CN117916364A - 用于生产增值化学品的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
一种分子制造方法，所述方法包括将平台分子与(i)生物催化剂和(ii)化学催化剂在适合于生产增值化学品的条件下接触。
Description
与相关申请的交叉引用
本申请要求由Lee等人于2021年7月22日提交的题为“用于生产增值化学品的组合物和方法”(COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCTION OF VALUE-ADDED CHEMICALS)的美国临时申请系列号63/224,553的优先权，所述临时申请的全部内容为所有目的整体通过引用并入本文。
对电子序列表的参考
于2022年7月9日创建的标题为“21PRC018(3416-07401)SEQUENCE LISTING.xml”、大小为38,283个字节的电子序列表的内容整体通过引用并入本文。
技术领域
本公开总的来说涉及用于生产增值化学品的组合物和方法。更具体而言，本公开涉及从生物可再生原料生产增值化学品的化学酶促方法。
背景技术
目前，大多数化学品和能源都从有限的基于化石燃料的资源生产。全世界社会和商业市场依赖于这些消耗性化石燃料来生产约80％的能源和90％的化学品。由于有害温室气体和有毒物质的排放，这些化石燃料的大规模生产和使用对环境造成了负面影响。随着世界人口的增长，对能源和化学品的需求也在大幅增加。
传统的化学制造通常基于(i)使用热产生反应和相应产物的石化途径，或(ii)通常利用微生物和诸如发酵的过程的生物途径。这两种路线都产生产物和杂质的混合物，其需要大量加工才能以可接受的纯度百分率获得感兴趣的化合物。因此，这些路线不是非常高效并且可能是昂贵的。此外，这两种路线都会产生大量的CO2，要么作为生物副产物，要么作为产生用于反应的热的燃烧的产物。从廉价的生物可再生原料生产增值化学品的典型挑战包括使用苛刻、昂贵和对环境不友好的试剂和条件。
由于对能源和化学品的需求不断增加，并且为了克服与消耗性化石燃料及其相关环境影响相关的问题，鉴定用于生产能源和化学品的替代资源势在必行。生物质是具有碳中和生产商业化学品潜力的唯一可行的可持续原料。通过利用生物质功能的多样性以及目前的热转化和生物化学转化能力，石化产品的生物基直接替代品以及当前石化行业范围之外的新产品具有巨大的潜力。
对于这些通常与增值化学品的商业生产相关的昂贵和碳排放密集型加工步骤的消除和简化，存在着持续的需求。
附图说明
为了详细描述所公开的方法和系统的各个方面，现在将参考附图，在所述附图中：
图1A是本文公开的方法的示意性概述。
图1B是本文公开的方法的示意性概述。
图2示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图3示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图4示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图5示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图6示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图7示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图8示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图9示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图10示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图11示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图12示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图13示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图14示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图15示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图16示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图17示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图18示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图19示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图20示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图21描绘了来自实施例1的样品的HPLC迹线。
图22A呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图22B呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图23A呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图23B呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图24呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图25呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图26呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图27A呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图27B呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图28呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图29A呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图29B呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图30A呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图30B呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图31呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图32A呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图32B呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图33呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图34呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图35呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图36示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图37呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图38示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图39示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图40呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图41呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图42呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图43呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图44呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图45呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图46呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图47呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
图48示意性描绘了本文公开的分子制造方法的一个方面。
图49呈现了所指示的样品的酶活性测定结果和反应方案。
具体实施方式
概述
本文公开了将原料例如糖、空气和二氧化碳分子转化为增值化学品(VAC)的方法和组合物。本文公开的方法利用生物催化剂和金属催化剂的组合来进行商业上重要的转化例如氧化、脱水、羧化、羧基连接和氢化的组合。在本公开的一个方面中，使用平台化学品来生产VAC。在一个方面中，所述平台化学品包括醇类例如乙醇和甲醇、糖类例如葡萄糖、羟甲基糠醛、2,5-呋喃二甲酸、甘油、乙二醇、琥珀酸、烟酰胺或其组合。
正如本文所公开的，所述反应化学包括四个单元操作，可以由此制造支撑现代社会的90％的化学品、成分和材料。本文公开的方法主要利用氧化、脱水、羧化和/或氢化反应来生产VAC。因此，正如本文所公开的，使用酶和催化剂(例如非均相催化剂如非均相金属催化剂)的系统可以进行氧化反应、脱水反应、羧化反应或氢化反应中的至少一者，以从反应物生产产物。然后可以使用各种分离步骤来分离产物，并将未反应的材料再循环到反应组列中以在系统内继续反应。总体而言，本文公开的方法可以有利地产生更少副产物，这将对所述方法的经济性做出积极贡献。
在本文公开的系统和方法中，正在开发至少三种酶促转化，包括氧化、脱水和羧化。这些反应允许所述系统和方法通过与氧气源(例如空气)或二氧化碳直接反应来转化各种不同的原料和中间体，以产生中间体和/或产物。通常，可以将所述酶在适合的环境例如水性环境(例如缓冲液)中与反应物接触。所述反应物可以是非均相(例如气体/液体环境)和/或均相的。在反应中，所述酶可以在各种化学循环中产生产物，使得所述酶可以在商业上适合的时间段内进行反应，同时在反应循环中维持足够的活性。可以设想，随着时间的推移，本公开的生物催化剂可能经历一些催化或结构完整性的损失。在一个或多个方面中，本公开的方法包括全部或部分酶催化剂的再生或替换。
