CN117919395A - 恩替卡韦、ASO药物、mRNA治疗性疫苗和/或干扰素的组合在用于制造治疗慢性乙型肝炎的药物方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了恩替卡韦、ASO药物、mRNA治疗性疫苗和/或干扰素的组合在用于制造治疗慢性乙型肝炎的药物方面的应用，其中恩替卡韦、干扰素具有抗病毒作用，ASO药物降低乙肝表面抗原滴度，mRNA治疗性疫苗免疫速度快，因此本发明能够抑制病毒复制，从多角度多层次打击乙肝病毒，达到良好、持久且不反弹的抗病毒效果，并且在某种程度上能实现乙肝治愈。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其涉及恩替卡韦、ASO药物、mRNA治疗性疫苗和/或干扰素的组合在用于制造治疗慢性乙型肝炎的药物方面的应用。
背景技术
慢性乙型肝炎是一种严重影响人类健康安全的传染性疾病，据报道全球约有2.57亿慢性乙型肝炎病毒感染人群，每年约65万人死于乙肝病毒感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌。最近研究表明，机体对乙肝病毒的特异性免疫反应功能失调是导致乙型肝炎病毒(HBV)持续感染的主要原因，但是目前尚未有一种药物能够显著抑制乙肝病毒复制、清除乙肝表面抗原、提高特异性抗体、且作用持久。mRNA疫苗虽然具有安全性高、免疫速度快等优点，但目前也尚未有上市的mRNA乙肝疫苗产品。
目前用于治疗慢性乙型肝炎的药物包括干扰素、核苷(酸)类似物、ASO药物。干扰素通过诱导细胞合成抗病毒蛋白来发挥作用，具有广谱抗病毒作用。通过干扰素治疗慢性乙肝，能清除乙肝表面抗原，但清除率低，且需要长期使用，并导致血液、消化和中枢神经系统等出现不良反应。核苷(酸)类似物如恩替卡韦，可竞争性结合病毒底物抑制病毒复制，但存在乙肝表面抗原血清转换率低、免疫疗效较短、停药易复发且长期使用可产生耐药变异等问题。ASO药物是指具有抗感染、抗肿瘤、调节免疫系统等多种作用的一类生物制剂，其主要成分为反义寡核苷酸。ASO药物通过与目标RNA特异性杂交，干扰RNA的正常表达和功能，降低乙肝表面抗原滴度，从而达到治疗疾病的目的，但是ASO药物同样具有停药后反弹倾向。
目前，也存在恩替卡韦与干扰素的组合用于疗慢性乙型肝炎的情况，但是治疗周期长，停药后会出现反弹情况，且长期使用会产生耐药性而降低用药效果，具有一定的不良反应。
因此制造能够从多角度多层次打击乙肝病毒，达到良好、持久且不反弹的抗病毒效果的药物，具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了恩替卡韦、ASO药物、mRNA治疗性疫苗和/或干扰素的组合在用于制造治疗慢性乙型肝炎的药物方面的应用，能够从多角度多层次打击乙肝病毒，达到良好、持久且不反弹的抗病毒效果。
发明解决上述问题的技术方案如下：
本发明提供了恩替卡韦、ASO药物和mRNA治疗性疫苗的组合在用于制造治疗慢性乙型肝炎的药物方面的应用；所述ASO药物的序列为mG*mA*(5Me-mC)*mG*T*G*C*A*G*A*G*G*T*G*A*A*G*(5Me-mC)*mG*A*A*G*T*G*C*C*A*(5Me-mC)*mG*mG*mU，其中mA/mU/mG/mC表示2'-O-甲基修饰，*为硫代磷酸骨架修饰，(5Me-mC)为2'-甲氧基-5-甲基胞嘧啶，所述mRNA治疗性疫苗为编码乙型肝炎病毒包膜蛋白的大蛋白区域氨基酸序列的mRNA疫苗。
