起去质子化，胺同时处于这两种状态)。也就是说，式IX涵盖了所有的盐和溶剂化物。其中一种形式的非限制性实例是：
在一个特定的实施方案中，式(I)化合物选自以下化合物(质子化或去质子化)或其盐、溶剂化物或立体异构体：
/>
其中R1在本说明书中均有定义，优选地R1选自/>
需要注意的是，上述6种结构涵盖了所有可能的形式(例如，一种酸去质子化、两种酸一起去质子化以及胺在这两种状态下)，位置P5可以如图所示存在，也可以是氧化衍生物，如下式III所示，其中存在一个额外的双键：
其中A和B为氢原子，H、I、J和K分别为碳原子，(虚线)表示可能存在(如氧化衍生物)或不存在的键。
在一个特定的实施方案中，式(I)化合物选自以下化合物(质子化或去质子化)或其盐、溶剂化物或立体异构体：
/>
其中，上述三种结构中的R1优选是(也称为AOMK，酰氧基甲基酮)。
需要注意的是，上述3种结构涵盖了所有可能的形式(例如，一种酸去质子化，两种酸一起去质子化，胺同时处于两种状态)，根据以下结构，位置P5可能是氧化衍生物，也可能不是：
其中，A和B是氢原子，H、I、J和K分别是碳原子，以及(虚线)代表可能存在(氧化衍生物)或不存在的键。
在另一个优选的实施方案中，式(I)化合物选自以下化合物(质子化或去质子化)或其盐、溶剂化物或立体异构体：
a.NH-Idc-hGlu-Glu(Chx)-P2-Asp-R1；
b.NH-Idc-hGlu-Glu-P2-Asp-R1；
c.NH-Idc-hGlu-Glu(me)-P2-Asp-R1；和/或
d.NH-Idc-hGlu-Val-P2-Asp-R1。
其中，P2选自赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)或二氨基丙酸(Dap)，优选地，R1是(也称为AOMK，酰氧基甲基酮)。
在另一个优选的实施方案中，式(I)化合物是式NH-Idc-hGlu-Mix-P2-Asp-R1(质子化或去质子化)的化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体，其中P2选自赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)或二氨基丙酸(Dap)、其中，Mix是选自由Ala(丙氨酸)、Arg(精氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Asp(天冬氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Lys(赖氨酸)、Nle(诺亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Ser(丝氨酸)、Thr(苏氨酸)、Trp(色氨酸)、Tyr(酪氨酸)和Val(缬氨酸)组成的列表中的任意天然氨基酸；其中，R1优选是(也称为AOMK，酰氧基甲基酮)。
药物成分
本发明中R1为弹头(如AOMK)的上述任一式化合物是胱天蛋白酶-2的不可逆抑制剂，因此可用于预防或治疗由该酶介导的紊乱或疾病。
因此，在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，该组合物包含本文定义的上式中任意一种化合物(其中R1是弹头如AOMK)或其盐、溶剂化物或立体异构体，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
术语“赋形剂”是指与活性成分一起使用的载体、稀释剂或佐剂。此类药用赋形剂可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或生理盐水水溶液、葡萄糖水溶液和甘油水溶液，尤其是注射用溶液，最好用作载体。E.W.Martin所著的《Remington's Pharmaceutical Sciences》2005年第21版或Rowe C.R.；Paul J.S.；Marian E.Q.的《Handbook ofPharmaceutical Excipients》2009年第6版中介绍了合适的药用载体。
制造本发明药物组合物所需给药形式所需的赋形剂和辅助物质，除其他因素外，取决于所选的给药形式。所述药物组合物的给药形式将根据本领域技术人员已知的常规方法制造。
药物组合物的例子包括任何用于口服、局部或非肠道给药的固体(片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂等)或液体(溶液剂、悬浮剂或乳剂)组合物。
在一个实施方案中，药物组合物采用口服给药形式。适合口服的剂型可以是片剂和胶囊剂，可以含有本领域已知的常规赋形剂，如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯伽马、明胶、山梨糖醇、吐根苋或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；制备片剂的润滑剂，例如硬脂酸镁；崩解剂，如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉乙醇酸钠或微晶纤维素；或药学上可接受的润湿剂，如十二烷基硫酸钠。固体口服组合物可以通过常规的混合、灌装或压片方法制备。这些操作都是本领域的常规操作。片剂可以通过干法或湿法制粒等方法制备，也可以根据常规制药方法进行包衣，特别是肠溶包衣。
药物组合物也可用于肠外给药，如无菌溶液、悬浮液或冻干产品的适当单位剂型。可使用合适的赋形剂，如膨松剂、缓冲剂或表面活性剂。
上述制剂可采用标准方法制备，如欧洲和美国药典及类似参考文献中描述或提及的方法。
本发明的化合物或组合物可以通过任何合适的方法给药，如口服、舌下含服、鼻内注射、眼内注射、肠外注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射或透皮给药。
一般来说，本发明化合物的有效用量取决于所选化合物的相对疗效、治疗和/或预防疾病的严重程度以及患者的体重。活性化合物可以每天给药1次或多次，例如每天1、2、3或4次，典型的日总剂量范围为约0.01毫克/千克体重/天至约1000毫克/千克体重/天。在另一个实施方案中，本发明化合物的有效剂量为约500毫克/千克体重/天或更少。在另一个实施方案中，本发明化合物的有效剂量为约100毫克/公斤体重/天或更少。在另一个实施方案中，本发明化合物的有效剂量范围为约0.01毫克/千克体重/天至约100毫克/千克体重/天；在另一个实施方案中，约0.02毫克/千克体重/天至约50毫克/千克体重/天；在另一个实施方案中，约0.025毫克/千克体重/天至约20毫克/千克体重/天。
本发明化合物的用途
本发明的化合物(其中R1是包含荧光团分子的基团)可用作基于活性的探针，以确定胱天蛋白酶-2的活性。
因此，在另一方面，本发明是指体外使用本文定义的本发明化合物(其中R1是包含荧光基的基团)或其盐、溶剂化物或立体异构体来测定胱天蛋白酶-2活性。
在一个特定的实施方案中，细胞或组织中的胱天蛋白酶-2活性可通过将本文所定义的化合物(其中R1是包含荧光基分子的基团，或其盐、溶剂化物或立体异构体)与包含所述细胞或组织的样品接触并测量光激发时发射的荧光信号来确定。
R1为弹头(如AOMK)的本发明上述任何式子的化合物包含能与目标酶(胱天蛋白酶-2)的活性位点反应的基团，从而提供不可逆的抑制作用。因此，其中R1为基团的本发明化合物可用于预防或治疗涉及胱天蛋白酶-2活性的疾病或紊乱。
