CN117925432A - 一种高效快速合成赤藓糖醇的酵母菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效快速合成赤藓糖醇的酵母菌及其构建方法，采用解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica为合成底盘，通过代谢工程改良手段，对该酵母进行遗传改良，增强其合成赤藓糖醇的产量、转化率，尤其是生产效率；将改造后的酵母菌用于合成赤藓糖醇的方法为：以发酵初始浓度为50～350克/升的葡萄糖作为碳源，以发酵初始浓度为5～30克/升的氮源以及无机盐类为原料，灭菌处理培养基，冷却后接入所述解脂耶氏酵母菌，在有氧条件下进行连续发酵或分批补料发酵；发酵结束后，从发酵液中提纯赤藓糖醇。该菌株能以葡萄糖为原料高效快速合成赤藓糖醇。在连续补料的条件下赤藓糖醇产量超过350g/L，生产效率超过4.5克/升·小时，比对比菌株提高接近100％。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，涉及一种高效快速合成赤藓糖醇的酵母菌及其构建方法；更具体涉及以解脂耶氏酵母菌为底盘微生物，通过代谢工程等手段来构建高效发酵合成赤藓糖醇的方法，利用该方法获得能以葡萄糖为碳源发酵合成赤藓糖醇的专有解脂耶氏酵母菌，以及利用该菌株来发酵合成赤藓糖醇方法。
背景技术
过量食用高热量的白砂糖、果葡糖浆或容易诱患高血糖、肥胖、高血脂等健康问题，因此从饮食上预防这些健康问题尤其显得重要。近几年来，减糖与控糖食品受到消费者的青睐。减糖类产品一般含有低热量多元醇如木糖醇、甘露醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇等。在这些多元醇产品中，赤藓糖醇作为一种天然甜味剂，由于其独特的特性，如比其它糖醇甜味剂都具有更高的每日可接受摄入量和安全性、低吸湿性和无回味等，在食品工业中得到了广泛应用。由于通过化学合成赤藓糖醇具有低产量、高复杂性和苛刻的操作条件，使赤藓糖醇的化学合成无任何优势，而发酵法合成赤藓糖醇具有成本较低，绿色安全使其成为商业化生产的唯一途径。赤藓糖醇主要由高渗酵母从葡萄糖发酵获得，赤藓糖醇生产参数的优化方法主要集中在菌株筛选和诱变育种、培养基优化和培养模式上。到目前为止，赤藓糖醇的最高产量、转化率和生产效率大约为240g/L、0.60g/g和2.84g/L·h(Jeya,M.,Lee,K.M.,Tiwari,M.K.,Kim,J.S.,Gunasekaran,P.,Kim,S.Y.,Kim,I.W.,Lee,J.K.,2009.Isolationof a novel high erythritol-producing Pseudozyma tsukubaensis and scale-up oferythritol fermentation to industrial level.Appl.Microbiol.Biotechnol.83,225-31)。使用的菌株为Pseudozyma tsukubaensis，虽然该菌株具有较高的产量与生产效率，但是该菌株也不属于美国FDA或者我国批准的公认安全菌株，限制了其使用。
而解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)因其优异的基因可操作性、广泛的底物利用率、以及公认安全性而受到更多关注(Bilal,M.,Xu,S.,Iqbal,H.M.N.,Cheng,H.,2020.Yarrowia lipolytica as an emerging biotechnological chassis forfunctional sugars biosynthesis.Critical Reviews in Food Science andNutrition.61,535-552.)。在诱变和优化培养条件后，该酵母对赤藓糖醇的最大产量、产量和生产率分别可达231.2g/L(Li,S.,Zhang,Y.,Li,L.,Yuan,Y.,Sun,H.,Xing,X.-H.,Wang,X.,Zhang,C.,2023.Establishment of picodroplet-based co-culture system toimprove erythritol production in Yarrowia lipolytica.Biochem.Eng.J.198.)、0.67g/L(Mirończuk,A.M.,Dobrowolski,A.,Rakicka,M.,Rywińska,A.,Rymowicz,W.,2015.Newly isolated mutant of Yarrowia lipolytica MK1 as aproper host forefficient erythritol biosynthesis from glycerol.Process Biochem.50,61-68.)和2.51g/L·h(Wang,N.,Chi,P.,Zou,Y.,Xu,Y.,Xu,S.,Bilal,M.,Fickers,P.,Cheng,H.,2020.Metabolic engineering of Yarrowia lipolytica for thermoresistance andenhanced erythritol productivity.Biotechnol Biofuels.13,176)。尽管现有解脂耶氏酵母菌株的赤藓糖醇的生产和产量已达到工业水平，但是生产效率(生产率)仍然较低，发酵时间长，消耗的能源大，这意味着生产成本由于更长的发酵时间而增加。因此，非常有必要通过代谢工程的手段进一步提高转化效率。
国外报道的以解脂耶氏酵母为菌株，生产赤藓糖醇的原料有采用葡萄糖或者甘油的，大部分文献采用甘油作为原料，因为这些报道认为甘油可以来自生物柴油加工的废弃原料，价值低下。因此认为采用生物柴油加工的下脚料甘油为碳源发酵生产赤藓糖醇具有原料的优势。基于此，Mirończuk等人首次将甘油应用于赤藓糖醇代谢工程的碳源原料，改良解脂耶氏酵母，通过利用甘油加速通过细胞膜来提升赤藓糖醇的生产。甘油激酶(GK或GUT1)过表达和GK与甘油-3-磷酸脱氢酶(GDH或GUT2)共表达的赤藓糖醇生产率分别为对照菌株的24％和35％，能够在44-48小时内将150克/升的甘油利用完，比对比菌株的时间显著减少(Mirończuk,A.M.,Rzechonek,D.A.,Biegalska,A.,Rakicka,M.,Dobrowolski,A.,2016.A novel strain of Yarrowia lipolytica as a platform for value-addedproduct synthesis from glycerol.Biotechnology for Biofuels.9：1-12)。粗甘油作为生产化学产品的廉价碳源是可以接受的，但目前的赤藓糖醇主要用于食品行业，对原料要求较高，生物柴油加工产生的下脚料粗甘油含有多种杂质，不符合食品级要求，因此，实际上这种粗甘油是没有被批准用于食品级赤藓糖醇生产的原料的。目前，工业生产赤藓糖醇的主要原料仍然是食品级葡萄糖粉末或者液体葡萄糖，因此开发一种利用葡萄糖高效生产赤藓糖醇的酵母底盘尤为重要，能够缩短发酵时间，提高生产效率。
在本发明人于2020年申请的一项专利中(专利申请号：2020100692506.6，专利名称：合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法及其菌株；发明人：程海荣，王楠，池萍)，利用代谢工程的方法，提高解脂耶氏酵母合成赤藓糖醇途径的部分基因表达，并且敲除了部分副产物合成相关的基因以及部分产物利用的相关基因，增强了“合成机器”的工作效率，提高了赤藓糖醇的合成产量与合成效率，获得的专利菌株CGMCCNo.19351在150升发酵罐中发酵合成赤藓糖醇最高产量达到198.4克/升，转化率达到62％，发酵时间为85小时，生产效率为2.33克/升·小时，并且不合成副产物甘露糖醇，也不再利用产物赤藓糖醇。技术参数虽然比之前的技术有所提高，但仍然具有很大的改进优化空间，比如转化率、生产效率(生产强度)仍需要大幅提升，发酵周期仍然较长，需要大幅降低，以节约成本，节约能源。本发明正是为了改进这些不足之处而进行了大量的工作。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的由葡萄糖发酵合成赤藓糖醇的菌株的不足之处，提供一种高效快速合成赤藓糖醇的酵母菌及其构建方法，并采用该方法构建一株高效快速发酵合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母工程菌株，以及采用该菌株发酵碳源如葡萄糖合成赤藓糖醇并从富含赤藓糖醇的发酵液中分离纯化赤藓糖醇的方法。