本发明还提供了恩替卡韦、ASO药物和干扰素的组合在用于制造治疗慢性乙型肝炎的药物方面的应用；所述ASO药物的序列为mG*mA*(5Me-mC)*mG*T*G*C*A*G*A*G*G*T*G*A*A*G*(5Me-mC)*mG*A*A*G*T*G*C*C*A*(5Me-mC)*mG*mG*mU，其中mA/mU/mG/mC表示2'-O-甲基修饰，*为硫代磷酸骨架修饰，(5Me-mC)为2'-甲氧基-5-甲基胞嘧啶，所述干扰素为派格宾聚乙二醇干扰素α-2b注射液。
本发明还提供了恩替卡韦、ASO药物、mRNA治疗性疫苗和干扰素的组合在用于制造治疗慢性乙型肝炎的药物方面的应用；所述ASO药物的序列为mG*mA*(5Me-mC)*mG*T*G*C*A*G*A*G*G*T*G*A*A*G*(5Me-mC)*mG*A*A*G*T*G*C*C*A*(5Me-mC)*mG*mG*mU，其中mA/mU/mG/mC表示2'-O-甲基修饰，*为硫代磷酸骨架修饰，(5Me-mC)为2'-甲氧基-5-甲基胞嘧啶，所述mRNA治疗性疫苗为编码乙型肝炎病毒包膜蛋白的大蛋白区域氨基酸序列的mRNA疫苗，所述干扰素为派格宾聚乙二醇干扰素α-2b注射液。
本发明中所述的mRNA治疗性疫苗为申请公布号CN 115992152A的编码乙型肝炎病毒包膜蛋白的大蛋白区域氨基酸序列的mRNA疫苗。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了恩替卡韦、ASO药物、mRNA治疗性疫苗和/或干扰素的组合在用于制造治疗慢性乙型肝炎的药物方面的应用，其中恩替卡韦、干扰素具有抗病毒作用，ASO药物降低乙肝表面抗原滴度，mRNA治疗性疫苗免疫速度快，因此本发明能够抑制病毒复制，从多角度多层次打击乙肝病毒，达到良好、持久且不反弹的抗病毒效果，并且在某种程度上能实现乙肝治愈。
附图说明
图1显示实施例3、4中探索结合IFN的组合药物制剂对疫苗效果的影响的小鼠分组及给药方式；
图2显示本发明实施例2中实验鼠的S、E抗原水平、HBV DNA水平；
图3显示本发明实施例2中实验鼠的S抗体水平；
图4显示本发明实施例2中实验鼠脾脏中T细胞占比；
图5显示本发明实施例3中实验鼠的S、E抗原水平、S抗体水平、HBV DNA水平；
图6显示本发明实施例3中实验鼠的ALT水平；
图7显示本发明实施例3中实验鼠的体重记录；
图8显示本发明实施例3中实验鼠的心、肺、肾切片示例；
图9显示本发明实施例3中实验鼠的总T细胞分类及细胞表面标志物及细胞因子占比；
图10显示本发明实施例4中实验鼠的S、E抗原水平、S抗体水平、HBV DNA水平；
图11显示本发明实施例4中实验鼠的总T细胞TSNE免疫细胞聚类及主要细胞占比；
图12显示本发明实施例4中实验鼠的总T细胞表面标志物表达量及细胞因子分泌情况。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但是实施例具体细节仅为了说明本发明，并不代表本发明构思下全部技术方法。因此不应理解为对本发明总的技术方案限定。本发明实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
在以下实施方式中，所用恩替卡韦为海南中和药业股份有限公司恩替卡韦分散片；所用ASO药物的序列为mG*mA*(5Me-mC)*mG*T*G*C*A*G*A*G*G*T*G*A*A*G*(5Me-mC)*mG*A*A*G*T*G*C*C*A*(5Me-mC)*mG*mG*mU，其中mA/mU/mG/mC表示2'-O-甲基修饰，*为硫代磷酸骨架修饰，(5Me-mC)为2'-甲氧基-5-甲基胞嘧啶；所用mRNA治疗性疫苗为申请公布号CN 115992152A的编码乙型肝炎病毒包膜蛋白的大蛋白区域氨基酸序列的mRNA疫苗；所用干扰素为派格宾聚乙二醇干扰素α-2b注射液
实施例1：动物造模
