CN117916265A - Osmr特异性单克隆抗体及其使用方法 - Google Patents

Osmr特异性单克隆抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

提供了分离的或重组的抗OSMR单克隆抗体。在一些实施方案中，本文中的抗体可用于检测、诊断和/或治疗性治疗人疾病，例如癌症。

Description

OSMR特异性单克隆抗体及其使用方法
参考通过电子归档(ELECTRONIC FILING)提交的序列表
于2022年7月26日创建并随同本申请以电子方式提交至USPTO专利中心的名为“UTH-004PCT0_sequence_listing_ST26_FILED.XML”的大小为253KB的序列表的XML文件的内容通过引用整体并入。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年7月30日提交的美国临时申请No.63/228,005的权益。前述申请的内容被依赖并且通过引用整体并入本文。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是根据国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助No.R01CA229907在美国政府支持下完成的。政府对本发明具有一定权利。
技术领域
本发明一般地涉及癌症生物学领域。更具体地，其涉及用于治疗和检测癌症的靶向制瘤素M受体(Oncostatin M receptor)(下文称为“OSMR”)的单克隆抗体。
背景技术
卵巢癌(ovarian cancer，“OC”)是最致命的妇科恶性病之一，并且是美国女性中癌症相关死亡的第五主要原因。虽然患有晚期卵巢癌的患者最初可对手术、化学治疗和靶向治疗有响应，但许多患者经常经历其癌症重新出现，其中这些患者中的近一半存活不超过五年。近期使用从高级别浆液性卵巢癌(high-grade serous ovarian cancer)(或“HGSOC”)腹水样品中收集的细胞的单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing，scRNA-seq)的研究提供了JAK/STAT3信号传导是用于卵巢癌细胞和癌症相关成纤维细胞的治疗的易受影响和潜在的靶标的证据(Izar et al.,2020)。这项研究表明，腹水微环境中的细胞，例如癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast)(或“CAF”)和肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage)(或“TAM”)，表达高转录水平的编码分泌型配体的基因，所述配体激活癌细胞中的JAK/STAT3途径。JAK/STAT3途径已显示出是卵巢癌生长和进展所需的重要信号传导机制(Chaluvally-Raghavan et al.，2016；Chen et al.，2020；Parashar ettal.，2019；Rose-John，2018；Yoshikawa et al.，2018)。然而，使用小分子抑制剂(例如JSI-124)直接靶向STAT3显示出次优的效力、不利的药代动力学(pharmacokinetics，PK)特性及其在非癌性细胞和免疫细胞中的非特异性作用(Izar etal.,2020)。这些不良作用也部分是由于STAT转录因子之间的高序列相似性和同源性以及与STAT抑制剂的生物利用度差相关的问题(Zou et al.,2020)。
已知信号传导结局(例如通过IL6家族配体进行的细胞分裂和迁移)是通过Janus激酶(Janus kinase，Jak)和STAT家族的转录因子的激活(Taga and Kishimoto,1997)。在通过IL-6亚家族配体例如IL6(或“白介素-6”)、IL11、睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophic factor)(或“CNTF”)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)(或“LIF”)、制瘤素M(oncostatin M)(下文称为“OSM”)、心肌营养因子1(cardiotrophin 1)(或“CT-1”)、心肌营养因子样细胞因子(cardiotrophin-like cytokine)(或“CLC”)、IL27和IL31刺激之后，胞质尾受体相关激酶如JAK1和JAK2被磷酸化并活化，然后其用作具有匹配SH2结构域的STAT转录因子(主要是STAT3和STAT1蛋白)的对接位点(Murakami et al.,2019；Rose-John,2018)。因此，STAT蛋白被磷酸化和二聚化，然后易位至细胞核并上调对癌症进展和转移重要的基因(Murakami et al.,2019；Rose-John,2018)。IL-6家族细胞因子及其受体构成白介素-6受体(interleukin-6receptor)(或“IL6R”)、白介素-11受体(interleukin-11receptor)(或“IL11RA”)、睫状神经营养因子受体(ciliaryneurotrophic factor receptor)(或“CNTFR”)、白血病抑制因子受体(leukemiainhibitory factor receptor)(或“LIFR”)、制瘤素M受体(OSMR)、白介素-27受体(interleukin-27 receptor)(或“IL-27RA”)和白介素-31受体(interleukin-31receptor)(或“IL31RA”)。
通过OSMR的信号传导是由OSM与OSMR的结合触发的，这导致OSMR与白介素-6信号转导子(interleukin-6 signal transducer)(IL6ST；也被称为糖蛋白130(或GP130))的异二聚化。OSM还与白血病抑制因子受体(LIFR)结合并导致其与IL6ST的异二聚化。另外，当IL-31与IL-31结合时，OSMR与白介素-31受体(IL31RA)二聚化(Tanaka and Miyajima,2003)。OSMR被鉴定为用于在癌细胞中通过JAK/STAT、MAPK、PKC同种型和PI3K/AKT途径来激活致癌途径的关键调节因子(Demyanets et al.,2011；Kurosawa et al.,2015)。然而，OSMR作为卵巢癌和另一些癌症的潜在治疗靶标尚未被探索。需要对卵巢癌进行更好的诊断和治疗。
发明内容
本文中现在提供了单克隆抗体组合物，其可用于诊断和/或治疗癌症，所述癌症包括例如某些类型的卵巢癌。有利地，该发现为其使用者提供了用于治疗对其他常规治疗没有充分响应的某些类型的癌症(例如卵巢癌)的手段。
本文中描述的是与OSMR结合的单克隆抗体。在另一些方面中，所提供的OSMR结合抗体降低通过至少IL6/JAK/STAT3信号传导途径介导的细胞信号传导并且可用于抑制癌细胞增殖。
因此，在一个方面中，提供了与OSMR特异性结合的分离的或重组的单克隆抗体。在某些方面中，提供了与以下竞争结合OSMR的抗体：B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，H11，H12，H13，H14，H15，或H16单克隆抗体。在某些方面中，抗体可包含以下的重链可变区和/或轻链可变区的全部或部分：B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，H11，H12，H13，H14，H15，或H16单克隆抗体。
在另一个方面中，抗体可包含与来自本发明实施方案的以下的轻可变链和/或重可变链的第一、第二和/或第三互补决定区(complementarity determining region，CDR)对应的氨基酸序列：
B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，H11，H12，H13，H14，H15，或H16单克隆抗体。
在某些实施方案中，分离的抗体包含与以下具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的CDR序列：B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，H11，H12，H13，H14，H15，或H16重链和轻链氨基酸序列的CDR区。在另一些方面中，除了在一个或更多个CDR处的一个或两个氨基酸替换、缺失或插入之外，抗体包含与以下相同的CDR区：B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，H11，H12，H13，H14，H15，或H16CDR区。
因此，在一些具体实施方案中，本公开内容的抗体包含：(a)与以下的VH CDR1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH CDR：
B01(SEQ ID NO：1)，B02(SEQ ID NO：4)，B03(SEQ ID NO：7)，B04(SEQ ID NO：10)，B05(SEQ ID NO：13)，B06(SEQ ID NO：16)，B07(SEQ ID NO：19)，B08(SEQ ID NO：22)，B09(SEQ ID NO：25)，B10(SEQ ID NO：28)，B12(SEQ ID NO：31)，B13(SEQ ID NO：34)，B14(SEQID NO：37)，B16(SEQ ID NO：40)，B17(SEQ ID NO：43)，B18(SEQ ID NO：46)，B19(SEQ IDNO：49)，B21(SEQ ID NO：52)，H09(SEQ ID NO：55)，H10(SEQ ID NO：58)，H11(SEQ ID NO：61)，H12(SEQ ID NO：64)，H13(SEQ ID NO：67)，H14(SEQ ID NO：70)，H15(SEQ ID NO：73)，或H16(SEQ ID NO：76)；(b)与以下的VH CDR2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第二VH CDR：
B01(SEQ ID NO：2)，B02(SEQ ID NO：5)，B03(SEQ ID NO：8)，B04(SEQ ID NO：11)，B05(SEQ ID NO：14)，B06(SEQ ID NO：17)，B07(SEQ ID NO：20)，B08(SEQ ID NO：23)，B09(SEQ ID NO：26)，B10(SEQ ID NO：29).B12(SEQ ID NO：32)，B13(SEQ ID NO：35)，B14(SEQID NO：38)，B16(SEQ ID NO：41)，B17(SEQ ID NO：44)，B18(SEQ ID NO：47)，B19(SEQ IDNO：50)，B21(SEQ ID NO：53)，H09(SEQ ID NO：56)，H10(SEQ ID NO：59)，H11(SEQ ID NO：62)，H12(SEQ ID NO：65)，H13(SEQ ID NO：68)，H14(SEQ ID NO：71)，H15(SEQ ID NO：74)，或H16(SEQ ID NO：77)；
(c)与以下的VH CDR3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第三VH CDR：
B01(SEQ ID NO：3)，B02(SEQ ID NO：6)，B03(SEQ ID NO：9)，B04(SEQ ID NO：12)，B05(SEQ ID NO：15)，B06(SEQ ID NO：18)，B07(SEQ ID NO：21)，B08(SEQ ID NO：24)，B09(SEQ ID NO：27)，B10(SEQ ID NO：30)，B12(SEQ ID NO：33)，B13(SEQ ID NO：36)，B14(SEQID NO：39)，B16(SEQ ID NO：42)，B17(SEQ ID NO：45)，B18(SEQ ID NO：48)，B19(SEQ IDNO：51)，B21(SEQ ID NO：54)，H09(SEQ ID NO：57)，H10(SEQ ID NO：60)，H11(SEQ ID NO：63)，H12(SEQ ID NO：68)，H13(SEQ ID NO：69)，H14(SEQ ID NO：72)，H15(SEQ ID NO：76)，或H16(SEQ ID NO：78)；
(d)与以下的VL CDR1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VL CDR：
B01(SEQ ID NO：79)，B02(SEQ ID NO：81)，B03(SEQ ID NO：83)，B04(SEQ ID NO：85)，B05(SEQ ID NO：87)，B06(SEQ ID NO：89)，B07(SEQ ID NO：91)，B08(SEQ ID NO：93)，B09(SEQ ID NO：95)，B10(SEQ ID NO：97)，B12(SEQ ID NO：99)，B13(SEQ ID NO：101)，B14(SEQ ID NO：103)，B16(SEQ ID NO：105)，B17(SEQ ID NO：107)，B18(SEQ ID NO：109)，B19(SEQ ID NO：111)，B21(SEQ ID NO：113)，H09(SEQ ID NO：115)，H10(SEQ ID NO：117)，H11(SEQ ID NO：119)，H12(SEQ ID NO：121)，H13(SEQ ID NO：123)，H14(SEQ ID NO：125)，H15(SEQ ID NO：127)，或H16(SEQ ID NO：129)；
(e)与选自以下的三肽的VL CDR2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第二VL CDR：GNS，DNN，DAS，SHN，DAT，SNN，NNN，RNN，EDN，AAS，DVS，LGS，QDN，WDS，和PDC；以及(f)与以下的VL CDR3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第三VLCDR：
B01(SEQ ID NO：80)，B02(SEQ ID NO：82)，B03(SEQ ID NO：84)，B04(SEQ ID NO：86)，B05(SEQ ID NO：88)，B06(SEQ ID NO：90)，B07(SEQ ID NO：92)，B08(SEQ ID NO：94)，B09(SEQ ID NO：96)，B10(SEQ ID NO：98)，B12(SEQ ID NO：100)，B13(SEQ ID NO：102)，B14(SEQ ID NO：104)，B16(SEQ ID NO：106)，B17(SEQ ID NO：108)，B18(SEQ ID NO：110)，B19(SEQ ID NO：112)，B21(SEQ ID NO：114)，H09(SEQ ID NO：116)，H10(SEQ ID NO：118)，H11(SEQ ID NO：120)，H12(SEQ ID NO：122)，H13(SEQ ID NO：124)，H14(SEQ ID NO：126)，H15(SEQ ID NO：128)，或H16(SEQ ID NO：130)。在某些方面中，这样的抗体是在人IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG4或经遗传修饰的IgG)骨架上包含前述CDR的人源化或去免疫化抗体。