所述系统中使用的酶的选择也是本文描述的方法的组成部分。在大多数系统中，可以开发或选择含有具有满足某些用户和/或方法目标的一种或多种特征的生物催化剂的生物体，以在本文公开的方法中使用。然而，生物有机体的使用可以产生一系列反应产物，包括副产物和二氧化碳。本公开的方法不是对生物体进行工程设计，而是考虑对酶进行合理的工程设计，所述酶可以针对满足某些用户和/或方法目标的一种或多种特征(例如特定反应速率和/或底物选择性)进行选择。
可以采用任何适合的酶选择方法。例如，酶的选择和开发工作可以包括高通量筛选以及计算设计和机器学习算法，以实现所需结果。一旦选择，可以生产所述酶(例如通过发酵)并随后进行分离，并且纯化的酶可以在不存在任何来源生物体的情况下部署在反应容器内。
在一个或多个方面中，酶催化剂的生产使用正交微生物宿主平台，从而可以使用短的设计-构建-测试-分析周期快速测试来自不同来源的蛋白质并扩大规模。在所述方法中使用的酶催化剂可以从广泛的各种天然来源(例如植物、细菌、真菌)获得，因此并不总是容易在单个宿主中表达。本公开的方法可以利用在酶生产过程中使用的三类来源生物体细菌、酵母和真菌中的一者或多者作为蛋白质生产宿主，以产生可能不在任何单一生物体中表达的有价值的酶。
现有技术的生物体工程设计能力与自动化和AI相结合，允许设计-构建-测试-分析周期保持较短，并允许通过递归学习不断改进，所有这些都是为了一个目标：蛋白质生产。通过这种方式，所产生的高度定制的酶可以容易地规模放大和分离，以用于本文公开的系统和方法。
在某些方面中，本公开中使用的催化剂可以是非均相金属催化剂。非均相金属催化剂通常由分散在高表面积多孔载体上的小金属纳米粒子组成。所述载体可以具有适合的孔径，以允许在所述过程中使用的各种分子反应。在某些方面中，所述金属催化剂可以在低温下在水性流体(例如水、缓冲液)中操作，而不会随着时间的推移显著降解。在某些方面中，催化组分可以包括金，其可以允许氧化、脱水和氢化反应。含金催化剂不可用于石化反应，因为它们在高温下失活。通常，本文公开的方法和反应可以在低于300℉下进行，这可以允许使用所述金属催化剂和酶的反应以高通量和高产率进行高选择性分子转化。
整个方法如图1A和1B中所示。如图1A中所示，所述方法包括将包含反应物的输入物在适合的介质中与生物催化剂(例如酶)反应。酶促途径的输出物可以产生中间体，然后使用金属催化剂使所述中间体反应以产生终产物。分离技术可以在所述方法中的任何点使用，用于分离和纯化一种或多种VAC以产生最终产物料流。
在某些方面中，反应的顺序可以改变。如图1B中所示，所述方法可以包括将包含反应物的输入物在适合的介质中与金属催化剂反应，以产生至少一种中间体。所述金属催化剂反应的输出物是中间体，然后可以使用生物催化剂例如酶使所述中间体反应以产生终产物。分离技术可以在所述方法中的任何点使用，用于分离和纯化一种或多种VAC以产生最终产物料流。
糖类
在一个方面中，所述平台化学品包括葡萄糖。在此类方面中，葡萄糖被转变成VAC例如葡萄糖二酸、D-异抗坏血酸、L-抗坏血酸、琥珀酸、2,5-呋喃二甲酸或呋喃二甲酸甲酯。
在一个方面中，如图2中示意性描绘的，葡萄糖被转变成葡萄糖二酸。参考图2途径A，葡萄糖在α-D-葡萄糖与β-D-葡萄糖之间异构化。可以将葡萄糖与半乳糖氧化酶(GAO)变体在适合于将C6醇氧化成醛的条件下接触，产生D-葡萄己二醛糖。然后可以将D-葡萄己二醛糖与葡萄糖氧化酶(GOX)在适合于将C1醇氧化的条件下接触，以产生L-古洛糖醛酸-δ-2,6-内酯。与L-古洛糖醛酸处于平衡中的L-古洛糖醛酸-δ-2,6-内酯可以被直接收获，或与非均相金属催化剂(HMC)或过渡金属催化剂(TMC)在适合条件下进一步反应，以形成葡萄糖二酸。
在一个可选方面中，如图2中的途径B所描绘的，将GAO变体和GOX同时与葡萄糖在适合条件下接触，以产生D-葡萄糖酸-δ-1,5-内酯。在一个或多个方面中，将D-葡萄糖酸-δ-1,5-内酯进一步处理并作为产物分离。在可选方案中，将D-葡萄糖酸-δ-1,5-内酯酸化以形成葡萄糖酸盐，将其与GAO在适合条件下接触以形成L-古洛糖醛酸盐。酸化可以使用任何适合的酸化剂(例如HCl)进行。可以将L-古洛糖醛酸盐与HMC在适合条件下接触，以形成葡萄糖二酸。
在一个可选方面中，如图3中示意性描绘的，将GAO变体与葡萄糖在适合于将葡萄糖的C6醇氧化成醛的条件下接触，产生二醛即D-葡萄己二醛糖。然后可以将D-葡萄己二醛糖与HMC和/或TMC在适合条件下接触，以形成葡萄糖二酸。
在一个或多个方面中，一种生产VAC葡萄糖二酸的方法包括将多糖单加氧酶(PMO)与平台化学品葡萄糖在适合于将葡萄糖的C1和C6醇两者氧化以形成糖二酸内酯的条件下接触。这个反应被示意性描绘在图4中。所述内酯在大于约pH 7的碱性条件下容易地水解，以形成葡萄糖二酸。值得注意的是，糖二酸内酯也在相关反应条件下缓慢地自水解形成游离酸。
在一个或多个方面中，PMO可以与GOX组合，以氧化葡萄糖的C1醇。由于当提供过氧化氢时PMO也疑似将C4醇氧化成酮，因此可以添加过氧化氢酶以限制这种氧化剂的可利用性，抑制不想要的C4酮途径。来自这个过程的产物也可以在HMC上通过，以将任何未反应的糖类氧化成二酸。
在一个或多个方面中，将葡萄糖与包含GOX、动物过氧化物酶(XPO)、卤化物离子、硝基自由基介导物(NRM)或其组合的酶促氧化组合物(EOC)接触。在本文中，“卤化物”具有其通常的含义；因此，卤化物的实例包括氟化物、氯化物、溴化物和碘化物。
在一个方面中并参考图5，可以将葡萄糖与NRM在适合的条件下接触，以形成D-葡萄己二醛糖。然后可以将D-葡萄己二醛糖与GOX在适合的条件下接触，以形成D-古洛糖醛酸-δ-1,5-内酯，其可以在HMC存在下转变成葡萄糖二酸。在可选方案中，将葡萄糖首先与GOX在适合的条件下接触，以形成D-葡萄糖酸-δ-1,5-内酯。可以将NRM包括在所述反应中，以促进从D-葡萄糖酸-δ-1,5-内酯形成D-葡萄糖醛酸-δ-1,5-内酯，并随后使用HMC将其氧化成葡萄糖二酸。
在一个方面中并参考图6，可以将葡萄糖与GAO在适合的条件下接触，以形成D-葡萄己二醛糖。D-葡萄己二醛糖可以任选地与GAO接触，以产生D-古洛糖醛酸。然后可以将D-葡萄己二醛糖或D-古洛糖醛酸与细胞周质醛氧化酶(PAO)或非特异性过氧合酶(UPO)接触，以形成葡萄糖二酸。
在另一个方面中，图7示意性描绘了从葡萄糖生产L-抗坏血酸(L-AA)的化学酶促方法的一个方面。参考图7，使用工程化半乳糖氧化酶(GAO)将葡萄糖氧化成醛。然后通过金属加氢催化剂将所述醛还原，以产生D-葡萄糖酸盐。然后使用吡喃糖-2-氧化酶(POX)将D-葡萄糖酸盐氧化成2-KGA，其可以通过酸催化剂、甲酯化、内酯化、质子化或其组合进行环化，以形成LAA。可以将过氧化氢酶添加到涉及产生过氧化氢的氧化酶的任何步骤中，以便将这种反应性化学品分解成无害的水和氧气，从而保护酶功能。
在一个方面中并参考图8，GOX氧化葡萄糖中的C1，以产生葡萄糖酸内酯。同时，POX氧化C2以产生2-酮基葡萄糖。两种酶的组合产生2-酮基葡萄糖酸盐。可以将产物(即2-酮基葡萄糖酸盐)分离，并随后与甲醇在酸存在下反应，以形成2-酮基葡萄糖酸甲酯。所述甲酯的形成阻止了醇和羧酸盐在加热后的酯化。在一个或多个方面中，碳酸氢钠和硫酸的添加被用于产生甲醇钠，其随后可以将2-酮基葡萄糖酸甲酯异构化成D-EA。
在图9中示意性描绘的本公开的另一个方面中，从D-葡萄糖通过GOX合成D-葡萄糖酸-1,5-内酯。D-葡萄糖酸内酯充当GLO的底物，其产生D-EA。可以添加过氧化氢酶以降解在GOX和GAO反应中产生的过氧化氢，从而保护酶功能。氧气通过充当电子受体被用于驱动氧化反应，其驱动辅因子再生。
在图10中示出的本发明的另一个方面中，将GOX和POX酶的混合物顺序或组合部署到葡萄糖底物上，以产生2-KG，然后通过酸催化将其环化。在图4中，使用POX催化葡萄糖向2-酮基葡萄糖的转化。然后使用非均相金属催化剂将这种化合物氧化成2-KG，然后在酸催化的过程中或通过与Reichstein方法相似的甲酯化、内酯化和质子化进行环化。在一个方面中，使用金属催化剂产生2-KG，因为这消除了对添加化学计算量的碱(即氢氧化钠)以使pH稳定并维持POX酶的功能的需求。
在一个方面中，所述金属催化剂包括金属氧化催化剂。在此类方面中，所述金属氧化催化剂是负载型过渡金属氧化催化剂或纳米粒子负载型过渡金属氧化催化剂。在后文中，它们被合称为“TMC”。在一个方面中，所述载体包括碳、二氧化硅、氧化铝、二氧化钛(TiO2)、氧化锆(ZrO2)、沸石或其任何组合，其含有以所述载体的总重量计少于约1.0重量百分比(wt.％)或少于约0.1wt.％或少于约0.01wt.％的SiO2黏合剂。
适合的载体材料主要是中孔或大孔的，并且基本上不含微孔。例如，所述载体可以包含少于约20％的微孔。在一个方面中，所述载体是多孔纳米粒子载体。本文所使用的术语“微孔”是指通过氮吸附和汞孔隙率测定法所测量并由IUPAC所定义的直径<2nm的孔。本文所使用的术语“中孔”是指通过氮吸附和汞孔隙率测定法所测量并由IUPAC所定义的直径为约2nm至约50nm的孔。本文所使用的术语“大孔”是指通过氮吸附和汞孔隙率测定法所测量并由IUPAC所定义的直径大于50nm的孔。
在一个方面中，所述载体包含中孔碳挤出物，其具有约10nm至约100nm的平均孔径和大于约20m2 g-1但小于约300m2 g-1的表面积。适合在本公开中使用的载体可以具有任何适合的形状。例如，所述载体可以被成形为0.8-3mm的三叶、四叶形或颗粒挤出物。这种成形的载体使得能够使用固定滴流床反应器在连续流动下进行最终的氧化步骤。
在一个或多个方面中，所述金属包括第8族金属(例如Re、Os、Ir、Pt、Ru、Rh、Pd、Ag)、3d过渡金属、早期过渡金属或其组合。在一个方面中，所述TMC包含金Au。
在一个方面中，所述TMC包含铂和金，并且是非均相固相TMC。在此类方面中，适合的催化剂载体包括但不限于碳、表面处理的氧化铝(例如钝化的氧化铝或包被的氧化铝)、二氧化硅、二氧化钛、氧化锆、沸石、蒙脱石和改性物及其混合物或组合。可以对催化剂载体进行处理，以促进铂和金在载体外表面上的优先沉积，从而产生壳型TMC。起到TMC作用的含有铂和金的化合物可以通过任何适合的方法来生产。例如，含有铂和金的TMC可以使用沉积程序例如初湿、离子交换和沉积沉淀来生产。
在其他方面中，所述金属催化剂是包含金属相的TMC，所述金属相是Cu、Ag、Au、Ni、Pd、Pt或Ir的单金属或多金属组合。所述活性相的活性、选择性和稳定性可以用早期3d、4d和5d过渡金属或重后过渡金属例如Sn、Sb和Bi的掺杂剂进行调节。在某些方面中，将金属(例如第1族金属)插入到金属晶格中以调节催化剂性质。在一个方面中，使用任何适合的方法将活性相的盐前体沉积到本文公开的类型的载体上。例如，活性相的沉积可以使用诸如初湿浸渍、本体吸附浸渍或沉积沉淀的技术来进行。
在一个方面中，然后将所述活性相的沉积盐前体在低于约100℃的温度下用适合的盐(例如甲酸盐)通过液相还原(LPR)，或者在约200℃至约500℃或约200℃至约450℃范围内的温度下通过气相还原(GPR)转化成活性相。在一个方面中，所述金属催化剂包含金、铂或其组合，并在等于或大于约150℃的温度下在空气中进行煅烧。