本实验方法采用C57BL/6/小鼠，SPF级，雄性，5-6周龄。首先，采用AAV转染的方法建立HBV carrier小鼠，1x1010vg rAAV8-1.3HBV ayw尾静脉注射4周后建立稳定HBV耐受及慢性HBV感染模型并使用。
实施例2：三联法组合药物制剂中不同给药方式与抗病毒效果研究
具体实施方式过程为将5-6周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为4组，每组6只，采用不同的处理方式，造模方法如实施例1所述，给药周期具体为：
第一组：ASO药物+恩替卡韦+DC为载体的mRNA疫苗，疫苗注射方式为皮下注射(ASO+ETV+DC mRNAVaccine s.c.)。第0周腹腔注射ASO药物30mg/kg，第1、2、5周腹腔注射ASO药物60mg/kg，第3、4周腹腔注射ASO药物90mg/kg。将恩替卡韦片剂以10μg/ml的浓度溶于小鼠日常饮用水中。DC为载体的mRNA疫苗采用双侧淋巴结周皮下注射200μl(10μg/只，大腿内侧淋巴结)，左侧100μl，右侧100μl，分别于第6、7周注射。
第二组：ASO药物+恩替卡韦+脂质纳米粒为载体的mRNA疫苗，疫苗注射方式为皮下注射(ASO+ETV+LNP mRNAVaccine s.c.)。ASO药物、恩替卡韦、疫苗注射方法同上组所示。
第三组：ASO药物+恩替卡韦+脂质纳米粒为载体的mRNA疫苗，疫苗注射方式为尾静脉注射(ASO+ETV+LNP mRNA Vaccine i.v.)。ASO药物，恩替卡韦给药方法同上组所示。
第四组：恩替卡韦(ETV)。恩替卡韦使用方法同上组所示。
第五组：对照组，饮用正常用水，并在相同时间点注射等量溶媒。
所有实验小鼠通过眼眶采血(～50ul)用于收集血液样本。血浆用于检测HBV DNA、HBeAg、HBsAg和HBsAb含量。给药29周后处死，取其脾脏进行流式实验分析外周免疫。
S抗原、E抗原、S抗体使用安图试剂盒检测
1.实验前准备
(1)将试剂盒(安图试剂盒)放置室温(18-25℃)下平衡。
(2)将恒温箱或水浴锅调至反应温度,待温度稳定后使用。
(3)配制洗液:1包固体洗液用500毫升纯化水溶解。
(4)提前60分钟将发光底物A、B液等比例混合至本次试验所需体积
2.实验步骤
(1)取出一定量的包被孔,编号,每孔分别加入50微升校准品及样本。
(2)每孔分别加入酶结合物50微升。
(3)在微型振荡器上振荡60秒使孔内液体混合均匀。
(4)贴上板贴,置37℃下温育60分钟。
(5)洗板:①手洗:甩净孔内液体,然后加入洗液350微升/孔,停留5秒钟后甩去,重复5次,最后在吸水纸上拍千。②机洗:每孔中注入洗液量350微升,洗板6次,最后在吸水纸上拍干。
(6)每孔加入混合后的发光底物50微升，震荡10秒后,室温(18℃-25℃)避光反应10分钟。
(7)化学发光检测仪检测发光强度。
DNA检测使用圣湘乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法)。
1.反应体系配置:
(1)取出样本释放剂(圣湘公司,与乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒配套使用),待平衡至室温后充分混匀,吸取5微升样本释放剂至96孔PCR板中。
(2)每孔加入待测样本5微升,用移液器吹打3-5次充分混匀，室温静置10分钟充分裂解。
(3)按照每个反应需要PCR反应液38微升,酶混合液2微升,内标0.2微升的比例根据测量样本的数量吸取各溶液,充分混匀成PCR混合液,瞬时离心后备用。
(4)每孔加入PCR混合液40微升,贴qPCR专用压敏封板膜后弹击充分混匀并去气泡，瞬时离心后进行PCR扩增。
2.PCR反应:
(1)将PCR板放入反应槽,并在软件中设置阴性对照、阳性对照、标准品及未知样品,标准品浓度为:标准品A:4x107IU/毫升,标准品B:4x106IU/毫升,标准品C:4x105IU/毫升,准品D:4x104IU/毫升。