在又一个方面中，本公开内容提供了重组多肽，其包含抗体VH结构域，所述抗体VH结构域包含：B01的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:1、2和3)；B02的VH结构域的CDR1至3(SEQID NO:4、5和6)；B03的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:7、8和9)；B04的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:10、11和12)；B05的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:13、14和15)；B06的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:16、17和18)；B07的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:19、20和21)；B08的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:22、23和24)；B09的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:25、26和27)；B10的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:28、29和30)；B12的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:31、32和33)；B13的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:34、35和36)；B14的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:37、38和39)；B16的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:40、41和42)；B17的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:43、44和45)；B18的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:46、47和48)；B19的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:49、50和51)；B21的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:52、53和54)；H09的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:55、56和57)；H10的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:58、59、60)；H11的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:61、62和63)；H12的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:64、65和66)；H13的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:67、68和69)；H14的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:70、71和72)；B15的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:73、74和75)；或者B16的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:76、77和78)。
在又一个方面中，本公开内容提供了重组多肽，其包含抗体VL结构域，所述抗体VL结构域包含：B01的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:79、三肽GNS和SEQ ID NO:80)；B02的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:81、三肽DNN和SEQ ID NO:82)；B03的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:83、三肽DAS和SEQ ID NO:84)；B04的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:85、三肽DAS和SEQ ID NO:86)；B05的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:87、三肽DAS和SEQ ID NO:88)；B06的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:89、三肽SHN和SEQ ID NO:90)；B07的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:91、三肽DAT和SEQ ID NO:92)；B08的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:93、三肽SNN和SEQ ID NO:94)；B09的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:95、三肽NNN和SEQ IDNO:96)；B10的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:97、三肽RNN和SEQ ID NO:98)；B12的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:99、三肽EDN和SEQ ID NO:100)；B13的VL结构域的CDR1至3(SEQID NO:101、三肽SNN和SEQ ID NO:102)；B14的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:103、三肽AAS和SEQ ID NO:104)；B16的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:105、三肽DAS和SEQ ID NO:106)；B17的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:107、三肽DVS和SEQ ID NO:108)；B18的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:109、三肽LGS和SEQ ID NO:110)；B19的VL结构域的CDR1至3(SEQID NO:111、三肽SNN和SEQ ID NO:112)；B21的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:113、三肽AAS和SEQ ID NO:114)；H09的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:115、三肽SNN和SEQ ID NO:116)；H10的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:117、三肽SNN和SEQ ID NO:118)；H11的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:119、三肽QDN和SEQ ID NO:120)；H12的VL结构域的CDR1至3(SEQID NO:121、三肽WDS和SEQ ID NO:122)；H13的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:123、三肽EDN和SEQ ID NO:124)；H14的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:125、三肽SNN和SEQ ID NO:126)；H15的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:127、三肽PDC和SEQ ID NO:128)；或者H16的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:129、三肽AAS和SEQ ID NO:130)。
在又一个方面中，本公开内容提供了包含以上实施方案中任一项所述的抗体或重组多肽的组合物。
在又一个方面中，本公开内容提供了宿主细胞，其包含编码以上实施方案中任一项所述的抗体或重组多肽或者其部分的一种或更多种多核苷酸分子(参见，例如SEQ IDNO:183至234的多核苷酸)。
在又一个方面中，本公开内容提供了用于治疗患有癌症的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的以上实施方案中任一项所述的抗体。
数字E5、E6和E7等在本文中分别与105、106和107等互换使用。
术语“包含/包括”及其变体(例如，包含、包括等)在这些术语出现在说明书和权利要求书中的情况下不具有限制性含义。
如本文中使用的，除非上下文另有明确指示，否则没有数量词修饰的名词、“至少一个/种”和“一个/种或更多个/种”可互换使用。
同样在本文中，通过端点记载的数值范围包括在该范围内包含的所有数字(例如，500至7000nm，包括500、530、551、575、583、592、600、620、650、700等)。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的本发明的一些实施方案。然而，在相同或其他情况下，另一些实施方案也可以是优选的。此外，一个或更多个优选实施方案的叙述不意味着另一些实施方案是无用的，并且不旨在从本发明的范围中排除另一些实施方案。
除非另有说明，否则本文中使用的所有科学和技术术语均具有本领域中通常使用的含义。本文中提供的定义是为了便于理解本申请中经常使用的某些术语并且不意味着在本公开内容的上下文中排除对这些术语的合理解释。
除非另有指示，否则本说明书和权利要求书中使用的在说明书和权利要求书中表示特征尺寸、量和物理特性的所有数字应被理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在前述说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据由本领域技术人员利用本文中所公开的教导试图获得的期望特性而变化。至少，并不试图将等同原则的应用限制在权利要求书的范围内，每个数值参数应当至少根据报道的有效数字的数值并通过应用一般的舍入技术来解释。虽然阐述本发明宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中阐述的数值是尽可能精确地报导的。然而，任何数值均固有地包括不可避免地由在其各自的测试测量中存在的标准偏差产生的某些误差。
本发明的以上概述不旨在描述本发明的每个公开的实施方案或每个实施方式。以下描述更具体地例示了举例说明性方案。
附图说明
以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一幅或更多幅可以更好地理解本发明。本专利或申请文件包含至少一幅以彩色绘制的附图。在提出请求并支付必要的费用后，官方将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1A至F.制瘤素M(OSM)家族基因通过OSM受体二聚化与卵巢癌的化学抗性相关。A，一式三份地在A2780-CP顺铂抗性细胞相对于A2780敏感细胞中从IL-6信号传导qPCR阵列产生的大于或小于1.5倍数变化的差异表达基因的热图聚类图。内源性上调或下调的基因分别由红色或绿色表示。C，在顺铂抗性卵巢癌细胞系A2780、PEO4和患者来源的卵巢癌细胞系SL-3以及在A2780、PEO1和SL-3的亲本形式中进行从(a)获得的顶部候选基因的Western印迹分析。D，通过Luminex多重ELISA确定了A2780-CP相对于A2780敏感细胞以及SL-3-CP相对于SL-3敏感细胞系的培养物上清液中人OSM、LIF、IL31、IL6和IL8的内源性水平。E，OSMR是从用OSM(100ng/mL)处理并用BS3试剂交联的A2780-CP和A2780敏感细胞中免疫沉淀(immunoprecipitate，IP)的。通过IP获得的单体和二聚体首先在SDS-PAGE上解析并使用OSMR对其单体和二聚体进行免疫印迹；然后剥离膜并用IL6ST对异二聚体进行免疫印迹。F.对A2780敏感和A2780-Cis以及OVCAR8和OVCAR8-Cis顺铂抗性细胞的Western印迹分析，其显示出了OSMR和pSTAT3的内源性表达。****P≤0.0001，***P≤0.001。进行Student t检验(双尾，未配对)(Dunnett多重比较)以确定不同组之间的显著性。数据表示平均值±SEM。
图2A至F.抗OSMR抗体通过经抑制OSMR和STAT3磷酸化而降低顺铂IC50和球状体形成来提高体外顺铂抗性卵巢癌细胞的化学敏感性。确定了在用不同浓度的顺铂处理48小时之后(A)A2780敏感和A2780-CP顺铂抗性细胞、(B)OVCAR8敏感和OVCAR8-Cis抗性细胞、(C)SL3和SL3 Cis抗性细胞的细胞生存力。三种细胞系的顺铂IC50在各自的框中示出。(D至F)在用B21抗OSMR抗体(10μg/mL)与不同浓度的顺铂组合处理48小时之后A2780敏感和A2780-CP顺铂抗性细胞、OVCAR8敏感和OVCAR8-Cis抗性细胞、SL3和SL3 Cis的细胞生存力，其显示出IC50降低。d，在存在OSM(100ng/mL)的情况下，用OSM及B14和B21抗OSMR抗体(各10μg/mL)处理之后，在A2780-CP中进行的3D球状体形成测定。
图3A至D.抗OSMR抗体通过降低球状体形成能力来提高体外顺铂抗性卵巢癌细胞的化学敏感性。(A至B)稳定表达萤光素酶报道基因的A2780-Cis和SL3-Cis细胞的3D球状体形成测定，所述细胞用B14和B21抗OSMR抗体(各10μg/mL)处理，然后进行重组人OSM(100ng/mL)的持续指定天数的外源性诱导并拍照。(C至D)在用B14和B21抗OSMR抗体(各10μg/mL)单独以及与顺铂(10μM)组合处理之后，A2780-Cis和SL3-Cis的3D球状体形成测定。显示发光强度的条形图对应于使用3D生存力测定进行的球状体数目。所显示的球状体尺寸是每次处理每4个视野的视图。比例尺，500uM。进行Student t检验(双尾，未配对)。数据表示平均值±SEM。**p≤0.01，*p≤0.05。
图4A至B.抗OSMR抗体降低卵巢癌细胞和顺铂抗性细胞中的集落形成能力和STAT3的磷酸化。(A)将OVCAR8和OVCAR8-Cis抗性细胞用重组人OSM(100ng/mL)以及B14和B21抗体(10ug/mL)处理，并随后接种10天以评估集落形成能力。对照IgG是同种型对照。(B)将OVCAR8和OVCAR8-Cis抗性细胞用B14和B21抗体(10ug/mL)然后用重组人OSM(100ng/mL)处理，并针对OSMR及其下游靶标进行Western印迹分析。
图5.A至H.抗OSMR抗体在体内提高卵巢癌细胞针对顺铂的化学敏感性。A至B，肿瘤生长的代表性图像是通过生物发光IVIS100成像仪从用同种型对照IgG在没有和有OSM刺激的情况下、OSM+B14和OSM+B21抗OSMR抗体处理的荷A2780-Luc+和A2780-Cis-Luc+瘤小鼠中确定的。图像是在指定天数下拍摄的。确定了来自(a)的处理组中的C至D萤光素酶信号强度的定量评估、和E至F肿瘤的总重量。G，代表性western印迹，其显示了来自‘A’的小鼠肿瘤组织的所指示蛋白质的蛋白质表达。H，所提出的模型，其显示了B14和B21抗OSMR mAb在抑制肿瘤进展和促进细胞存活以及调节肿瘤细胞对顺铂的敏感性方面的效力和机制。在(C至E)中进行了Dunnett多重比较检验和Student t检验(双尾，未配对)。(C至E)中的数据表示平均值±SEM。****P≤0.0001，***P≤0.001，**P≤0.01，*P≤0.05。