在一个方面中，装载在本文公开的类型的载体上的活性相的量以所述TMC金属催化剂的总重量计小于约2.0重量百分比(wt.％)、或小于约1.5wt.％、或小于约1.0wt.％。在一个方面中，装载在本文公开的类型的载体上的活性相的量以所述TMC金属催化剂的总重量计等于或小于约0.5wt.％。在一个方面中，所述活性相在载体上的径向分布是各向异性的，其中所述活性相基本上集中在“核-壳”构型的挤出载体表面附近<500μm的环中。本文公开的类型的TMC金属催化剂可以被表征为醛官能团转化为羧酸的生产率等于或大于约0.05mol酸g-1活性金属h-1或等于或大于约0.1mol酸g-1活性金属h-1，选择性为约70％至约90％、或等于或大于约70％、或等于或大于约80％、或等于或大于约85％、或等于或大于约90％。在此类方面中，所述TMC金属催化剂表现出约60％至约95％、或等于或大于约70％、或等于或大于约80％、或等于或大于约90％的转化率。此类TMC金属催化剂可以表现出约1ppb至约100ppb、或小于约100ppb、或小于约90ppb的稳态淋溶量。在一个方面中，本文公开的类型的TMC金属催化剂可以在约40℃至约120℃、或约40℃至约110℃或约50℃至约100℃的温度范围内，在约10巴至约100巴、或约20巴至约100巴、或约20巴至约90巴范围内的压力下使用。
在一个方面中，在本公开的反应中使用小分子化学催化剂，例如酸或碱。适合用作整理催化剂的酸或碱的实例包括但不限于盐酸、硫酸、甲酸、氢氧化钠和尿素。
在一个方面中，除了一种或多种生物催化剂之外，用于生产D-EA的反应混合物还可以包括一种或多种纯化的酶辅因子。适用于本公开的纯化的酶辅因子的非限制性实例包括焦磷酸硫胺素、NAD+、NADP+、磷酸吡哆醛、甲基钴胺素、钴胺素、生物素、辅酶A、四氢叶酸、甲基萘醌、抗坏血酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸和辅酶F420。此类辅因子可以被包括在初始反应混合物中和/或在反应过程中的不同点加入。在某些方面中，辅因子可以容易地用氧气再生和/或可以在生物催化剂的整个寿命期间保持稳定。
在一个或多个方面中，在本文公开的氧化反应期间产生的过氧化氢可以使用任何适合的方法歧化。例如，过氧化氢可以通过与过氧化氢酶在适合的条件下接触而歧化，以形成水和分子氧。在此类方面中，分子氧可以作为产物回收，其被再循环并在另外的反应中用作组分。
在一个方面中，从平台化学品葡萄糖合成VAC琥珀酸。在此类方面中，本公开的方法包括将葡萄糖氧化以形成2-酮基中间体。在一个方面中，葡萄糖的氧化由TMC催化。可以使用能够将葡萄糖氧化以产生2-酮基中间体的任何TMC。在一个方面中，所述TMC包含铂、铋、金或其组合。在此类方面中，所述TMC可以被负载在诸如碳或氧化铝的材料上。在一个方面中，所述TMC是负载型Pt/Bi/Au催化剂。在本公开的一个方面中，将葡萄糖与负载型Pt/Bi/Au催化剂在适合条件下接触导致形成2-酮基中间体2-酮基-葡萄糖酸。
在生产琥珀酸的可选方面中，所述催化剂是酶，可选为醇氧化酶(AOX，E.C.1.1.3.13)或醇氧化酶同源物。AOX是一种普遍存在的黄素依赖性酶，其使用氧气作为氧化剂将低级伯醇氧化为醛。AOX可以来源于克勒克酵母属(Kloeckera)、Torulosis、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)和梅奇酵母属(Metschnikowia)物种的甲基营养酵母。在一个可选方面中，AOX来源于利用甲醇的细菌例如荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)、嗜热土壤真菌例如金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)和褐腐真菌例如密褐褶孔菌(Gloeophyllum trabeum)。或者，所述AOX可以来源于白腐担子菌黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。将葡萄糖与AOX在适合的条件下接触导致形成2-酮基中间体2-酮基-葡萄糖酸盐。
在又一个方面中，将葡萄糖转变成琥珀酸的方法包括将2-酮基中间体脱羧以形成D-核酮糖。在一个方面中，2-酮基中间体的脱羧在任何适合的催化剂存在下进行。例如，所述脱羧可以在与聚合物基质缔合的铜离子存在下进行。在一个方面中，所述催化剂包含CuSO4和聚乙烯吡咯烷酮，并且所述反应在氧化性气氛下进行。
在一个方面中，所述将葡萄糖转变成琥珀酸的方法进一步包括将D-核酮糖脱水以产生糠醛。D-核酮糖的脱水可以在酸催化剂存在下在适合条件下进行。适合在本公开中使用的酸催化剂是固体酸催化剂或离子交换树脂酸催化剂。例如，所述酸催化剂可以包含AMBERLYSTTM 15DRY聚合物催化剂，其是一种珠子形式的强酸性催化剂。在一个可选方面中，所述D-核酮糖的脱水在甲酸和AMBERLYSTTM 15DRY聚合物催化剂存在下进行。在此类方面中，所述甲酸可以通过添加氧化剂例如过氧化氢来去除。
在一个方面中，所述将葡萄糖转变成琥珀酸的方法进一步包括将糠醛氧化以产生琥珀酸。在一个方面中，糠醛向琥珀酸的氧化在氧化剂和催化剂存在下进行。例如，所述酸催化剂可以包括AMBERLYSTTM 15DRY聚合物催化剂，并且所述氧化剂可以包括过氧化氢。所述反应可以在适合于将糠醛转变成琥珀酸的条件下进行。
在一个方面中，从平台化学品葡萄糖产生VAC 2,5-呋喃二甲酸(FDCA)或(FDME)。在此类方面中，可以将葡萄糖与酶(例如GAO)、碱(例如NaOH)和空气在适合条件下接触，以形成氧化产物。
醇类
在一个方面中，所述平台化学品是醇例如乙醇。在一个方面中，本公开的方法包括将乙醇与醇氧化酶(E.C.1.1.3.13)在适合条件下接触，以形成乙醛。这被示意性描绘在图11中。
在一个方面中，本公开的方法包括从平台化学品乙醇生产VAC丙二醇。在此类方面中，将乙醇与本文公开的类型的乙醇氧化酶(例如AOX、GAO)在适合条件下接触，以形成醛。所述方法可以进一步包括将所述醛与生物催化剂在适合条件下接触，以形成丙酮酸。可以使用适合于将醛转变成丙酮酸的任何生物催化剂。在一个方面中，将所述醛与丙酮酸脱羧酶(PDC)在二氧化碳存在下，在适合于形成丙酮酸的条件下接触。在一个方面中，本公开的方法进一步包括将所述丙酮酸在加氢催化剂存在下，在适合条件下加氢，以形成丙二醇。
在一个方面中，本文公开了从平台化学品乙醇生产VAC乳酸、丙烯酸、丙二醇和丙醇的方法。在一个方面中，本文公开的方法涉及将乙醇化学酶促转变成乳酸、丙烯酸、丙二醇或丙醇。在后文中，乳酸、丙烯酸、丙二醇和丙醇可以被单独地称为“C3产物”或合称为“C3产物”。
在一个方面中，生产C3产物的方法包括将乙醇与一种或多种酶在适合条件下接触，以产生中间体(例如乙醛)。这被描绘在图12中。
参考图12，本公开的方法包括阶段I，其中将乙醇与能够催化乙醇向乙醛的选择性有氧氧化的酶接触。在一个方面中，这种酶是乙醇氧化酶(EOX)。阶段1可以进一步包括将所述醛与丙酮酸脱羧酶(PDC)在二氧化碳(CO2)或CO2源的存在下接触，以产生丙酮酸。如图12中所描绘的，丙酮酸与丙酮酸盐之间的平衡可以使用任何适合的方法来建立，例如pH调节、电解或离子交换。在一个方面中，所述pH调节通过添加包含单价阳离子的碱来进行。例如，所述碱可以是氢氧化钠，其形成包含单个丙酮酸根阴离子和钠阳离子的阳离子对。
所述方法可以进一步包括阶段2，其中从乙醇与EOX的反应产生的丙酮酸随后通过部分氢化被转变成乳酸，然后脱水成丙烯酸。或者，丙酮酸或乳酸可以被部分氢化成1,2-丙二醇(丙二醇)或正丙醇。
本文公开的方法的阶段2部分可以可选地通过两条路线进行，均由金属催化剂催化。第一条路线使用苛性氢氧化物与电渗析和离子交换相结合，同时产生硫酸钠或石膏。第二条路线使用氨和酯化，通过乙酯中间体(例如丙酮酸乙酯、乳酸乙酯和丙烯酸乙酯)进行，而不同时产生盐。
在一个方面中，所述加氢催化剂包括金属催化剂，可选为负载型金属催化剂。乳酸盐与乳酸之间的平衡可以使用任何适合的方法来建立，例如pH调节、电解或离子交换。在某些方面中，所述金属催化剂是手性的，并催化主要或专门是R-乳酸或主要或专门是S-乳酸的生产。
在一个可选方面中，阶段2进一步包括将乳酸盐脱水以形成丙烯酸盐。丙烯酸盐与丙烯酸之间的平衡可以使用任何适合的方法来建立，例如pH调节、电解或离子交换。在某些方面中，乳酸盐的脱水由金属催化剂、可选为负载型金属催化剂催化。所述金属催化剂或负载型金属催化剂可以与用于促进丙酮酸盐还原的催化剂相同或不同。在另一个可选方面中，阶段2包括在金属催化剂或负载型金属催化剂和氢气存在下将乳酸氢化，以形成含有丙基的化合物。在一个方面中，所述含有丙基的化合物包括1-丙醇、2-丙醇、丙二醇或其组合。所述金属催化剂或负载型金属催化剂可以与用于促进丙酮酸盐通过氢化的还原的催化剂相同或不同。
在一个方面中，另一种将乙醇转变成C3化合物的方法总体描绘在图13中。参考图13，本公开的方法包括阶段I，其中将乙醇与能够催化乙醇向乙醛的选择性有氧氧化的酶接触。在一个方面中，这种酶是乙醇氧化酶(EOX)。阶段1可以进一步包括将乙醛与丙酮酸脱羧酶(PDC)在二氧化碳(CO2)或CO2源存在下接触，以产生丙酮酸。如图13中所示，丙酮酸与丙酮酸盐之间的平衡可以使用任何适合的方法来建立，例如pH调节、电解或离子交换。在一个方面中，pH调节通过添加包含二价阳离子的碱来进行。例如，所述碱可以是氢氧化钙，其能够提供每个钙离子两个氢氧根离子。向丙酮酸添加氢氧化钙产生包含两个丙酮酸根阴离子和钙阳离子的阳离子对。
所述方法可以进一步包括阶段2，其包括通过加氢催化剂将丙酮酸盐还原以形成乳酸盐。在一个方面中，所述加氢催化剂包括金属催化剂，可选为负载型金属催化剂。如图13中所示，乳酸钙(具有两个乳酸根部分)与乳酸之间的平衡可以使用任何适合的方法来建立，例如pH调节、电解或离子交换。在某些方面中，所述催化剂是手性的，并催化主要或专门是R-乳酸或主要或专门是S-乳酸的生产。
在一个可选方面中，阶段2进一步包括将乳酸盐脱水以形成丙烯酸盐。如图13中所示，丙烯酸钙(具有两个丙烯酸根部分)与丙烯酸之间的平衡可以使用任何适合的方法来建立，例如pH调节、电解或离子交换。在某些方面中，乳酸盐的脱水由金属催化剂、可选为负载型金属催化剂催化。所述金属催化剂或负载型金属催化剂可以与用于促进丙酮酸盐还原的催化剂相同或不同。在另一个可选方面中，阶段2包括在金属催化剂或负载型金属催化剂和氢气存在下将乳酸氢化，以形成含有丙基的化合物。在一个方面中，所述含有丙基的化合物包括1-丙醇、2-丙醇、丙二醇或其组合。
在一个方面中，用于将平台化学品乙醇转变成增值C3化合物的方法总体描绘在图14中。参考图14，本公开的一种方法包括阶段I，其中将乙醇与能够催化乙醇向乙醛的选择性有氧氧化的酶接触。在一个方面中，这种酶是乙醇氧化酶EOX。阶段1可以进一步包括将乙醛与丙酮酸脱羧酶(PDC)在二氧化碳(CO2)或CO2源存在下接触，以产生丙酮酸。丙酮酸乙酯可以通过丙酮酸盐在乙醇或有机溶剂存在下的酯化来产生。酯化可以使用任何适合的酶例如CalB脂肪酶(即Novozymes 435固定化的CalB)来实现。由于使用脂肪酶的酯化通常需要无水条件，因此这个反应可以在叔丁醇、丁酸甲酯或其他溶剂存在下，可能在双相系统中进行。
参见图14，丙酮酸乙酯可以通过丙酮酸乙酯的水解转变成丙酮酸。所述方法可以进一步包括阶段2，其包括由加氢催化剂催化的丙酮酸乙酯还原，以形成乳酸乙酯。在一个方面中，所述加氢催化剂包括金属催化剂，可选为负载型金属催化剂。如图14中所示，乳酸乙酯可以通过乳酸乙酯的水解转变成乳酸。在某些方面中，所述催化剂是手性的，并催化主要或专门是R-乳酸或主要或专门是S-乳酸的生产。
在一个可选方面中，阶段2进一步包括将乳酸乙酯脱水，以形成丙烯酸乙酯。在又一个方面中，乳酸乙酯可以通过水解转变成乳酸。在某些方面中，乳酸乙酯的水解由金属催化剂、可选为负载型金属催化剂催化。所述金属催化剂或负载型金属催化剂可以与用于促进丙酮酸盐还原的催化剂相同或不同。