因此，在另一方面，本发明涉及一种其中R1为AOMK等弹头的本发明化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体，可用作药物。
在另一方面，本发明涉及一种R1为弹头(如AOMK)的本发明的化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体，用于预防和/或治疗与胱天蛋白酶-2活化增加有关的疾病或紊乱，该疾病或紊乱选自退行性疾病，如阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、轻度认知障碍、肌萎缩侧索硬化症和克雅氏病、肾上腺白质营养不良症；新生儿脑损伤，尤其是新生儿脑缺血；创伤性脑损伤；肾缺血；缺氧缺血损伤；中风样脑损伤；心脏缺血；心肌梗塞；肌萎缩性脊髓侧索硬化症；视网膜损伤；眼科疾病，如老年黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜色素变性、钝性眼损伤、缺血性视神经病变和青光眼；预防细胞毒性，特别是化学物质、辐射和声波创伤等物理因素引起的细胞毒性；皮肤损伤；无菌性炎症，如糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、假性痛风、关节松动、动脉粥样硬化、铝盐引发的综合征、非动脉缺血性视神经病变、青光眼和代谢性疾病；非无菌炎症性疾病，如细菌感染，特别是产生孔形成毒素的细菌感染、流感病毒感染和单链RNA弹状病毒科(Rhabdoviridae)感染，如马拉巴病毒或水泡性口炎病毒；由布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等致病菌引起的疾病；血脂异常；肥胖；代谢综合征；非酒精性脂肪肝，如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝(NAFLD)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种本发明的化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体，其中R1是一种弹头，如AOMK，用于预防和/或治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)。
在本说明书中，术语“疗法(treatment)”或“治疗(to treat)”是指施用根据本发明的化合物或组合物，以改善或消除疾病或与所述疾病相关的一种或多种症状。“疗法(treatment)”还包括改善或消除疾病的生理后遗症。
在本发明中，术语“改善”被理解为对接受治疗的患者状况的任何改善。
在本说明书中，术语“预防”或“防止”是指施用根据本发明的化合物或组合物，以降低获得或发展疾病或与所述疾病相关的一种或多种症状的风险。
在一个实施方案中，本文所述的任何方法或用途可进一步包括向患者施用至少一种其他治疗剂。
下文将通过举例对本发明进行补充说明。这种解释绝不能被解释为对权利要求书中所定义的本发明范围的限制。
具体实施方式
生物检测
实施例1.基质酶动力学研究
材料和方法
试剂
Fmoc保护氨基酸购自Iris Biotech GmbH(Marktredwitz，德国)、Sigma-Aldrich(Poznan，波兰)、Bachem(Torrance，CA，USA)、Creosalus(Louisville，KY，USA)、PEBiosciences Limited(中国香港)和Combi-Blocks(San Diego，USA)。Fmoc-ACC荧光染料是根据Maly等人之前发表的程序合成的。RinkAmide AM树脂(200-300目，负载量0.48mmol/g)，(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟脲(HBTU)，1-[双(二甲基-乙氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐(HATU)、哌啶(PIP)、二异丙基碳二亚胺(DICI)，和三氟乙酸(TFA)购自Iris Biotech GmbH。无水HOBt购自Creosalus。2,4,6-三甲基吡啶(2,4,6-collidine)、乙腈(ACN，HPLC梯度级)、三异丙基硅烷(TIPS)购自Sigma-Aldrich。N,N′-二甲基甲酰胺(DMF，分析纯)、甲醇(MeOH)、二氯甲烷(DCM)、乙酸(AcOH)、二乙醚(Et2O)和五氧化二磷(P2O5)购自POCh公司(Gliwice，波兰)。所有ACC标记的荧光基质均在Waters系统(Waters M600溶剂输送模块和Waters M2489检测器系统)上使用半制备型C8色谱柱(粒径10μm)进行反相高效液相色谱纯化。用于基质纯化和LC-MS分析的溶剂组成如下：相A(水/0.1％TFA)，相B(ACN/0.1％TFA)。纯化时，在线性梯度(从95％的相A到5％的相A)中运行测定30分钟。纯度和分子质量[m/z+H]+由Waters LC-MS仪器测定，使用的是分析型/>C8色谱柱(粒径10μm)。从95％的相A到5％的相A进行20分钟的LC-MS测定。所有化合物的纯度至少为95％。
基质的合成
根据前面描述的一般方法，在固体载体上合成通式为NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-P2-Asp-ACC的基质。除非另有说明，所有氨基酸均为L构型。
对于所有合成的基质，将约10g(1当量，4.8mmol)Fmoc保护的林克酰胺树脂(0.48mol/g)放入250mL玻璃筒中进行固相合成，并在DCM中溶胀30分钟。然后将DCM沥干，并用DMF将树脂洗涤三次。然后，在三个循环(5分钟、5分钟和25分钟)中，使用DMF中的20％哌啶去除Fmoc-保护基，并用DMF洗涤树脂六次。用2.5当量的HOBt(12mmol，1.8g)和2.5当量的DICI(12mmol，1.6mL)在极少量的DMF中预活化约2.5当量的Fmoc-ACC-OH(12mmol，5.3g)3分钟，并倒入树脂上。轻轻搅拌筒滤筒30分钟，当混合物变得过于浓稠时，加入更多的DMF。反应进行24小时，然后过滤并用DMF冲洗树脂三次。使用1.5当量的上述试剂重复Fmoc-ACC-OH偶联以提高偶联产率。24小时后，用DMF冲洗树脂三次，并进行茚三酮测试以确认Fmoc-ACC-OH偶联完全。然后用20％的哌啶在DMF中去除ACC上的Fmoc基团，再用DMF冲洗树脂六次。接着，将2.5当量的Fmoc-Asp(tBu)-OH(12mmol，5.3g)与2.5当量的HATU(12mmol，4.6g)和2.5当量的2,4,6-甲苯胺(12mmol，1.6mL)在DMF中预孵育3分钟，然后倒入H2N-ACC树脂上。反应进行了24小时，然后使用1.5当量的Fmoc-Asp(tBu)-OH/HATU/2,4,6-三甲基吡啶试剂再重复进行24小时。然后用DMF洗涤三次Fmoc-Asp(tBu)-ACC-树脂，再用20％的哌啶在DMF中进行Fmoc脱保护，用DMF洗六次树脂，用DCM洗三次树脂，用MeOH洗三次树脂，然后在干燥器中用P2O5干燥过夜。将得到的树脂(约12g)分成100mg每份，并用于合成单个胱天蛋白酶-2基质。