图6A至H.OSMR的敲低显著抑制卵巢癌细胞和成纤维细胞的增殖和迁移。A至D，CCK8测定，其表明卵巢癌细胞(HEYA8和OVCAR4)、成纤维细胞、巨噬细胞(THP1)和内皮细胞(RF24)的增殖。用IL6家族受体的指定siRNA转染细胞24小时，并在指定的时间点进行CCK8增殖测定。E至H，卵巢癌细胞(HEYA8和OVCAR4)、巨噬细胞(THP1)、内皮细胞(RF24)和成纤维细胞的Trans-well迁移测定。用IL6家族受体的指定siRNA转染细胞24小时，并进行迁移测定12小时。在(A至H)w.r.t对照siRNA中进行Student t检验(双尾，未配对)。数据表示平均值±SEM。****P￡0.0001，***P￡0.001，**P￡0.01，*P￡0.05，#P￡0.001，$P￡0.0001，ns：不显著。
图7A至C.OSMR表达与卵巢癌的恶性特征相关。A.GSEA分析，表明了基于TCGA卵巢癌样品中OSM表达的指定功能注释标志的富集评分。ES：富集评分，NES：归一化的富集评分。B.来自卵巢癌组织微阵列核心的代表性图像，显示了针对OSM进行免疫染色并使用AperioScan Scope(Aperio Technologies)进行扫描的OSM表达。标记了正常(normal，N)、正常邻近肿瘤(normal adjacent tumor，NAT)、恶性I期、II期和III期。比例尺，100μm。C.直方图显示了如在指定时间点处的球状体相对尺寸。在(C)中进行Student t检验和Dunnett多重比较检验。数据表示平均值±SEM。****P￡0.0001，和**P￡0.01。
图8A至J.高OSMR表达促进卵巢癌中的致癌信号传导。A，用OSM刺激OVCAR4细胞24小时并制备细胞裂解物，并且使用磷酸-蛋白激酶阵列膜来对磷酸-激酶蛋白的水平进行定量。B，直方图代表阵列膜上以白色方块标记的显著改变的磷酸-激酶蛋白的光密度读出的平均值。C，用pUNO1-OSMR过表达质粒稳定转染HEYA8和OVCAR5细胞。C#1至C#3是指在稳定转染之后选择的不同克隆，并对指定蛋白质进行western印迹。D，分别用克隆#1和克隆#3稳定转染HEYA8和OVCAR5，并对指定蛋白质进行western印迹。E，用pUNO-1-OSMR过表达质粒稳定转染HEYA8和OVCAR5细胞，并将1200个细胞接种在6孔板上用于集落形成测定。将集落用0.5％结晶紫染色并在第10天拍照。F，将结晶紫染色的集落在10％乙酸中洗脱并定量。G，将在pUNO1-对照载体和pUNO1-OSMR的克隆#1的情况下稳定过表达的HEYA8细胞分别接种12小时和16小时用于迁移和侵袭。比例尺，100μm。H，将结晶紫染色的经迁移和侵袭的细胞在10％乙酸中洗脱并定量。I，在pUNO1-对照载体和pUNO1-OSMR的克隆#1的情况下稳定过表达的HEYA8的伤口愈合测定，并在指定的时间点拍照。J，3D球状体形成测定的代表性图像。在pUNO1-OSMR的情况下稳定过表达的HEYA8细胞培养在低黏附板上的克隆细胞培养基中，并在指定的天数拍照。比例尺，500μm。在(F，H)中进行Student t检验(双尾，未配对)。数据表示平均值±SEM。****P￡0.0001，***P￡0.001。
现在将参考附图来描述本发明的一些具体非限制性实施方案。
具体实施方式
根据本公开内容，现在已知白介素-6信号转导子(下文称为“IL6ST”)及其二聚配偶体OSMR是卵巢癌细胞中两种最高度表达的受体蛋白。此外，根据本公开内容，现在已知OSMR在卵巢癌细胞、癌症相关成纤维细胞和内皮细胞中高度表达。本发明人还发现制瘤素M(下文称为“OSM”)(其是OSMR的配体)是由肿瘤相关巨噬细胞产生的。出乎意料地，已经发现本文中所述的全人单克隆抗体针对OSMR的胞外结构域，其消除了OSM诱导的OSMR-IL6ST异二聚化，促进了OSMR的内化和降解，并在体外有效阻断了OSMR介导的信号传导。本文中公开的结果出乎意料地显示出抗OSMR抗体可介导对OSM诱导的OSMR-IL6ST二聚化和致癌信号传导的破坏。
实施方案的抗体
在某些实施方案中，考虑了与OSMR蛋白的至少一部分结合并抑制OSMR信号传导和癌细胞增殖的抗体或其片段。如本文中使用的术语“抗体”旨在泛指任何免疫结合剂，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和经遗传修饰的IgG以及包含保留抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。抗体可选自：嵌合抗体、亲和力成熟抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、或抗原结合抗体片段或者天然的或合成的配体。优选地，抗OSMR抗体是单克隆抗体或人源化抗体。
“抗体分子”涵盖任何类别的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要是任何特定类别。根据其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可被分配至不同的类别。免疫球蛋白存在五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的数种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的。
如本文中使用的术语抗体分子的“抗原结合部分”是指保留了与PD1特异性结合能力的完整抗体的一个或更多个片段。抗体分子的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来进行。在术语抗体分子的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的一些实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、单结构域抗体(domain antibody，dAb)片段、和分离的互补决定区(CDR)。
术语“Fc区”用于限定免疫球蛋白重链的C端区域。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变化，但人IgG重链Fc区通常被限定为从第Cys226位或从第Pro230位的氨基酸残基延伸至其羧基末端。Fc区中残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域：CH2和CH3。如本领域中已知的，Fc区可以以二聚体或单体形式存在。
抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。如本领域中已知的，重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的四个框架区(framework region，FR)组成，有助于抗体的抗原结合位点的形成。当选择FR位于CDR侧翼时，例如当人源化或优化抗体时，优选来自包含相同规范类别中的CDR序列的抗体的FR。
如本文中使用的术语“保守替换”是指用不显著有害地改变功能活性的另一种氨基酸来替代氨基酸。“保守替换”的一个优选实例是用在BLOSUM 62替换矩阵中的值大于或等于(gtoreq.)0的另一种氨基酸替代一种氨基酸(参见Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89：10915-10919)。
因此，通过已知方式并如本文中所述，可产生对OSMR蛋白、一个或更多个其各自表位、或前述任一种的缀合物具有特异性的多克隆或单克隆抗体、抗体片段和结合结构域和CDR(包含前述任一种的经改造形式)，无论这样的抗原或表位是从天然来源分离的还是天然化合物的合成衍生物或变体。
适合于本发明实施方案的抗体片段的一些实例包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CHI结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CHI结构域组成的“Fd”片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的“Fv”片段；(iv)由VH结构域组成的“dAb”片段；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头使这两个结构域缔合以形成结合结构域；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见例如美国专利No.5,091,513)；和(ix)双抗体，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(参见例如美国专利申请公开No.20050214860)。Fv、scFv或双抗体分子可通过并入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定。还可制备包含与CH3结构域连接的scFv的微抗体(参见，例如
Hu et al，1996，“Minibody：A Novel Engineered Anti-CarcinoembryonicAntigen Antibody Fragment(Single-Chain Fv-CH3)Which Exhibits Rapid，High-LevelTargeting of Xenografts”，Cancer Res.56：3055-3061)。
在另一个方面中，本公开内容的抗体可包含与来自以下的第一、第二和/或第三互补决定区(CDR)对应的氨基酸序列：本文中公开并描述的B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，H11，H12，H13，H14，H15，或H16单克隆抗体的轻可变链和/或重可变链。
在某些方面中，本公开内容的分离的抗体包含与以下具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的CDR序列：B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，H11，H12，H13，H14，H15，或H16重链和轻链氨基酸序列的CDR区。在另一些方面中，除了一个或更多个CDR处的一个或两个氨基酸替换、缺失或插入之外，本公开内容的抗体包含与以下相同的CDR区：B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，H11，H12，H13，H14，H15，或H16 CDR区。例如，抗体可包含CDR，其中CDR序列相对于以下的CDR，在VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3中包含1或2个氨基酸替换：B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，H11，H12，H13，H14，H15，或H16单克隆抗体。
因此，在一些具体方面中，本公开内容的抗体包含：(a)与以下的VH CDR1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH CDR：
B01(SEQ ID NO：1)，B02(SEQ ID NO：4)，B03(SEQ ID NO：7)，B04(SEQ ID NO：10)，B05(SEQ ID NO：13)，B06(SEQ ID NO：16)，B07(SEQ ID NO：19)，B08(SEQ ID NO：22)，B09(SEQ ID NO：25)，B10(SEQ ID NO：28)，B12(SEQ ID NO：31)，B13(SEQ ID NO：34)，B14(SEQID NO：37)，B16(SEQ ID NO：40)，B17(SEQ ID NO：43)，B18(SEQ ID NO：46)，B19(SEQ IDNO：49)，B21(SEQ ID NO：52)，H09(SEQ ID NO：55)，H10(SEQ ID NO：58)，H11(SEQ ID NO：61)，H12(SEQ ID NO：64)，H13(SEQ ID NO：67)，H14(SEQ ID NO：70)，H15(SEQ ID NO：73)，或H16(SEQ ID NO：76)；
(b)与以下的VH CDR2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第二VH CDR：
B01(SEQ ID NO：2)，B02(SEQ ID NO：5)，B03(SEQ ID NO：8)，B04(SEQ ID NO：11)，B05(SEQ ID NO：14)，B06(SEQ ID NO：17)，B07(SEQ ID NO：20)，B08(SEQ ID NO：23)，B09(SEQ ID NO：26)，B10(SEQ ID NO：29)，B12(SEQ ID NO：32)，B13(SEQ ID NO：35)，B14(SEQ ID NO：38)，B16(SEQ ID NO：41)，B17(SEQ ID NO：44)，B18(SEQ ID NO：47)，B19(SEQID NO：50)，B21(SEQ ID NO：53)，H09(SEQ ID NO：56)，H10(SEQ ID NO：59)，H11(SEQ IDNO：62)，H12(SEQ ID NO：65)，H13(SEQ ID NO：68)，H14(SEQ ID NO：71)，H15(SEQ ID NO：74)，或H16(SEQ ID NO：77)；
(c)与以下的VH CDR3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第三VH CDR：
B01(SEQ ID NO：3)，B02(SEQ ID NO：6)，B03(SEQ ID NO：9)，B04(SEQ ID NO：12)，B05(SEQ ID NO：15)，B06(SEQ ID NO：18)，B07(SEQ ID NO：21)，B08(SEQ ID NO：24)，B09(SEQ ID NO：27)，B10(SEQ ID NO：30)，B12(SEQ ID NO：33)，B13(SEQ ID NO：36)，B14(SEQID NO：39)，B16(SEQ ID NO：42)，B17(SEQ ID NO：45)，B18(SEQ ID NO：48)，B19(SEQ lIDNO：51)，B21(SEQ ID NO：54)，H09(SEQ ID NO：57)，H10(SEQ ID NO：60)，H11(SEQ ID NO：63)，H12(SEQ ID NO：66)，H13(SEQ ID NO：69)，H14(SEQ ID NO：72)，H15(SEQ ID NO：75)，或H16(SEQ ID NO：78)；
(d)与以下的VL CDR1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VL CDR：
B01(SEQ ID NO：79)，B02(SEQ ID NO：81)，B03(SEQ ID NO：83)，B04(SEQ ID NO：85)，B05(SEQ ID NO：87)，B06(SEQ ID NO：89)，B07(SEQ ID NO：91)，B08(SEQ ID NO：93)，B09(SEQ ID NO：95)，B10(SEQ ID NO：97)，B12(SEQ ID NO：99)，B13(SEQ ID NO：101)，B14(SEQ ID NO：103)，B16(SEQ ID NO：105)，B17(SEQ ID NO：107)，B18(SEQ ID NO：109)，B19(SEQ ID NO：111)，B21(SEQ ID NO：113)，H09(SEQ ID NO：115)，H10(SEQ ID NO：117)，H11(SEQ ID NO：119)，H12(SEQ ID NO：121)，H13(SEQ ID NO：123)，H14(SEQ ID NO：125)，H15(SEQ ID NO：127)，或H16(SEQ ID NO：129)；
