CN117925411A - 一种提高三角褐指藻岩藻黄素产率的藻菌共培养方法及其应用 - Google Patents
一种提高三角褐指藻岩藻黄素产率的藻菌共培养方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高三角褐指藻岩藻黄素产率的藻菌共培养方法及应用，由三角褐指藻与促生菌在添加有机碳源的微藻培养基中，在通气条件下共培养而成。本发明为解决现有三角褐指藻培养效率低下、培养体系不稳定的问题，而提供了一种以促生菌为基础的，在添加外源有机碳源条件下的，适用于三角褐指藻高效培养的藻菌共培养体系，并将之用于高附加值物质生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于提高三角褐指藻岩藻黄素产率的藻菌共培养方法及其应用，属于工业生物技术领域。
背景技术
岩藻黄素具有抗肥胖、抗肿瘤、抗阿尔兹海默症、抗炎症、抗氧化等多种生物活性，在医药、功能食品、化妆品等领域具有广阔应用前景。传统的岩藻黄素制品多以海带、裙带菜等大型褐藻为原材料。大型褐藻不仅岩藻黄素含量低(仅为生物质干重的1/10000–1/1000)，而且含有大量褐藻多糖，给下游提纯制造了巨大障碍。这也进一步导致岩藻黄素价格十分昂贵(纯品价格高达30万元/公斤以上)，且难以满足市场需求。
海洋硅藻中的岩藻黄素含量数十倍乃至百倍于大型褐藻，且生长速度快、培养过程不受季节、地域限制。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是海洋硅藻的模式物种，其富含岩藻黄素、多不饱和脂肪酸的藻油(护肝制品)已经在美国、欧盟等诸多地区获得上市许可；这也是唯一获批上市的微藻来源的岩藻黄素制品。因此，三角褐指藻迅速在全球范围内成为岩藻黄素生产领域的最热门材料，而如何进一步提高三角褐指藻的岩藻黄素产率是该领域的重要研究内容。
研究表明，多种微藻可利用外源有机碳进行异养生长并达到很高的培养效率；但我们研究发现，三角褐指藻缺乏异养能力。兼养(指同时利用光能和外源有机碳的营养方式)是除异养外的另一种高效培养方式，其培养效率甚至高于异养；这也是最有希望应用于三角褐指藻大规模生产的培养策略。然而，该培养方式下(尤其是通气培养过程中)，三角褐指藻藻液中的细菌丰度由于外源有机碳的存在会急剧增加，而敌害菌数量难以控制，甚至有可能成为优势菌群并进而导致培养失败。换言之，如何提高兼养体系的稳定性，是推动三角褐指藻生产岩藻黄素产业发展的关键问题。
发明内容
本发明为解决现有三角褐指藻培养效率低下、培养体系不稳定的问题，而提供了一种以促生菌为基础的，在添加外源有机碳源条件下的，适用于三角褐指藻高效培养的藻菌共培养体系，并将之用于高附加值物质生产。
本发明的藻菌共培养体系由三角褐指藻与促生菌在添加有机碳源的微藻培养基中，在通气条件下共培养而成。
进一步的，所述三角褐指藻为Phaeodactylum tricornutum。
进一步的，所述促生菌为海洋芽孢杆菌Rossellomorea spp.。
进一步的，所述有机碳源为甘油和粗甘油。
进一步的，所述有机碳源浓度为1.5g/L-50g/L。
进一步的，所述微藻培养基由0.075g/L-0.75g/L的NaNO3、0.005g/L-0.05g/L的NaH2PO4·H2O、微量元素和维生素组成。
进一步的，所述微量元素由3.15mg/L–31.5mg/L的FeCl3·6H2O、4.36mg/L-43.6mg/L的Na2EDTA·2H2O、0.18mg/L-1.8mg/L的MnCl4·4H2O、0.022mg/L-0.22mg/L的ZnSO4·7H2O、0.01mg/L-0.1mg/L的CoCl2·6H2O、0.0098mg/L-0.098mg/L的CuSO4·5H2O、0.0063mg/L-0.063mg/L的Na2MoO4·2H2O组成。
进一步的，所述维生素由0.05μg/L-0.5μg/L的VB12、0.05μg/L-0.5μg/L的VB7、10μg/L-100μg/L的VB1组成。
进一步的，所述通气条件为二氧化碳与空气的混合气体，以固定速率通入培养体系；其中，二氧化碳占混合气体的体积比例为0.0％-5％(包括0)，通气速率为0.025v/v/min-1v/v/min。