在又一个可选方面中，阶段2包括将乳酸在金属催化剂或负载型金属催化剂和氢气存在下加氢，以形成含有丙基的化合物。在一个方面中，所述含有丙基的化合物包括1-丙醇、2-丙醇、丙二醇或其组合。所述金属催化剂或负载型金属催化剂可以与用于促进丙酮酸盐通过加氢的还原的催化剂相同或不同。
在一个方面中，从乙醇生产乙偶姻、2,3-丁二醇、1,3-丁二烯和2-丁酮。在一个方面中，本文公开的方法涉及将平台化学品乙醇化学酶促转变成乙醛，随后将其转变成VAC乙偶姻、2,3-丁二醇、1,3-丁二烯和2-丁酮。在后文中，乙偶姻、2,3-丁二醇、1,3-丁二烯和2-丁酮可以被单独称为“C4产物”或合称为“C4产物”。
在一个方面中，生产C4产物的方法包括将乙醇与一种或多种酶在适合条件下接触，以产生乙醛。尽管在本文中描绘并讨论了将乙醇作为底物，但设想了可以利用其他底物。
在一个方面中，一种将乙醇转变成C4化合物的方法总体描绘在图15中。参考图15，本公开的阶段1包括将乙醇转变成乙偶姻。在一个方面中，一种将乙醇转变成C4化合物的方法包括将乙醇与能够催化乙醇向乙醛的选择性有氧氧化的酶接触。在一个方面中，这种酶是乙醇氧化酶EOX。阶段1可以进一步包括将两个乙醛分子碳连接以产生乙偶姻。可以使用任何适合的催化剂进行乙醛分子的碳连接。在一个方面中，乙醛的碳连接由乙偶姻合酶(AS)催化。在一个可选方面中，乙醛的碳连接由含有硫胺素的催化剂、碳烯催化剂例如N-杂环催化剂或其组合催化。在某些方面中，乙醛的碳连接以产生乙偶姻在适合于提高反应产物的立体特异性的条件下进行；例如，所述反应产物可以包含过量的或排他的特定对映异构体，例如(R)-乙偶姻。在一个可选方面中，乙醛的碳连接以产生乙偶姻在适合于产生外消旋产物的条件下进行。在此类方面中，碳连接由诸如甲醛化酶(formolase)(FLS)或丙酮酸脱羧酶(PDC)的酶催化。
在一个方面中，本文公开的用于将平台化学品乙醇转变成VAC C4化合物的方法的阶段2包括通过在金属催化剂上的加氢将乙偶姻还原，以形成2,3-丁二醇。在一个方面中，可以通过2,3-丁二醇的脱水形成丁二烯。将乙醇转变成C4化合物的方法可以进一步包含将2,3-丁二醇部分脱水以形成2-丁酮。2,3-丁二醇的脱水可以由与用于催化乙偶姻的水解的金属催化剂相同或不同的金属催化剂催化。
在一个方面中，用于生产VAC乙醇酸的方法包括将平台化学品乙二醇与一种或多种生物催化剂在适合条件下接触，以产生乙醇醛。可以进一步将乙醇醛与一种或多种催化剂在适合条件下接触，以产生乙醇酸。本公开的所述化学酶促方法描绘在图16中。
在一个方面中，在图17中示出了一种从平台化学品乙二醇生产VAC乙醇胺的方法。在一个方面中，方法包括将乙二醇与生物催化剂在适合条件下接触，以转变成氧化的中间体。在一个方面中，所述氧化的中间体是乙醇醛。所述方法可以进一步包括将乙醇醛转变成EA。乙醇醛向EA的转变可以使用化学试剂或生物催化剂催化。
在一个方面中，在图18中示出了一种从平台化学品乙二醇生产VAC甘油的方法。参考图18，本公开的阶段1包括将乙二醇转变成乙醇醛。在一个方面中，利用能够使用分子氧将乙二醇选择性氧化成乙醇醛(EGOX)并产生过氧化氢的酶来催化第一步。正如图16中所示，可以使用适合的碳连接催化剂将乙醇醛和二氧化碳转变成3-羟基丙酮酸。在一个方面中，本文公开的方法的阶段2包括将3-羟基丙酮酸在金属催化剂上通过加氢进行还原，以形成甘油。
在一个方面中，在图19中示出了一种从平台化学品甘油生产VAC二羟丙酮的方法。在一个方面中，方法包括将甘油与生物催化剂在适合条件下接触，以转变成氧化的中间体。适用于生产DHA的生物催化剂包括醇氧化酶(AOX)、糖醛氧化酶(AlDO)、铜自由基氧化酶(CRO)、甘油氧化酶(GlyOX)或其组合。在一个方面中，所述氧化的中间体是甘油醛。所述方法可以进一步包括将甘油醛转变成DHA。
烟酰胺
在一个方面中，提供了一种从平台化学品3-氰基吡啶生产VAC烟酰胺的体外化学酶促路线。在这个方面中，将3-氰基吡啶与水在腈水合酶存在下在适合条件下反应，以形成烟酰胺。在某些方面中，作为这个方法在体外进行的结果，所述反应可以在水中进行，并且可以容易地以高纯度回收烟酰胺。
在一个方面中，3-氰基吡啶的水解由能够促进腈的水解的任何适合的生物催化剂催化。在一个方面中，所述生物催化剂是腈水合酶(NHase)。
HMF
在一个方面中，在图20中描绘了一种从平台化学品5-羟甲基糠醛(HMF)生产VACFDCA的体外化学酶促路线。本文公开了用于生产FDCA的化学酶促方法。在一个方面中，本公开的方法包括将HMF在温和的反应条件下酶促氧化，以产生中间体。应该理解，HMF是用于生产FDCA的示例性反应物，并且本公开设想了其他反应物。在一个方面中，本公开的方法进一步包括通过金属催化剂、可选为TMC氧化所述中间体，以产生FDCA。HMF向FDCA的氧化转化总体描绘在图20中。
氧化生物催化剂
醇氧化酶
适合用于所公开的方法的示例性生物催化剂包括但不限于醇氧化酶、半乳糖氧化酶和甘油氧化酶。在一个方面中，所述氧化生物催化剂是醇氧化酶(AOX,E.C.1.1.3.13)或醇氧化酶同源物。AOX是一种普遍存在的黄素依赖性酶，其使用氧气作为氧化剂将短链伯醇氧化成醛。实例描绘在反应方案1中。
反应方案1
AOX可以来源于克勒克酵母属(Kloeckera)、Torulosis、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)和梅奇酵母属(Metschnikowia)物种的甲基营养酵母。在一个可选方面中，AOX来源于利用甲醇的细菌例如荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)、嗜热土壤真菌例如金黄色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)和褐腐真菌例如密褐褶孔菌(Gloeophyllum trabeum)。或者，所述AOX可以来源于白腐担子菌黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。
甲基营养酵母广泛用于蛋白质生产和化学合成的发酵过程中。在许多情况下，这些酵母被用于在甲醇诱导的AOX1启动子的控制下异源生产蛋白质。内源性AOX1基因可以被保留(Mut+菌株)、缺失(Muts)或与次要醇氧化酶AOX2一起缺失(Mut-)。通常，在能够利用甲醇作为碳源的菌株中获得更高的蛋白质滴度，而在非甲醇诱导的过程中，可以将AOX基因缺失以提高蛋白质滴度。
在一个方面中，所述AOX来源于Mut+细胞，作为甲基营养酵母发酵的副产物产生。这些方法中的细胞密度可以达到约350g/L至约450g/L湿细胞的最终水平。当在甲醇中生长时，AOX可以占可溶性细胞蛋白的30％、无细胞提取物的20％和细胞体积的80％。可选地，在这种方法中使用的AOX序列可以来源于甲基营养酵母之外的生物体。
在一个方面中，所述氧化生物催化剂是来自嗜热生物体例如Candidamethanosorbosa(Topt＝45℃)、Ogataea thermomethanolica(Topt＝50℃)或黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)(Topt＝50℃)的固有稳定形式的AOX。
在本公开中使用的AOX可用于乙二醇的氧化中，并且在此类情况下被称为乙二醇氧化酶或EGOX。
半乳糖氧化酶
在一个方面中，所述氧化生物催化剂是铜自由基氧化酶(CRO)家族的成员。例如但不限于，适用于本公开的铜自由基氧化酶是半乳糖氧化酶(GAO，EC 1.1.3.9)。GAO是在机理研究和实际应用方面研究最广泛的醇氧化酶之一。铜自由基氧化酶家族中的其他成员可以适合地用于本公开。GAO是一种铜依赖性醇氧化酶，其氧化作为单糖或含有半乳糖的糖缀合物的非还原末端处的半乳糖残基。GAO是一种新型金属自由基复合物，在活性位点中包含与铜离子配位的蛋白质自由基。异常稳定的蛋白质自由基由交联的酪氨酸残基(Tyr–Cys)的氧化还原活性侧链形成。
甘油氧化酶
在一个方面中，所述氧化生物催化剂是甘油氧化酶(GlyOx)。GlyOx(E.C.1.1.3.B4)按照下述反应催化在耗氧情况下甘油的氧化，以形成甘油醛和过氧化氢：
CH2OHCHOHCH2OH+O2→CHOCHOHCH2OH+H2O2
所述反应在不存在外源辅因子的情况下进行。含有铜血红素辅因子的天然甘油氧化酶来源于葱腐葡萄孢(Botrytis allii)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)(AT 001和AT 008)、米曲霉(Aspergillus oryzae)AT 105、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)AT462、黄曲霉(Aspergillus flavus)AT 853、溜曲霉(Aspargillus tamarii)AT 857、Aspergillus itaconicus AT 923、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)AT 989、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)AT 003、好食脉孢霉(Neurospora sitophila)AT 045、四孢脉孢菌(Neurospora tetrasperma)AT 053和青霉属菌种(Penicllium sp.)UT 1750。
序列
在一个方面中，适用于本公开的生物催化剂可以具有SEQ ID No.1至SEQ IDNo.16中的任一者。
负载型金属催化剂
在一个方面中，所述金属催化剂包括过渡金属氧化催化剂。在此类方面中，所述金属氧化催化剂是负载型过渡金属氧化催化剂，可选为纳米粒子负载型过渡金属氧化催化剂。在后文中它们被合称为TMC。在一个方面中，所述载体包括碳、二氧化硅、氧化铝、二氧化钛(TiO2)、氧化锆(ZrO2)、沸石或其任何组合，其含有以所述载体的总重量计小于约1.0重量百分比(wt.％)、或小于约0.1wt.％或小于约0.01wt.％的SiO2黏合剂。
适合的载体材料主要是中孔或大孔的，并且基本上不含微孔。例如，所述载体可以包含少于约20％的微孔。在一个方面中，所述载体是多孔纳米粒子载体。本文所使用的术语“微孔”是指通过氮吸附和汞孔隙率测定法所测量并由IUPAC所定义的直径<2nm的孔。本文所使用的术语“中孔”是指通过氮吸附和汞孔隙率测定法所测量并由IUPAC所定义的直径为约2nm至约50nm的孔。本文所使用的术语“大孔”是指通过氮吸附和汞孔隙率测定法所测量并由IUPAC所定义的直径大于50nm的孔。
在一个方面中，所述载体包含中孔碳挤出物，其具有约10nm至约100nm的平均孔径和大于约20m2 g-1但小于约300m2 g-1的表面积。适合在本公开中使用的载体可以具有任何适合的形状。例如，所述载体可以被成形为0.8-3mm的三叶、四叶形或颗粒挤出物。这种成形的载体使得能够使用固定滴流床反应器在连续流动下进行最终的氧化步骤。
在一个或多个方面中，所述金属包括第8族金属(例如Re、Os、Ir、Pt、Ru、Rh、Pd、Ag)、3d过渡金属、早期过渡金属或其组合。在一个方面中，所述TMC包含金Au。
在一个方面中，所述TMC包含铂和金，并且是非均相固相TMC。在此类方面中，适合的催化剂载体包括但不限于碳、表面处理的氧化铝(例如钝化的氧化铝或包被的氧化铝)、二氧化硅、二氧化钛、氧化锆、沸石、蒙脱石和改性物及其混合物或组合。可以对催化剂载体进行处理，以促进铂和金在载体外表面上的优先沉积，从而产生壳型TMC。起到TMC作用的含有铂和金的化合物可以通过任何适合的方法来生产。例如，含有铂和金的TMC可以使用沉积程序例如初湿、离子交换和沉积沉淀来生产。