(e)与选自以下的VL CDR2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第二VL CDR：GNS，DNN，DAS，SHN，DAT，SNN，NNN，RNN，EDN，AAS，DVS，LGS，QDN，WDS，或PDC；以及(f)与以下的VL CDR3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第三VLCDR：
B01(SEQ ID NO：80)，B02(SEQ ID NO：82)，B03(SEQ ID NO：84)，B04(SEQ ID NO：86)，B05(SEQ ID NO：88)，B06(SEQ ID NO：90)，B07(SEQ ID NO：92)，B08(SEQ ID NO：94)，B09(SEQ ID NO：96)，B10(SEQ ID NO：98)，B12(SEQ ID NO：100)，B13(SEQ ID NO：102)，B14(SEQ ID NO：104)，B16(SEQ ID NO：106)，B17(SEQ ID NO：108)，B18(SEQ ID NO：110)，B19(SEQ ID NO：112)，B21(SEQ ID NO：114)，H09(SEQ ID NO：116)，H10(SEQ ID NO：118)，H11(SEQ ID NO：120)，H12(SEQ ID NO：122)，H13(SEQ ID NO：124)，H14(SEQ ID NO：126)，H15(SEQ ID NO：128)，或H16(SEQ ID NO：130)。
在某些方面中，这样的抗体是在人IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG4或经遗传修饰的IgG)骨架上包含前述CDR的人源化或去免疫化抗体。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B01的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO：1、2、3、79、80和81表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B01的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体可包含与B01的VH结构域(SEQ ID NO：131)或B01mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B01的VL结构域(SEQ ID NO：157)或B01mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B01 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B01 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，本公开内容的抗体可包含与人源化B01 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B01 mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体包含与单克隆抗体B01的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B02的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO：4、5和6；和SEQ ID NO：81、三肽DNN、和SEQ ID NO：82表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B02的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与B02的VH结构域(SEQ ID NO:132)或B02 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B02的VL结构域(SEQ ID NO:158)或B02 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B02mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B02 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体可包含与人源化B02 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B02 mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体包含与单克隆抗体B02的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B03的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:7、8、9；和SEQ ID NO:83、三肽DAS、和SEQ ID NO:84；85、86和87表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B03的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与B03的VH结构域(SEQ ID NO:133)或B03 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B03的VL结构域(SEQ ID NO:159)或B03 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B03mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B03 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体可包含与人源化B03 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B03 mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体包含与单克隆抗体B03的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B04的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:10、11、12；和SEQ ID NO:85、三肽DAS、和SEQ ID NO:86表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B04的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体可包含与B04的VH结构域(SEQ ID NO:134)或B04mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B04的VL结构域(SEQ ID NO:160)或B04mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B04 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B04 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体可包含与人源化B04 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B04 mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B04的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B05的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:13、14、15；和SEQ ID NO:87、三肽DAS、和SEQ ID NO:88表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B05的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体可包含与B05的VH结构域(SEQ ID NO:135)或B05mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B05的VL结构域(SEQ ID NO:161)或B05mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B05 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B05 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体可包含与人源化B05 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B05 mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B05的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B06的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:16、17、18；和SEQ ID NO:89、三肽SHN、和SEQ ID NO:90表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B06的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体可包含与B06的VH结构域(SEQ ID NO:136)或B06mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B06的VL结构域(SEQ ID NO:162)或B06mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B06 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B06 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体可包含与人源化B06 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B06 mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B06的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B07的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:19、20、21；和SEQ ID NO:91、三肽DAT、和SEQ ID NO:92表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B07的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体可包含与B07的VH结构域(SEQ ID NO:137)或B07mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B07的VL结构域(SEQ ID NO:163)或B07mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B07 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B07 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体可包含与人源化B07 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B07 mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B07的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B08的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:22、23、24；和SEQ ID NO:93、三肽SNN、和SEQ ID NO:94表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B08的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体可包含与B08的VH结构域(SEQ ID NO:138)或B08mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B08的VL结构域(SEQ ID NO:164)或B08mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B08 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B08 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体可包含与人源化B08 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B08 mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B08的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，并且本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B09的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:25、26、27；和SEQ ID NO:95、三肽NNN、和SEQ ID NO:96表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B09的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体可包含与B09的VH结构域(SEQ ID NO:139)或B09mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B09的VL结构域(SEQ ID NO:165)或B09mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B09 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B09 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体可包含与人源化B09 