本发明发现底物的快速高效运输进细胞是发展高效微生物细胞工厂的一个重要研究点，只有底物原料能高效快速进入细胞，细胞内的“合成机器”才能获得足够的原料来合成产物。同时加强细胞内的“合成机器”的协作也是非常重要的点；当底物原料高效转运进细胞后，若合成机器不能及时快速合成产物，就会导致底物的积累，从而反馈抑制底物的转运。另外，产物合成后也需要及时的运输出细胞，否则就有可能产生反馈抑制。因此需要转运蛋白(包括原料转入的转运蛋白以及产物输出的转运蛋白)工程与途径工程紧密结合，才能实现产物赤藓糖醇的高效合成，二者缺一不可。本发明采用这种全局的设计策略，而不是以往的只从细胞内的赤藓糖醇合成途径出发，从而达到高效快速合成赤藓糖醇的目的。
本发明通过合成生物学的手段，将原有的合成赤藓糖醇的专利解脂耶氏酵母菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.19351进行多重策略的改良。CGMCC No.19351菌株在中国发明专利申请号2020100692506.6中亦称为Yarrowia lipolytica ery949-4Δ，该菌株已经于2020年1月14日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19351，基因型为：ery::HK::TKL1::TAL::EryPase△PGI△ArDH△MDH△EYD(过表达果糖激酶基因、转酮酶基因、转醛酶基因、4-磷酸赤藓糖磷酸酶基因，同时敲除四种基因磷酸葡萄糖异构酶基因、阿拉伯糖醇脱氢酶基因、甘露醇脱氢酶基因以及赤藓糖醇脱氢酶基因)，该底盘菌株的背景信息以及构建方法详见申请号为2020100692506.6国家发明专利。在本发明中以此底盘CGMCC No.19351为出发菌株对其进行改良，获得的新的酵母为为Yarrowia lipolyticaCGMCC No.28807，能够利用葡萄糖为碳源高效快速合成赤藓糖醇。
本发明通过代谢工程改良手段，在底盘CGMCC No.19351酵母菌基础上进行进一步协同基因操作，一方面进一步增强底物碳源如葡萄糖转运进入底盘细胞的效率，一方面进一步增强细胞内赤藓糖醇合成的能力，一方面增强产物赤藓糖醇输出细胞的效率，通过这三方面的协作，从而使得获得的新的解脂耶氏酵母菌株能由葡萄糖碳源高效快速发酵合成赤藓糖醇。由于保留了出发菌株CGMCC No.19351的性能，如无副产物甘露醇与阿拉伯糖醇的合成，且不会再利用赤藓糖醇，新的菌株Yarrowia lipolytica CGMCCNo.28807比出发菌株CGMCC No.19351具有更好的实施效果，取得的实施效果详见实施例。
本发明的目的可以通过以下方案来实现：
第一方面，本发明提供了一种高效快速合成赤藓糖醇的酵母菌，以解脂耶氏酵母菌株为底盘微生物，引入与赤藓糖醇合成有关的基因所获得的酵母菌。
作为本发明的一个实施方案，所述解脂耶氏酵母菌株为基因组中含有与SEQ IDNo.1序列具有97％及以上同源性或相似性的DNA序列，且能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母菌株。
进一步地，所述解脂耶氏酵母菌株包括Yarrowia lipolytica CGMCC 7326、Yarrowia lipolytica ery929 CGMCC No.18478、Yarrowia lipolytica ery929 CGMCCNo.19351中的任意一种。其中Yarrowia lipolytica CGMCC 7326菌株参考本发明人发表的论文(Huiling Cheng et al.Identification,characterization of two NADPH-dependent erythrose reductases in the yeast Yarrowia lipolytica andimprovement of erythritol productivity using metabolic engineering.MicrobialCell Factories,2018,17:133.)。
更进一步地，所述解脂耶氏酵母菌株为Yarrowia lipolytica ery929 CGMCCNo.19351。
本发明使用的底盘解脂耶氏酵母菌株Yarrowia lipolytica ery929，已经于2020年1月14日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19351。
作为本发明的一个实施方案，所述与赤藓糖醇合成有关的基因包括以下基因的一种或一种以上：
(1)编码葡萄糖转运蛋白(Glucose transporters proteins,GTPs)的基因，包括GTPs1(SEQ ID No.2),GTPs2(SEQ ID No.3),GTPs3(SEQ ID No.4),GTPs4(SEQ ID No.5)等；
(2)编码赤藓糖醇合成酶(Erythritol synthases,ETs)的基因，包括ETs1(SEQ IDNo.6),ETs2(SEQ ID No.7),ETs3(SEQ ID No.8),ETs4(SEQ ID No.9)等；
(3)编码5-磷酸核酮糖异构酶(Ribulose-5-P isomerase,RPI,SEQ ID No.10)的基因；
(4)编码5-磷酸核酮糖差向异构酶(Ribulose-5-P,epimerase,RPE,SEQ IDNo.11)的基因；
(5)编码葡萄糖激酶(Glucose kinase,GLK,SEQ ID No.12)的基因；
(6)编码赤藓糖醇转运蛋白(Erythritol transporter,ETP,SEQ ID No.13)的基因；
(7)编码果糖-6-磷酸激酶(Fructose-6-P kinase,FPK,SEQ ID No.14)的基因；
(8)编码果糖1,6-二磷酸醛缩酶(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase,FBA,SEQ IDNo.15)的基因；
(9)编码生长因子(Growth factors,GFs,SEQ ID No.16)的基因；
(10)编码生长因子的DNA结合转录因子(Growth factor-DNA-bindingtranscription factor,GFDBTF,SEQ ID No.17)的基因。
特别需要提及的是，上述十种基因种类或16条基因序列(SEQ ID No.2至SEQ IDNo.17)均来自解脂耶氏酵母自身，而非来自任何其它异源生物。引入上述十种基因种类或16条基因序列(SEQ ID No.2至SEQ ID No.17)的目的在于使底盘微生物获得相应的功能，或增强相应的功能。
作为本发明的一个实施方案，所述赤藓糖醇高效合成基因包括：上述基因(1)、基因(6)，还包括上述基因(2)-(5)，(7)-(10)中的至少一种。
在一些优选实施例中，所述酵母菌为以解脂耶氏酵母菌株为底盘微生物，引入如SEQ ID No.2至SEQ ID No.17序列所示的可能的与赤藓糖醇高效合成有关的基因的表达框所获得的酵母菌。
第二方面，本发明提供一种高效快速合成赤藓糖醇的酵母菌，所述酵母菌为解脂耶氏酵母菌Yarrowia lipolytica菌株，其保藏编号为CGMCC No.28807，于2023年11月14日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所。
第三方面，本发明一种高效快速合成赤藓糖醇的酵母菌的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
A1、设计赤藓糖醇高效合成基因表达框，并合成该基因表达框；
A2、将步骤A1合成的基因表达框转化解脂耶氏酵母；
A3、筛选含有基因表达框的解脂耶氏酵母，即所述酵母菌；
或，
B1、将如SEQ ID No.2至SEQ ID No.17任意一种或多种所示的赤藓糖醇高效合成基因与自身的启动子以及自身的终止子进行组合，构成基因开放阅读框(open readingframe,ORF)；
B2、筛选含有基因开放阅读框的解脂耶氏酵母，即所述酵母菌。
作为本发明的一个实施方案，步骤A1中，所述赤藓糖醇高效合成基因表达框包括上游同源整合臂序列、启动子序列、如SEQ ID No.2至SEQ ID No.17任意一种或多种所示的赤藓糖醇高效合成基因序列、终止子序列、启动子序列、筛选标记序列、终止子序列、下游同源整合臂序列。
进一步地，在一些实施例中，所述赤藓糖醇高效合成基因表达框包括上游同源整合臂序列、下游同源整合臂序列、启动子序列、终止子序列、筛选标记序列、如SEQ ID No.2至SEQ ID No.17任意一种或多种所示的赤藓糖醇高效合成基因序列