本发明的三角褐指藻岩藻黄素产率的藻菌共培养方法按以下步骤进行：
1.将促生菌接种到细菌培养基中，接种量为培养体积1‰-10％；培养条件为15-30℃，pH值为6-12，摇床转速为20rpm-500rpm；培养至指数生长中后期，OD600为0.5-10。
2.将三角褐指藻接种到添加有机碳源的微藻培养基中，接种比例为培养体积的1％-50％；培养条件为15-30℃，pH值为6-12，通入二氧化碳与空气的混合气体(二氧化碳占混合气体的体积比例为0.5％-5％，通气速率为0.025v/v/min-1v/v/min)，光照强度为30μmoLm-2s-1-1200μmoLm-2s-1。
3.将步骤1的促生菌菌液添加至步骤2的三角褐指藻藻液之中，藻液与添加菌液体积比为106:1-103:1；进行藻菌共培养；培养条件为15-30℃，pH值为6-12，通入二氧化碳与空气的混合气体(二氧化碳占混合气体的体积比例为0.0％-5％，通气速率为0.025v/v/min-1v/v/min)，光照强度为30μmoL m-2s-1-1200μmoLm-2s-1。
4.若步骤2所用三角褐指藻为有菌三角褐指藻，则需在步骤3的培养过程中，定时添加步骤1的菌液，以维持促生菌在细菌群落结构中的优势地位，藻液与添加菌液体积比为106:1-103:1。
5.若步骤2所用三角褐指藻为无菌三角褐指藻，则需在步骤3的培养过程中通入无菌气体。
进一步的，步骤1中所述促生菌为海洋芽孢杆菌Rossellomorea spp.。
进一步的，步骤1中所述细菌培养基为海洋2216E培养基及以之为基础改良的其它海洋细菌培养基。2216E培养基基础配方为：5.0g/L的蛋白胨，1.0g/L的酵母粉，0.1g/L的FeC6H5O7，19.45g/L的NaCl，5.98g/L的MgCl2，3.24g/L的Na2SO4，1.8g/L的CaCl2，0.55g/L的KCl，0.16g/L的Na2CO3，0.08g/L的KBr，0.034g/L的CsCl，0.022g/L的H3BO3，0.004g/L的Na2SiO3，0.0024g/L的NaF，0.0016g/L的NaNO3，0.008g/L的Na2HPO4。
进一步的，步骤2中所述三角褐指藻为Phaeodactylum tricornutum。
进一步的，步骤4中所述定时频率为3h-48h。
本发明的有益效果：
1)本发明提出的以三角褐指藻促生菌为基础的藻菌共培养体系解决了三角褐指藻培养过程中的培养效率低下、培养体系不稳定的问题，大幅度提高了三角褐指藻的生物量积累效率。2)基于促生菌的兼养通气条件下的藻菌共培养体系，还确保了三角褐指藻培养体系的稳定性，降低了培养失败概率。
3)以三角褐指藻促生菌为基础的藻菌共培养体系大幅度提高了多不饱和脂肪酸和岩藻黄素的产率。
附图说明
图1为无菌三角褐指藻和有菌三角褐指藻的荧光显微镜图片。
图2为无菌三角褐指藻在非通气条件下，自养、兼养(甘油为有机碳源)、异养(甘油为有机碳源)、藻菌共培养(甘油为有机碳源)模式下的生长曲线和生物量积累情况。
图3为无菌三角褐指藻在通气条件下，自养、兼养(甘油为有机碳源)、异养(甘油为有机碳源)、藻菌共培养(甘油为有机碳源)模式下的生物量积累情况。
图4为有菌三角褐指藻在通气藻菌共培养(甘油为有机碳源)模式下，定时补充促生菌和无促生菌补充情况下的生长曲线和生物量积累情况。
图5为无菌三角褐指藻在通气和不通气条件下，自养、兼养(甘油为有机碳源)、藻菌共培养(甘油为有机碳源)模式下的脂肪酸组成情况。
图6为无菌三角褐指藻在通气和不通气条件下，自养、兼养(甘油为有机碳源)、藻菌共培养(甘油为有机碳源)模式下的色素含量情况。
具体实施方式
实施例1
本实施例以无菌三角褐指藻(图1)和促生菌在以甘油为有机碳源的微藻培养基中，在非通气条件下完成。所述无菌三角褐指藻为Phaeodactylum tricornutum；所述促生菌为海洋芽孢杆菌Rossellomorea spp.；所述甘油浓度为3g/L；所述微藻培养基由0.3g/L的NaNO3、0.02g/L的NaH2PO4·H2O、12.6mg/L的FeCl3·6H2O、17.38mg/L的Na2EDTA·2H2O、0.72mg/L的MnCl4·4H2O、0.088mg/L的ZnSO4·7H2O、0.04mg/L的CoCl2·6H2O、0.04mg/L的CuSO4·5H2O、0.025mg/L的Na2MoO4·2H2O、0.2μg/L的VB12、0.2μg/L的VB7、40μg/L的VB1组成；培养条件为：藻菌接种体积比为103：1，25℃，pH值为8，光照强度为60μmoL m-2s-1。经过8天的共培养，得到图2所示结果：藻菌共培养条件下的三角褐指藻终细胞密度达到了OD750＝0.42，生物量干重达到了815mg/L；是自养条件下的3倍左右。