在其他方面中，TMC包含金属相，所述金属相是Cu、Ag、Au、Ni、Pd、Pt或Ir的单金属或多金属组合。所述活性相的活性、选择性和稳定性可以用早期3d、4d和5d过渡金属或重后过渡金属例如Sn、Sb和Bi的掺杂剂进行调节。在某些方面中，将金属(例如第1族金属)插入到金属晶格中以调节催化剂性质。在一个方面中，使用任何适合的方法将活性相的盐前体沉积到本文公开的类型的载体上。例如，活性相的沉积可以使用诸如初湿浸渍、本体吸附浸渍或沉积沉淀的技术来进行。
在一个方面中，然后将所述活性相的沉积盐前体在低于约100℃的温度下用适合的盐(例如甲酸盐)通过液相还原(LPR)，或者在约200℃至约500℃或约200℃至约450℃范围内的温度下通过气相还原(GPR)转化成活性相。在一个方面中，所述整理催化剂包含金，并在等于或大于约150℃的温度下在空气中进行煅烧。
在一个方面中，装载在本文公开的类型的载体上的活性相的量以所述TMC整理催化剂的总重量计小于约2.0重量百分比(wt.％)、或小于约1.5wt.％、或小于约1.0wt.％。在一个方面中，装载在本文公开的类型的载体上的活性相的量以所述TMC整理催化剂的总重量计等于或小于约0.5wt.％。在一个方面中，所述活性相在载体上的径向分布是各向异性的，其中所述活性相基本上集中在“核-壳”构型的挤出载体表面附近<500μm的环中。本文公开的类型的TMC整理催化剂可以被表征为醛官能团转化为羧酸的生产率等于或大于约0.05mol酸g-1活性金属h-1或等于或大于约0.1mol酸g-1活性金属h-1，选择性为约70％至约90％、或等于或大于约70％、或等于或大于约80％、或等于或大于约85％、或等于或大于约90％。在此类方面中，所述TMC整理催化剂表现出约60％至约95％、或等于或大于约70％、或等于或大于约80％、或等于或大于约90％的转化率。此类TMC整理催化剂可以表现出约1ppb至约100ppb、或小于约100ppb、或小于约90ppb的稳态淋溶量。在一个方面中，本文公开的类型的TMC整理催化剂可以在约40℃至约120℃、或约40℃至约110℃或约50℃至约100℃的温度范围内，在约10巴至约100巴、或约20巴至约100巴、或约20巴至约90巴范围内的压力下使用。
在某些方面中，所述整理催化剂是异构化催化剂。可以利用与HVCOS的其他组分相容的任何异构化催化剂。在某些方面中，所述异构化催化剂包括沸石。
化学催化剂
在一个方面中，所述整理催化剂是小分子化学催化剂，例如酸或碱。适合用作整理催化剂的酸或碱的实例包括但不限于盐酸、硫酸、甲酸、氢氧化钠和尿素。
辅因子
在一个方面中，适合用于本文公开的类型的HVCOS中的生物催化剂可以进一步包括一种或多种纯化的辅因子。在这里，辅因子是指调节所述生物催化剂的生物活性的非蛋白质化学化合物。许多酶需要辅因子才能发挥适当功能。适用于本公开的纯化的酶辅因子的非限制性实例包括焦磷酸硫胺素、NAD+、NADP+、磷酸吡哆醛、甲基钴胺素、钴胺素、生物素、辅酶A、四氢叶酸、甲基萘醌、抗坏血酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸和辅酶F420。此类辅因子可以被包括在生物催化剂制剂中和/或在反应过程中的各个点加入。在某些方面中，与生物催化剂制剂一起包含的辅因子可以容易地用氧气再生和/或可以在酶的整个寿命期间保持稳定。
过氧化氢酶
正如本领域技术人员结合本公开所能理解的，本文公开的类型的反应(例如乙二醇的生物催化氧化)可能导致副产物(例如过氧化氢)的产生，所述副产物可能对反应混合物的其他组分产生不利影响。例如，过氧化氢可能降解生物催化剂，导致催化活性的损失。在此类方面中，可以例如通过引入过氧化氢酶(E.C.1.11.1.61)、使用耐过氧化氢的生物催化剂或其组合来减轻过氧化氢的有害影响。
生物催化剂的形式和表达系统
在一个方面中，本文公开的类型的生物催化剂是野生型酶、其功能性片段或其功能性变体。本文所使用的“片段”意在包括比全长生物催化剂(例如AOX)短的任何氨基酸序列，但其中所述片段保持足以满足某些用户或方法目标的催化活性。片段可以包括与生物催化剂序列的一部分相同的单个连续序列。或者，片段可以具有或包括几个不同的较短区段，其中每个区段的氨基酸序列与生物催化剂的氨基酸序列的不同部分相同，但通过与生物催化剂序列不同的氨基酸连接。在本文中，生物催化剂的“功能性变体”是指在一个或多个氨基酸位置处具有保守或非保守的插入、缺失或替换的多肽，并且其中这些类型的变化中的每一者可以在给定序列中单独地或与一种或多种其他变化组合地发生一次或多次，但保留催化活性。
可选地或与上述突变组合，生物催化剂可以被突变以提高催化活性。可以进行突变以增强蛋白质或同源物的活性，提高蛋白质在底物和产物例如甲醛、乙醛、乙醇醛和/或过氧化氢存在下的稳定性，并提高蛋白质产率。
在本文中已提及生物催化剂的“来源”。应该理解，这是指由所提名的生物体表达的生物分子。设想了生物催化剂可以从生物体获得，或者将所述生物催化剂的某个版本(野生型或重组的)作为适合的构建体提供给适合的表达系统。
在一个方面中，本文公开的类型的任何生物催化剂都可以被克隆到适合的表达载体中，并用于转化表达系统的细胞，例如大肠埃希氏杆菌(E.coli)、酵母属、毕赤酵母属、曲霉属、木霉属或毁丝霉属菌种。“载体”是复制子例如质粒、噬菌体、病毒构建体或黏粒，其上可以附连另一个DNA片段。载体用于在细胞中转导和表达DNA片段。本文所使用的术语“载体”和“构建体”可以包括复制子例如质粒、噬菌体、病毒构建体、黏粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、人类人工染色体(HAC)等，其中可以连接或连接有一个或多个基因表达盒。在本文中，当例如作为与转染试剂的复合物或包装在病毒粒子中的外源或异源核酸或载体被引入到细胞内时，所述细胞已被此类核酸或载体“转化”。转化DNA可以整合(共价连接)也可以不整合到细胞的基因组中。
在一个方面中，本文公开的生物催化剂的基因作为重组序列提供在载体中，其中所述序列与一个或多个控制或调控序列可操作地连接。“可操作地连接的”表达控制序列是指其中表达控制序列与感兴趣的基因相邻以控制所述感兴趣的基因这样一种连接，以及反式或远距离作用以控制所述感兴趣的基因的表达控制序列。
术语“表达控制序列”或“调控序列”可互换使用，并在本文中用于指称影响与其可操作地连接的编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包括适合的转录起始、终止、启动子和增强子序列，高效的RNA处理信号例如剪接和多腺苷酸化信号，稳定细胞质mRNA的序列，增强翻译效率的序列(例如核糖体结合位点)，增强蛋白质稳定性的序列，以及在需要时增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质根据宿主生物体的不同而不同；在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”旨在至少包括其存在对表达至关重要的所有组分，并且还可以包括其存在有利的附加组分，例如前导序列和融合配偶体序列。
本文所使用的术语“重组宿主细胞”(“表达宿主细胞”、“表达宿主系统”、“表达系统”或简称“宿主细胞”)意指已引入重组载体的细胞。应当理解，此类术语不仅意指特定的受试细胞，而且是指此类细胞的后代。由于因突变或环境影响，某些修饰可能会在后续世代中发生，因此事实上，此类后代可能与亲本细胞不相同，但仍包含在本文所使用的术语“宿主细胞”的范围之内。重组宿主细胞可以是在培养物中生长的分离的细胞或细胞系，或者可以是存在于活组织或生物体中的细胞。
优点
本文公开了一种分子制造平台，用于从可再生原料例如糖和醇化学酶促生产VAC。在一个方面中，以商业规模生产了本公开的VAC，并且其纯度等于或大于约70％、或等于或大于大约80％、或等于或大于大约90％。
实施例
已对本发明的主题内容进行了一般性描述，下面的实施例作为本公开的特定方面给出，并被包括以演示其实践和优点以及本公开的主题内容的方面和特点。本领域技术人员应当理解，在下述实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在本主题内容的实践中作用良好的技术，并因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开范围的情况下，可以对所公开的具体方面做出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果。应当理解，所述实施例是通过说明的方式给出的，并不旨在以任何方式限制本说明书或权利要求书。
突变酶
已知糖不是UPO的天然底物，因此将对UPO进行工程化改造以提高对葡萄糖或氧化的葡萄糖衍生物的比活性、Km和kcat。这将通过筛选一组UPO的基线活性和其他适合的特性例如最适pH、热稳定性和化学稳定性以及在工程(大肠杆菌)和生产(真菌)宿主中的表达水平来实现。一旦选择了适合的酶，将通过定向进化和合理设计方法来改善其酶学性能。
本文公开了一种新方法，所述方法不依赖于发酵和/或石油化学，而是依赖于与催化剂偶联的酶反应，以在较低温度下并以较少的副产物提供产物的生成。酶的使用可以导致产生中间体和产物的反应，而不需要活性发酵。当与催化化学偶联时，这两个过程可以以高选择性和高产率从反应物产生产物，同时限制CO2的产生。
实施例1
使用葡萄糖氧化酶催化剂从葡萄糖生产葡萄糖酸
在用O2加压至100psi的200mL容器中进行50mL反应。所述容器装有20％葡萄糖、100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5)、0.0002％葡萄糖氧化酶和0.0002％过氧化氢酶。反应在20℃或30℃下以500rpm搅拌。在大约25小时时停止反应并通过反相HPLC-MS测定，每克葡萄糖氧化酶产生45,000g葡萄糖酸。HPLC分析的结果示出在图31中。
实施例2
从葡萄糖和葡萄糖酸盐产生葡萄糖二酸
将Collariella viriscens(CviUPO)和Daldinia caladariorum(DcaUPO)UPO在大肠埃希氏杆菌中表达，通过亲和层析进行纯化，并测试其对葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖二醛、古洛糖醛酸和葡萄糖醛酸的基线活性。反应以96孔板格式建立，含有0.1g/L的酶、柠檬酸钠(pH 4)或磷酸钾(pH 6)缓冲液、2mM H2O2和2mM葡萄糖或葡萄糖氧化产物。允许反应进行20小时，然后通过HPLC-MS进行分析。参考图21，示出了通过HPLC-MS测量的使用Collariellaviriscens(CviUPO)或Daldinia caladariorum(DcaUPO)作为催化剂从葡萄糖和/或葡萄糖氧化产物基线生产的葡萄糖二酸。示出了反应后的所有产物迹线。值得注意的是，DcaUPO从葡萄糖产生葡萄糖二酸盐，而CviUPO被发现从葡萄糖酸盐产生少量葡萄糖二酸。对于这两种酶来说，葡萄糖二酸盐仅在pH 4下产生。在pH 6下，两种酶都产生2-酮基葡萄糖酸盐，不产生葡萄糖二酸盐。
实施例3
在巴尔弹中产生L-古洛糖醛酸