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B09 mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体包含与单克隆抗体B09的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B010的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:28、29、30；和SEQ ID NO:97、三肽RNN、和SEQ ID NO:98表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B010的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与B010的VH结构域(SEQ ID NO:140)或B10 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B10的VL结构域(SEQ ID NO:166)或B10 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B10 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B10 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化B10 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B10mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B10的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B12的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:31、32、33；和SEQ ID NO:99、三肽EDN、和SEQ ID NO:100表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B12的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与B12的VH结构域(SEQ ID NO:141)或B12 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B12的VL结构域(SEQ ID NO:167)或B12 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B12 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B12 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化B12 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B12mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B12的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B13的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:34、35、36；和SEQ ID NO:101、三肽SNN、和SEQ ID NO:102表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B13的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与B13的VH结构域(SEQ ID NO:142)或B13 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B13的VL结构域(SEQ ID NO:168)或B13 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B13 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B13 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化B13 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B13mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B13的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B14的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:37、38、39；和SEQ ID NO:103、三肽AAS、和SEQ ID NO:104表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B14的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与B14的VH结构域(SEQ ID NO:143)或B14 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B14的VL结构域(SEQ ID NO:169)或B14 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B14 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B14 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化B14 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B14mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B14的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B016的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:40、41、42；和SEQ ID NO:105、三肽DAS、和SEQ ID NO:106表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B16的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与B16的VH结构域(SEQ ID NO:144)或B16 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B16的VL结构域(SEQ ID NO:170)或B16 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B16 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B16 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化B16 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B16mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B16的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B17的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:43、44、45；和SEQ ID NO:107、三肽DVS、和SEQ ID NO:108表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B17的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与B17的VH结构域(SEQ ID NO:145)或B17 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B17的VL结构域(SEQ ID NO:171)或B17 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B17 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B17 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化B17 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B17mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B17的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B18的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:46、47、48；和SEQ ID NO:109、三肽LGS、和SEQ ID NO:110表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B18的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与B18的VH结构域(SEQ ID NO:146)或B18 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B18的VL结构域(SEQ ID NO:172)或B18 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B18 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B18 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化B18 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B18mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B18的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B19的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:49、50、51；和SEQ ID NO:111、三肽SNN、和SEQ ID NO:112表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B19的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与B19的VH结构域(SEQ ID NO:147)或B19 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B19的VL结构域(SEQ ID NO:173)或B19 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B19 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B19 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化B19 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B19mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B19的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体B21的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:52、53、54；和SEQ ID NO:113、三肽AAS、和SEQ ID NO:114表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体B21的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与B21的VH结构域(SEQ ID NO:148)或B21 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与B21的VL结构域(SEQ ID NO:174)或B21 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化B21 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化B21 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化B21 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化B21mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体B21的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体H09的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:55、56、57；和SEQ ID NO:115、三肽SNN、和SEQ ID NO:116表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体H09的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与H09的VH结构域(SEQ ID NO:149)或H09 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与H09的VL结构域(SEQ ID NO:175)或H09 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化H09 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化H09 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化H09 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化H09mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体H09的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体H10的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:58、59、60；和SEQ ID NO:117、三肽SNN、和SEQ ID