(2)荧光通道选择FAM通道检测HBV-DNA,选择VIC通道检测内标,选择ROX通道作为参比荧光。
(3)循环参数设定:
3.数据处理:
利用分析软件通过对标准品Ct值的测量拟合标准曲线,并利用该标准曲线求得未知样品的HBV-DNA浓度
4.质量控制:
a)阴性对照:无Ct值显示；但内标检测为阳性(Ct值≤40)；
b)阳性对照:检测浓度值介于1.26x105-1.26x106IU/ml；
c)定量标准品:均检测为阳性，且标准曲线相关系数r≥0.98。
图2为小鼠治疗周期第203天血清HBsAg,HBeAg,HBV DNA测试结果，图3为小鼠疫苗免疫后8至29周的anti-HBs水平。
结果显示，与对照组相比，ASO、恩替卡韦与治疗性疫苗组合药物均可降低HBsAg滴度，中位下降水平可达80％，其中静脉注射mRNA疫苗小鼠在治疗周期后出现了HBsAg清零，清零率达16.7％，50％在100IU/ml以下(图2A)。不同疫苗给药方式对HBeAg并无明显区别，但与对照组相比约降低80％中位滴度(图2B)。恩替卡韦可抑制HBV DNA，降低其滴度，但与治疗性疫苗组合后可更好地抑制HBV DNA(HBV DNA转阴率：LNP皮下注射83.3％、LNP静脉注射66.7％、DC皮下注射50％，图2C)。
结果显示，ASO、恩替卡韦与治疗性疫苗组合药物制剂能诱导产生抗S抗体，在疫苗免疫后13周，静脉注射脂质纳米粒包裹的mRNA疫苗和皮下注射DC为载体的mRNA疫苗两组小鼠均呈现抗体阳性。其中，DC组出现一只小鼠用药敏感，产生高滴度抗体水平，其余小鼠在疫苗免疫后21周特异性抗体降至检测限以下，静脉注射组显示更强的抗体滴度水平，静脉给药可延长并增强小鼠抗体免疫时间(图3)。
体液免疫与细胞免疫激活验证：
从脾脏组织中用percoll密度梯度离心法分离单细胞形式的淋巴细胞,从新鲜血液中用Ficoll分离PBMC，进行计数后,将细胞用培养液稀释后加入24孔板中。培养板中加入适量S蛋白pepmix刺激物和阻断剂孵育12小时，将24孔板在37℃孵箱中孵育。12小时后，回收细胞，用流式细胞术胞外胞内染色实验对免疫相关细胞进行进一步分析。
流式细胞术的结果如图4所示，分别为小鼠脾脏中效应CD8+T细胞(图4A)、初始CD8+T细胞(图4B)、效应CD4+T细胞(图4C)、初始CD4+T细胞(图4D)的相对占比。
结果显示，ASO药物、恩替卡韦与mRNA疫苗的联合用药可以显著提高CD8+T细胞向CD8+效应T细胞转化(图4A-B)。脂质纳米粒为载体的mRNA疫苗可以促进CD4+/>T细胞向CD4+效应T细胞的转变(图4C-D)。静脉注射可以诱导更强大的初始T细胞向免疫功能细胞的分化。
综上所述，不同疫苗给药方式均能降低抗原滴度，诱导产生一定水平抗体。乙肝治疗型mRNA疫苗与ASO、抗病毒药物组合使用具有激活细胞免疫与体液免疫的双重功效，可打破免疫耐受状态，对乙肝功能性治愈具有良好前景。其中静脉注射以脂质纳米粒为递送方式的mRNA疫苗能够实现抗原转阴，诱导出更强大且持久的的抗体反应。但相比于静脉注射方式，皮下注射LNP为载体的mRNA疫苗抗体诱导能力有待提升。
实施例3：结合IFN的四联组合药物制剂的抗乙肝病毒作用
具体实施方式过程为将5-6周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为4组，每组6只，采用不同的处理方式，造模方法如实施例1所述，联合用药周期如图1，具体为：
