CN117925724A - 载体组合、载药外泌体的制备方法、载药外泌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种载体组合、载药外泌体的制备方法、载药外泌体的制备方法、载药外泌体及其应用。载药外泌体的制备方法包括如下步骤：将载体组合转染293T细胞，构建表达转运蛋白的慢病毒；用表达转运蛋白的慢病毒转染脂肪干细胞，得到表达转运蛋白的脂肪干细胞；用添加了刺激剂的培养基对表达转运蛋白的脂肪干细胞进行培养，培养完成后收集培养上清液；分离得到携带有转运蛋白的外泌体；将外泌体和NAD+代谢干预活性物质混合，超声处理，得到载药外泌体。本发明的载药外泌体的制备方法，通过外泌体和NAD+代谢干预活性物质制备载药外泌体，通过用于转运蛋白可以将NAD+代谢干预活性物质的转运到外泌体内，可以实现外泌体运载NAD+代谢干预活性物质。
Description
技术领域
本发明涉及保健品技术领域，尤其是涉及一种载体组合、载药外泌体的制备方法、载药外泌体及其应用。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD+)代谢干预活性物质(如NMN、NA、NR、NAD等)通过维持细胞内充足的NAD+，可以保持DNA的自我修复能力，使年龄增长带来的DNA损伤得以有效修复，从而抑制衰老。然而，传统的方案中，NAD+代谢干预活性物质一般通过口服的方式给药，这种方式利用率低且靶向性差。
外泌体作为药物载体进行药物运输时，向细胞转运药物的效率高，具有一定的靶向性。
然而，目前尚未有运载NAD+代谢干预活性物质的外泌体的报道。
发明内容
基于此，有必要提供一种用于制备载药外泌体的载体组合。
此外，还有必要提供一种可以用于解决上述问题的载药外泌体的制备方法。
此外，还有必要提供一种上述载药外泌体的制备方法制备的载药外泌体及其应用。
一种载体组合，用于制备载药外泌体，包括重组载体和辅助载体，所述重组载体内插入有转运蛋白表达基因，所述转运蛋白表达基因用于表达用于转运NAD+代谢干预活性物质的转运蛋白。
在一个实施例中，所述转运蛋白选自NMN转运子、NA转运子、NR转运子和NAD转运子中的至少一种。
在一个实施例中，所述转运蛋白表达基因为用于表达NMN转运子的SLC12A8基因，所述转运蛋白表达基因的序列如SEQ ID No.1所示。
在一个实施例中，所述重组载体内还插入有红色荧光蛋白表达基因和嘌呤霉素表达基因，所述红色荧光蛋白表达基因的序列如SEQ ID No.2所示。
在一个实施例中，所述重组载体为pLV3-CMV-MCS-puro，所述辅助载体为pMD.2G和PSPAX。
一种载药外泌体的制备方法，包括如下步骤：
提供上述的载体组合；
将所述载体组合转染293T细胞，构建表达转运蛋白的慢病毒；
提供脂肪干细胞，用所述表达转运蛋白的慢病毒转染所述脂肪干细胞，得到表达所述转运蛋白的所述脂肪干细胞；
用添加了刺激剂的培养基对表达所述转运蛋白的所述脂肪干细胞进行培养，培养完成后收集培养上清液；
从所述培养上清液中分离得到外泌体，所述外泌体携带有所述转运蛋白；
将所述外泌体和所述NAD+代谢干预活性物质混合，超声处理，得到所需要的载药外泌体。
在一个实施例中，所述NAD+代谢干预活性物质选自NMN、NA、NR和NAD中的至少一种。
在一个实施例中，所述添加了刺激剂的培养基中，所述刺激剂的质量浓度为10μg/mL，所述刺激剂为Cytochalasin B；
用添加了刺激剂的培养基对表达所述转运蛋白的所述脂肪干细胞进行培养的操作中，培养条件为37℃、5％ CO2处理30分钟。
一种载药外泌体，由上述的载药外泌体的制备方法制备得到；
所述载药外泌体包括所述外泌体以及容纳在所述外泌体内的所述NAD+代谢干预活性物质。
一种上述的载药外泌体在保健品领域的应用。
本发明的载体组合可用于制备载药外泌体，本发明的载药外泌体的制备方法，通过外泌体和NAD+代谢干预活性物质制备载药外泌体，通过用于转运蛋白可以将NAD+代谢干预活性物质的转运到外泌体内，可以实现外泌体运载NAD+代谢干预活性物质。
结合说明书测试例可以看出，这种载药外泌体的制备方法制备的载药外泌体可以显著增加脂肪组织内的NAD+含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
其中：