使用添加到用氧气加压至100psi的巴尔弹容器中的GAO-mut1和GOX酶，在台式规模上演示了L-古洛糖醛酸的生产。在初始实验中，制备含有10％重量/体积(w/v％)的葡萄糖、0.02w/v％的GAO-mut1和0.001w/v％的过氧化氢酶的50mM磷酸钠缓冲液(pH 8)的溶液(50mL)，并添加到容器的内腔中。搅拌的反应在20℃下进行20小时。然后通过30kD MWCO离心装置经过滤除去GAO Mut-1酶。在第二反应阶段中，GOX和过氧化氢酶都被添加至0.001w/v％的浓度。再次允许反应在20℃下搅拌20小时。值得注意的是，在反应过程中，pH从8下降到3，推测是由于添加GOX后产生的酸性物质葡萄糖酸和L-古洛糖醛酸，如图22A中所示。最终反应混合物的HPLC-MS分析证实，产生了约0.2-0.3％的L-古洛糖醛酸(2-3％摩尔产率)、2％的葡萄糖酸盐和未指定量的葡萄糖二醛，如图22B中所示。
为了提高产率进行了第二个实验，其中在产酸的第二个步骤中控制pH。首先，将50mM磷酸钠缓冲液(pH 8)、15w/v％的葡萄糖、0.02w/v％的GAO-mut1和0.001w/v％的过氧化氢酶的溶液添加到巴尔弹(50mL)中，并在20℃的温度下搅拌20小时以产生葡萄糖二醛。在第二个步骤中，添加0.001w/v％的GOX和0.001w/v％的额外过氧化氢酶，并允许其在相同条件下进行额外的20小时。如图23A中所示，在2小时和4小时时停止反应，将pH调节至5，然后重新加压并允许反应至20小时。在LC-MS分析后，与前一次运行相比，产生了更高浓度(约5％或31％摩尔产率)的L-古洛糖醛酸。结果示出在图23B中。
进行了第三次运行，通过在第二催化步骤中添加更高浓度的GAO-mut1并将pH调节至6来进一步提高产率。首先，将50mM磷酸钠缓冲液(pH 8)、约4w/v％的葡萄糖、0.1w/v％的GAO-mut1和0.001w/v％的过氧化氢酶的溶液以50mL的体积添加到巴尔弹中，并在20℃的温度下搅拌20小时以产生葡萄糖二醛。在第二步中，添加0.001w/v％的GOX和额外0.001w/v％的过氧化氢酶，并允许在相同条件下再进行20小时。周期性地暂停反应并将pH调节至6。在与GAO-Mut1反应后，葡萄糖的浓度从4.3w/v％的初始载量下降到0.9w/v％。在添加GOX并反应20小时后，产生1.0w/v％葡萄糖酸和3.6w/v％L-古洛糖醛酸的混合物(85％摩尔产率)。结果呈现在图24中。
实施例4
用于从葡萄糖生产葡萄糖二醛的GAO突变体的产生
为了支持途径A，工程化设计了一种能够将葡萄糖转变成葡萄糖二醛的GAO突变体。在定向进化和合理酶工程后，所述改进的GAO突变体对葡萄糖表现出>35U mg-1的比活性。
定向进化
在含有下述添加的突变的亲本序列上，对在催化性铜的以内的30个位点进行了定向进化：1)R330K、Q406T、W290F，其通过向GAO引入小于1U mg-1的葡萄糖活性而发现；2)C383S，其被发现降低了所述酶对半乳糖的KM；和3)Y405F和Q406E，其被发现增强了对D-N-乙酰葡糖胺底物的活性。发现表I中描述的其他突变对葡萄糖二醛的产生活性具有中性或有害影响。所述新的组合序列被命名为GAO-Mut1。所述表达的构建体的完整序列在SEQ IDNo.15中给出。
表1
| 名称 | 起始突变体 | 添加突变 |
| M1 | 野生型 | S10P M70V P136P G195E V494A N535D |
| M-RQW | M1 | R330K Q406T W290F I463P |
| GAO | M-RQW | C383S |
| GAO-mut1 | GAO | Y405F Q406E |
| GAO-mut2 | GAO | F194T |
| GAO-mut3 | GAO | C383E |
| GAO-mut4 | GAO | N245R |
| GAO-mut5 | GAO | Q326E Y329K |
使用含有NNS密码子的引物，通过Quikchange方法将GAO-Mut1中的选定位置突变成所有20个氨基酸。然后以以下方式筛选构建体：挑取菌落，并用于在预装有Luria-Bertani(LB)肉汤的96孔深孔板中各接种一个孔。然后将生长的克隆用于在单独的96孔深孔板中接种自诱导培养基，用于蛋白质表达。用细菌蛋白提取试剂(B-PER)裂解收获的细胞，并使用检测过氧化氢的2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)比色测定法筛选裂解物的氧化酶活性。
简而言之，在有和没有暴露于热的情况下测定裂解物的活性。为了在没有热激惹的情况下测定活性，将裂解物稀释50倍。将体积为5μL的稀释裂解物与ABTS测定溶液(终浓度为2w/v％葡萄糖、0.0125mg/ml辣根过氧化物酶(HRP)、50mM磷酸钠缓冲液(pH 8)和0.05％ABTS)合并至终体积为200μL，并监测405nm处的吸光度变化，直至反应完成。为了测定热激惹后的残余活性，将50μL裂解物在50℃下温育10分钟，并将20μL热处理的裂解物添加到ABTS溶液中，然后监测405nm处的吸光度变化。根据下述公式计算比活性，使用曲线的线性部分测量ΔA405/min，并将ABTS在405nm处的消光系数取为36.8mM-1·cm-1。除以2是为了说明通过HRP一分子H2O2氧化两分子ABTS的事实。
选择表现出的ΔA405/min大于GAO-Mut1的突变体裂解物进行进一步表征。在通过DNA测序鉴定突变后，将命中物表达、纯化，并测定比活性和热稳定性，正如通过观察到最大活性的一半时的温度(T50)所评估的。使用24孔板中的自诱导培养基，从5mL培养物中纯化突变体。用细菌蛋白提取试剂(B-PER)裂解收获的细胞，并将裂解物在4℃下以15,000rcf离心30min。裂解物上清液中带有His标签的蛋白使用HisPurTM Ni-NTA旋转板，通过固定化金属亲和层析进行纯化。将洗脱的蛋白质样品用含有0.5mM CuSO4的pH＝7.5的100mM磷酸钾缓冲液稀释，并使用上述ABTS测定法测量比活性。
通过在没有底物的情况下加热蛋白质，冷却，然后使用ABTS测定法测量残余活性，来测量T50。通过将蛋白质在一定体积的pH 7.5的100mM磷酸盐缓冲液中稀释至2.5mg/L的浓度，将50μL等分到一排96孔PCR板中，并在足以捕获最高和最低酶性能的温度梯度上温育10分钟，来完成加热。在加热后立即将混合物在冰上冷却，并如上所述测量20μL酶溶液在200μL终体积的ABTS溶液中的ΔA405/min。
可以被有益地组合在Mut1背景中的有希望的点突变体包括A193R、D404H、F441Y和A172V(表3)。这些突变被组合在一个名为GAO-Mut47的单一组合突变体中，其表现出27.3Umg-1的比活性和56.8℃的T50。结果呈现在图25和表2中。
合理工程
GAO进一步接受葡萄糖底物并鉴定稳定化突变的合理工程，使用基于结构的计算方法和多序列比对(MSA)数据的组合来完成。先前，已发现GAO-M-RQW-S(没有Y405F和Q406E突变的GAO-Mut1序列)可以接受葡萄糖和葡萄糖酸盐两者作为底物。具有和不具有N-端His标签的GAO-M-RQW-S序列分别呈现在SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17中。由于正努力产生对两种底物具有活性的GAO，因此对GAO-M-RQW-S序列而不是GAO-Mut1进行了合理设计。所采用的结构方法包括将FoldX(40个预测的突变)和PROSS(80个突变)应用于PDB结构2WQ8的修饰形式，以包含GAO-M-RQW-S突变。准备了基于MSA的预测(34个突变)和(28个突变)，并将其应用于185个成员的MSA。该MSA从使用JALVIEW挑选的1000个序列的初始集生成，以除去具有98％冗余度的序列，并仅保留实验验证为糖类氧化酶的序列。使用与上述筛选定向进化克隆相同的方法总共筛选了202个点突变体。从初筛鉴定了39个命中物，并从第二轮筛选重新鉴定了16个命中物。在来自定向进化步骤的最佳组合突变体(GAO-Mut47)中产生组合突变体后，突变N66S、S306A、S311F和Q486L被鉴定为互补且有益的，而N28I、Y189W、S331R、A378D和R459Q在这种背景下被视为有害的(表3)。含有Mut47突变和N66S、S306A、S311F和Q486L的最终GAO-Mut107构建体对2％葡萄糖呈现出34.96U mg-1的比活性，T50为60.56℃。结果呈现在图26中。从机器学习算法鉴定的其他突变在晚些时候被合并，以产生GAO-mut142和GAO-mut164。这些额外突变体以及GAO-mut47和GAO-mut107酶的活性测定的结果呈现在图27中。
表3
粗体突变在Mut47背景A193R D404H F441Y A172V中是有益的在独立实验中从其他数据收集的数据。提高倍数与内部Mut47对照相比来计算。在独立实验中从其他数据收集的数据。提高倍数与内部Mut47对照相比来计算。使用GAO-Mut47的一步巴尔弹反应以生产D-葡萄糖二醛
在加压至100psi的200mL容器中进行50mL反应。所述容器装有50mM磷酸钠(pH 8)缓冲液、50μM CuSO4、15w/v％葡萄糖、0.005w/v％过氧化氢酶、0.001％辣根过氧化物酶和0.001w/v％工程化GAO。将反应在500rpm、11℃下搅拌48小时。在0、24和48小时取样，然后使用HPLC测定以测量残余葡萄糖。结果示出在图28中。
使用GAO-Mut47的两步巴尔弹反应以生产L-古洛糖醛酸
在加压至100psi的200mL容器中进行50mL反应。所述容器装有50mM磷酸钠(pH 8)缓冲液、50μM CuSO4、15w/v％葡萄糖、0.005w/v％过氧化氢酶、0.001％辣根过氧化物酶和0.001w/v％工程化GAO。将反应在500rpm、11℃下搅拌72小时，以从葡萄糖产生葡萄糖二醛。在第二个步骤中，添加0.002w/v％GOX和额外的0.001w/v％过氧化氢酶，并允许在相同条件下继续进行24小时。周期性地暂停反应并将pH调节至7。结果呈现在图29A中。时间零(0)时的葡萄糖浓度显示为左侧的条，在第一个酶促步骤、具体来说是与GAO酶组合物的反应之后的葡萄糖浓度示于右侧。
在与GAO-Mut47反应后，葡萄糖浓度从16％w/v的初始载量下降至1.5％w/v。在添加GOX并反应24小时后，产生2.0％w/v葡萄糖酸和12％w/v L-古洛糖醛酸的混合物(75％摩尔产率)。结果图示在图29B中。
实施例5
用于从葡萄糖酸盐或葡萄糖酸内酯生产L-古洛糖醛酸的GAO突变体的产生
筛选在对葡萄糖具有活性的GAO突变体的合理工程化过程中产生的组合突变体对葡萄糖酸盐的活性。我们推测，在基于GAO-M-RQW-S背景产生的组合中可能存在对葡萄糖酸盐具有活性的突变体，因为亲本构建体已经表现出对葡萄糖酸酸盐具有约1U mg-1的比活性。
用2％葡萄糖酸盐对纯化的蛋白质进行的筛选揭示出Mut 49(N66W、A172V和Y189W)和Mut 62(N66S、A172V、Y189W、S306A、S311F、S331R、A178D、Q486L)对葡萄糖酸盐具有高活性，比活性约为4和6U mg-1。结果呈现在图30A中。
使用GAO-Mut62的一步巴尔弹反应以生产L-古洛糖醛酸
在用O2加压至100psi的200mL容器中进行50mL反应。所述容器装有50mM磷酸钠(pH8)缓冲液、50μM CuSO4、4w/v％葡萄糖、0.005w/v％过氧化氢酶、0.001w/v％辣根过氧化物酶、0.0002w/v％GOX和0.05w/v％工程化GAO-mut62。将反应在500rpm、11℃下搅拌24小时。定期暂停反应并将pH调节至7.5。在反应24小时后，从4％葡萄糖产生3w/v％的L-古洛糖醛酸和1w/v％的葡萄糖酸。结果呈现在图30B中。