第一组：ASO药物+恩替卡韦+干扰素+mRNA疫苗组(ASO+ETV+IFN+Vaccine)。第0周腹腔注射ASO药物30mg/kg，第1、2、8周腹腔注射ASO药物60mg/kg，第3、4周腹腔注射ASO药物90mg/kg，第9周腹腔注射ASO药物45mg/kg。将恩替卡韦片剂以10μg/ml的浓度溶于饮用水中。mRNA疫苗采用双侧淋巴结周皮下注射200μl(10μg/只，大腿内侧淋巴结)，左侧100μl，右侧100μl，分别于第10、11周注射。第5周起给予小鼠干扰素5000ng/只，三天一次，持续2周；
第二组：ASO药物+恩替卡韦+mRNA疫苗组(ASO+ETV+Vaccine)。ASO、ETV、mRNA疫苗给药方式如上所示；
第三组：ASO药物+恩替卡韦(ASO+ETV)。ASO、ETV给药方式如上所示；
第四组：mRNA疫苗组(Vaccine)。mRNA疫苗给药方式如上所示；
第五组：对照组，饮用正常用水，并在相同时间点注射等量溶媒。
所有小鼠皮下注射药物后，隔天称量体重并记录。所有实验小鼠通过眼眶采血(～50ul)用于收集血液样本。血浆用于检测HBV DNA、HBeAg、HBsAg和HBsAb含量以及ALT。分组由动物体重和HBsAg和HBV DNA含量决定。给药29周后处死,取其肝脏、脾脏、外周血。肝脏进行质谱流式分析肝脏原位免疫。
图5为小鼠治疗周期第203天血清HBsAg,HBeAg,HBV DNA测试结果和疫苗免疫后70至203天的anti-HBs水平。
结果显示，四联组合药物组显示强大且持久的HBsAg清除能力，用药结束后实现50％转阴率(图5A)。HBeAg在治疗周期后16.7％转阴，66.7％降至100PE IU/ml以下，与未加IFN组相比，HBeAg在100PE IU/ml以下占比提升50％，证明IFN与疫苗组合使用有助于E抗原不反弹(图2B，图5B)。与恩替卡韦组相比，联合治疗性疫苗的四药组合药物组与三药组合药物组均可以显著降低HBV DNA水平，抑制率实现83.3％(图5C)。单用疫苗组在疫苗免疫后第105天产生高滴度抗体，之后迅速下降。四联组合药物组不仅抗体滴度高，且在第203天依旧能产生高水平特异性抗体(图5D)。
使用Elabscience丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性荧光法试剂盒进行ALT检测。
1.试剂准备
(1)检测前,所有试剂需平衡至室温。
(2)酶试剂工作液的配制:每支酶试剂粉剂用1.2毫升缓冲液充分溶解,置于冰盒上待用。
(3)1毫摩尔/升丙酮酸标准品储备液的配制；取10微升100mmol/L丙酮酸标准品加入到990微升缓冲液中,配制成1毫摩尔/升的丙酮酸标准品储备液。
(4)50微摩尔/升丙酮酸标准品溶液的配制:按照1毫摩尔/升丙酮酸标准品储配液:缓冲液体积比为1:19的比例稀释20倍,即得50微摩尔/升标准品溶液,按需配制,置于冰盒上待用。
(5)反应工作液的配制:按缓冲液:探针:酶试剂工作液:底物体积比为56:4:20:20的比例混匀,避光保存。
2.操作步骤
(1)标准孔:向酶标板对应的标准孔中加入20微升的不同浓度标准品；测定孔:向酶标板对应的测定孔中加入20微升的待测样本。
(2)向步骤(1)各孔中加入100微升的反应工作液
(3)酶标仪上振板5秒,室温静置3分钟,荧光酶标仪上设置激发光波长535nm,发射光波长587nm,测定各孔荧光值,记为F1,然后于室温下避光静置反应60分钟,相同波长条件下测定各孔荧光值,记为F2,则△F＝F2-F1(注:标准孔不需要求差值,直接取反应60分钟后测定的荧光值做标准曲线即可)。
小鼠血清中ALT水平如图6所示。小鼠体重如图7所示。小鼠心、肺、肾切片示例如图8所示。
结果显示，四联组合药物组在第28天ALT水平有轻微上调趋势，但整体无差异(图6)，小鼠体重(图7)、心、肺、肾病理切片无差异(图8)，证明mRNA疫苗无明显毒性。