作为本发明的一个实施方案，上、下游同源整合臂序列是一段来自解脂耶氏酵母自身基因组中的DNA序列，能够将上下游同源臂之间的DNA序列通过同源双交换重组的方法插入到基因组中的同源DNA序列之间。常用的同源臂包括解脂耶氏酵母的intA序列、intB序列、intC序列，intD序列，intE序列，intF序列等(Holkenbrink C,Dam M I,Kildegaard KR,et al.EasyCloneYALI:CRISPR/Cas9-based synthetic toolbox for engineering ofthe yeast Yarrowia lipolytica[J].Biotechnology journal,2018,13(9):1700543.)，这些序列在公开数据库如NCBI中能获取。
作为本发明的一个实施方案，所述启动子序列是一段能够诱发启动其下游基因转录的DNA序列，该序列可以是人工合成的启动子序列如UAS1B8、UAS1B16、hp4d等启动子序列(Blazeck et al.2013.Generalizing a hybrid synthetic promoter approach inYarrowia lipolytica.Appl Microbiol Biotechnol,97:3037-3052.)，也可以是来自解脂耶氏酵母本身基因的启动子序列如转酮酶基因启动子序列、转醛酶基因的启动子序列、PEXP启动子等。
作为本发明的一个实施方案，所述终止子序列是一段能够终止其上游基因继续转录的DNA序列，如细胞色素CYC基因的终止子序列(Tcyc1)、碱性蛋白酶AEP基因终止子序列(Taep)、转酮酶TKL基因终止子序列等。
作为本发明的一个实施方案，所述筛选标记序列是指抗生素抗性基因如潮霉素抗性基因等，或者营养选择型基因如乳糖酶基因(Lac2，编码产物使得解脂耶氏酵母能利用乳糖)、核糖醇脱氢酶基因(RDH，编码产物使得解脂耶氏酵母能利用核糖醇)、尿嘧啶核苷酸合成酶基因3(URA3，编码产物使得ura3缺陷型的解脂耶氏酵母能在不含尿嘧啶的基本培养基上生长)、蔗糖酶Suc2基因、霉酚酸筛选标记(guaB)等。
作为本发明的一个实施方案，步骤A1中，所述合成的方法包括同源双交换重组的方法。
本发明中，根据解脂耶氏酵母中上述需要表达的基因的序列(SEQ ID2至SEQID17)，体外合成完整的用于基因组整合的表达框(即整合表达载体)。整合表达载体含有同源整合臂序列(包括上游与下游两段)、启动子序列、终止子序列、筛选标记序列等必要的DNA元件。本发明中同源整合臂序列是一段来自解脂耶氏酵母自身基因组中的DNA序列，能够将上下游同源臂之间的DNA序列通过同源双交换重组的方法插入到基因组中的同源DNA序列之间。启动子是一段能够诱发启动其下游基因转录的DNA序列，该序列可以是人工合成的启动子序列如UAS1B8、UAS1B16、hp4d等启动子序列(Blazeck etal.2013.Generalizinga hybrid synthetic promoter approach in Yarrowia lipolytica.Appl MicrobiolBiotechnol,97:3037-3052.)，也可以是来自解脂耶氏酵母本身基因的启动子序列如转酮酶基因启动子序列、转醛酶基因的启动子序列等。终止子是一段能够终止其上游基因继续转录的DNA序列。筛选标记序列是指抗生素抗性基因如潮霉素抗性基因等，或者营养选择型基因如乳糖酶基因(Lac2，编码产物使得解脂耶氏酵母能利用乳糖)、核糖醇脱氢酶基因(RDH，编码产物使得解脂耶氏酵母能利用核糖醇)、尿嘧啶核苷酸合成酶基因3(URA3，编码产物使得ura3缺陷型的解脂耶氏酵母能在不含尿嘧啶的基本培养基上生长)等。质粒含有上下游同源整合臂序列、启动子序列、目的基因序列(即赤藓糖醇高效合成基因序列)、终止子序列、解脂耶氏酵母筛选标记序列等必要的DNA元件。
作为本发明的一个实施方案，步骤A2中，转化方法参考本发明人程海荣发表的论文：Journal of Functional Foods,2017,32：208～217。
作为本发明的一个实施方案，步骤A3和B2中，筛选在含筛选标记的培养基中进行。若整合表达载体上含有乳糖酶筛选标记，转化后则将酵母涂布在含乳糖的YNB基本培养基上筛选(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，乳糖10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)。若整合表达载体上含有潮霉素抗性基因筛选标记，转化后则将酵母涂布在含潮霉素的YPD培养基上筛选(葡萄糖10克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，琼脂15克/升，潮霉素300微克/毫升，pH6.0)；若整合表达载体上含有霉酚酸筛选标记，转化后则将酵母涂布在含霉酚酸的培养基上筛选(酵母氮碱6.7克/升，硫酸铵5克/升，葡萄糖20克/升，霉酚酸300毫克/升，琼脂粉15克/升，pH6.5)。
进一步地，提取转化子的总RNA并进行反转录进行基因定量表达，若基因表达量显著增加，说明目的基因已经整合到解脂耶氏酵母基因组中且进行了表达。接着采用Cre/loxP系统回收转化子中的筛选标记(原理见参考文献：J.Microbiol.Methods,2003,55,727–737)，具体回收筛选方法详见实施例。第一种目的基因整合到基因组中，筛选标记回收后获得的工程菌株即可以作为宿主，继续转化第二种目的基因。验证第二种目的基因的整合、筛选标记的回收后获得的新的工程菌株又可以作为宿主用于转化其它的目的基因，依次操作，直到将全部目的基因整合到基因组中，并去除筛选标记基因。这些基因的操作方法是本领域常见的分子生物学操作方法。最终获得能高效快速合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母菌株Yarrowia lipolytica CGMCC 28807，过表达所述十种基因(或从SEQ ID No.2至SEQID No.17共16条基因)。
通过上述分子生物学的操作，获得一系列解脂耶氏酵母的突变株，其中包括过表达上述十种基因中的一种或一种以上的突变株，优选地，突变株为同时过表达上述十种基因的解脂耶氏酵母菌株：Yarrowia lipolytica CGMCC No.28807。
本发明所述构建方法，是以能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母菌株(Yarrowialipolytica，之前称为Candida lipolytica)为底盘微生物，通过代谢工程、基因工程的手段，构建以葡萄糖为碳源发酵高效合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母菌株的方法。该方法能显著提高其合成赤藓糖醇的能力，包括大幅缩短发酵时间，提高生产效率，提高发酵液中目标产物赤藓糖醇的含量，同时无副产物如甘露醇与阿拉伯糖醇的合成。
作为本发明的一个实施方案，步骤B1中，采用来自解脂耶氏酵母自身的基因的目的是：避免本发明构建的新菌株属于转基因的范畴。转基因是将一种生物的基因转入另外一种不同的生物基因组中，而本发明中不涉及任何解脂耶氏酵母自身基因组以外的其它生物的基因，只是将来自自身的与赤藓糖醇高效合成相关的基因进行组合以进一步增强表达，以增强合成产物的物质流。
上述与赤藓糖醇合成相关的基因是通过以上方式在解脂耶氏酵母中表达的，这些方式仅是作为示例来说明目的基因是如何整合在解脂耶氏酵母细胞中，而不是对本发明的限定。
第四方面，本发明提供了一种所述酵母菌在合成赤藓糖醇中的用途。
第五方面，本发明提供了一种所述酵母菌发酵合成赤藓糖醇的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、将酵母菌于培养基中发酵培养，分离得到含赤藓糖醇的发酵液以及酵母细胞；
S2、从步骤S1中所述含赤藓糖醇的发酵液以及酵母细胞中分离纯化得到赤藓糖醇。
作为本发明的一个实施方案，所述培养基包括碳源、氮源、无机盐、水；所述培养条件包括：在起始pH值3.0～7.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌发酵培养。
进一步地，在一些实施例中，所述pH值包括3.0、7.0。
进一步地，在一些实施例中，所述温度包括25℃、28℃、30℃、32℃、33℃、35℃。
进一步地，所述培养基中的碳源包括葡萄糖，所述碳源用量为50～350克/升。
进一步地，在一些实施例中，所述碳源用量包括50克/升、100克/升、200克/升、250克/升、300克/升、310克/升、320克/升、350克/升。