实施例2
本实施例以无菌三角褐指藻(图1)和促生菌在以甘油为有机碳源的微藻培养基中，在通气条件下完成，所述无菌三角褐指藻为Phaeodactylum tricornutum；所述促生菌为海洋芽孢杆菌Rossellomorea spp.；所述甘油浓度为3g/L；所述微藻培养基由0.3g/L的NaNO3、0.02g/L的NaH2PO4·H2O、12.6mg/L的FeCl3·6H2O、17.38mg/L的Na2EDTA·2H2O、0.72mg/L的MnCl4·4H2O、0.088mg/L的ZnSO4·7H2O、0.04mg/L的CoCl2·6H2O、0.04mg/L的CuSO4·5H2O、0.025mg/L的Na2MoO4·2H2O、0.2μg/L的VB12、0.2μg/L的VB7、40μg/L的VB1组成；所述通气条件为经过0.22μm滤膜过滤的二氧化碳和空气混合气体，其中，二氧化碳体积占比1.5％，通气速率为0.025v/v/min；培养条件为：藻菌接种体积比为103：1，25℃，pH值为8，光照强度为60μmoL m-2s-1。经过8天的共培养，得到图3所示结果：藻菌共培养条件下的三角褐指藻终细胞密度达到了OD750＝0.64，生物量干重达到了1298.8mg/L；大幅度高于自养处理组。
实施例3
本实施例以有菌三角褐指藻(图1)在以甘油为有机碳源的微藻培养基中，在通气条件下进行。所述有菌三角褐指藻为Phaeodactylum tricornutum；所述促生菌为海洋芽孢杆菌Rossellomorea spp.；所述甘油浓度为3g/L；所述微藻培养基由0.3g/L的NaNO3、0.02g/L的NaH2PO4·H2O、12.6mg/L的FeCl3·6H2O、17.38mg/L的Na2EDTA·2H2O、0.72mg/L的MnCl4·4H2O、0.088mg/L的ZnSO4·7H2O、0.04mg/L的CoCl2·6H2O、0.04mg/L的CuSO4·5H2O、0.025mg/L的Na2MoO4·2H2O、0.2μg/L的VB12、0.2μg/L的VB7、40μg/L的VB1组成；所述通气条件为未经0.22μm滤膜过滤的二氧化碳和空气混合气体，其中，二氧化碳体积占比1.5％，通气速率为0.025v/v/min；培养条件为：藻菌接种体积比为103：1，25℃，pH值为8，光照强度为60μmoL m-2s-1。在两个批次的培养过程中，得到图4所示结果：补充促生菌的处理组终细胞密度分别为OD750＝0.66和0.59，生物量分别为1026.9mg/L和932.9mg/L；而未补充促生菌的处理组生物量仅为663.9mg/L和409.3mg/L。
实施例4
本实施例以无菌三角褐指藻和促生菌在以甘油为有机碳源的微藻培养基中完成。所述无菌三角褐指藻为Phaeodactylum tricornutum；所述促生菌为海洋芽孢杆菌Rossellomorea spp.；所述甘油浓度为3g/L；所述微藻培养基由0.3g/L的NaNO3、0.02g/L的NaH2PO4·H2O、12.6mg/L的FeCl3·6H2O、17.38mg/L的Na2EDTA·2H2O、0.72mg/L的MnCl4·4H2O、0.088mg/L的ZnSO4·7H2O、0.04mg/L的CoCl2·6H2O、0.04mg/L的CuSO4·5H2O、0.025mg/L的Na2MoO4·2H2O、0.2μg/L的VB12、0.2μg/L的VB7、40μg/L的VB1组成；所述通气条件为经过0.22μm滤膜过滤的二氧化碳和空气混合气体，其中，二氧化碳体积占比1.5％，通气速率为0.025v/v/min；培养条件为：藻菌接种体积比为103：1，25℃，pH值为8，光照强度为60μmoL m-2s-1。经过8天的共培养，得到图5和图6结果。通气和非通气条件下的藻菌共培养处理组的不饱和脂肪酸占总脂肪酸比例为75.8％-83.2％，岩藻黄素含量为1.03％-1.30％，均与自养组非常接近。然而，由于藻菌共培养处理组大幅度提高了三角褐指藻生物量，因此该处理组的岩藻黄素和不饱和脂肪酸产率也获得了很大提升。