NO:118表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体H10的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与H10的VH结构域(SEQ ID NO:150)或H10 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与H10的VL结构域(SEQ ID NO:176)或H10 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化H10 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化H10 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化H10 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化H10mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体H10的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体H11的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:61、62、63；和SEQ ID NO:119、三肽QDN、和SEQ ID NO:120表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体H11的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与H11的VH结构域(SEQ ID NO:151)或H11 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与H11的VL结构域(SEQ ID NO:177)或H11 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化H11 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化H11 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化H11 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化H11mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体H11的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体H12的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:64、65、66；和SEQ ID NO:121、三肽WDS、和SEQ ID NO:122表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体H12的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与H12的VH结构域(SEQ ID NO:152)或H12 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与H12的VL结构域(SEQ ID NO:178)或H12 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化H12 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化H12 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化H12 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化H12mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体H12的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体H13的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:67、68、69；和SEQ ID NO:123、三肽EDN、和SEQ ID NO:124表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体H13的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与H13的VH结构域(SEQ ID NO:153)或H13 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与H13的VL结构域(SEQ ID NO:179)或H13 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化H13 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化H13 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化H13 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化H13mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体H13的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体H14的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:70、71、72；和SEQ ID NO:125、三肽SNN、和SEQ ID NO:126表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体H14的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与H14的VH结构域(SEQ ID NO:154)或H14 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与H14的VL结构域(SEQ ID NO:180)或H14 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化H14 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化H14 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化H14 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化H14mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体H14的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体H15的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:73、74、75；和SEQ ID NO:127、三肽PDC、和SEQ ID NO:128表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体H15的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与H15的VH结构域(SEQ ID NO:155)或H15 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与H15的VL结构域(SEQ ID NO:181)或H15 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化H15 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化H15 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化H15 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化H15mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体H15的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
在另一些方面中，本公开内容的分离的抗体可包含与单克隆抗体H16的相应CDR序列(其分别由SEQ ID NO:76、77、78；和SEQ ID NO:129、三肽AAS、和SEQ ID NO:130表示)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VL CDR序列。在一个方面中，分离的抗体包含与单克隆抗体H16的CDR序列相同的CDR序列。
在另一个方面中，分离的抗体包含与H16的VH结构域(SEQ ID NO:156)或H16 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH结构域；和与H16的VL结构域(SEQ ID NO：182)或H16 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL结构域。例如，抗体可包含与人源化H16 mAb的VH结构域具有至少95％同一性的VH结构域和与人源化H16 mAb的VL结构域具有至少95％同一性的VL结构域。因此，在一些方面中，抗体包含与人源化H16 mAb的VH结构域相同的VH结构域和与人源化H16mAb的VL结构域相同的VL结构域。在一个具体实例中，分离的抗体可包含与单克隆抗体H16的VH和VL结构域相同的VH和VL结构域。
一些实施方案中还考虑了抗体样结合肽模拟物。
Liu et al.(Murali，R.；Liu，Q.；Cheng，X.；Berezov，A.；Richter，M.；Furuchi，K.；Greene，M.I.；Zhang，H Antibodyl ike peptidomimetics as large scaleimmunodetection probes Ccll.Mol.Biol.(Noisy-le-grand)2003，49：209-216)
描述了“抗体样结合肽模拟物”(antibody like binding peptidomimetic，ABiP)，其是这样的肽：用作精简抗体(pared-down antibody)并且具有某些优点(更长的血清半衰期以及更少繁琐的合成方法)。
动物可接种抗原，例如OSMR蛋白，以产生对OSMR蛋白具有特异性的抗体。通常，抗原与另一分子结合或缀合以增强免疫应答。如本文中使用的缀合物是与用于在动物中引发免疫应答的抗原结合的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白质性物质。在动物中响应于抗原接种而产生的抗体包含由多种单独抗体产生B淋巴细胞制备的多种非相同分子(多克隆抗体)。多克隆抗体是抗体物质的混合群体，所述抗体物质各自可识别相同抗原上的不同表位。给定在动物中产生多克隆抗体的正确条件，动物血清中的大多数抗体将识别已对动物进行免疫接种的抗原化合物上的集合表位。这种特异性通过亲和纯化进一步增强，以仅选择识别目的抗原或表位的那些抗体。
单克隆抗体(或“mAb”)是其中每个抗体分子均识别相同表位的单一种类的抗体，因为所有抗体产生细胞均来源于单一B淋巴细胞细胞系。用于产生单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)的方法通常沿着与用于制备多克隆抗体的那些路线相同的路线开始。在一些实施方案中，啮齿动物(例如小鼠和大鼠)用于产生单克隆抗体。在一些实施方案中，兔、绵羊或蛙细胞用于产生单克隆抗体。大鼠的使用是公知的并且可提供某些优点。小鼠(例如，BALB/c小鼠)是常规使用的并且通常提供高百分比的稳定融合。
杂交瘤技术涉及将来自先前用EGFL6抗原免疫接种的小鼠的单一B淋巴细胞与永生性骨髓瘤细胞(通常是小鼠骨髓瘤)融合。该技术提供了使单一抗体产生细胞繁殖无限代的方法，以使得可产生无限量的具有相同的抗原或表位特异性的结构上相同的抗体(单克隆抗体)。
血浆B细胞(CD45+CD5-CD19+)可从经免疫接种的兔的新鲜制备的兔外周血单个核细胞分离并进一步针对OSMR结合细胞进行选择。在富集抗体产生B细胞之后，可分离总RNA并合成cDNA。可扩增来自重链和轻链二者的抗体可变区的DNA序列，将其构建到噬菌体展示Fab表达载体中，并转化到大肠杆菌(E.coli)中。可通过多轮富集淘选选出OSMR特异性结合Fab并进行测序。所选择的OSMR结合命中物(hit)可在人胚肾(HEK293)细胞(Invitrogen)中使用哺乳动物表达载体系统表达为兔和兔/人嵌合形式的全长IgG，并使用蛋白G树脂用快速蛋白质液相色谱(fast protein liquid chromatography，FPLC)分离单元进行纯化。
在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如，包含来自与异源非人、人或人源化序列(例如，框架和/或恒定结构域序列)接枝的非人供体的抗原结合序列的抗体。已经开发出用人来源的类似结构域代替单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域而使外来抗体的可变区保持完整的方法。或者，在针对人免疫球蛋白基因转基因的小鼠中产生“完全人”单克隆抗体。还已经开发了通过重组构建具有啮齿动物(例如小鼠)和人二者氨基酸序列的抗体可变结构域来将单克隆抗体的可变结构域转化为更加人形式的方法。在“人源化”单克隆抗体中，仅高变CDR来源于小鼠单克隆抗体，而框架区和恒定区来源于人氨基酸序列(参见例如美国专利No.5,091,513和6,881,557)。不受理论的限制，认为将抗体中啮齿动物特征性的氨基酸序列替换为人抗体中相应位置处存在的氨基酸序列将降低在治疗使用期间不良免疫反应的可能性。也可对杂交瘤或产生抗体的其他细胞进行遗传突变或其他改变，其可改变(或可以不改变)由杂交瘤产生的抗体的结合特异性。
用于在多种动物物种中产生多克隆抗体的方法以及用于产生多种类型(包括人源化、CAR和完全人)单克隆抗体的方法是本领域中公知的并且是高度可预测的。例如，以下美国专利和专利申请(其通过引用整体并入本文)提供了对这样的方法的可行描述：美国专利申请No.2004/0126828和2002/0172677；以及美国专利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253；5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434；和6,891,024。
本文中及其中引用的所有专利、专利申请出版物和其他出版物均在此通过引用并入本申请。
抗体可从任何动物来源包括鸟类和哺乳动物中产生。优选地，抗体是绵羊的、鼠(例如小鼠和大鼠)的、兔的、山羊的、豚鼠的、骆驼的、马的或鸡的。另外，更新的技术允许从人组合抗体文库中开发和筛选人抗体。例如，噬菌体抗体表达技术允许在不存在动物免疫接种的情况下产生特异性抗体，如美国专利No.6,946,546中所述。这些技术在以下中进一步描述：Marks(1992)；Stemmer(1994)；Gram et al.(1992)；Barbas et al.(1994)；和Schier et al.(1996)。