进一步地，所述培养基中的氮源包括蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、磷酸氢二铵、柠檬酸铵中的一种或几种的混合；所述培养基中氮源含量为5～30克/升。
上述步骤S1中，所述培养基中的无机盐包括硫酸镁、氯化锌、柠檬酸铵中的一种或一种以上；所述培养基中无机盐含量为0～1克/升；优选为0.1～0.5克/升。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，发酵培养时，每隔一段时间取样检测底物碳源的剩余量与产物赤藓糖醇的生成量，当底物碳源利用完毕后结束发酵；
或，当发酵液中葡萄糖剩余量低于30克/升时补充葡萄糖的量，进行补料连续发酵，以进一步提升发酵液中赤藓糖醇的含量。
作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，所述分离纯化包括：菌液分离得到澄清含赤藓糖醇的发酵液、浓缩得到富含赤藓糖醇浓缩液、一次结晶得到赤藓糖醇粗制品、粗品重溶、离子交换去除离子、脱色、浓缩、二次结晶得到赤藓糖醇精制品、干燥。
进一步地，所述菌液分离包括：发酵液离心或者膜过滤分离去除菌体，菌体加入水漂洗两次以充分回收其中的赤藓糖醇，得到澄清含赤藓糖醇的发酵液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明采用过表达多种葡萄糖转运蛋白GTPs(途径一)，通过非耗能的形式将葡萄糖转运到细胞内，而非以磷酸化的形式转运，利用多种GTPs的协同增强底物碳源如葡萄糖转运进入底盘细胞的效率，显著缩短赤藓糖醇的发酵时间。
2)本发明通过引入赤藓糖醇转运蛋白ETP(途径三)，避免产物积累产生的反馈抑制，来增强产物赤藓糖醇输出细胞的效率，从而实现产物赤藓糖醇的高效合成。
3)本发明在途径一、三的基础进一步引入赤藓糖醇合成酶ETs、5-磷酸核酮糖异构酶RPI、5-磷酸核酮糖差向异构酶RPE、葡萄糖激酶GLK、果糖-6-磷酸激酶FPK、果糖1,6-二磷酸醛缩酶FBA、生长因子GFs、生长因子的DNA结合转录因子GFDBTF(途径二)等，大大增强细胞内赤藓糖醇合成的能力，进一步提高产物赤藓糖醇的合成效率。
4)本发明采用全局的设计策略，通过三条途径的协同作用，使得本发明的酵母菌在同等条件下，发酵合成赤藓糖醇的时间显著缩短，由对比菌株的超过80小时缩短到50小时以内，发酵时间缩短近30小时；发酵合成赤藓糖醇的生产效率显著增加，由对比菌株的2.3克/升·小时提高到4.6克/升·小时，发酵效率提升达到100％；发酵合成赤藓糖醇的产量显著增加，能够耐受多次连续补料，产量超过350克/升，比之前报道的菌株提高至少100克/升。这些改进取得了具有非常有益的实施效果。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为高效快速合成赤藓糖醇的多途径协作示意图；
图2为典型的过表达DNA元件组合(表达框)示意图；
图3为含葡萄糖转运蛋白GTPs基因过表达载体(表达框)示意图；
图4为过表达的葡萄糖转运蛋白GTPs1、GTPs2，GTPs3、GTPs4(GTPs1-4)的基因表达分析；其中，1,3,5,7分别是是对比出发菌的GTPs1-4表达量，2,4,6,8分别是工程菌株CGMCC.28807的GTPs1-4表达量；
图5为过表达的赤藓糖醇合成酶ETs1、ETs2、ETs3、ETs4(ETs1-4)的基因表达分析；其中，1,3,5,7分别是是对比出发菌的ETs1-4表达量，2,4,6,8分别是工程菌株CGMCC.28807的ETs1-4表达量；
图6为过表达的RPI、RPE、GLK、ETP的基因表达分析；其中，1,3,5,7分别是对比出发菌的RPI、RPE、GLK、ETP表达量，2,4,6,8分别是工程菌株CGMCC.28807的RPI、RPE、GLK、ETP表达量；
图7为过表达的FPK、FBA、GFs、GFDBTF的基因表达分析；其中，1,3,5,7分别是对比出发菌的FPK、FBA、GFs、GFDBTF表达量，2,4,6,8分别是工程菌株CGMCC.28807的FPK、FBA、GFs、GFDBTF表达量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实例在本发明技术方案的前提下进行实施，提供了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。需要指出的是，本发明的保护范围不限于下述实施例，在本发明的构思前提下做出的若干调整和改进，都属于本发明的保护范围。
实施例1、在解脂耶氏酵母中过表达葡萄糖转运蛋白基因
如图2所示顺序，具体按照如下顺序合成葡萄糖转运蛋白表达框：上游26S rDNA序列→启动子(hp4d)→葡萄糖转运蛋白基因GTPs序列→葡萄糖转运蛋白终止子序列(Tcyc1)→loxP→启动子(PEXP)→霉酚酸筛选标记(guaB)→终止子序列(Taep)→loxP→下游26SrDNA序列。合成的含葡萄糖转运蛋白基因的表达框的序列为SEQ IDNo.18。本实施例中选取的葡萄糖转运蛋白序列为SEQ ID No.3，即GTPs3。其它的葡萄糖转运蛋白基因的过表达的方法同本实施例。
构建的含葡萄糖转运蛋白基因的整合表达框中DNA元件示意图如图3所示，其中的葡萄糖转运蛋白基因来自解脂耶氏酵母本身，基因序列为SEQ ID No.2-5中的一种及以上。筛选标记还可以用营养缺陷型标记如ura3基因代替，也可以用蔗糖酶Suc2基因，还可以用霉酚酸筛选标记，本实施例用霉酚酸筛选标记。用该载体转化合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母(如发明人之前获得的Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326或CGMCCNo.19351等)，在含霉酚酸的培养基上筛选。筛选培养基的成分为：酵母氮碱6.7克/升，硫酸铵5克/升，葡萄糖20克/升，霉酚酸300毫克/升，琼脂粉15克/升，pH6.5。由于解脂耶氏酵母本身不抗霉酚酸，因此在含霉酚酸的培养基中能生长的转化子就能生长，同时还含有葡萄糖转运蛋白基因，该转化子即为表达葡萄糖转运蛋白的突变体。
然后将含有Cre重组酶的质粒pUB4-CRE(来自公开发表的文献：Fickers etal.2003.New disruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescuein the yeast Yarrowia lipolytica.J.Microbiol.Methods,55,727-737)转化上述表达葡萄糖转运蛋白的突变体，在含有潮霉素为选择标记的YPD琼脂培养基中筛选(葡萄糖15克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨5克/升，琼脂15克/升，潮霉素350微克/毫升，pH6.5)。长出的转化子转接在含有霉酚酸的基本培养基中(酵母氮碱6.7克/升，硫酸铵5克/升，葡萄糖10克/升，霉酚酸300毫克/升，琼脂粉15克/升，pH6.5)，选择霉酚酸标记丢失的突变体。然后在不含潮霉素的液体YPD培养基中培养不能利用霉酚酸的突变体，再梯度稀释涂布在不含潮霉素的固体YPD培养基上，从长出的转化子中挑取转接在含有潮霉素的YPD琼脂培养基中，选择不能再抗潮霉素的突变体，即为过表达葡萄糖转运蛋白基因，同时筛选标记霉酚酸标记基因也丢失的突变体，可用于再过表达其它基因(或进一步增强葡萄糖转运蛋白基因)的宿主。按照南京诺唯赞生物科技有限公司的荧光定量检测试剂盒说明书进行提取总RNA、反转录以及荧光定量检测(产品货号Q711-02/03，试剂盒名称为ChamQ TM Universal qPCR Master Mix)。提取该突变体的总RNA，并进行反转录，以反转录产物作为模板进行荧光定量PCR(qPCR)，检测葡萄糖转运蛋白基因的表达水平，与对比出发菌株Yarrowialipolytica CGMCC No.7326或CGMCC No.19351的表达水平相比，发现新工程菌株的葡萄糖转运蛋白基因的mRNA的表达水平比对照菌株要显著提高(图4)，说明葡萄糖转运蛋白基因在工程菌株中得到表达。将过表达葡萄糖转运蛋白基因同时筛选标记又丢失的转化子标记为突变株ery::GTPs3。按照同样的操作方法将GTPs4基因转入ery::GTPs3得到ery::GTPs3::GTPs4。其中图4显示转入的各个基因的相对表达量，图中1,3,5,7分别是是对比出发菌的GTPs1-4表达量，设定为1；2,4,6,8分别是工程菌株Y.lipolytica CGMCC.28807的GTPs1-4表达量，显示均比对比出发菌株要显著提升，说明在工程菌株中得到表达。按照同样的基因操作方法，将GTPs1与GTPs2基因进一步引入解脂酵母中，得到过表达GTPs1::GTPs2的重组菌株ery::GTPs1::GTPs2::GTPs3::GTPs4，简写为ery::GTPs。