P2基质合成
使用MultiChem 48孔合成仪(SciGene公司的FlexChem，CA，USA)合成了通式为NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-P2-Asp-ACC的ACC标记荧光基质。对于每种基质，将每种100mg、0.05mmol的NH2-Asp(tBu)-ACC-树脂分别放入多滤筒的不同孔中，然后加入DCM使树脂溶胀。然后过滤掉DCM，并用DMF将树脂洗涤三次。在30个1.5mL试管中，将含有3当量的各种氨基酸(0.15mmol)与1mL含有3当量的HATU(0.15mmol，60mg)和3当量的2,4,6-三甲基吡啶(0.15mmol，20mL)的DMF混合，然后倒入树脂上。P2偶联反应进行了3小时，然后进行茚三酮测试。然后用20％的哌啶在DMF中去除每个基质上的Fmoc基团，并用DMF将每个孔中的树脂洗涤六次。接着，将3当量的(x30)的Fmoc-Thr(Bzl)-OH(4.5mmol，1.95g)与3当量的(x30)的HATU(4.5mmol，1.72g)和2,4,6-三甲基吡啶(4.5mmol，600uL)在极少量的DMF中预孵育1分钟，然后倒在树脂上。进行P3偶联反应3小时，然后进行茚三酮测试。然后用20％的哌啶在DMF中去除每个基质上的Fmoc基团，并用DMF将每个孔中的树脂洗涤六次。接着，将3当量的(x30)的Fmoc-hGlu(tBu)-OH(4.5mmol，2.0g)与3当量的(x30)的HATU(4.5毫摩尔，1.72克)和2,4,6-甲苯胺(4.5mmol，600mL)在极少量的DMF中预孵育1分钟，然后倒在树脂上。进行P4偶联反应3小时，然后进行茚三酮测试。然后用20％的哌啶在DMF中去除每个基质上的Fmoc基团，并用DMF将每个孔中的树脂洗涤六次。接着，将3当量的(x30)的Fmoc-Idc-OH(4.5mmol，1.75g)与3当量的(x30)的HATU(4.5mmol，1.72g)和2,4,6-三甲基吡啶(4.5mmol，600mL)在极少量的DMF中预孵育1分钟，然后倒在树脂上。进行P5偶联反应3小时，然后进行茚三酮测试。然后用20％的哌啶在DMF中去除每种基质上的Fmoc基团，并且用DMF洗涤每个孔中的树脂六次，用DCM洗涤三次，用MeOH洗涤三次，然后在干燥器中用P2O5干燥过夜。使用冰冷的TFA/TPS/水(％v/v/v，95/2.5/2.5)混合物裂解树脂中的所有基质，时间为2小时(每15分钟振荡一次)。分别收集各孔的溶液，并用TFA洗涤剩余的树脂。然后用冰冷的Et2O沉淀基质30分钟并离心。然后弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于冰冷的Et2O中并再次离心。然后弃去上清液，使沉淀干燥，将粗产物溶解在1mLDMSO中，并在HPLC上纯化。收集纯基质，在-80℃下冷冻并冻干。然后将最终产物(白色粉末)溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，使其达到20mM的最终浓度，并保存在-80℃温度下，直至使用。
重组胱天蛋白酶(caspases)的制备
人凋亡胱天蛋白酶表达和纯化的详细方案见其他文献(Stennicke，1999年)。
酶动力学研究
使用fMax光谱荧光仪(Molecular Devices,Sunnyvale，CA，USA)以荧光动力学模式在96孔康宁(Corning)(康宁，NY，USA)板中对胱天蛋白酶-2、-3和-8的P2基质进行筛选。使用355nm(激发)和460nm(发射)波长监测ACC荧光。在进行动力学分析之前，使用zVAD-fmk抑制剂(Cayman化学公司，订货号14467)对所有的胱天蛋白酶进行活性位点滴定。胱天蛋白酶分析缓冲液为10％w/v蔗糖、1M柠檬酸钠、20m皮普斯(Pipes)、10mM NaCl、1mM EDTA和10mM DTT(pH＝7.3)。缓冲液在室温下配制，所有动力学测定均在37℃下进行。在进行任何活性测定之前，所有酶都要预培养15分钟。筛选的基质浓度为10mM，胱天蛋白酶浓度如下：胱天蛋白酶-25nM、胱天蛋白酶-315nM、胱天蛋白酶-840nM。单孔总容量为100毫升。总测定时间为30分钟，但只取荧光进展曲线的线性部分进行分析。动力学数据使用Graph PadPrism软件进行分析。数据表示为每10nM胱天蛋白酶的荧光释放/产生速率(RFU/s，相对荧光单位/秒)。
结论
我们的目标是通过重新研究胱天蛋白酶-2在P2(在本发明中也称为AA)位置的催化偏好，开发出高度特异性和选择性的胱天蛋白酶-2基质。根据公认的观点，“特异性”意味着高动力学参数(例如基质的高kcat/KM，或抑制剂的高kobs/I)，“选择性”意味着某些试剂(基质/抑制剂)只针对一种酶。本发明这一部分的主要目的是合成一系列五肽荧光基质并对其进行生物化学评估，这些基质是基于NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Ser-Asp-ACC(WRMP23)式设计的，其先前被发表为最具选择性的胱天蛋白酶-2基质(Poreba等人，Cell Death&Differentiation 2019,26,2695-2709)。根据上述式WRMP23，设计了以下支架(见下文支架1)，其形成了新开发的本发明的高特异性和选择性胱天蛋白酶-2基质和抑制剂的基础：
支架1。NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-AA-Asp-R1。R1：-ACC(基质)或-AOMK(抑制剂)。R3:H.R2:HAA：P2。
本文的结果以基质水解速率表示，表示为RFU/s，其中RFU为每10nM胱天蛋白酶的相对荧光单位(见图1和表1)。
表1
如上表所示，本发明的发明人已经发现下式的化合物：
在AA位上有一个Lys而不是丝氨酸的化合物，表现出很高的胱天蛋白酶-2活性，并且对胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-8具有显著的选择性，从而改进了胱天蛋白酶-2基质抑制剂。发明人进一步发现，在AA位含有His而不是丝氨酸的上式化合物表现出很强的胱天蛋白酶-2活性。
实施例2.使用抑制剂进行酶动力学研究
材料和方法
试剂