Claims (10)
1.一种提高三角褐指藻岩藻黄素产率的藻菌共培养体系，其特征在于，由三角褐指藻与促生菌在添加有机碳源的微藻培养基中，在通气条件下共培养而成。
2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述三角褐指藻为Phaeodactylum
tricornutum。
3.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述促生菌为海洋芽孢杆菌Rossellomorea spp.。
4.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述有机碳源为甘油和粗甘油。
5.根据权利要求4所述的培养体系，其特征在于，所述有机碳源浓度为1.5g/L-50g/L。
6.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述微藻培养基由0.075g/L-0.75g/L的NaNO3、0.005g/L-0.05g/L的NaH2PO4·H2O、微量元素和维生素组成。
7.根据权利要求6所述的培养体系，其特征在于，所述微量元素由3.15mg/L–31.5mg/L的FeCl3·6H2O、4.36mg/L-43.6mg/L的Na2EDTA·2H2O、0.18mg/L-1.8mg/L的MnCl4·4H2O、0.022mg/L-0.22mg/L的ZnSO4·7H2O、0.01mg/L-0.1mg/L的CoCl2·6H2O、0.0098mg/L-0.098mg/L的CuSO4·5H2O、0.0063mg/L-0.063mg/L的Na2MoO4·2H2O组成。
8.根据权利要求6所述的培养体系，其特征在于，所述维生素由0.05μg/L-0.5μg/L的VB12、0.05μg/L-0.5μg/L的VB7、10μg/L-100μg/L的VB1组成。
9.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述通气条件为二氧化碳与空气的混合气体，以固定速率通入培养体系；其中，二氧化碳占混合气体的体积比例为0.0％-5％(包括0)，通气速率为0.025v/v/min-1v/v/min。
10.利用上述任一项权利要求所述的培养体系提高三角褐指藻岩藻黄素产率的藻菌共培养方法，其特征在于，按以下步骤进行：
(1)将促生菌接种到细菌培养基中，接种量为培养体积1‰-10％；培养条件为15-30℃，pH值为6-12，摇床转速为20rpm-500rpm；培养至指数生长中后期，OD600为0.5-10；
(2)将三角褐指藻接种到添加有机碳源的微藻培养基中，接种比例为培养体积的1％-50％；培养条件为15-30℃，pH值为6-12，通入二氧化碳与空气的混合气体(二氧化碳占混合气体的体积比例为0.5％-5％，通气速率为0.025v/v/min-1v/v/min)，光照强度为30μmoLm-2s-1-1200μmoLm-2s-1；
(3)将步骤1的促生菌菌液添加至步骤2的三角褐指藻藻液之中，藻液与添加菌液体积比为106:1-103:1；进行藻菌共培养；培养条件为15-30℃，pH值为6-12，通入二氧化碳与空气的混合气体(二氧化碳占混合气体的体积比例为0.0％-5％，通气速率为0.025v/v/min-1v/v/min)，光照强度为30μmoL m-2s-1-1200μmoLm-2s-1；
(4)若步骤2所用三角褐指藻为有菌三角褐指藻，则需在步骤3的培养过程中，定时添加步骤1的菌液，以维持促生菌在细菌群落结构中的优势地位，藻液与添加菌液体积比为106:1-103:1；
(5)若步骤2所用三角褐指藻为无菌三角褐指藻，则需在步骤3的培养过程中通入无菌气体。
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