CN117925879A - 紫花苜蓿液相育种芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了紫花苜蓿液相育种芯片，具体的说，公开了紫花苜蓿的5037个SNP位点或用于检测所述5037个SNP位点的物质在如下任一中的应用：(1)制备紫花苜蓿SNP位点基因型检测的试剂盒；(2)紫花苜蓿分子育种；(3)构建紫花苜蓿种质资源或品种的DNA指纹数据库；(4)检测任两个紫花苜蓿品种的相似性。通过本发明的紫花苜蓿5037个SNP位点的比对，能够实现对紫花苜蓿分子育种、构建紫花苜蓿种质资源或品种的DNA指纹数据库以及检测任两个紫花苜蓿品种的相似性，进而实现紫花苜蓿的聚类分析。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种紫花苜蓿中5037个SNP位点的应用，及基于所述5037个SNP位点的紫花苜蓿液相育种芯片。
背景技术
紫花苜蓿，豆科苜蓿属多年生宿根草本植物，茎直立、丛生或匍匐，呈四棱形，多分枝；托叶较大，卵状披针形，小叶片呈倒卵状长圆形；花朵是成族状的总状花序；花梗呈尊钟状，花冠紫色花；果实螺旋形，熟时呈棕褐色；种子小而平滑，呈黄色或棕色；花期5—7月，果期为6—8月。因其花开紫色，故取名为紫花苜蓿。
现有技术中，对紫花苜蓿的种质资源的研究一般是通过系统考察记载资源材料的生育期、形态特征、抗病虫能力及对气候环境的适应性,经田间种植观察发现优良性状、特殊性状,进行遗传性研究。研究周期长，人为因素影响大，检测准确度不好。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种紫花苜蓿中5037个SNP位点的应用，及基于所述5037个SNP位点的紫花苜蓿液相育种芯片。
本发明要求保护5037个SNP位点或用于检测所述5037个SNP位点的物质在如下任一中的应用：
(1)制备紫花苜蓿SNP位点基因型检测的试剂盒；
(2)紫花苜蓿分子育种；
(3)构建紫花苜蓿种质资源或品种的DNA指纹数据库；
(4)检测任两个紫花苜蓿品种的相似性；
所述5037个SNP位点的物理位置是基于紫花苜蓿品种中苜4号的全基因组序列比对确定的，所述紫花苜蓿品种中苜4号的全基因组序列的版本号为GWH:GWHBECI00000000，上传日期为2021年8月21日的Zhongmu-4全基因序列；所述5037个SNP位点分别为位于1号染色体的584个位点；位于2号染色体的558个位点；位于3号染色体的666个位点；位于4号染色体的637个位点；位于5号染色体的546个位点；位于6号染色体的737个位点；位于7号染色体的607个位点；位于8号染色体的702个位点。
其中，所述5037个SNP位点具体如实施例中的表1所示，其中SNP-id表示SNP位点的编号，chrom表示位点所在的染色体号，position表示位点在染色体上的位置，ref和alt表示每个SNP位点的两种类型。
本发明提供一种用于检测紫花苜蓿SNP位点基因型检测的试剂盒，包括用于检测所述的5037个位点的物质。所述基因型检测的试剂盒可以为对待测植株的基因组进行测序的物质之后再进基于测序结果行数据比对；也可以为针对5037个位点设计的液相基因芯片。
本发明提供一种检测紫花苜蓿种质的方法，包括提取待测紫花苜蓿的全基因组DNA并检测所述的5037个位点的基因型的步骤。
本发明提供一种对紫花苜蓿进行聚类分析的方法，包括：
1)提取待测紫花苜蓿的全基因组DNA并检测其中所述的5037个位点的基因型；
2)根据所得基因型数据，建立聚类树状图，从而将所述紫花苜蓿划分为不同类群。
本发明提供一种构建紫花苜蓿DNA指纹数据库的方法，包括如下步骤：
(a1)分别提取用于构建紫花苜蓿DNA指纹数据库的所有紫花苜蓿品种的基因组DNA；
(a2)检测所述所有紫花苜蓿品种的基因组DNA中所述的5037个SNP位点的基因型，所得基因型数据即构成紫花苜蓿DNA指纹数据库。
本发明提供一种紫花苜蓿分子育种方法，包括如下步骤：将携带有目标性状的紫花苜蓿供体亲本与紫花苜蓿受体亲本杂交，再将所得杂交后代与所述紫花苜蓿供体亲本进行若干次回交，分别检测所述紫花苜蓿受体亲本以及所得的携带有所述目标性状的回交后代基因组DNA中所述的5037个SNP位点的基因型，根据检测结果从携带有所述目标性状的所述回交后代中选择所述5037个SNP位点的基因型与所述紫花苜蓿受体亲本一致性最高的个体。
本发明的有益效果在于：通过本发明的紫花苜蓿5037个SNP位点的比对，能够实现对紫花苜蓿分子育种、构建紫花苜蓿种质资源或品种的DNA指纹数据库以及检测任两个紫花苜蓿品种的相似性，进而实现紫花苜蓿的聚类分析。