验证:GTPs1、GTPs2、GTPs3、GTPs4基因表达的正向与反向引物序列分别为SEQIDNo.19-20,21-22,23-24,25-26所示。
将上述过表达葡萄糖转运蛋白基因，同时霉酚酸筛选标记基因也丢失的突变体接种在发酵培养基中，合成赤藓糖醇的试验，与对比菌株(CGMCC No.19351)对比。发酵培养基的成分为：一水葡萄糖330克/升，酵母粉8克/升，蛋白胨2克/升，柠檬酸铵3克/升，七水硫酸镁0.01克/升，氯化锌0.001克/升，pH6.5，灭菌。在3升发酵罐中进行发酵，含1.5升发酵培养基，温度30℃，搅拌700转每分钟，通气量1.2vvm。定时取样检测，发现突变株ery::GTPs3::GTPs4在70小时时葡萄糖利用完全，赤藓糖醇185.5±3.5克/升，无甘露醇，赤藓糖醇的合成效率为2.64克/升·小时。而对照菌株Y.lipolytica CGMCC No.19351需要在85小时将葡萄糖消耗完，合成的赤藓糖醇的量为173±5.5克/升，赤藓糖醇的合成效率为2.0克/升·小时。重组菌株ery::GTPs在同样的发酵条件下，在68小时时葡萄糖利用完全，赤藓糖醇189.5±2.5克/升，无甘露醇，赤藓糖醇的合成效率为2.74克/升·小时。由发酵结果可以看出，只过表达葡萄糖转运蛋白基因，解脂耶氏酵母合成赤藓糖醇的效率即能有所提高，由2.0提升到2.64-2.74克/升·小时。主要原因是提升了葡萄糖进入酵母细胞内的效率，从而能为赤藓糖醇的合成及时提供碳源。
实施例2、在解脂耶氏酵母中过表达赤藓糖醇合成酶基因
以赤藓糖醇合成酶基因(ETs1-4，SEQ ID No.6-9)分别替换实施例1中的序列SEQID No.18中的葡萄糖转运蛋白基因(如GTPs3)，其余DNA元件可以保持不变，也可以相应的变化，如启动子序列可以采用其它启动子序列，如3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子序列等。本实施例只替换其中的葡萄糖转运蛋白基因。转化方法、筛选方法与发酵方法同实施例1。
在过表达葡萄糖转运蛋白基因的基础上过表达赤藓糖醇合成酶基因的转化子突变株标记为ery::GTPs1::GTPs2::GTPs3::GTPs4::ETs1::ETs2::ETs3::ETs4(为了书写方便，简称为ery::GTPs::ETs)。按照南京诺唯赞生物科技有限公司的荧光定量检测试剂盒说明书进行提取总RNA、反转录以及荧光定量检测(产品货号Q711-02/03，试剂盒名称为ChamQTM Universal qPCR Master Mix)。提取过表达赤藓糖醇合成酶基因的总RNA，并进行反转录，以反转录产物作为模板进行荧光定量PCR(qPCR)，检测赤藓糖醇合成酶基因的表达水平，与对照菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.19351相比，发现突变株的赤藓糖醇合成酶基因的mRNA的表达水平比对照菌株显著提升(图5)，说明赤藓糖醇合成酶基因在突变株中得到表达。其中图5中1,3,5,7分别是对比出发菌的ETs1-4表达量，设定为1；2,4,6,8分别是工程菌株Y.lipolytica CGMCC.28807的ETs1-4表达量，显示均比对比出发菌株要显著提升，说明在工程菌株中得到表达。
验证ETs1、ETs2、ETs3、ETs4基因表达的引物正反向序列分别为SEQ ID No.27-28,29-30,31-32,33-34所示。
将获得的过表达赤藓糖醇合成酶基因的转化子进行发酵合成赤藓糖醇试验，发酵培养基成分与条件同实施例1。不同菌株发酵合成赤藓糖醇的效果如下表1：
表1
由上表可见，和对比菌株相比，同时过表达葡萄糖转运蛋白与赤藓糖醇合成酶基因更能够提高赤藓糖醇的合成效率，比只过表达葡萄糖转运蛋白的突变株又要提升约15％。
实施例3、在解脂耶氏酵母中过表达RPI基因(SEQ ID No.10)
以5-磷酸核酮糖异构酶基因RPI替换实施例1中的序列SEQ ID No.18中的葡萄糖转运蛋白基因，其余DNA元件可以保持不变，也可以相应的变化，如启动子序列可以采用其它启动子序列，如转酮酶基因启动子序列等。本实施例只替换其中的葡萄糖转运蛋白基因。转化方法、筛选方法与发酵方法同实施例1。
DNA转化、转化子菌株筛选以及筛选标记的回收利用的方法同实施例1。所用的底盘菌株可以是实施例2中获得的含过表达赤藓糖醇合成酶基因的转化子ery::GTPs::ETs，也可以是其它能合成赤藓糖醇的菌株(如发明人之前获得的专利菌株Yarrowialipolytica CGMCC No.7326等)。获得的含有RPI基因的转化子标记为ery::GTPs::ETs::RPI，将仅过表达RPI基因的转化子标记为ery::RPI。按照南京诺唯赞生物科技有限公司的荧光定量检测试剂盒说明书进行提取总RNA、反转录以及荧光定量检测(产品货号Q711-02/03，试剂盒名称为ChamQ TM Universal qPCR Master Mix)。提取过表达RPI基因的总RNA，并进行反转录，以反转录产物作为模板进行荧光定量PCR(qPCR)，检测RPI基因的表达水平，与对照菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.19351相比，发现突变株的RPI基因的mRNA的表达水平比对照菌株要显著提升(图6)，说明RPI基因在突变株中得到表达。其中图6中1,3,5,7分别是对比出发菌的RPI、RPE、GLK、ETP表达量，设定为1；2,4,6,8分别是工程菌株Y.lipolytica CGMCC.28807的RPI、RPE、GLK、ETP表达量，显示均比对比出发菌株要显著提升，说明在工程菌株中得到表达。
验证RPI、RPE、GLK、ETP基因表达的引物序列分别为SEQ ID No.35-36,37-38,39-40,41-42所示。
将获得的过表达RPI基因的转化子进行发酵合成赤藓糖醇试验，发酵培养基成分与条件同实施例1。合成赤藓糖醇与副产物的效果如下表2：
表2
由上表可见，和对比菌株相比，同时过表达GTPs、ETs与RPI基因能够进一步提高赤藓糖醇的合成效率。仅仅过表达RPI基因没有起到显著的作用，需要与其它基因协调表达才能起到作用。
实施例4、在解脂耶氏酵母中过表达RPE基因
以5-磷酸核酮糖差向异构酶基因(RPE，SEQ ID No.11)替换实施例1中的序列SEQID No.18中的葡萄糖转运蛋白基因，其余DNA元件可以保持不变，也可以相应的变化，如启动子序列可以采用其它启动子序列，如转醛酶基因启动子序列等。本实施例只替换其中的葡萄糖转运蛋白基因。转化方法、筛选方法与发酵方法同实施例1。
DNA转化、转化子菌株筛选以及筛选标记的回收利用的方法同实施例1。所用的底盘菌株可以是实施例3中获得的含过表达赤藓糖醇合成酶基因的转化子ery::GTPs::ETs::RPI，也可以是其它能合成赤藓糖醇的菌株(如发明人之前获得的专利菌株Yarrowialipolytica CGMCC No.7326等)。本实施例使用实施例3中获得的菌株。转化后获得的含有RPE基因的转化子标记为ery::GTPs::ETs::RPI::RPE，将仅过表达RPE基因的转化子标记为ery::RPE。按照南京诺唯赞生物科技有限公司的荧光定量检测试剂盒说明书进行提取总RNA、反转录以及荧光定量检测(产品货号Q711-02/03，试剂盒名称为ChamQ TM UniversalqPCR Master Mix)。提取过表达RPE基因的总RNA，并进行反转录，以反转录产物作为模板进行荧光定量PCR(qPCR)，检测RPE基因的表达水平，与对照菌株Yarrowia lipolyticaCGMCC No.19351相比，发现突变株的RPE基因的mRNA的表达水平比对照菌株要显著提升(图6)，说明RPE基因在突变株中得到表达。
将获得的过表达RPE基因的转化子进行发酵合成赤藓糖醇试验，发酵培养基成分与条件同实施例1。合成赤藓糖醇与副产物的效果如下表3：
表3
由上表可见，和对比菌株相比，同时过表达GTPs、ETs、RPI与RPE基因能够进一步提高赤藓糖醇的合成效率。为了方便书写，将同时过表达GTPs、ETs、RPI与RPE的解脂耶氏酵母标记为ery::GERE。单独过表达RPE与对比菌未见差异，说明需要与其它基因协调作用才能进一步提升合成效率，体现了本发明的多基因相互协调促进的效果。
实施例5、在解脂耶氏酵母中过表达其它基因