实施例6
使用吡喃糖氧化酶催化剂从葡萄糖生产2-酮基葡萄糖
一种充分表征的酶POX使用紧密结合或共价的FAD辅因子表现出10U mg-1的天然比活性，所述辅因子可以与所述蛋白质一起从表达宿主纯化。POX是一种在降解木质纤维素的真菌中发现的黄素依赖性酶，它将葡萄糖氧化成2-酮基葡萄糖，同时形成过氧化氢。重组毛栓孔菌(Trametes hirsuita)POX目前在食品工业中用于烘焙，提供了表明所述酶可以以低成本生产的一些证据。表4呈现了在此方法中使用的先前表征过的感兴趣的POX酶。单位被定义为每分钟消耗1μmol底物。基于内部经验评估，白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、Trametesmulticolor和黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)POX具有足够的起始活性。这被图示在图32和表4中。
表4.
在放置在用O2加压至100psi的容器中的20mL小瓶中进行4mL反应。所述小瓶装有20％w/v葡萄糖、100mM磷酸钾(pH 6)、0.005％过氧化氢酶和0.005、0.01或0.02％的来自白囊耙齿菌(Irpex lacteus)的POX。将反应在500rpm、16或28℃下搅拌。在71小时时，停止反应并通过反相HPLC-MS进行分析。对于28℃和0.020％的反应，2-酮基葡萄糖作为主要产物(基于峰面积，83％)产生得到了证实，同时形成了一些过氧化产物(11％)和未反应的葡萄糖(6％)，图33。
实施例7
使用葡萄糖氧化酶催化剂从2-酮基葡萄糖生产2-酮基葡萄糖酸盐
在放置在用O2加压至100psi的容器中的20mL小瓶中进行4mL反应。所述小瓶装有如实施例6中所述产生并用切向流过滤处理以除去酶的2-酮基葡萄糖、100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5)、0.0001％过氧化氢酶和0.0005或0.001％w/v GOX。在每个时间点用NaOH将反应pH调回到5.0。产生了作为主要产物的2-酮基葡萄糖酸盐，并存在一些从产生2-酮基葡萄糖的POX反应中未反应的葡萄糖产生的葡萄糖酸盐、未反应的2-酮基葡萄糖和2-酮基葡萄糖过氧化产物。结果呈现在图34中。
实施例8
使用吡喃糖氧化酶催化剂从葡萄糖二醛生产2-酮基葡萄糖二醛
在微量滴定板中进行实施例3中所描述的比色ABTS测定，每个孔含有20mM葡萄糖二醛、50mM磷酸钾缓冲液(pH 6)和50uL 1000x17.4mg/L M-RQWS GAO、25.5mg/mL GAO-Mut1、10.5mg/mL GAO-mut47、10.7mg/mL GAO-mut62、42mg/mL GOX或30mg/mL POX。在葡萄糖二醛上检测了POX活性，比活性>7.5U/mg。结果呈现在图35中。
实施例9
准备100μL的体积，其含有0.01％w/v大肠埃希氏杆菌葡萄糖二酸脱水酶(GlucD)、10mM底物(葡萄糖二酸盐、葡萄糖酸盐或葡萄糖醛酸盐)、5 0mM磷酸钾(pH 7.5)、5mM MgSO4和100mM NaCl。允许反应进行24小时，并在0、5min、20min、1hr、2hr和24小时通过LCMS监测葡萄糖二酸的消耗。在20分钟内观察到葡萄糖二酸盐的完全转化。当使用葡萄糖酸或葡萄糖醛酸作为底物时，没有观察到反应。反应图示在图36中，结果图示在图37中。
为了确定最佳的酶负载量，准备了100μL的体积，其含有0.001、0.002、0.005或0.01％w/v的葡萄糖二酸脱水酶(GlucD)、10％w/v的葡萄糖二酸盐、50mM磷酸钾(pH 7.5)、5mM MgSO4和100mM NaCl。允许反应进行74小时，并通过反相LCMS监测4-脱氧-5-酮基葡萄糖二酸盐的形成和葡萄糖二酸盐的消耗。在72小时后用所有测试的GlucD浓度实现了完全转化，其中使用0.005％的酶在24hr内发生完全转化。反应图示在图36中，结果图示在图40中。
实施例10
从葡萄糖生产异抗坏血酸
图38中描述了生产D-异抗坏血酸(D-EA)的方法。D-EA也被称为D-(-)-异抗坏血酸、阿拉伯抗坏血酸、葡糖酮酸内酯、erycorbin、D-异抗坏血酸、saccharosonic acid、mercate 5、neo-cebicure、D-阿拉伯抗坏血酸、NSC 8117和D-赤藓糖-己-2-烯酸γ-内酯，是抗坏血酸(维生素C)的立体异构体，通常被用作食品防腐剂以防止烹饪或腌制过程中的氧化(褐变)和亚硝胺形成。例如，D-EA是腌制肉类和冷冻蔬菜中常见的防腐剂。所述化合物也是非血红素铁吸收的有效增强剂。
参考图38，葡萄糖可以在TMC和氧化剂(O2)存在下在适合条件下被氧化，以形成葡萄糖酸。葡萄糖向葡萄糖酸的氧化可以具有等于或大于约85％、此外或可选地等于或大于约90％、或此外或可选地等于或大于约95％的选择性。葡萄糖酸可以在TMC和氧化剂(O2)存在下进一步氧化以形成2-酮基-D-葡萄糖酸，反应选择性可以具有等于或大于约80％、此外或可选地等于或大于约85％、或此外或可选地等于或大于约90％的选择性。然后可以将2-酮基葡萄糖酸在醇溶剂(例如乙醇)和酸催化剂中内酯化，以形成异抗坏血酸。从葡萄糖形成葡萄糖酸和从葡萄糖酸形成2-酮基葡萄糖酸的化学计量反应也呈现在图38中。根据所公开的方法，与发酵法相比，通过化学酶促法或催化法维生素C被更廉价且更有效地生产。1.使用保留酶并避免直接使用细胞的膜系统(30Kda或更低)。2.使用Solugen中孔AuPt催化剂选择性氧化L-山梨糖/果糖。3.将葡萄糖酸和古洛糖酸选择性氧化为2-酮基葡萄糖酸和2-酮基古洛糖酸。
实施例11
从葡萄糖二酸钾生产FDCA
使用酸性催化剂生产FDCA。研究的酸性催化剂是沸石、H-ZSM5、MCM 41、硫酸化氧化锆、磺酸化二氧化硅、杂多酸、催化剂粉末、颗粒、挤出物片剂。样品的特征在于BET为20m2/g–100m2/g，压碎强度为60N/cm2。选择性>60％，转化率>60％，副产物未知。反应呈现在图39中，结果呈现在图40中。
实施例12
从热温育产生脱水的D-葡萄己二醛糖(GDA)产物使用GAO-Mut47的一步巴尔弹反应以高产率生产D-葡萄糖二醛
在加压至100psi的400mL容器中进行100mL反应。容器装有50mM磷酸钠(pH 8)缓冲液、50μM MnSO4、15w/v％葡萄糖、0.005w/v％过氧化氢酶、0.001％辣根过氧化物酶和0.01％工程化GAO。将反应物在11℃下以500rpm搅拌48小时。在0和48小时采集样品，然后用HPLC测定以测量残余葡萄糖。在反应48hr后，>95％的葡萄糖被转变为GDA，结果示出在图41中。
GDA溶液的热温育以催化脱水反应
将100μL从巴尔反应产生的GDA溶液(～14.5w/v％的GDA、0.5％w/v％的葡萄糖)等分到PCR板的每个孔中，并将样品在40至90℃的温度范围内热温育。在0、0.5、1、2、4、6、8和24hr时间取样，然后用HPLC测定，以监测脱水产物1,2,3,4-四羟基苯和其他中间产物的形成。
通过HPLC对结果进行分析。如图42中所示，当温育温度高于50℃时，观察到GDA降解，并且降解百分率随着温育温度的升高或温育时间的延长而增加。在90℃下温育24hr后，GDA降解百分率为约90％。在约10hr的短温育时间下，在温育反应中产生分子量为176和174的两种中间体化合物。在将温育时间增加到24hr后，反应产生作为主要产物的1,2,3,4-四羟基苯(142g/mol)。
实施例13
产生的1,2,3,4-四羟基苯的表征
将40mL含有14.5w/v％GDA和0.5w/v％葡萄糖的巴尔反应产物在90℃下温育30hr，以将GDA转变成1,2,3,4-四羟基苯。将温育的样品用80mL乙酸乙酯萃取两次。将萃取的样品浓缩并在TLC板上运行，如图43A中所示。在板上可见两个斑点A和B。从制备TLC板提取级分A和B，并在LC/MS上分析。图43B的MS数据显示级分A和B的分子量分别为126和142。
通过2D-NMR(HSQC，在DMSO-d6中)分析纯化的级分A和B以确定分子结构。图44上示出的NMR数据表明，级分A中的分子是1,2,3-三羟基苯，也被称为邻苯三酚，级分B中的分子为1,2,3,4-四羟基苯。图45中示出的FT-IR分析显示在任一分子上都没有羰基官能团，这进一步证实了从NMR分析提出的分子结构。
使用配备有三重四极质量检测器的LC系统进行了进一步分析，数据示出在图46和47中。使用LC/QQQ对纯化的级分A进行分析，并与真实的标准邻苯三酚进行比较。级分A分子的裂解模式与邻苯三酚标准片完全匹配。图48中示出了从GDA样品热温育产生邻苯三酚和1,2,3,4-四羟基苯的建议的反应机制。
将从巴尔反应产生的三个GDA样品在不同条件下温育，A)90℃下1hr，B)60℃下8hr，或C)90℃下30hr，以最大限度地将GDA转变成两种中间体分子中的任一者或1,2,3,4-四羟基苯。正如在图49中看到的，样品A具有相对较高浓度的中间体分子，分子量为176，样品B具有最高浓度的分子量为174的第二个中间体分子，样品C对1,2,3,4-四羟基苯具有最高的转化率。
所有三种不同的热温育GDA样品都用几种不同的工业相关细菌进行了作为抗微生物剂的测试。分离并用于本试验的总需氧细菌被鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和成团肠杆菌(Enterobacter aggolomerans)。还使用了从采出液分离的野生菌株硫酸盐还原细菌和产酸细菌。将它们放置在微量滴定板中，在那里可以进行高通量测试以确定MIC(最低抑制剂浓度)。将样品在下述剂量(1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9和1.95ppm)下测试，并基于初始GDA浓度(15w/v％)计算浓度。
图49中示出的抗微生物测试结果总结了每个样品对不同细菌的MIC。在将细菌平板温育24小时后确定MIC。在适当的温育时间后没有显示生长的孔的浓度被记录为特定制剂的MIC值。具有最高浓度的1,2,3,4-四羟基苯的样品C对所有三种测试细菌的MIC都显著较低，这表明1,2,3,4-四羟基苯具有良好的抗微生物活性。
表V.三种热GDA样品的抗微生物测试
额外公开内容
作为非限制性实例提供了本公开的下述列举方面。
第一方面是一种分子制造方法，所述方法包括将平台分子与(i)生物催化剂和(ii)化学催化剂在适合于生产增值化学品的条件下接触。
第二方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括葡萄糖二酸。
第三方面是根据第一至第二方面中任一者所述的方法，其中所述生物催化剂包括半乳糖氧化酶，并且所述化学催化剂包括过渡金属催化剂。
第四方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括L-抗坏血酸。
第五方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括琥珀酸。
第六方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括2,5-呋喃二甲酸。
第七方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括2,5-呋喃二甲酸二甲酯。