Fmoc保护氨基酸购自Iris Biotech GmbH(Marktredwitz，德国)、Sigma-Aldrich(Poznan，波兰)、Bachem(Torrance，CA，USA)、Creosalus(Louisville，KY，USA)、PEBiosciences Limited(中国香港)和Combi-Blocks(San Diego，USA)。2-氯三苯甲基氯化物树脂(100-200目，负载量1.59mmol/g)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧化六氟磷酸盐(HATU)、哌啶(PIP)、二异丙基碳二亚胺(DICI)和三氟乙酸(TFA)购自Iris Biotech GmbH。2,4,6-三甲基吡啶(2,4,6-collidine)、乙腈(ACN，HPLC梯度级)、三异丙基硅烷(TIPS)、氢溴酸溶液(乙酸(AcOH)中30％HBr重量)、N-甲基吗啉(NMM)、无水四氢呋喃(无水THF)、氯甲酸异丁酯(IBCF)和2,6-二甲基苯甲酸(2,6-DMBA)购自Sigma-Aldrich。N,N′-二甲基甲酰胺(DMF，分析纯)、甲醇(MeOH)、二氯甲烷(DCM)、乙酸(AcOH)、二乙醚(Et2O)和五氧化二磷(P2O5)购自POCh(波兰Gliwice)。根据AldrichTechnical Bulletin(AL-180)方案生成用于酰氧甲基酮(AOMK)抑制剂合成的二唑甲烷。使用半制备型C8柱(粒径10μm)，通过Waters系统(Waters M600溶剂输送模块和Waters M2489检测器系统)上的反相HPLC纯化所有AOMK抑制剂。用于抑制剂纯化和LC-MS分析的溶剂组成如下：相A(水/0.1％反式脂肪酸)，相B(乙腈/0.1％反式脂肪酸)。纯化时，在线性梯度(从95％的相A到5％的相A)中运行30分钟。纯度和分子质量[m/z+H]+由WatersLC-MS仪器测定，使用的是分析型/>C8色谱柱(粒径10μm)。从95％的相A到5％的相A进行20分钟的LC-MS测定。所有化合物的纯度至少为95％。
P2抑制剂的合成
通过对P2位凋亡半胱天冬酶荧光基质的详细动力学分析，我们选择了胱天蛋白酶-2选择性四肽基团，并利用它们设计出不可逆的AOMK标记抑制剂。根据先前描述的一般方法合成了通式为NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-AA-Asp-AOMK的抑制剂(Poreba 2019，Poreba2016)。作为对照抑制剂，合成了Ac-VDVAD-AOMK。基于AOMK的抑制剂合成的详细步骤以合成NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Ser-Asp-AOMK为例(NH-23-C2，Poreba等，Cell Death&Differentiation 2019，26，2695-2709)。所有其他抑制剂的合成和纯化方法相同。除非另有说明，所有氨基酸均为L构型。
NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Ser-Asp-AOMK(NH-23-C2)的合成。将0.2M溶液Boc-Asp(tBu)-OH氨基酸(5mmol，1.45g)在无水THF中于冰/丙酮浴中在-10℃下搅拌10分钟。然后，加入4-甲基吗啉(6.25mmol，1.25当量)和氯甲酸异丁酯(5.75mmol，1.15当量)。反应在-10℃下进行45分钟。在平行实验中，根据Aldrich Technical Bulletin(AL-180)协议生成重氮甲烷。然后，在0℃下将混合酸酐溶液滴加到乙醚状重氮甲烷(16.6-21.4mmol)中。搅拌混合物10分钟，然后移开冰浴，并在室温下反应2小时。为了得到Boc-Asp(tBu)-CH2Br，在10分钟的时间内向混合物中滴加15mL 1：2的HBr(在CH3COOH中的重量比为30％)和水。之后，立即用乙酸乙酯稀释混合物，转移到分离漏斗中，并用水(一次)、饱和NaHCO3水溶液(两次)和盐水(两次)萃取。有机馏分经MgSO4干燥后减压蒸发。产物为淡黄色油状物，无需进一步纯化即可用于合成。经HPLC测定，产物纯度大于95％，总收率大于90％。在下一个反应中，将1当量的Boc-Asp(tBu)-CH2Br溶解在小体积的DMF中，然后加KF(3当量)和2,6-二甲基苯并酸(2,6-DMBA)(1.2当量)。将混合物在氩气惰性气氛中搅拌25分钟。反应完成后(HPLC分析)，用乙酸乙酯稀释溶液，转移到分离漏斗中，并用5％柠檬酸(两次)、5％NaHCO3水溶液(两次)和盐水(两次)萃取。然后，有机馏分经MgSO4干燥，减压蒸发。产物为黄色油状物(收率大于95％)，无需进一步纯化即可用于探针合成。将Boc-Asp(tBu)-AOMK(100mg/0.213mmol)加入到25％TFA的DCM溶液中。进行Boc和tBu基团的脱保护作用30分钟。然后减压蒸发TFA和DCM，得到黄色油状的最终产物(NH2-Asp-AOMK)，无需进一步纯化即可使用(HPLC收率98％)(方框B，合成方案1)。在另一种合成中，使用2-氯三氯甲烷树脂(200mg，1.6mmol/g，0.33mmol)合成了NH-Idc-hGlu(tBu)-Thr(Bzl)-Ser(tBu)-OH肽片段。将Fmoc-L-Ser(tBu)-OH(3当量，1mmol，383mg)溶解在最小体积的无水DCM中，然后加入4.5当量的DIPEA(1.5mmol，260μL)，混合物活化1分钟后倒入树脂中。将反应混合物搅拌3h。然后用20％的哌啶在DMF中去除Fmoc基团，并用DMF将树脂洗涤六次。然后，将Fmoc-Thr(Bzl)-OH(3当量，1mmol，431mg)和HATU(3当量，1mmol，380mg)溶于最小体积的DMF中，并加入3当量的2,4,6-三甲基吡啶(2,4,6-collidine)(1mmol，130μL)。将混合物倒入树脂中，反应进行3h。之后，用20％的哌啶在DMF中去除Fmoc基团，并用DMF将树脂洗涤六次。接下来，将Fmoc-hGlu(tBu)-OH(3当量，1mmol，440mg)和HATU(3当量，1mmol，380mg)溶于最小体积的DMF中，并加入3当量的2,4,6-三甲基吡啶(1mmol，130μL)。将混合物倒入树脂中，反应进行了3小时。之后，用20％的哌啶在DMF中去除Fmoc基团，并用DMF将树脂洗涤六次。接着，将Fmoc-Idc-OH(3当量，1mmol，386mg)和HATU(3当量，1mmol，380mg)溶于最小体积的DMF中，并加入3当量的2,4,6-三甲基吡啶(1mmol，130μL)。将混合物倒入树脂中，反应进行3小时。之后，用20％的哌啶在DMF中除去Fmoc基团，并用DMF、DCM和MeOH分别洗涤树脂六次、三次和三次。然后将树脂在P2O5干燥器中干燥过夜。然后，在DCM/TFE/AcOH(v/v/v，8:1:1)混合物中孵育45分钟，从树脂中裂解出肽。然后过滤溶液，减压除去溶剂。将粗肽溶于乙腈：H2O(v/v,7:3)并冻干，得到白色粉末状的NH-Idc-hGlu(tBu)-Thr(Bzl)-Ser(tBu)-OH(方框a，合成方案1)。多肽纯度大于95％，用于NH-23-C2抑制剂的合成而无需进一步纯化。接下来，将肽片段(1当量)与NH2-Asp-AOMK(1当量)在DMF中偶联，并使用HATU(1当量)和2,4,6-三甲基吡啶(5当量)作为偶联试剂。反应在室温下进行2小时，之后将混合物注入HPLC，纯化并冻干NH-Idc-hGlu(tBu)-Thr(Bzl)-Ser(tBu)-Asp-AOMK。然后将产物溶解在DCM:TFA 1:2的混合物中以去除保护基。反应在室温下进行1小时，然后用氩气除去DCM:TFA混合物。粗产物经HPLC纯化和冻干后得到最终化合物：NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Ser-Asp-AOMK(方框C，合成方案1)。分子质量[m/z+H]+和纯度经LC-MS分析确认。以类似方式合成了其他抑制剂。此外，参考抑制剂Ac-VDVAD-AOMK(Ac-Val-Asp-Val-Ala-Asp-AOMK)也是用这种方法合成的，然而在这种情况下，肽片段另外用乙酰基进行了N-封端。将乙酸(5当量)和HBTU(5当量)溶于极少量的DMF中，然后倒入NH2-Val-Asp(tBu)-Val-Ala树脂(1当量)中，乙酰化反应进行30分钟。然后按上述步骤对N-乙酰化肽进行处理。