其它基因包括：葡萄糖激酶基因(GLK，SEQ ID No.12)、赤藓糖醇转运蛋白基因(ETP，SEQ ID No.13)、果糖-6-磷酸激酶基因(FPK，SEQ ID No.14)、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因(FBA，SEQ ID No.15)、生长因子基因(GFs，SEQ ID No.16)以及生长因子的DNA结合转录因子(GFDBTF，SEQ ID No.17)。分别含这些基因的表达载体的构建方法、转化方法、筛选方法以及获得的转化子的发酵方法与条件同上述实施例，在此就不再一一重复描述。获得的最终工程菌株过表达上述GTPs,ETs,RPI,RPE,GLK,ETP,FPK,FBA,GFs,GFDBTF十种基因，基因型为：ery::GTPs::ETs::RPI::RPE::GLK::ETP::FPK::FBA::GFs::GFDBTF，为了方便书写，简称为Yarrowia lipolytica ery989，即保存编号为Yarrowia lipolyticaCGMCCNo.28807.各种基因的表达验证如图6与图7所示，过表达后工程菌的相应的基因的表达水平明显提升。其中图7中1,3,5,7分别是对比出发菌的FPK、FBA、GFs、GFDBTF表达量，设定为1；2,4,6,8分别是工程菌株Y.lipolytica CGMCC.28807的FPK、FBA、GFs、GFDBTF表达量，显示均比对比出发菌株要显著提升，说明在工程菌株中得到表达。
验证FPK、FBA、GFs、GFDBTF基因表达的引物序列分别为SEQ ID No.43-44,45-46,47-48,49-50所示。
将获得的ery989转化子进行发酵合成赤藓糖醇试验，发酵培养基成分与条件同实施例1。合成赤藓糖醇的效果如下表4：
表4
由上表可见，和对比菌株相比，同时过表达十种基因，能够显著提高赤藓糖醇的合成效率，提升效率达到100％，取得了意想不到的实施效果。
对比例1
为了显示本发明的实施效果，本发明还利用本实验室之前申请的专利(名称：合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法及其菌株，申请号：2020100692506.6)中的专有菌株CGMCC No.19351为底盘，只将赤藓糖醇转运蛋白基因(ETP，SEQ ID No.13)转入菌株CGMCC No.19351，发酵结果显示，得到的含有SEQ ID No.13表达增强的菌株，在同样条件下(同实施例1)其合成赤藓糖醇的转化率为60.8％，发酵时间为85小时，产量为182.5克/升，合成效率为2.14g/L·h。远不及工程菌ery989(CGMCC No.28807)的实施效果，说明在菌株CGMCC No.19351基础上过表达赤藓糖醇转运蛋白基因(ETP，SEQ ID No.13)产量已有提升。只是，如要有更显著的效果需要多种基因协调完成。相当于木桶理论，单独补足其中的一个或几个短板并不能起到装满水的功效，需要将全部短板补齐后才能装满水，起到理想的功效。
对比例2
以本实验之前申请的专利(申请号2020100692506.6)中的专有菌株CGMCCNo.19351为底盘，将葡萄糖转运蛋白基因(GTPs，SEQ ID No.2-5)和赤藓糖醇合成酶ETs、5-磷酸核酮糖异构酶RPI、5-磷酸核酮糖差向异构酶RPE、葡萄糖激酶GLK、果糖-6-磷酸激酶FPK、果糖1,6-二磷酸醛缩酶FBA、生长因子GFs、生长因子的DNA结合转录因子GFDBTF(SEQ ID No.6-12、SEQ ID No.14-17)编码的基因转入菌株CGMCCNo.19351，但是没有额外将赤藓糖醇转运蛋白基因(ETP，SEQ ID No.13)转入菌株CGMCCNo.19351，获得的菌株的发酵结果显示，在相同条件下(发酵条件同实施例1)发酵结束时间为55±2小时(碳源葡萄糖完全消耗完毕)，长于菌株CGMCC No.28807(发酵时间低于50小时)，转化率为67±1％，低于菌株CGMCC No.28807(≈71％)。说明菌株的合成性能需要多种基因包括赤藓糖醇转运蛋白基因在内的协同作用，才能发挥更好的实施效果。
对比例3
以本实验之前申请的专利(申请号2020100692506.6)中的专有菌株CGMCCNo.19351为底盘，将赤藓糖醇转运蛋白基因(ETP，SEQ ID No.13)和赤藓糖醇合成酶ETs、5-磷酸核酮糖异构酶RPI、5-磷酸核酮糖差向异构酶RPE、葡萄糖激酶GLK、果糖-6-磷酸激酶FPK、果糖1,6-二磷酸醛缩酶FBA、生长因子GFs、生长因子的DNA结合转录因子GFDBTF(SEQ ID No.6-12、SEQ ID No.14-17)基因转入菌株CGMCCNo.19351，但是没有额外将葡萄糖转运蛋白基因(GTPs，SEQ ID No.2-5)转入菌株CGMCC No.19351，获得的菌株在相同条件下发酵(条件同实施例1)，发酵结束时间为58±2小时(碳源葡萄糖完全消耗完毕)，长于菌株CGMCC No.28807(发酵时间低于50小时)，转化率为66±2％，低于菌株CGMCC No.28807(≈71％)。说明菌株的合成性能需要多种基因包括葡萄糖转运蛋白基因在内的协同作用，才能更好的发挥作用。
对比例4
以本实验室申请的专利(申请号：2020100692506.6)中的专有菌株CGMCCNo.19351为底盘，仅将葡萄糖转运蛋白基因(GTPs，SEQ ID No.2-5)和赤藓糖醇转运蛋白基因(ETP，SEQ ID No.13)基因转入菌株CGMCC No.19351，而没有将赤藓糖醇合成途径的基因额外加强表达，获得的菌株在相同条件下发酵(条件同实施例1)，发酵结束时间为67±2小时，显著长于菌株CGMCC No.28807(发酵时间低于50小时)，赤藓糖醇含量188.5±2.5克/升，低于菌株CGMCC No.28807(≈210克/升)。说明仅仅将转运蛋白基因转入底盘菌株并不能显著提升赤藓糖醇的合成性能，需要其它多种基因的协调。
对比例5
将上述实施例1中的葡萄糖转运蛋白基因替换成己糖激酶基因HK(序列参见申请号2020100692506.6的在先专利)，即在菌株CGMCC No.19351的基础上再过表达HK基因(注：菌株CGMCC No.19351已经过表达了HK基因，详见发明专利2020100692506.6)。转化方法与发酵方法同实施例1，发酵结果显示，再过表达己糖激酶的菌株的赤藓糖醇的产量为191克/升，发酵时间78小时，与对比菌株CGMCCNo.19351相比，并没有显著的提升，对比菌株的产量为189克/升，发酵时间为79小时。说明只过表达己糖激酶并不能取得显著的效果。
上述对比例结果表明，本发明所获得专有菌株CGMCC No.28807是因为利用了本发明的多种基因的协同效益，才取得了极其显著甚至是预料不到的实施效果，只有将本发明的多种基因共同表达才能取得最佳的实施效果，能将发酵周期缩短到50小时以内，生产强度(克/小时·升)由2.3提升至4.6，提升近100％。
实施例6、解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica ery989发酵合成的优化试验
选择合成赤藓糖醇最好的代表性菌株解脂耶氏酵母Yarrowia lipolyticaery989进行保存，保存编号为CGMCC No.28807，该菌株高效快速合成赤藓糖醇的多途径协作如图1所示。下面的步骤以该代表性菌株为例，进行发酵合成赤藓糖醇的优化试验。
(1)CGMCC No.28807菌株在温度25℃，葡萄糖浓度为50克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。
将酵母CGMCC No.28807菌株接种在含300毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌溶氧效果)，起始菌体密度(OD600)为1.2，发酵培养基成分为：葡萄糖50克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨2克/升，磷酸氢二铵1克/升，起始pH6.5，在25℃振荡发酵，转速每分钟220转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至24小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为25克/升，转化率为50％，合成效率为1.1克/升·小时，可见当初始葡萄糖浓度较低时，转化率与生产效率均比较低。原因可能是葡萄糖浓度低的时候，大部分葡萄糖用于细胞生长，用于合成产物的葡萄糖较少。
(2)CGMCC No.28807菌株在温度25℃，葡萄糖浓度为200克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。