完全预期到的是针对OSMR的抗体将具有中和或抵消OSMR的作用的能力，而不管动物物种、单克隆细胞系或抗体的其他来源如何。某些动物物种对于产生治疗性抗体可能不太优选，因为它们可能更易于由于通过抗体的“Fc”部分激活补体系统而引起变应性应答。然而，完整抗体可被酶消化成“Fc”(补体结合)片段和具有结合结构域或CDR的抗体片段。去除Fc部分降低了抗原抗体片段将引发不期望的免疫应答的可能性，并因此，不具有Fc的抗体对于预防性或治疗性处理可以是优选的。如上所述，也可将抗体构建成嵌合的或者部分或完全人的，以降低或消除由于向动物施用已在其他物种中产生或具有来自其他物种的序列的抗体而引起的不良免疫结果。
替换变体通常包含蛋白质内一个或更多个位点处的一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，并且可被设计成在丧失或不丧失其他功能或特性的的情况下调节多肽的一种或更多种特性。替换可以是保守的，即一个氨基酸被一个形状和电荷相似的氨基酸替代。保守替换是本领域公知的，并且其包括例如：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。或者，替换可以是非保守的，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守的改变通常涉及将残基用化学上相异的残基替换，例如用极性或带电荷的氨基酸替换非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。
本公开内容的蛋白质(例如，单克隆抗体)可以是分离的(例如，富集和/或纯化至一定程度)和/或可以是体外重组或合成的。或者，非重组或重组蛋白质可从细菌分离。还预期的是，包含这样的变体的细菌可应用于组合物和方法中。因此，不需要分离蛋白质。
因此，本公开内容提供了与OSMR特异性结合的分离的或重组的单克隆抗体。在某些方面中，提供了与以下竞争结合OSMR的抗体：
B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，H11，H12，H13，H14，H15，或H16单克隆抗体(各自在本文中公开和描述)。在某些方面中，抗体可包含：
B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，，H11，H12，H13，H14，H15，或H16
单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区的全部或部分。
预期在组合物中，每ml具有约0.001mg至约10mg的总多肽、肽和/或蛋白质。因此，组合物中蛋白质的浓度可以为约、至少约或至多约
0.001，0.010，0.050，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0mg/ml或更多(或其中可推导出的任何范围)。其中，约、至少约或至多约
1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％可以是结合OSMR的抗体。
抗体或优选地抗体的免疫部分可与具有其他蛋白质的融合蛋白化学缀合或表达为具有其他蛋白质的融合蛋白。出于本说明书和所附权利要求书的目的，所有这样的融合蛋白均包括在抗体或抗体的免疫部分的定义中。
一些实施方案提供了针对OSMR、多肽和肽的与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物或载荷(payload)的抗体和抗体样分子。为了提高抗体分子作为诊断剂或治疗剂的效力，常规地与至少一种期望的分子或部分连接或共价结合或复合。这样的分子或部分可以是但不限于至少一种效应分子或报道分子。效应分子包含具有期望活性(例如细胞毒性活性)的分子。已与抗体连接的效应分子的一些非限制性实例包括毒素、治疗性酶、抗生素、放射性标记的核苷酸等。相比之下，报道分子被定义为可以使用测定进行检测的任何部分。已与抗体缀合的报道分子的一些非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒或配体(例如生物素)。
用于使抗体与其缀合部分连接或缀合的数种方法是本领域中已知的。一些连接方法涉及使用金属螯合复合物，其使用例如与抗体连接的有机螯合剂，例如二乙烯三胺五乙酸酐(diethylenetriaminepentaacetic acid anhydride，DTPA)；亚乙基三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲。单克隆抗体也可在存在偶联剂例如戊二醛或高碘酸盐的情况下与酶反应。具有荧光素标志物的缀合物在存在这些偶联剂的情况下或通过与异硫氰酸酯反应来制备。
嵌合抗原受体
如本文中使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂合蛋白或多肽，其包含与活化免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)的结构域或信号传导(例如，T细胞信号传导或T细胞活化结构域)相连的抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))。CAR能够利用单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制性方式将免疫细胞特异性和反应性重新导向选定的靶标。这种非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的免疫细胞以独立于加工识别抗原的能力，由此绕过肿瘤逃逸的机制。在另一个方面中，提供了包含如本文中所提供的抗原结合片段的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)蛋白。在另一个方面中，提供了编码如本文中所提供的CAR蛋白的分离的核酸。
在另一个方面中，包含如本文中所提供的分离的核酸的经改造细胞。在某些实施方案中，经改造细胞是T细胞、NK细胞或髓样细胞。在另一个方面中，本公开内容提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞。在一些实施方案中，CAR包含本文中所提供的抗原结合片段。在一些实施方案中，CAR蛋白从N端到C端包含：前导肽、抗OSMR重链可变结构域、接头结构域、抗OSMR轻链可变结构域、人IgG1-CH2-CH3结构域、间隔区、CD28跨膜结构域、抗OSMR胞内共刺激信号传导结构域和CD3胞内T细胞信号传导结构域。
在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体包含与本文中公开的任何一种OSMR特异性单克隆抗体的抗原结合结构域具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的抗原结合结构域。在某些实施方案中，经改造细胞表达与本文中公开的任何一种OSMR特异性单克隆抗体的抗原结合结构域具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，提供了在对象中治疗癌症或改善癌症的作用的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的如本文中所限定的抗体或其抗原结合片段。在癌症的治疗中，所述方法可降低或根除对象中的肿瘤负荷，可降低肿瘤细胞的数目，可降低肿瘤尺寸，可根除对象中的肿瘤。在一些实施方案中，所治疗的癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，免疫细胞可以经遗传改造以表达抗原受体，例如经改造T细胞受体(T cell receptor，TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。例如，宿主细胞(例如自体或同种异体T细胞)被修饰以表达对癌症抗原具有抗原特异性的TCR。在一些具体实施方案中，NK细胞被改造以表达TCR。NK细胞还可被改造以表达CAR。可以将多种CAR和/或TCR(例如针对不同的抗原的CAR和/或TCR)添加至单一细胞类型(例如T细胞或NK细胞)。
疾病的治疗
本发明实施方案的某些方面可用于预防或治疗与IL6/JAK/STAT信号传导相关的疾病或病症。由OSMR介导的信号传导可通过任何合适的药物来降低，以阻止癌细胞增殖。优选地，这样的物质将是抗OSMR抗体。
“治疗”及其变化形式是指出于获得疾病或健康相关病症的治疗益处的目的而向对象施用或应用治疗剂或者对对象进行程序或模式(modality)。例如，治疗可包括施用药学有效量的抑制OSMR信号传导的抗体。
“对象”和“患者”是指人或非人，例如灵长类、哺乳动物和脊椎动物。在一些具体实施方案中，对象是人。
本申请通篇使用的术语“治疗益处”或“治疗有效的”是指就药物治疗该病症而言促进或增强对象健康的任何情况。这包括但不限于降低疾病的体征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可涉及例如减小肿瘤尺寸、降低肿瘤侵袭性、降低癌症生长速率或阻止转移。癌症的治疗还可指延长患有癌症的对象的存活。
药物制剂
在进行包含抑制性抗体的治疗性组合物的临床应用的情况下，制备适合于预期应用的药物或治疗性组合物通常将是有益的。在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在另一些实施方案中，活性化合物可包含单位重量的约2％至约75％，或例如约25％至约60％，以及其中可推论出的任何范围。
本发明实施方案的治疗性组合物有利地以作为液体溶液剂或混悬剂的可注射组合物的形式施用；也可制备适合在注射之前溶解于或混悬于液体中的固体形式。这些制剂还可被乳化。
短语“可药用或药理学上可接受的”是指适当时当施用于动物(例如人)时不产生不利反应、变应性反应或其他不良(untoward)反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含抗体或另外的活性成分的药物组合物的制备对于本领域技术人员将是已知的。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解，制剂应符合FDA生物标准办公室(FDA Office ofBiological Standards)所要求的无菌性、致热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。
如本领域普通技术人员将已知的，如本文中使用的“可药用载体”包括任何和所有水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外载剂(例如氯化钠、林格(Ringer’s)右旋糖等))、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯(例如油酸乙酯))、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等张剂、吸收延迟剂、盐类、药物、药物稳定剂、凝胶剂、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、流体和营养补充剂、这样的类似材料，及其组合。根据公知的参数调节药物组合物中多种组分的pH和精确浓度。
术语“单位剂量”或“剂量”是指适合用于对象的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的治疗性组合物，所述预定量经计算产生与其施用(即，合适的途径和治疗方案)相关的以上讨论的期望响应。根据治疗数量和单位剂量二者，待施用的量取决于所期望的效果。施用于患者或对象的本发明实施方案的组合物的实际剂量可通过身体和生理因素例如以下来确定：对象的体重、年龄、健康状况和性别，被治疗疾病的类型，疾病渗透程度，先前或同时的治疗性干预，患者的特发病，施用途径，以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性。例如，剂量还可包含每次施用约1g/kg/体重至约1000mg/kg/体重(该这样的范围包括干预剂量)或更多，以及其中可推论出的任何范围。在从本文中所列数字可推论出的范围的一些非限制性实例中，可施用约5g/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5g/kg/体重至约500mg/kg/体重等的范围。在任何情况下，负责施用的从业者将确定组合物中活性成分的浓度和用于个体对象的合适剂量。
活性化合物可配制成用于肠胃外施用，例如配制成用于通过静脉内、肌内、皮下或甚至腹膜内途径注射。通常来说，这样的组合物可被制备为液体溶液剂或混悬剂；也可制备适合用于在注射之前在添加液体之后制备溶液剂或混悬剂的固体形式；并且制剂也可被乳化。
适合于可注射使用的药物形式包括：无菌水溶液剂或分散剂；包含芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌散剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须是达到其可容易地注射之程度的流体。其在制造和储存条件下也应该是稳定的，并且必须被保存以免受微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。
蛋白质性组合物可配制成中性或盐形式。可药用盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)以及与例如如盐酸或磷酸的无机酸或者例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成的。与游离羧基形成的盐也可来源于无机碱，例如如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等。
药物组合物可包含溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、以及植物油。适当的流动性可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的防止可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，其将优选地包含等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
组合治疗
在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及与第二或另外的治疗组合的针对OSMR以抑制其在癌细胞增殖中的活性的抗体或抗体片段。这样的治疗可应用于治疗与OSM介导的细胞增殖相关的任何疾病。例如，疾病可以是癌症。
包括组合治疗的方法和组合物增强了治疗或保护作用，和/或提高了另外的抗癌或抗过度增殖治疗的治疗作用。治疗性和预防性的方法和组合物可以以有效实现期望作用(例如杀伤癌细胞和/或抑制细胞过度增殖)的组合量提供。该过程可涉及使细胞与抗体或抗体片段和第二治疗二者接触。组织、肿瘤或细胞可与包含一种或更多种药剂(即抗体或抗体片段或抗癌剂)的一种或更多种组合物或一种或更多种药理制剂接触，或者通过使组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种不同的组合物或制剂接触，其中一种组合物提供1)抗体或抗体片段，2)抗癌剂，或3)抗体或抗体片段和抗癌剂二者。同样，预期了可将这样的组合治疗与化学治疗、放射治疗、手术治疗或免疫治疗结合使用。
当应用于细胞时，本文中使用的术语“接触”和“暴露”用于描述通过其治疗构建体和化学治疗剂或放射治疗剂被递送至靶细胞或被置于与靶细胞的直接临近处的方法。为了实现细胞杀伤，例如，将两种药剂以有效杀伤细胞或阻止其分裂的组合量递送至细胞。