图1为实施例1中脂肪干细胞NMN转运子SLC12A8的表达的Western blot检测结果图。
图2为实施例1所述脂肪干细胞外泌体标志性蛋白及NMN转运子的表达的Westernblot检测结果图。。
图3为测试例1中实施例1～3以及对比例1制备的载药外泌体中的NMN含量检测结果图。
图4为测试例2中用载药外泌体处理小鼠的白色脂肪、肝脏、肺、心脏、肾脏组织后的NAD+水平检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开了一实施方式的载体组合，用于制备载药外泌体，包括重组载体和辅助载体，重组载体内插入有转运蛋白表达基因，转运蛋白表达基因用于表达用于转运NAD+代谢干预活性物质的转运蛋白。
优选的，本实施方式中，转运蛋白选自NMN转运子、NA转运子、NR转运子和NAD转运子中的至少一种。
具体来说，本实施方式中，转运蛋白表达基因为用于表达NMN转运子的SLC12A8基因，所述转运蛋白表达基因的序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，本实施方式中，重组载体内还插入有红色荧光蛋白表达基因和嘌呤霉素表达基因，红色荧光蛋白表达基因的序列如SEQ ID No.2所示。
红色荧光蛋白表达基因用于表达红色荧光蛋白，嘌呤霉素表达基因用于表达嘌呤霉素，二者可以用于辅助分离纯化。
具体来说，本实施方式中，重组载体为pLV3-CMV-MCS-puro，辅助载体为pMD.2G和PSPAX。
本发明的载体组合可用于制备载药外泌体。
本发明还公开了一实施方式的载药外泌体的制备方法，包括如下步骤：
S10、提供上述的载体组合；
S20、将载体组合转染293T细胞，构建表达转运蛋白的慢病毒；
S30、提供脂肪干细胞，用表达转运蛋白的慢病毒转染脂肪干细胞，得到表达转运蛋白的脂肪干细胞；
S40、用添加了刺激剂的培养基对表达转运蛋白的脂肪干细胞进行培养，培养完成后收集培养上清液；
S50、从培养上清液中分离得到外泌体，外泌体携带有转运蛋白；
S60、将外泌体和NAD+代谢干预活性物质混合，超声处理，得到所需要的载药外泌体。
本发明的载药外泌体的制备方法，通过外泌体和NAD+代谢干预活性物质制备载药外泌体，通过用于转运蛋白可以将NAD+代谢干预活性物质的转运到外泌体内，可以实现外泌体运载NAD+代谢干预活性物质。
结合说明书测试例可以看出，这种载药外泌体的制备方法制备的载药外泌体可以显著增加脂肪组织内的NAD+含量。
优选的，本实施方式中，NAD+代谢干预活性物质选自NMN、NA、NR和NAD中的至少一种。
优选的，本实施方式中，转运蛋白表达基因为用于表达NMN转运子的SLC12A8基因，重组载体内还插入有红色荧光蛋白表达基因和嘌呤霉素表达基因。
具体来说，本实施方式中，重组载体为pLV3-CMV-MCS-puro，辅助载体为pMD.2G和PSPAX。
重组载体和辅助载体一起转染293T细胞，即可包装成表达转运蛋白的慢病毒。
本实施方式中，还包括在用表达转运蛋白的慢病毒转染脂肪干细胞的操作之后，在得到表达转运蛋白的脂肪干细胞的操作之前，进行如下操作：对转染后的脂肪干细胞进行筛选。
具体来说，本实施方式中，对转染后的脂肪干细胞进行筛选的操作为：通过嘌呤霉素杀细胞和红色荧光蛋白流式细胞分选对转染后的脂肪干细胞进行筛选，得到表达NMN转运子膜蛋白SLC12A8的阳性脂肪干细胞。
优选的，本实施方式中，添加了刺激剂的培养基中，刺激剂的质量浓度为10μg/mL，刺激剂为Cytochalasin B。
优选的，本实施方式中，用添加了刺激剂的培养基对对表达转运蛋白的脂肪干细胞进行培养的操作中，培养条件为37℃、5％ CO2处理30分钟。
优选的，本实施方式中，将外泌体和NAD+代谢干预活性物质混合后超声处理的操作中，超声处理的具体参数为：20KHZ，脱气处理，6秒/次，超声4次，期间每次超声后置于冰上平衡5分钟。
本发明还公开了一实施方式的由上述载药外泌体的制备方法制备得到的载药外泌体，载药外泌体包括外泌体以及容纳在外泌体内的NAD+代谢干预活性物质。
本发明的载药外泌体包括外泌体和NAD+代谢干预活性物质，通过用于转运蛋白可以将NAD+代谢干预活性物质的转运到外泌体内，可以实现外泌体运载NAD+代谢干预活性物质。
结合说明书测试例可以看出，这种载药外泌体可以显著增加脂肪组织内的NAD+含量。