附图说明
图1为5037个SNP位点在8条染色体上的分布。
图2为334种紫花苜蓿分为4个亚群的结果示意图。
图3为本发明的紫花苜蓿品种中苜4号的全基因组序列的版本的网页截图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的中苜1号、中苜3号、中苜4号、中苜5号，分别在河北地区22个紫花苜蓿品种的生产性能比较研究，吕会刚，草地学报，2018年7月；Genome Assembly ofAlfalfa Cultivar Zhongmu-4and Identification of SNPs Associated withAgronomic Traits；播种量和行距配置对盐碱地紫花苜蓿草产量及品质的影响；等文章中公开，公众可以从中国农业科学院北京畜牧兽医研究所获取次材料用于重复本实验。
实施例1
采用220份紫花苜蓿材料重测序数据获得的VCF文件，以紫花苜蓿参考基因组zhongmu-4为参考(紫花苜蓿品种中苜4号的全基因组序列的版本号为GWH:GWHBECI00000000，上传日期为2021年8月21日的Zhongmu-4全基因序列，其网页截图如图3所示)，对数据中的位点信息进行初步筛选目标区段，然后再合成目标区段对应的探针。通过选取220个紫花苜蓿品种进行芯片数据测试，优先挑选均已性好的目标区域，并保证整体的均匀分布。最终筛选获得5037个SNP位点，其中包括94个与基本农艺性状、耐盐性以及品质性状相关的位点。这些位点分布如下：1号染色体584个位点；2号染色体558个位点；3号染色体666个位点；4号染色体637个位点；5号染色体546个位点；6号染色体737个位点；7号染色体607个位点；8号染色体702个位点，如图1所示。
所述5037个SNP位点在各个染色体中的位置以及其在zhongmu4中的基因型分别如表1所示，其中SNP-id表示SNP位点的编号，chrom表示位点所在的染色体号，position表示位点在染色体上的位置，ref和alt表示每个SNP位点的两种类型，del表示缺失。
表1
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实施例2
基于上述5037个SNP位点，本实施例提供一种用于检测紫花苜蓿SNP位点基因型检测的试剂盒，包括用于检测所述的5037个位点的物质。所述基因型检测的试剂盒可以为对待测植株的基因组进行测序的物质之后再进基于测序结果行数据比对；也可以为针对5037个位点设计的液相基因芯片。
本实施例还提供一种检测紫花苜蓿种质的方法，包括提取待测紫花苜蓿的全基因组DNA并检测所述的5037个位点的基因型的步骤。
本实施例还提供一种对紫花苜蓿进行聚类分析的方法，包括：
1)提取待测紫花苜蓿的全基因组DNA并检测其中所述的5037个位点的基因型；
2)根据所得基因型数据，建立聚类树状图，从而将所述紫花苜蓿划分为不同类群。
本实施例还提供一种构建紫花苜蓿DNA指纹数据库的方法，包括如下步骤：
(a1)分别提取用于构建紫花苜蓿DNA指纹数据库的所有紫花苜蓿品种的基因组DNA；
(a2)检测所述所有紫花苜蓿品种的基因组DNA中所述的5037个SNP位点的基因型，所得基因型数据即构成紫花苜蓿DNA指纹数据库。
本实施例还可以提供一种紫花苜蓿分子育种方法，包括如下步骤：将携带有目标性状的紫花苜蓿供体亲本与紫花苜蓿受体亲本杂交，再将所得杂交后代与所述紫花苜蓿供体亲本进行若干次回交，分别检测所述紫花苜蓿受体亲本以及所得的携带有所述目标性状的回交后代基因组DNA中所述的5037个SNP位点的基因型，根据检测结果从携带有所述目标性状的所述回交后代中选择所述5037个SNP位点的基因型与所述紫花苜蓿受体亲本一致性最高的个体。
实施例3334份紫花苜蓿品种的检测
一、对分别属于中苜1号、中苜3号、中苜4号和中苜5号的334株紫花苜蓿样本，按照下述方法进行品种检测。
1、提取样本的基因组DNA，并构建样品文库；
1)、样品DNA提取
采用CTAB法对样本DNA进行提取。
2)、样品DNA质检
将测试样品DNA，用Qubit Fluorometric Quantitation(Thermo Fisher)对DNA浓度进行测定，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。检测合格的样品放入4℃冰箱，保存、备用。
3)、样品DNA片段化
取12μL质检合格的DNA放置于0.2μL PCR管中，将管置于超声波破碎仪中对DNA进行随机物理破碎，片段破碎至200～400bp。
4)、样品末端修复