体液免疫与细胞免疫激活验证步骤如实施例2所示，用质谱流式实验对免疫相关细胞进行进一步分析。
质谱流式结果如图9所示，图9A为总T细胞TSNE免疫细胞聚类图，图9B为总T细胞marker热图，图9C显示C21亚群细胞占比，图9D、E显示T-bet表达情况及IL-2分泌情况。
C21细胞亚群是细胞杀伤性效应记忆T细胞，在T细胞中发挥重要作用(图9A-B)。结果显示，四药组合药物组的C21记忆细胞毒性T细胞占比显著高于三联用药组，表明四联组合药物可显著提高记忆CD8+T细胞占比(图9C)，联合IFN治疗有助于诱导记忆T细胞增殖。T-bet是T-box转录因子，广泛表达于活化的NK细胞、T、B细胞，是Th1发育的主要调节因子，并能调节IFN-γ的产生，对控制病原体至关重要。四联组合药物组的细胞T-bet表达显著高于三联组合药物组(图9D)，联合IFN治疗对细胞增殖，激活，发挥功能的表面标志物T-bet有显著增强效果。IL-2作为T细胞生长因子，是由T细胞受抗原刺激后产生的，具有促进T细胞的增殖分化以及诱导B细胞，NK细胞等其他免疫细胞增殖分化的功能。四联组合药物组的细胞IL-2表达显著高于三联组合药物组(图9E)。
由于静脉注射不良反应较多的共识，选用皮下注射的方式进行免疫治疗，综上所述，增加IFN的用药方式，具有保持S抗原、E抗原长期不反弹，HBV DNA清零，提高记忆CD8+T细胞趋势等特点，即ASO+ETV+IFN+Vaccine治疗方法具有提高小鼠特异性抗体产生、诱导细胞免疫相关记忆CD8+T细胞的产生、促进细胞因子产生等激活体液免疫与细胞免疫反应的优势。联合IFN治疗可增加免疫细胞T细胞数量，激活并促进其增殖和分化，显著提高细胞免疫应答；增强细胞因子如IL-2的分泌，具有促进B细胞增殖分化作用，通过间接提高体液免疫达到增强疫苗免疫的目的，使其更好地激发免疫系统产生免疫反应。
实施例4：三联或四联组合药物制剂抗乙肝病毒作用机制研究
具体实施方式过程为将5-6周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为4组，每组6只，采用不同的处理方式，造模方法如实施例1所述，联合用药周期如图1，给药方法如实施例3所示，分组具体为：
第一组：ASO药物+恩替卡韦+干扰素+mRNA疫苗组(ASO+ETV+IFN+Vaccine)；
第二组：ASO药物+恩替卡韦+干扰素组(ASO+ETV+IFN)；
第三组：ASO药物+恩替卡韦组(ASO+ETV)；
第四组：疫苗组(Vaccine)；
第五组：恩替卡韦组(ETV)；
第四组：对照组(Control)。
上述mRNA疫苗均为LNP包裹的mRNA疫苗，给药方式为皮下注射。
检测HBV DNA、HBeAg、HBsAg和HBsAb含量，肝脏进行质谱流式分析肝脏原位免疫，具体实施操作皆如实施例3所示。
小鼠相关数据结果参见图10-12所示，图10为小鼠治疗周期第203天血清HBsAg,HBeAg,HBV DNA测试结果和疫苗免疫后70-203天的anti-HBs水平。图11A为总T细胞TSNE免疫细胞聚类图，图11B、C为C21、C22亚群细胞占比，图12A-D显示T细胞表面marker表达情况，图12E-F显示T细胞主要细胞因子IL-2、IL-4分泌情况。
结果显示，如前所述，IFN与mRNA疫苗有助于S抗原、E抗原不反弹。只有IFN未加疫苗组，在治疗周期结束后全部处于检测限以上(图10A-B)，HBV DNA无法全部清零(图10C)，抗体水平均处于极低滴度状态(图10D)。
C22细胞亚群是细胞杀伤性效应T细胞，是杀伤性T细胞免疫的主要部分(图12A)。结果显示，四药组合药物组的C21记忆细胞毒性T细胞(图12B)、C22细胞杀伤性效应T细胞占比显著高于三联组合药物组，表明四联组合药物可显著提高功能性T细胞占比，联合治疗性疫苗有助于诱导记忆性和杀伤性T细胞增殖，显著激活细胞免疫。