第八方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括乙醛。
第九方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括丙二醇。
第十方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括乳酸。
第十一方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括丙烯酸。
第十二方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括丙醇。
第十三方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括乙偶姻。
第十四方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括2,3-丁二醇。
第十五方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括1,3-丁二烯。
第十六方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括2-丁酮。
第十七方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括乙二醇，并且所述增值化学品包括乙醇酸。
第十八方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括乙二醇，并且所述增值化学品包括乙醇胺。
第十九方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括乙二醇，并且所述增值化学品包括甘油。
第二十方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括甘油，并且所述增值化学品包括二羟丙酮。
第二十一方面是根据第一方面所述的方法，其中所述平台化学品包括3-氰基吡啶，并且所述增值化学品包括烟酰胺。
第二十二方面是根据第一方面所述的方法，其中所述增值化学品具有等于或大于约80％的纯度。
第二十三方面是一种分子制造方法，所述方法包括：
将平台分子与生物催化剂接触以产生中间产物；和将所述中间产物与化学催化剂在适合条件下接触，以从所述中间产物生产增值化学品。
第二十四方面是一种分子制造方法，所述方法包括将平台分子与化学催化剂接触以产生中间产物；和将所述中间产物与生物催化剂在适合条件下接触，以从所述中间产物生产增值化学品。
第二十五方面是根据第二十三至第二十四方面中任一者所述的方法，其中产生所述中间产物或产生所述增值化学品中的至少一者包括引起氧化反应、脱水反应、羧化反应或氢化反应中的至少一者。
第二十六方面是根据第二十三至第二十五方面中任一者所述的方法，其进一步包括纯化所述增值化学品以产生终产物。
第二十七方面是根据第二十三至第二十六方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括葡萄糖二酸。
第二十八方面是根据第二十三至第二十六方面中任一者所述的方法，其中所述生物催化剂包括半乳糖氧化酶，并且所述化学催化剂包括过渡金属催化剂。
第二十九方面是根据第二十三至第二十八方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括L-抗坏血酸。
第三十方面是根据第二十三至第二十九方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括琥珀酸。
第三十一方面是根据第二十三至第三十方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括2,5-呋喃二甲酸。
第三十二方面是根据第二十三至第三十一方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括2,5-呋喃二甲酸二甲酯。
第三十三方面是根据第二十三至第三十二方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括乙醛。
第三十四方面是根据第二十三至第三十三方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括丙二醇。
第三十五方面是根据第二十三至第三十四方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括乳酸。
第三十六方面是根据第二十三至第三十五方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括丙烯酸。
第三十七方面是根据第二十三至第三十六方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括丙醇。
第三十八方面是根据第二十三至第三十七方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括乙偶姻。
第三十九方面是根据第二十三至第三十八方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括2,3-丁二醇。
第四十方面是根据第二十三至第三十九方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括1,3-丁二烯。
第四十一方面是根据第二十三至第四十方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括2-丁酮。
第四十二方面是根据第二十三至第四十一方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括乙二醇，并且所述增值化学品包括乙醇酸。
第四十三方面是根据第二十三至第四十二方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括乙二醇，并且所述增值化学品包括乙醇胺。
第四十四方面是根据第二十三至第四十三方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括乙二醇，并且所述增值化学品包括甘油。
第四十五方面是根据第二十三至第四十四方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括甘油，并且所述增值化学品包括二羟丙酮。
第四十六方面是根据第二十三至第四十五方面中任一者所述的方法，其中所述平台化学品包括3-氰基吡啶，并且所述增值化学品包括烟酰胺。
第四十七方面是根据第二十三至第四十六方面中任一者所述的方法，其中所述增值化学品具有等于或大于约80％的纯度。
本公开的主题内容已被显示和描述，本领域技术人员可以在不偏离所述主题内容的精神和教导的情况下对其进行修改。本文描述的各个方面仅仅是示例性的，而并不旨在进行限制。本文公开的主题内容的许多变化和修改是可能的，并在所公开的主题内容的范围之内。在明确陈述了数值范围或限制的情况下，这种明确的范围或限制应当被理解为包括落于所述明确陈述的范围或限度之内的类似大小的迭代范围或限度(例如，约1至约10包括2、3、4等；大于0.10包括0.11、0.12、0.13等)。对于权利要求的任何要素而言，术语“任选地”的使用旨在意味着主题要素是需要或不需要的。这两种替代方案都旨在落于所述权利要求的范围之内。更广泛的术语例如包含、包括、具有等的使用，应当被理解为对更窄的术语例如由……组成、基本上由……组成、实质上由……组成等提供支持。
因此，保护范围不受上文提出的描述的限制，而是仅受权利要求书的限制，其范围包括权利要求书的主题内容的所有等价物。每一项权利要求均作为本公开的一个方面并入到本说明书中。因此，权利要求书是进一步的描述，并且是对本发明的各个方面的补充。本文对参考文献的讨论并不是承认它是本公开的主题内容的现有技术，尤其是发表日期可能在本申请的优先权日期之后的任何参考文献。本文中引用的所有专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用并入本文，只要它们为本文中阐述的内容提供了示例性、程序性或其他补充细节。
Claims (20)
1.一种分子制造方法，其包括：
将平台分子与(i)生物催化剂和(ii)化学催化剂在适合于生产增值化学品的条件下接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括葡萄糖二酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物催化剂包括半乳糖氧化酶，并且所述化学催化剂包括过渡金属催化剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括L-抗坏血酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括琥珀酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括2,5-呋喃二甲酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括葡萄糖，并且所述增值化学品包括2,5-呋喃二甲酸二甲酯。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括乙醛。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括丙二醇。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括乳酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括丙烯酸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括丙醇。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括乙偶姻。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括2,3-丁二醇。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括1,3-丁二烯。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括乙醇，并且所述增值化学品包括2-丁酮。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括乙二醇，并且所述增值化学品包括乙醇酸。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括乙二醇，并且所述增值化学品包括乙醇胺。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括乙二醇，并且所述增值化学品包括甘油。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述平台化学品包括甘油，并且所述增值化学品包括二羟丙酮。
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