向管中加入4μL GenoBaits End Repair Buffer(GenoBaits，即石家庄博瑞迪生物科技有限公司)和2.7μL GenoBaits End Repair Enzyme，补水至20μL，放入ABI 9700PCR仪中37℃温育20分钟，完成破碎片段的末端修复和加A过程。
5)、样品测序接头连接
从PCR仪中取出小管加入2μL GenoBaits Ultra DNA ligase、8μL GenoBaitsUltra DNA Ligase Buffer和2μL GenoBaits Adapter，补水至40μL，然后放置于ABI9700PCR仪上22℃反应30分钟，完成测序接头的连接。
6)、样品DNA纯化
向连接产物中加入48μL的Beackman AMPure XP Beads(Beackman公司)对连接产物进行纯化，纯化后采用磁珠进行片段筛选，保留插入片段在200～300bp的连接产物。
7)、样品文库扩增
向上一步的PCR管中加入5μL带有Barcode序列的测序接头、1μL P5接头、10μLGenoBaits PCR Master Mix，并用纯水补至20μL；用ABI 9700PCR仪进行扩增，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；重复2-4步，共8个循环；72℃延伸5min。不同的Barcode用于区分不同的样品。
8)、样品文库纯化
向第二轮PCR产物中加入24μL Beckmen AMPure XP Beads(Beackman公司)，用移液器上下吸打均匀后，将0.2μL的PCR管置于磁力架上至溶液澄清，弃去上清并用75％乙醇洗涤磁珠一次，用pH值为8.0的Tris-HCl将文库DNA洗脱下来。
2.利用委托博瑞迪公司制备的液相基因芯片测定目标植株在5037个SNP位点的基因型或者通过基因测序的方法，测定实施例1中所述的5037个位点的基因型；
1)、DNA杂交
取500ng已完成构建的基因组DNA测序文库，加入5μL GenoBaits Block I和2μLGenoBaits Block II，置于Eppendorf Concentrator plus(Eppendorf公司)真空浓缩仪上，在≤70℃的温度下蒸干至干粉。向干粉管中加入8.5μL GenoBaits 2x Hyb Buffer、2.7μL GenoBaits Hyb Buffer Enhancer、2.8μL Nuclease-Free Water，用移液器吸打混匀后放置于ABI 9700PCR仪上95℃温育10分钟，然后取出PCR管加入3μL已经合成的探针(探针的浓度为60ng/μL)，旋涡震荡混匀后放置于ABI 9700PCR仪上65℃温育2小时，完成探针杂交反应。
2)、DNA捕获
向上一步杂交完成的反应体系中加入100μL GenoBaits DNA Probe Beads，上下吸打10次，放入ABI 9700PCR仪上65℃温育45分钟，使磁珠与探针结合。用100μL GenoBaitsWash Buffer I、150μL GenoBaits Wash BufferII分别对结合探针后的磁珠进行65℃热洗，然后再用100μL GenoBaits Wash Buffer I、150μL GenoBaits Wash Buffer II(和150μL GenoBaits Wash Buffer III分别对磁珠进行常温洗涤。洗涤完成的磁珠用20μLNuclease-Free Water进行重悬。
取13μL重悬后的DNA(带磁珠)加入到新的0.2mL PCR管中，然后加入15μLGenoBaits PCR Master Mix、2μL GenoBaits Primer Mix配置post-PCR体系，用ABI9700PCR仪进行文库扩增，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；重复2-4步，共15个循环；72℃延伸5min。
向post-PCR产物中加入45μL Beckmen AMPure XP Beads(Beackman公司)并用移液器上下吸打均匀，然后将0.2mL PCR管置于磁力架上至溶液澄清，弃去上清并用75％乙醇洗涤磁珠两次，用pH为8.0的Tris-HCl将文库DNA洗脱下来。完成探针的杂交捕获工作。
3)、DNA杂交捕获文库质检
用Qubit Fluorometric Quantitation(Thermo Fisher)对文库的DNA浓度进行测定，然后用琼脂糖凝胶电泳检测文库DNA的片段大小是否在300～400bp之间。