合成方案1.以合成NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Ser-Asp-AOMK为例的基于AOMK的抑制剂合成程序
表2.通式为NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-AA-Asp-AOMK的抑制剂的结构。
合成NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Lys-Asp-AOMK时，用Fmoc-L-Lys(Boc)-OH代替Fmoc-L-Ser(tBu)-OH。合成NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Orn-Asp-AOMK时，用Fmoc-L-Orn(Boc)-OH代替Fmoc-L-Ser(tBu)-OH。合成NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Dab-Asp-AOMK时，用Fmoc-L-Dab(Boc)-OH代替Fmoc-L-Ser(tBu)-OH。合成NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Dap-Asp-AOMK时，用Fmoc-L-Dab(Boc)-OH代替Fmoc-L-Ser(tBu)-OH。在合成NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Arg-Asp-AOMK时，用Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH代替Fmoc-L-Ser(tBu)-OH。
酶动力学研究--确定kobs/I抑制参数
使用fMax光谱荧光仪(Molecular Devices,Sunnyvale，CA，USA)以荧光动力学模式在96孔康宁(Corning，NY，USA)板中测量合成抑制剂对胱天蛋白酶-2、-3和-8的kobs/I抑制参数(二阶酶抑制率)。在进行动力学分析之前，使用zVAD-fmk抑制剂(Cayman ChemicalCompany，目录号14467)对所有的胱天蛋白酶进行活性位点滴定。胱天蛋白酶检测缓冲液为10％w/v蔗糖、1M柠檬酸钠、20mM Pipes、10mM NaCl、1mM EDTA和10mM DTT(pH＝7.3)。缓冲液在室温下配制，所有动力学测定均在37℃下进行。kobs/I参数是在伪一阶动力学条件下测量的([I]>>[E])。在96孔板中稀释抑制剂(20μL)并与适当的基质(20μL)混合；NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Ser-Asp-ACC(50μM)用于胱天蛋白酶-2，Ac-DEVD-ACC(100μM)用于胱天蛋白酶-3，Ac-LEHD-ACC(100μM)用于胱天蛋白酶-8。使用355nm(激发)和460nm(发射)波长监测ACC荧光。基质-抑制剂混合物(共40μL)在37℃预孵育15分钟。15分钟后，将酶加入孔中(每孔60μL，总反应体积100μL)，并立即开始监测荧光30分钟。在至少三个独立实验中测定二阶抑制率(kobs/I)，并以平均值表示。使用GraphPad Prism 7软件进行计算(见图2)。
重组胱天蛋白酶的制备。
表达和纯化人类凋亡胱天蛋白酶的详细方案可在其他地方找到(Stennicke，1999年)。
酶动力学研究--Ki和IC50抑制参数的测定
使用fMax光谱荧光仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)以荧光动力学模式在96孔康宁(Corning，NY，USA)板中测量合成抑制剂对胱天蛋白酶-2、-3和-8的Ki和IC50抑制参数。在进行动力学分析之前，使用zVAD-fmk抑制剂(Cayman Chemical Company，目录号14467)对所有的胱天蛋白酶进行活性位点滴定。胱天蛋白酶检测缓冲液为10％w/v蔗糖、1M柠檬酸钠、20mM Pipes、10mM NaCl、1mM EDTA和10mM DTT(pH＝7.3)。缓冲液在室温下配制，所有动力学测定均在37℃下进行。Ki参数使用莫里森方程测量(Copeland，2000)。对于每种胱天蛋白酶，都使用了适当的ACC荧光基质来监测基质水解：NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Ser-Asp-ACC(50μM)用于胱天蛋白酶-2，Ac-DEVD-ACC(100μM)用于胱天蛋白酶-3，Ac-LEHD-ACC(100μM)用于胱天蛋白酶-8。使用355nm(激发)和460nm(发射)波长监测ACC荧光。为满足可逆抑制剂动力学标准，最低抑制剂浓度比测定中的胱天蛋白酶浓度高至少4倍。首先将胱天蛋白酶(60μL)在96孔板的检测缓冲液中37℃预热15分钟，然后与抑制剂(20μL)在37℃下再预孵育15分钟。然后，将基质(20μL)加入酶抑制剂混合物中，并随着时间的推移监测反应的进展(ACC释放)。Ki参数由莫里森方程计算得出，IC50参数则用公式计算得出：IC50＝Kix(1+[S]/Km]，其中[S]是测定中使用的基质浓度，Km是基质的迈克尔-门顿常数(Michaelis-Menten constant)。所有测量至少进行三次，并使用GraphPadPrism 7软件对数据进行分析。
Ki和IC50(针对胱天蛋白酶-2)的数据见图3。
结果以kobs/I表示，Ki和IC50值见下表3至5。
表3
表4
表5
选择性结果也以kobs/I、Ki和IC50值的划分来表示(见下文表6和表7)。
表6
表7
如前所述，化合物NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Ser-Asp-ACC和NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-Ser-Asp-AOMK作为胱天蛋白酶-2基质和抑制剂公开于Poreba等人，Cell Death&Differentiation 2019，26，2695-2709。如上表所示，本发明的发明者发现，式NH-Idc-hGlu-Thr(Bzl)-AA-Asp-AOMK的化合物在AA位上具有Lys、Orn、Dab或Dap基团，而不是丝氨酸等，具有很高的胱天蛋白酶-2抑制活性，并且对胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-8具有显著的选择性，从而导致改进的胱天蛋白酶-2抑制剂。
实施例3：细胞内脂质积累
-材料和方法
将HepG2细胞(50,000个细胞/孔)移植到12多孔培养皿中，盖玻片上事先涂有胶原蛋白(2mg/mL胶原蛋白溶液(BD Biosciences)在PBS中，37℃孵育30分钟)。