优选的，本实施方式中，外泌体和NAD+代谢干预活性物质的质量比为1：1～3。
本发明还公开了一实施方式的上述的载药外泌体在保健品领域的应用。
以下为具体实施例。
具体实施例中，NMN购自深圳邦泰生物公司，如无特别说明，实施例中使用到的培养基为DMEM/F12培养基。
实施例1携带有用于NMN转运子的外泌体的制备
提供脂肪来源的脂肪干细胞(深圳市茵冠生物公司)，利用常规干细胞培养方法获取扩增后的脂肪干细胞。具体来说，用加有10％胎牛血清的低糖DMEM培养基，在37℃、5％CO2的培养箱中对获取的脂肪干细胞进行培养，每2-3天更换一次培养基，当细胞生长至80-90％的密度时，进行细胞传代。
在脂肪来源的脂肪干细胞不具备高表达NMN转运子这一必要特征时，利用蛋白质过量表达方法构建高表达NMN转运子的脂肪干细胞。将NMN转运子SLC12A8基因序列(如SEQID No.1所示)和红色荧光蛋白mCherry基因序列(如SEQ ID No.2所示)插入到含有嘌呤霉素基因的慢病毒表达质粒pLV3-CMV-MCS-puro(购自淼灵生物)上；将该质粒和辅助质粒pMD.2G、PSPAX(均购自淼灵生物)一起转染293T细胞(购自武汉普诺赛)，包装慢病毒；DMEM完全培养基培养72小时左右，将含慢病毒的上清液用0.45μm滤头过滤，按上清液和5X PEG-8000NaCl溶液(联迈生物)体积比4:1的比例充分混合，4℃、5000rpm离心20分钟，弃上清，溶解后得纯化后的慢病毒；将纯化后的慢病毒感染脂肪来源的脂肪干细胞72小时，使其高表达NMN转运子，用含2μg/mL嘌呤霉素的培养基筛选阳性脂肪干细胞，并在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达，最后使用流式进一步富集高表达NMN转运子膜蛋白的阳性脂肪干细胞并培养。
利用Western blot表征NMN转运子的表达情况，检测结果如图1所示。
结合图1可以看出，脂肪干细胞高表达NMN转运子SLC12A8。
分别将常规脂肪干细胞和高表达NMN转运子膜蛋白的脂肪干细胞富集并培养，并刺激脂肪干细胞分泌外泌体。
具体操作如下：将细胞在培养基中培养至密度达到80％～90％，培养基中含有10μg/mL的刺激剂Cytochalasin B。收集培养上清液，去除细胞碎片、蛋白质和其他杂质，保留培养上清液。
通过超速离心(12000g，20分钟)将培养上清液内的细胞碎片和细胞残留物去除，获得初步的外泌体。再次进行超速离心(100,000g，60分钟)以分离得到纯净的外泌体。
其中，常规脂肪干细胞分泌的外泌体记为对照外泌体，高表达NMN转运子膜蛋白的脂肪干细胞分泌的外泌体记为实验外泌体。
利用Western blot对脂肪干细胞外泌体标志性蛋白进行鉴定，表征外泌体上NMN转运子的表达程度，检测结果如图2所示。
结合图2可以看出，脂肪干细胞外泌体上高表达NMN转运子SLC12A8。
实施例2
将25μg蛋白/mL实施例1制备的实验外泌体溶液和25μg/mL NMN溶液混合，超声处理，超声法的具体参数为：20KHZ，脱气处理，6秒/次，超声4次，期间每次超声后置于冰上平衡5分钟。超声结束后，室温平衡30分钟后13500g离心40分钟，将上清液与沉淀分离，得到沉淀为所需要的载药外泌体。
实施例3
将25μg蛋白/mL实施例1制备的实验外泌体溶液和50μg/mL NMN溶液混合，超声处理，超声法的具体参数为：20KHZ，脱气处理，6秒/次，超声4次，期间每次超声后置于冰上平衡5分钟。超声结束后，室温平衡30分钟后13500g离心40分钟，将上清液与沉淀分离，得到沉淀为所需要的载药外泌体。
实施例4
将25μg蛋白/mL实施例1制备的实验外泌体溶液和75μg/mL NMN溶液混合，超声处理，超声法的具体参数为：20KHZ，脱气处理，6秒/次，超声4次，期间每次超声后置于冰上平衡5分钟。超声结束后，室温平衡30分钟后13500g离心40分钟，将上清液与沉淀分离，得到沉淀为所需要的载药外泌体。
对比例1
将25μg蛋白/mL实施例1制备的对照外泌体溶液和75μg/mL NMN溶液混合，超声处理，超声法的具体参数为：20KHZ，脱气处理，6秒/次，超声4次，期间每次超声后置于冰上平衡5分钟。超声结束后，室温平衡30分钟后13500g离心40分钟，将上清液与沉淀分离，得到沉淀为所需要的载药外泌体。
测试例1