Ki67是细胞增殖的激活标志，四联用药组的T细胞Ki67表达显著高于三联组合药物组(图12A)，联合疫苗治疗具有诱导T细胞增殖作用。CD86可在活化的T，B细胞，巨噬细胞，DC细胞表达，四联组合药物组的细胞CD86表达显著高于三联用药组(图12B)。CD279(PD-1)是一种重要的免疫抑制分子，在活化的效应T细胞上高表达。四联组合药物组的细胞PD-1表达显著高于三联组合药物组(图12C)，证明联合疫苗治疗可显著激活T细胞发挥免疫效应。Th1细胞参与细胞免疫应答，其特征性转录因子为T-bet，四联组合药物组的T-bet表达显著高于三联组合药物组，证明联合治疗性疫苗具有增强杀伤性T细胞增殖分化能力(图12D)。同样的，四联组合药物组的细胞因子IL-2的分泌显著高于三联组合药物组(图12E)。Th2细胞具有促进B细胞增殖分化为浆细胞并产生抗体的功能，主要分泌IL-4细胞因子，四联组合药物组IL-4分泌增强(图12F)，暗示联合治疗性疫苗通过增强Th细胞功能，间接地促进体液免疫。
综上所述，联合mRNA疫苗治疗方法在诱导特异性抗体产生方面具有显著效果。治疗性疫苗的联用具有激发T细胞增殖、激活，发挥免疫应答功能的作用，可诱导细胞免疫相关T细胞产生，直接激活细胞免疫与间接激活体液免疫的双重作用。
不同治疗手段提升细胞免疫能力不同，乙肝治疗型mRNA疫苗与ASO、抗病毒药物可激活细胞免疫与体液免疫，打破免疫耐受窘境，增加IFN治疗可显著刺激T细胞免疫反应，诱导更强大抗体反应。不同给药方式证明，静脉注射疫苗可激发细胞免疫，而皮下注射疫苗联合干扰素亦可以显著提高细胞免疫能力。本发明所述的ASO、恩替卡韦、mRNA治疗性疫苗和/或IFN的组合可保持抗原长期不反弹，维持一个较高且持久的抗体滴度水平，所诱导的细胞免疫效果更强，可行性更高。
Claims (3)
1.恩替卡韦、ASO药物和mRNA治疗性疫苗的组合在用于制造治疗慢性乙型肝炎的药物方面的应用；所述ASO药物的序列为mG*mA*(5Me-mC)*mG*T*G*C*A*G*A*G*G*T*G*A*A*G*(5Me-mC)*mG*A*A*G*T*G*C*C*A*(5Me-mC)*mG*mG*mU，其中mA/mU/mG/mC表示2'-O-甲基修饰，*为硫代磷酸骨架修饰，(5Me-mC)为2'-甲氧基-5-甲基胞嘧啶，所述mRNA治疗性疫苗为编码乙型肝炎病毒包膜蛋白的大蛋白区域氨基酸序列的mRNA疫苗。
2.恩替卡韦、ASO药物和干扰素的组合在用于制造治疗慢性乙型肝炎的药物方面的应用；所述ASO药物的序列为mG*mA*(5Me-mC)*mG*T*G*C*A*G*A*G*G*T*G*A*A*G*(5Me-mC)*mG*A*A*G*T*G*C*C*A*(5Me-mC)*mG*mG*mU，其中mA/mU/mG/mC表示2'-O-甲基修饰，*为硫代磷酸骨架修饰，(5Me-mC)为2'-甲氧基-5-甲基胞嘧啶，所述干扰素为派格宾聚乙二醇干扰素α-2b注射液。
3.恩替卡韦、ASO药物、mRNA治疗性疫苗和干扰素的组合在用于制造治疗慢性乙型肝炎的药物方面的应用；所述ASO药物的序列为mG*mA*(5Me-mC)*mG*T*G*C*A*G*A*G*G*T*G*A*A*G*(5Me-mC)*mG*A*A*G*T*G*C*C*A*(5Me-mC)*mG*mG*mU，其中mA/mU/mG/mC表示2'-O-甲基修饰，*为硫代磷酸骨架修饰，(5Me-mC)为2'-甲氧基-5-甲基胞嘧啶，所述mRNA治疗性疫苗为编码乙型肝炎病毒包膜蛋白的大蛋白区域氨基酸序列的mRNA疫苗，所述干扰素为派格宾聚乙二醇干扰素α-2b注射液。
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