细胞用“NASH混合物(NASH cocktail)”处理：DMEM含4.5mg/mL葡萄糖，补充有10％(v/v)FBS、1％(v/v)PenStrep和2mM L-谷氨酰胺，再加上脂肪酸(100μM油酸钠和100μM棕榈酸)、100nM胰岛素(均为Sigma-Aldrich)和炎症细胞因子(50ng/mL肿瘤坏死因子、TNF-α(Prospec)、25ng/mL白细胞介素IL-1β(Petroteck)和8ng/mL转化生长因子TGF-β(R&DSystems))。将细胞暴露于这种“NASH混合物”24小时，并同时加入不同浓度的KIN化合物。
处理结束后，用PBS冲洗细胞，并用染色液(BODIPY493/503(Thermo FisherScientific))在37℃下孵育15分钟。然后用PBS洗涤细胞三次，并在室温下用4％PFA固定30分钟。再用PBS洗涤三次后，将玻璃载玻片上滴一滴Gold抗褪色试剂(Invitrogen)和DAPI，安装盖玻片，室温下过夜。使用Axoimagen M1显微镜(Zeiss，Oberkochen，Germany)拍摄荧光显微照片，并使用ImageJ对荧光信号(DAPI和BODIPY)进行量化(n＝10)。细胞内脂质负荷是以BODIPYTM 493/503脂质染料面积的函数来计算的。
-结果
新脂肪生成(DNL)被认为是引发NASH的一个代谢过程，患者的新脂肪生成率可高出3倍(Lambert等人，2014年)。DNL被推测通过增加肝细胞中的细胞内脂毒性游离脂肪酸(FFA)来促进NASH的进展。据描述，胱天蛋白酶-2可调节促脂肪生成酶的转录，如HMGCR(3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoAReductase))和HMGCS(羟甲基戊二酰-CoA合成酶(hydroxymethylglutaryl-CoAsynthase))(Kim，2018年)。因此，抑制胱天蛋白酶2可通过降低肝细胞内的脂质浓度来防止发展为NASH。
NASH的体外细胞模型用于测试胱天蛋白酶-2抑制剂防止细胞内脂质积聚的功效。在该模型中，HepG2细胞在“NASH条件”下暴露24小时，包括致脂(葡萄糖、胰岛素、脂肪酸)以及炎症和促凋亡(TNF-α、IL-1β和TGF-β)诱因。与未触发的对照组相比，细胞内脂质负荷明显增加至少2倍。该模型与人类NASH病理相关(Boeckmans等人，2019年)。
用10μM的KIN抑制剂处理NASH触发的HepG2培养物24小时，并按照“材料与方法”中的描述对细胞内脂质积累的抑制作用进行量化。如图4所示，所有测试的胱天蛋白酶-2抑制剂都能在NASH条件下抑制脂质积累。化合物1、2和3的抑制率明显高于NH-23-C2化合物。
胱天蛋白酶-2抑制剂在防止细胞内脂质积累方面的功效被用来比较NH-23-C2和化合物1的功效。将细胞与NASH条件和浓度为10、20和25μM的胱天蛋白酶-2抑制剂一起培养，分析其对脂质积累的保护作用。如图5所示，化合物1在NASH条件下抑制细胞内脂质积累的效果优于NH-23-C2。
这些实验结果提供了实验证据，证明能够调节胱天蛋白酶-2活性的本发明化合物能够有效抑制肝细胞内的脂质积累。
实施例4：动力学测定
-材料和方法
根据标准SPPS程序合成胱天蛋白酶-2基质，经HPLC纯化，冷冻干燥并溶于DMSO中至20mM的最终浓度(Poreba等人，2014年，CDD)。具体而言，本实施例合成了以下胱天蛋白酶-2基质：
/>
/>
在进行动力学测定之前，将基质(若干μL)用DMSO中稀释至1μM(工作浓度)。然后，在96孔板的孔中加入1μL基质，再加入99mL缓冲液中的胱天蛋白酶-2。加入酶后，立即将板放入荧光板读取器中，并在动力学模式下随时间测量荧光(激发355nm，发射460nm)。荧光释放持续30分钟，并且仅取曲线的线性部分进行分析以计算反应速率。最佳裂解基质的速率设定为100％，并相应地调整所有其他基质(裂解速率，％)。基质的最终浓度为10μM，胱天蛋白酶-2的最终浓度为10nM。胱天蛋白酶-2检测缓冲液为20mM Pipes、100mM NaCl、10％蔗糖(w/v)、10mM DTT，pH 7.2-7.4。将胱天蛋白酶-2在37℃的缓冲液中预培养15分钟，然后添加到基质中。
结果
结果如图6所示，并在下表中详细说明：
为了确保数据的可靠性，所有的胱天蛋白酶2基质都是独立制作的(合成、纯化、在DMSO中稀释)。参考比较值是来自该特定系列基质的最佳基质(即NH-Idc-hGlu-Glu(Chx)-Dab-Asp-ACC)的水解速率。从该实施例中可以清楚地看出，当使用具有以下支架NH-Idc-P4-P3-Dab-Asp-ACC的五肽时，P4位置更优选为hGlu，并且P3可以对化合物Thr(Bzl)、Glu(Chx)、Glu(me)、Glu或Val中的至少任何一种开放(也对Abu开放)。图7进一步说明了这一点。
实施例5：
-材料和方法
根据Poreba等人，CDD，2014中所述的一般方法，在固体支持物上合成了一系列通式为NH-Idc-P4-Mix-Dab-Asp-ACC的胱天蛋白酶-2基质，其中P4为Asp、hGlu、Ile、Leu或hLeu；Mix为天然氨基酸的等摩尔混合物，ACC为荧光标签，根据Poreba等人,CDD,2014中描述的一般方法在固体载体上合成。将500mg(1当量，0.24mmol)受Fmoc保护的RinkAmide树脂(0.48mol/g)置于用于固相合成的玻璃筒中并在DCM中溶胀30分钟。然后将DCM沥干，并用DMF将树脂洗涤三次。接着，用20％的哌啶在DMF中分三个循环(5分钟、5分钟和25分钟)去除Fmoc保护基，并用DMF洗涤树脂六次。约2.5当量的Fmoc-ACC-OH(0.6mmol，265mg)与2.5当量的HATU(0.6mmol，228mg)和2.5等量的2,4,6-三甲基吡啶(0.6mmol，80μL)在极少量的DMF中预活化3分钟，并倒在树脂上。反应进行了4小时，然后过滤并用DMF冲洗树脂三次。之后，用DMF冲洗树脂三次，并进行茚三酮测试，以确认Fmoc-ACC-OH偶联完全。然后用20％的哌啶在DMF中去除ACC上的Fmoc基团，再用DMF将树脂洗涤六次。接着，将2.5当量的Fmoc-L-Asp(tBu)-OH(0.6mmol，247mg)与2.5当量的HATU(0.6mmol，228mg)和2.5当量的2,4,6-三甲基吡啶(0.6mmol，80μL)在DMF中预孵育3分钟，然后倒入H2N-ACC树脂上。反应进行了24小时，然后使用1.5当量Fmoc-L-Asp(tBu)-OH/HATU/2,4,6-collidine试剂再重复进行24小时。然后用DMF将Fmoc-L-Asp(tBu)-ACC树脂洗涤三次，再用20％的哌啶在DMF中进行Fmoc脱保护，并用DMF将树脂洗涤六次。接着，将Fmoc-L-Dab(Boc)-OH偶联到P2位置。将2.5当量的这种氨基酸(0.6mmol，264mg)、2.5当量的HATU(0.6mmol，229mg)和2.5当量的2,4,6-三甲基吡啶(0.6mmol，80mL)稀释到DMF中，并倒入H2N-mix-Asp(tBu)-ACC树脂上。反应进行了3小时，然后用DMF冲洗浆液(6次)，并进行茚三酮测试以确认偶联完全。用20％的哌啶在DMF中去除Fmoc基团，然后用DMF将树脂洗涤六次。将19种天然氨基酸的等效混合物(不包括半胱氨酸，但包括模拟蛋氨酸的去甲亮氨酸)偶联到P3位置。为此，将5当量的等效混合物(1.2mmol)、5当量的HOBt(1.2mmol，180mg)和5当量的DICI(1.2mmol，160μL)在DMF中稀释并预激活3分钟。