4)、DNA杂交捕获文库测序
将构建好的DNA文库用华大MGISEQ2000测序仪进行测序。
5)、基因型数据分析
测序数据经过FastQC(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/project)质控后，用BWA(bio-bwa.sourceforge.net)的默认参数将测序数据比对到参考基因组上，用GATK(software.broadinstitute.org/gatk)软件对测序数据进行SNP鉴定，用自编的Perl脚本对探针捕获测序的基因型分型信息进行提取，形成最终的基因型分型文件。
二、334份紫花苜蓿的聚类分析
分别比较334份紫花苜蓿品种在5037个SNP位点的基因型，以及其检出率，结果如表2和图2所示。从表2可以看出，基因分型的结果表明334份紫花苜蓿品种的检出率5037个SNP位点介于97.20％-99.88％。
表2
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三、334份材料群体结构划分
根据步骤1中的检验结果，对上述334份材料进行群体划分，发现这些材料可以分为4个亚群，结果如图2所示。从图2可以看出，334份紫花苜蓿分为四大类，与其来源的中苜1号、中苜3号、中苜4号以及中苜5号一一对应相匹配。
上述实施例可以表明，通过本发明的紫花苜蓿5037个SNP位点的比对，能够实现对紫花苜蓿分子育种、构建紫花苜蓿种质资源或品种的DNA指纹数据库以及检测任两个紫花苜蓿品种的相似性，进而实现紫花苜蓿的聚类分析。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (7)
1.5037个SNP位点或用于检测所述5037个SNP位点的物质在如下任一中的应用：
(1)制备紫花苜蓿SNP位点基因型检测的试剂盒；
(2)紫花苜蓿分子育种；
(3)构建紫花苜蓿种质资源或品种的DNA指纹数据库；
(4)检测任两个紫花苜蓿品种的相似性；
所述5037个SNP位点的物理位置是基于紫花苜蓿品种中苜4号的全基因组序列比对确定的，所述紫花苜蓿品种中苜4号的全基因组序列的版本号为GWH:GWHBECI00000000，上传日期为2021年8月21日的Zhongmu-4全基因序列；所述5037个SNP位点分别为位于1号染色体的584个位点；位于2号染色体的558个位点；位于3号染色体的666个位点；位于4号染色体的637个位点；位于5号染色体的546个位点；位于6号染色体的737个位点；位于7号染色体的607个位点；位于8号染色体的702个位点。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述5037个SNP位点具体如下表所示：
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其中SNP-id表示SNP位点的编号，chrom表示位点所在的染色体号，position表示位点在染色体上的位置，ref和alt表示每个SNP位点的两种类型。
3.一种用于检测紫花苜蓿SNP位点基因型检测的试剂盒，包括用于检测权利要求1或2中所述的5037个位点的物质。
4.一种检测紫花苜蓿种质的方法，其特征在于，包括提取待测紫花苜蓿的全基因组DNA并检测权利要求1或2中所述的5037个位点的基因型的步骤。
5.一种对紫花苜蓿进行聚类分析的方法，其特征在于，包括：
1)提取待测紫花苜蓿的全基因组DNA并检测权利要求1或2中所述的5037个位点的基因型；
2)根据所得基因型数据，建立聚类树状图，从而将所述紫花苜蓿划分为不同类群。
6.一种构建紫花苜蓿DNA指纹数据库的方法，包括如下步骤：
(a1)分别提取用于构建紫花苜蓿DNA指纹数据库的所有紫花苜蓿品种的基因组DNA；
(a2)检测所述所有紫花苜蓿品种的基因组DNA中权利要求1或2中所述的5037个SNP位点的基因型，所得基因型数据即构成紫花苜蓿DNA指纹数据库。
7.一种紫花苜蓿分子育种方法，包括如下步骤：将携带有目标性状的紫花苜蓿供体亲本与紫花苜蓿受体亲本杂交，再将所得杂交后代与所述紫花苜蓿供体亲本进行若干次回交，分别检测所述紫花苜蓿受体亲本以及所得的携带有所述目标性状的回交后代基因组DNA中权利要求1或2中所述的5037个SNP位点的基因型，根据检测结果从携带有所述目标性状的所述回交后代中选择所述5037个SNP位点的基因型与所述紫花苜蓿受体亲本一致性最高的个体。
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