将酵母CGMCC No.28807菌株接种在含200毫升发酵培养基的2L三角瓶中，起始菌体密度(OD600)为1.2，发酵培养基成分为：葡萄糖200克/升，酵母粉6克/升，蛋白胨3克/升，磷酸氢二胺2克/升，硫酸镁0.2克/升，氯化锌0.005克/升，起始pH6.5，在25℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至38小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为120克/升，转化率为60％，合成效率为3.15克/升·小时，可见当葡萄糖浓度提升时合成效率明显提升。
(3)CGMCC No.28807菌株在温度28℃，葡萄糖浓度为300克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。
将酵母CGMCC No.28807菌株接种在含200毫升发酵培养基的2L三角瓶中，起始菌体密度(OD600)为1.2，发酵培养基成分为：葡萄糖300克/升，酵母粉8克/升，蛋白胨2克/升，柠檬酸铵3克/升，硫酸镁0.2克/升，氯化锌0.01克/升，起始pH6.5，在28℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至48小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为210克/升，转化率为70％，合成效率为4.37克/升·小时，可见当葡萄糖浓度进一步提升时合成效率进一步提升。
(4)CGMCC No.28807菌株在温度32℃，葡萄糖浓度为350克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。
将酵母CGMCC No.28807菌株接种在含200毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为1.2，发酵培养基成分为：葡萄糖350克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨3克/升，柠檬酸铵4克/升，硫酸镁0.4克/升，起始pH6.5，在32℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至55小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为235克/升，转化率为67.1％，合成效率为4.27克/升·小时。
(5)CGMCC No.28807菌株在温度33℃，葡萄糖浓度为320克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。
将酵母CGMCC No.28807菌株接种在含200毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为1.5，发酵培养基成分为：葡萄糖320克/升，酵母粉8克/升，蛋白胨3克/升，柠檬酸铵3克/升，硫酸镁0.4克/升，起始pH5.5，在33℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至50小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为218克/升，转化率为68.1％，合成效率为4.36克/升·小时。
(6)CGMCC No.28807菌株在温度35℃，葡萄糖浓度为100克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。
将酵母CGMCC No.28807菌株接种在含200毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为1.5，发酵培养基成分为：葡萄糖100克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨2克/升，柠檬酸铵1克/升，硫酸镁0.05克/升，起始pH6.5，在35℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至80小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为45.5克/升，转化率为45.5％，合成效率为0.56克/升·小时。这是由于该菌不耐热的原因，导致在高温35度下生长差，OD值仅为13，导致发酵时间延长。
(7)CGMCC No.28807菌株在温度30℃，起始pH3.0，葡萄糖浓度为310克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。
将酵母CGMCC No.28807菌株接种在含200毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为1.2，发酵培养基成分为：葡萄糖310克/升，酵母粉8克/升，蛋白胨3克/升，柠檬酸铵3克/升，硫酸镁0.2克/升，用柠檬酸调起始pH3.0，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至49小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为213克/升，转化率为68.7％，合成效率为4.34克/升·小时。
(8)CGMCC No.28807菌株在温度33℃，葡萄糖浓度为250克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。
将酵母CGMCC No.28807菌株接种在含200毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为1.2，发酵培养基成分为：葡萄糖250克/升，酵母浸膏10克/升，玉米浆干粉2克/升，柠檬酸铵3克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在33℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至52小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为155克/升，转化率为62％，合成效率为2.98克/升·小时。
(9)CGMCC No.28807菌株在温度30℃，起始pH7.0，葡萄糖浓度为300克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。
将酵母CGMCC No.28807菌株接种在含200毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为1.2，发酵培养基成分为：葡萄糖300克/升，酵母粉8克/升，蛋白胨2克/升，柠檬酸铵3克/升，硫酸镁0.2克/升，用氢氧化钠调起始pH7.0，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至48小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为215克/升，转化率为71.6％，合成效率为4.47克/升·小时。
上述各发酵的实施方案中，发酵过程要定时补充蒸发的水分至发酵起始的重量。发酵起始时记下含发酵液的发酵瓶的重量，每次取样时再记下重量，用无菌水补充水至发酵起始的重量。每次取样量为0.2毫升，稀释10-20倍后用于HPLC液相检测碳源原料(如葡萄糖等)与赤藓糖醇的含量。分析柱为Shodex的SP0810糖柱，示差检测器，纯水为流动相，流速为1ml/min，柱温70℃。
(10)CGMCC No.28807菌株在5升发酵罐中发酵合成赤藓糖醇的试验。
将酵母CGMCC No.28807菌株接种在含3升发酵培养基的5L发酵罐中，起始菌体密度(OD600)为1.2，发酵培养基成分为：葡萄糖310克/升，酵母粉6克/升，蛋白胨2克/升，柠檬酸铵3克/升，磷酸氢二铵2克/升，硫酸镁0.05克/升，起始pH6.5，在30℃发酵，搅拌转速起始每分钟500转(rpm)，通气量每分钟3升，待菌体长到OD600超过10.0时提高至700rpm，通气增加到每分钟5升。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至46小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为214.6克/升，转化率为69.2％，合成效率为4.66克/升·小时。
(11)CGMCC No.28807菌株在200升发酵罐中发酵合成赤藓糖醇的试验。