然后将混合物倒入树脂中，搅拌3小时。将浆液过滤并用DMF冲洗三次。茚三酮试验证实了P3的完全偶联。接着，在DMF中用20％的哌啶去除Fmoc基团，然后将H2N-Mix-Dab(Boc)-Asp(tBu)-ACC树脂分成5份(每份0.05mmol)。P4偶联使用MultiChem 48孔合成仪(FlexChem，来自SciGene，CA，USA)进行。将5份树脂放入48孔滤芯中，用DCM溶胀30分钟。然后过滤DCM，用DMF将树脂洗涤三次。在5支1.5mL的试管中，将2.5当量的各种氨基酸(0.12mmol)与含有2.5当量的HATU(0.12mmol，46mg)和2.5当量的2,4,6-三甲基吡啶(0.12mmol，16μL)的1mL DMF混合，然后倒入树脂中。P4偶联反应进行了4小时，然后进行了茚三酮测试。最后，用20％的哌啶在DMF中去除Fmoc基团，并用DMF将树脂洗涤6次。接着，Fmoc-L-Idc-OH被偶联到P5位置。将2.5当量的这种氨基酸(0.6mmol，231mg)、2.5当量的HATU(0.6mmol，229mg)和2.5当量的2,4,6-三甲基吡啶(0.6mmol,80mL)稀释到DMF中，然后倒入每份H2N-P4-Mix-Dab(Boc)-Asp(tBu)-ACC树脂上。反应进行了3小时，然后用DMF冲洗浆料(6次)，并进行茚三酮测试以确认偶联完全。用DMF中的20％哌啶除去Fmoc基团，然后用DMF、DCM和MeOH分别洗涤树脂6次、3次和3次。树脂在P2O5干燥器中干燥过夜。使用冰冷的TFA/TPS/水(％v/v/v，95/2.5/2.5)混合物将所有基材从树脂上裂解2小时(每15分钟振荡一次)。分别收集来自各孔的溶液，并用TFA洗涤剩余的树脂。然后用冰冷的Et2O沉淀基质30分钟并离心。然后弃去上清液，将沉淀重新悬浮于冰冷的Et2O中并再次离心。然后弃去上清液，使沉淀干燥，将其溶于5mL水：乙腈1:1的混合物中，在-80℃下冷冻并冻干。然后将最终产物(白色粉末)溶于二甲基亚砜(DMSO)中至最终浓度为10mM，并储存在-80℃下，直至使用。
在96孔板的孔中加入1μL基质(10mM)，然后加入99mL缓冲液中的胱天蛋白酶-2。加入酶后，立即将板放入荧光板读取器中，并在动力学模式下随时间测量荧光(激发355nm，发射460nm)。荧光的释放持续30分钟，并且仅取曲线的线性部分进行分析以计算反应速率。最佳裂解基质的速率设定为100％，所有其他基质的速率也相应调整(裂解速率，％)。
该特定合成中使用的等速混合物的组成(总量—1.2mmol)
基质的最终浓度为10μM，胱天蛋白酶-2的最终浓度为10nM。胱天蛋白酶-2检测缓冲液为20mM Pipes、100mM NaCl、10％蔗糖(w/v)、10mM DTT，pH 7.2-7.4。将胱天蛋白酶-2加入基质前在缓冲液中37℃预培养15分钟。
结果见图8(左图)和下表：
从上表中可以清楚地看出，P4必须是独立于P3中使用的天然氨基酸hGlu，该天然氨基酸可以是选自Ala(丙氨酸)、Asp(天冬氨酸)、Asn(天冬氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Lys(赖氨酸)、Nle(诺亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Ser(丝氨酸)、Thr(苏氨酸)、Trp(色氨酸)、Tyr(酪氨酸)和Val(缬氨酸)。
最后，为了更好地表示实施例4和实施例5所示各系列中每一个的最佳基质的水解速率，将水解速率设定为100％，并对其他基质进行了相应调整，结果如图8所示。

Claims (26)

1.一种化合物，所述化合物为式(I)所示的化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体：
其中，
-n是1、2、3或4；
-A是胺基；
其中，
P5为式(III)所示的化合物：
其中，A和B是氢原子，H、J和K是碳原子；虚线代表一个键，这个键可能存在，也可能不存在，当存在时，这个键与已经存在的单键结合形成双键；
P4是hGlu(高谷氨酸)，P4所示氨基酸残基可以是去质子化或质子化形式；
P1是Asp或天冬氨酸，其中，P1所示氨基酸残基可以是质子化或去质子化形式；
P3选自谷氨酸环己酯(Glu(Chx))、L-谷氨酸甲酯(Glu(me))、苏氨酸苄基醚(Thr(Bzl))、氨基丁酸(Abu)或选自由Ala(丙氨酸)、Arg(精氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Lys(赖氨酸)、Nle(诺亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Ser(丝氨酸)、Thr(苏氨酸)、Trp(色氨酸)、Tyr(酪氨酸)和Val(缬氨酸)组成的列表中的任意天然氨基酸；以及
其中，
R1选自以下组成的组：
其中，
q为0、1、2、3、4或5，
每个Z1独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN、-NO2和C1-6烷氧基，
Z2是卤素，以及
Z3选自C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10)芳基或(C1-6)烷基；
或者所述化合物选自下式所示化合物：
其中
W选自-NH-和-O-，
R10-R13独立地选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基、芳基、杂芳基、CF3、-CH2COOH、-CH2CONHR14和CH2OR14，以及
R14选自H、C1-6烷基和C3-7环烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1是下式所示的化合物：
其中，
q是0、1、2、3或4，以及
Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN和C1-6烷氧基；或
可选地，R1是下式所示的化合物：
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中，P3选自谷氨酸环己酯(Glu(Chx))、L-谷氨酸甲酯(Glu(me))、Glu或Thr(Bzl)(苏氨酸苄基醚)。
4.根据权利要求1至2中任意一项所述的化合物，其中，P3选自由以下组成的列表中选择的任意天然氨基酸：Ala(丙氨酸)、Arg(精氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Asp(天冬氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Lys(赖氨酸)、Nle(诺亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Ser(丝氨酸)、Thr(苏氨酸)、Trp(色氨酸)、Tyr(酪氨酸)和Val(缬氨酸)。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的化合物，其中，n为2、3或4。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的化合物，其中，所述化合物为式(IX)所示的化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体：