通过高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)法，分别测定实施例1～3以及对比例1制备的载药外泌体中的NMN含量，检测结果如图3所示。
结合图3可以看出，实施例1～3制备的载药外泌体中的NMN含量显著高于对比例1制备的载药外泌体中的NMN含量。
测试例2
分别将实施例1～3、对比例1制备的载药外泌体以及NMN与生理盐水混合构建五组注射用悬液，其中，第一组采用生理盐水+5μg蛋白/mL的实施例1制备的载药外泌体，第二组采用生理盐水+5μg蛋白/mL的实施例2制备的载药外泌体，第三组采用生理盐水+5μg蛋白/mL的实施例3制备的载药外泌体，第四组采用生理盐水+5μg蛋白/mL的对比例1制备的载药外泌体，第五组采用生理盐水+75μg/mL的NMN。
使用6个月龄的C57BL/6J雌性小鼠，每组6只，使用尾静脉注射方法分别，按5mL/kg体积将五组注射用悬液注射于小鼠体内，每两天注射1次，连续注射3次。于最后一次注射48小时后通过颈部脱臼方法处死小鼠。
采集小鼠的白色脂肪、肝脏、肺、心脏、肾脏组织，利用HPLC-MS方法检测各组织中的NAD+水平，检测结果如图4所示。
结合图4可以看出，实施例1～3、对比例1制备的载药外泌体，可以显著提高脂肪组织中的NAD+含量。
此外，第一组、第二组和第三组的肝脏、肺、心脏、肾脏中的NAD+含量明显低于第一组、第二组和第三组的脂肪组织。
说明对比例1，实施例1～3制备的载药外泌体，有明显的脂肪组织选择性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种载体组合，用于制备载药外泌体，其特征在于，包括重组载体和辅助载体，所述重组载体内插入有转运蛋白表达基因，所述转运蛋白表达基因用于表达用于转运NAD+代谢干预活性物质的转运蛋白。
2.根据权利要求1所述的载体组合，其特征在于，所述转运蛋白选自NMN转运子、NA转运子、NR转运子和NAD转运子中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的载体组合，其特征在于，所述转运蛋白表达基因为用于表达NMN转运子的SLC12A8基因，所述转运蛋白表达基因的序列如SEQ ID No.1所示。
4.根据权利要求3所述的载体组合，其特征在于，所述重组载体内还插入有红色荧光蛋白表达基因和嘌呤霉素表达基因，所述红色荧光蛋白表达基因的序列如SEQ ID No.2所示。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的载体组合，其特征在于，所述重组载体为pLV3-CMV-MCS-puro，所述辅助载体为pMD.2G和PSPAX。
6.一种载药外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供如权利要求1～5中任意一项所述的载体组合；
将所述载体组合转染293T细胞，构建表达转运蛋白的慢病毒；
提供脂肪干细胞，用所述表达转运蛋白的慢病毒转染所述脂肪干细胞，得到表达所述转运蛋白的所述脂肪干细胞；
用添加了刺激剂的培养基对表达所述转运蛋白的所述脂肪干细胞进行培养，培养完成后收集培养上清液；
从所述培养上清液中分离得到外泌体，所述外泌体携带有所述转运蛋白；
将所述外泌体和所述NAD+代谢干预活性物质混合，超声处理，得到所需要的载药外泌体。
7.根据权利要求6所述的载药外泌体的制备方法，其特征在于，所述NAD+代谢干预活性物质选自NMN、NA、NR和NAD中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的载药外泌体的制备方法，其特征在于，所述添加了刺激剂的培养基中，所述刺激剂的质量浓度为10μg/mL，所述刺激剂为Cytochalasin B；
用添加了刺激剂的培养基对表达所述转运蛋白的所述脂肪干细胞进行培养的操作中，培养条件为37℃、5％CO2处理30分钟。
9.一种载药外泌体，其特征在于，由如权利要求6～8中任意一项所述的载药外泌体的制备方法制备得到；
所述载药外泌体包括所述外泌体以及容纳在所述外泌体内的所述NAD+代谢干预活性物质。
10.一种权利要求9所述的载药外泌体在保健品领域的应用。
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