将酵母CGMCC No.28807菌株接种在含140升发酵培养基的200L发酵罐中，起始菌体密度(OD600)为1.2，发酵培养基成分为：葡萄糖310克/升，酵母粉6克/升，蛋白胨2克/升，柠檬酸铵3克/升，磷酸氢二铵2克/升，硫酸镁0.05克/升，起始pH6.5，在30℃发酵，搅拌转速起始每分钟500转(rpm)，通气量每分钟140升，待菌体长到OD600超过10.0时提高至600rpm，通气增加到每分钟200升。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至47小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为217.8克/升，转化率为70.2％，合成效率为4.63克/升·小时。
(12)CGMCC No.28807菌株在200升发酵罐中进行补料发酵合成赤藓糖醇的试验。
将酵母CGMCC No.28807菌株接种在含110升发酵培养基的200L发酵罐中，起始菌体密度(OD600)为1.2，发酵培养基成分为：葡萄糖300克/升，酵母粉8克/升，蛋白胨3克/升，柠檬酸铵3克/升，磷酸氢二铵3克/升，硫酸镁0.05克/升，起始pH6.5，在30℃发酵，搅拌转速起始每分钟500转(rpm)，通气量每分钟200升，待菌体长到OD600超过5.0时提高至600rpm，通气增加到每分钟250升。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。当葡萄糖含量在50克/升时补充600克/升灭菌的葡萄糖溶液10升，继续发酵，共补料3次。至82小时时补料的葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为353.6克/升，合成效率4.31克/升·小时。可以看出后期补料有利于赤藓糖醇浓度的提高，能够节约后期浓缩的蒸汽成本，具有显著的有益效果。
上述各发酵实施例中，所述的发酵培养基均经过灭菌处理，冷却至室温后再接入菌种。
(13)从发酵液中纯化赤藓糖醇的试验。
发酵结束后，发酵液装入1000毫升离心管中，在8000g条件下离心10分钟获得澄清的含赤藓糖醇的上清。沉淀酵母细胞再用200毫升纯净水悬浮洗涤以使胞内的赤藓糖醇释放出来，离心得上清。将发酵上清与洗涤细胞的溶液合并，转入旋转蒸发瓶中蒸发浓缩，期间测定折光，当折光达到66时停止蒸发。将浓缩液转入球形烧瓶中，置于梯度冷却机中用磁力搅拌棒缓慢搅拌，每分钟55转。当温度降低到30℃时加入晶种，放置开始出现可见细小颗粒状结晶，随着温度的逐渐下降，结晶量逐渐增加，此时增加搅拌速度至每分钟80转。结晶量不再增加时，停止搅拌，离心分离晶体，得到赤藓糖醇粗制品。重新溶解至折光50，依次进行离子交换、脱色，去除离子与色素，再进行浓缩、结晶、离心与干燥的步骤，得到白色赤藓糖醇精制品。
本发明获得的新的工程菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.28807在优化的发酵条件下，在5升发酵罐中46小时内从310g/L葡萄糖中产生214.6g/L赤藓糖醇，转化率达到69.2％，生产效率达到4.66克/升·小时。在200升发酵罐中47小时内从310g/L葡萄糖中产生217.8g/L赤藓糖醇，转化率达到70.2％，生产效率达到4.63克/升·小时，与5升发酵罐的数据基本一致。在200L发酵罐中，分批补料发酵条件下，经过三次连续补葡萄糖，最终在82小时后发酵结束，赤藓糖醇产量达到353.6g/L，是迄今为止报道的最高产量，生产效率也达到4.31克/升·小时。
本发明提供的技术相比公开报道的其它文献中描述的技术具有显著的意想不到的实施效果，尤其是生产效率达到最高4.66克/升·小时，比其它文献报道的提高接近100％。总产量达到350克/升，是目前报道最高的产量。
特别需要说明的是，本发明选择性的过表达各种基因并不是任意选择的，而是经过反复试验验证的，并取得了上述有益效果的。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，发明人可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种高效快速合成赤藓糖醇的酵母菌，其特征在于，以解脂耶氏酵母菌株为底盘微生物，引入与赤藓糖醇合成有关的基因所获得的酵母菌。
2.如权利要求1所述的酵母菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母菌株为基因组中含有与SEQ ID No.1序列具有97％及以上同源性或相似性的DNA序列，且能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母菌株。
3.如权利要求1所述的酵母菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母菌株包括Yarrowialipolytica CGMCC 7326、Yarrowia lipolytica ery929 CGMCC No.18478、Yarrowialipolytica ery929 CGMCC No.19351中的任意一种。
4.如权利要求1所述的酵母菌，其特征在于，所述与赤藓糖醇合成有关的基因包括以下基因的一种或一种以上：
(1)如SEQ ID No.2-5所示的编码葡萄糖转运蛋白的基因GTPs1,GTPs2,GTPs3,GTPs4；
(2)如SEQ ID No.6-9所示的编码赤藓糖醇合成酶的基因ETs1,ETs2,ETs3,ETs4；
(3)如SEQ ID No.10所示的编码5-磷酸核酮糖异构酶RPI基因；
(4)如SEQ ID No.11所示的编码5-磷酸核酮糖差向异构酶RPE基因；
(5)如SEQ ID No.12所示的编码葡萄糖激酶GLK基因；
(6)如SEQ ID No.13所示的编码赤藓糖醇转运蛋白ETP基因；
(7)如SEQ ID No.14所示的编码果糖-6-磷酸激酶FPK基因；
(8)如SEQ ID No.15所示的编码果糖1,6-二磷酸醛缩酶FBA基因；
(9)如SEQ ID No.16所示的编码生长因子GFs基因；
(10)如SEQ ID No.17所示的编码生长因子的DNA结合转录因子GFDBTF基因。
5.一种如权利要求1-4中任一项所述高效快速合成赤藓糖醇的酵母菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
A1、设计赤藓糖醇高效合成基因表达框，并合成该基因表达框；
A2、将步骤A1合成的基因表达框转化解脂耶氏酵母；
A3、筛选含有基因表达框的解脂耶氏酵母，即所述酵母菌；
或，
B1、将如SEQ ID No.2至SEQ ID No.17任意一种或多种所示的赤藓糖醇高效合成基因与自身的启动子以及自身的终止子进行组合，构成基因开放阅读框；
B2、筛选含有基因开放阅读框的解脂耶氏酵母，即所述酵母菌。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤A1中，所述赤藓糖醇合成基因表达框包括上游同源整合臂序列、下游同源整合臂序列、启动子序列、终止子序列、筛选标记序列、如SEQ ID No.2至SEQ ID No.17任意一种或多种所示的赤藓糖醇合成有关的基因序列。
7.一种高效快速合成赤藓糖醇的酵母菌，其特征在于，所述酵母菌为解脂耶氏酵母菌Yarrowia lipolytica菌株，保藏编号为CGMCC No.28807。
8.一种如权利要求1-4、7中任一项所述的酵母菌或权利要求5-6中任一项所述构建方法得到所述酵母菌在合成赤藓糖醇中的用途。
9.一种利用如权利要求1-4、7中任一项所述的酵母菌或权利要求5-6中任一项所述构建方法得到的酵母菌发酵合成赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将酵母菌于培养基中发酵培养，分离得到含赤藓糖醇的发酵液以及酵母细胞；
S2、从步骤S1中所述含赤藓糖醇的发酵液以及酵母细胞中分离纯化得到赤藓糖醇。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述培养基包括碳源、氮源、无机盐、水；所述培养基中的碳源包括葡萄糖，所述碳源用量为50～350克/升；所述培养基中的氮源包括蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、磷酸氢二铵、柠檬酸铵中的一种或几种的混合，所述培养基中氮源含量为5～30克/升；所述培养基中的无机盐包括硫酸镁、氯化锌、柠檬酸铵中的一种或一种以上，所述培养基中无机盐含量为0～1克/升；所述培养条件包括：在起始pH值3.0～7.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌发酵培养。
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