其中，
R2和R3独立地为H；并且R2和R3也可以不存在，从而形成去质子化形式CO(O-)；
其中，
n是1、2、3或4；
A是胺基；以及
R1选自下式组成的组：
其中Z1各自独立地选自C1-6烷基、卤素、-CN和C1-6烷氧基。
7.根据权利要求1至5中任意一项所述的化合物，其中，所述化合物选自以下任意化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体：
a.NH-Idc-hGlu-Glu(Chx)-P2-Asp-R1
b.NH-Idc-hGlu-Glu-P2-Asp-R1
c.NH-Idc-hGlu-Glu(me)-P2-Asp-R1
d.NH-Idc-hGlu-Val-P2-Asp-R1
其中，P2选自赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)或二氨基丙酸(Dap)。
8.根据权利要求1至5中任意一项所述的化合物，其中，所述化合物选自以下任意化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体：
a.NH-Idc-hGlu-Glu(Chx)-P2-Asp-R1；
b.NH-Idc-hGlu-Glu-P2-Asp-R1；
c.NH-Idc-hGlu-Glu(me)-P2-Asp-R1；
其中，P2选自赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)或二氨基丙酸(Dap)。
9.根据权利要求1至5中任意一项所述的化合物，其中，所述化合物选自以下任一化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体：
a.NH-Idc-hGlu-Glu(Chx)-Dab-Asp-R1；
b.NH-Idc-hGlu-Glu-Dab-Asp-R1；和/或
c.NH-Idc-hGlu-Glu(me)-Dab-Asp-R1。
10.根据权利要求1至5中任意一项所述的化合物，其中，所述化合物为NH-Idc-hGlu-Mix-P2-Asp-R1或其盐、溶剂化物或立体异构体，其中P2选自赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)或二氨基丙酸(Dap)；并且其中，Mix是选自由以下组成的列表的任意天然氨基酸：Ala(丙氨酸)、Arg(精氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Asp(天冬氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Lys(赖氨酸)、Nle(诺亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Ser(丝氨酸)、Thr(苏氨酸)、Trp(色氨酸)、Tyr(酪氨酸)和Val(缬氨酸)。
11.根据权利要求6至8或10中任意一项所述的化合物，其中，P2是赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)或二氨基丁酸(Dab)。
12.根据权利要求7至11中任意一项所述的化合物，其中，R1具有式其中Me是甲基(CH3)基团。
13.根据权利要求6所述的化合物，其中，所述化合物为下式所示的化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体：
其中，虚线代表的键可能存在，也可能不存在；当虚线代表的键存在时，虚线代表的键与已存在的单键结合形成双键。
14.根据权利要求6所述的化合物，其中，所述化合物为下式所示的化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体：
其中，虚线代表的键可能存在，也可能不存在，当虚线代表的键存在时，虚线代表的键与已存在的单键结合形成双键。
15.根据权利要求6所述的化合物，其中，所述化合物为下式所示的化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体：
其中，虚线代表的键可能存在，也可能不存在，当虚线代表的键存在时，虚线代表的键与已存在的单键结合形成双键。
16.根据权利要求13至15中任意一项所述的化合物，其中，R1由式组成。
17.根据前述任意一项权利要求所述的化合物，其中，所述化合物中的所有氨基酸均为L构型。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1至17中任意一项所述的化合物和任选的药学上可接受的赋形剂。
19.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求16所述的化合物和药学上可接受的赋形剂。
20.权利要求1至17中任意一项所述的化合物，用作药物。
21.权利要求16所述的化合物，用作药物。
22.权利要求1至17中任意一项所述的化合物，用于预防和/或治疗退行性疾病，疾病如阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、路易体痴呆症、轻度认知障碍、肌萎缩侧索硬化症和克雅氏病；新生儿脑损伤，特别是新生儿脑缺血；创伤性脑损伤；肾缺血；缺氧缺血损伤；中风样脑损伤；心脏缺血；心肌梗塞；肌萎缩性脊髓侧索硬化症；视网膜损伤；眼科疾病，如钝性眼损伤、缺血性视神经病变和青光眼；皮肤损伤；无菌性炎症，如糖尿病、动脉粥样硬化、心肌缺血、痛风、假性痛风、关节松动、动脉粥样硬化、铝盐引发的综合征、非动脉缺血性视神经病变、青光眼和代谢性疾病；非无菌性炎症，如细菌感染，尤其是产生孔隙毒素的细菌、流感病毒感染和单链RNA弹状病毒感染，如马拉巴病毒或水泡性口炎病毒；布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等致病菌引起的疾病；血脂异常；肥胖；代谢综合征；非酒精性脂肪肝，如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝(NAFLD)、肝硬化、原发性硬化性胆管炎和肝细胞癌。
23.权利要求1至17中任意一项所述的化合物，用于预防和/或治疗血脂异常、肥胖、代谢综合征、肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝(NAFLD)。
24.权利要求16所述的化合物，用于预防和/或治疗血脂异常、肥胖、代谢综合征、肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝(NAFLD)。
25.权利要求1至17中任一项所述的化合物，用于预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝(NAFLD)。
26.权利要求16所述的化合物，用于预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝(NAFLD)。
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