抑制性抗体可以在相对于抗癌治疗之前、期间、之后或以多种组合来施用。施用可以以同时至数分钟至数天至数周的间隔进行。在将抗体或抗体片段与抗癌剂分开提供给患者的一些实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间相当长的一段时间内不会失效，以使得两种化合物将仍能够对患者发挥有利的组合作用。在这样的情况下，考虑在彼此相隔约12小时至24小时或72小时内，并且更特别地，在彼此相隔约6小时至12小时内可为患者提供抗体治疗和抗癌治疗。在一些情况下，可期望显著地延长治疗的时间段，其中在各施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
在某些实施方案中，治疗过程将持续1至90天或更长(该这样的范围包括间隔天数)。考虑可在第1天至第90天(该这样的范围包括间隔天数)或其任意组合的任一天给予一种药剂，并且在第1天至第90天(该这样的范围包括间隔天数)或其任意组合的任一天给予另一种药剂。在一天内(24小时期间)，可给予患者一次或多次药剂施用。此外，在治疗过程之后，考虑存在不施用抗癌治疗的时间段。该时间段可持续1至7天，和/或1至5周，和/或1至12个月或更长(该这样的范围包括间隔天数)，这取决于患者的状况，例如其预后、体力(strength)、健康等。预期治疗周期可根据需要进行重复。
可采用多种组合。对于以下的实例，抗体治疗是“A”，并且抗癌治疗是“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A。
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，向患者施用本发明实施方案的任何化合物或治疗将遵循用于施用这样的化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于组合治疗的毒性的步骤。
化学治疗
根据本发明实施方案可使用广泛多种的化学治疗剂。术语“化学治疗”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于意指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。通过这些药剂或药物在细胞内的活性模式(例如，它们是否影响细胞周期以及在什么阶段影响细胞周期)对其进行分类。或者，药剂可基于其直接交联DNA、嵌入到DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体畸变和有丝分裂畸变的能力来表征。例如，目前卵巢癌的化学治疗通常涉及以下的组合：卡铂(或顺铂)和紫杉烷例如紫杉醇或多西他赛(docetaxel)还添加了贝伐单抗(bevacizumab)/> 和聚ADP核糖聚合酶(poly ADP ribosepolymerase，PARP)抑制剂，例如但不限于尼拉帕尼(niraparib)/>卢卡帕尼(rucaparib)/>和奥拉帕尼(olaparib)/>化学治疗剂的另外的一些实例包括：烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱类(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；卡利抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类(nitrosurea)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γll和加利车霉素ωll)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；二膦酸盐类(bisphosphonate)，例如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authrarnycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfimromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifiuridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷；雄激素类，例如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯；抗肾上腺类，例如米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；埃博霉素类(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登素生物碱类(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物；雷佐生(razoxane)；根毒素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurinA)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛(docetaxel)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位复合物，例如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂；长春碱；铂类；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜膦酸(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylornithine，DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；卡铂、丙卡巴肼(procarbazine)、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨、诺维本(navelbine)、法呢基(famesyl)蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)；以及以上任一种的可药用盐、酸或衍生物。
放射治疗
导致DNA损伤并已广泛使用的其他因素包括通常被称为γ射线、X射线的那些和/或向肿瘤细胞定向递送放射性同位素。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束辐照(参见例如美国专利5,760,395和4,870,287)和U-辐照。最可能的是所有这些因素均对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损害。X射线的剂量范围为从50至200伦琴的日剂量持续延长的一段时间(3至4周)到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射的放射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
免疫治疗
技术人员将理解，另外的免疫治疗可与一些实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向并破坏癌细胞。利妥昔单抗(rituximab)就是这样的一个实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。抗体单独可用作治疗的效应物，或者其可募集其他细胞以实际影响细胞杀伤。抗体还可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并用作靶向剂。或者，效应物可以是携带与肿瘤细胞靶标直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。多种效应物细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
已经出现抗体-药物缀合物作为癌症治疗剂开发的突破性方法。癌症是世界上的首要死亡原因之一。抗体-药物缀合物(Antibody-drug conjugate，ADC)包含与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(mAb)。该方法将mAb针对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物组合，产生将载荷(药物)递送至具有丰富抗原水平的肿瘤细胞的“武装”mAb。药物的靶向递送还使其在正常组织中的暴露最小化，导致毒性降低和治疗指数提高。FDA对两种ADC药物的批准(2011年(维汀-布仑妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年/>(曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emtansine)或T-DM1))验证了该方法。目前存在超过30种ADC药物候选物处于癌症治疗临床试验的多个阶段中。随着抗体工程和接头载荷优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合于该方法和靶向mAb产生的新靶标的鉴定和验证。ADC靶标的两个标准是在肿瘤细胞中上调/高水平表达和稳健的内化。
在免疫治疗的一个方面中，肿瘤细胞必须携带适合于靶向的一些标志物，即不存在于大多数其他细胞上的标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些肿瘤标志物中的任一种可适合于在本发明实施方案的背景下靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、层黏连蛋白受体、erb B和pi 55。免疫治疗的一个替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激分子，其包括：细胞因子例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趋化因子例如MIP-1、MCP-1、IL-8；以及生长因子例如FLT3配体。
目前正在研究或应用的免疫治疗的一些实例是：免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169)；细胞因子治疗，例如干扰素、IL-1、GM-CSF和TNF；基因治疗，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(参见例如美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗pl85(参见例如美国专利5,824,311)。考虑一种或更多种抗癌治疗可与本文中所述的抗体治疗一起使用。
手术
约60％的患有癌症的人将经历一些类型的手术，其包括预防性、诊断性或阶段性、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中将全部或部分的癌性组织物理地去除、切除和/或破坏，并且可与其他治疗，例如本发明实施方案的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗联合使用。肿瘤切除术是指物理去除肿瘤的至少一部分。除了肿瘤切除术之外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制的手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。
在切除部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤之后，可在体内形成腔。治疗可通过灌注、直接注射或向该区域局部施加另外的抗癌治疗来完成。这样的治疗可例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周、或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月进行重复。这些治疗也可具有不同的剂量。
另一些药剂
考虑可将另外的药剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的治疗效力。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的上调的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、提高过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂，或其他生物药剂。通过提高GAP连接数来提高胞间信号传导将提高对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在另一些实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的抗过度增殖效力。考虑细胞黏附抑制剂以改善本发明实施方案的效力。细胞黏附抑制剂的一些实例是黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。还考虑了可将提高过度增殖细胞对凋亡的敏感性的另一些药剂(例如抗体c225)与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗效力。
药盒和诊断剂
在一些实施方案的多个方面中，设想药盒包含治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂。在一些实施方案中，本发明实施方案考虑了用于制备和/或施用一些实施方案的治疗的药盒。药盒可包含一个或更多个密封的小瓶，其包含本发明一些实施方案的任何药物组合物。药盒可包含例如至少一种抗OSMR抗体以及用于制备、配制和/或施用一些实施方案的组分或进行本发明方法的一个或更多个步骤的试剂。在一些实施方案中，药盒还可包含合适的容器，所述容器是将不与药盒的组分发生反应的容器，例如埃彭道夫(Eppendorf)管、测定板、注射器、瓶或管。容器可由可灭菌材料(例如塑料或玻璃)制成。
药盒还可包含说明书，其概述了本文中所述方法的程序性步骤，并将遵循与如本文中所述或本领域普通技术人员已知的基本上相同的程序。指令信息可在包含机器可读指令的计算机可读介质中，当使用计算机执行该机器可读指令时，导致显示递送药学有效量的治疗剂的真实或虚拟程序。
术语“分离的分子”(其中分子为例如多肽、多核苷酸或抗体)是这样的分子：由于其起源或来源，(1)不与其天然状态下与其伴随的天然缔合组分缔合，(2)基本上不含来自同一物种的其他分子，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成的或在与其天然来源于的细胞不同的细胞系统中表达的分子将与其天然缔合组分“分离”。也可通过使用本领域公知的纯化技术进行分离来使分子基本上不含天然缔合组分。可通过许多本领域公知的手段来测定分子纯度或均匀性。例如，可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶染色来测定多肽样品的纯度以使用本领域公知的技术来使多肽显现。出于某些目的，可通过使用HPLC或本领域公知的用于纯化的其他手段来提供较高的分辨率。
术语“表位”是指能够在抗体分子的一个或更多个抗原结合区处被抗体分子或其抗原结合部分识别和结合的分子部分。表位可以由一级、二级或三级蛋白质结构的限定区域组成，并包含由抗体的抗原结合区或其抗原结合部分识别的靶标的二级结构单元或结构结构域的组合。表位同样可由分子的限定化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，并具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。如本文中使用的术语“抗原表位”被定义为可与抗体分子特异性结合的多肽的一部分，如通过本领域公知的任何方法，例如通过常规免疫测定、抗体竞争性结合测定或者通过x-射线晶体学或相关结构确定方法(例如NMR)来确定的。
术语“结合亲和力”或“KD”是指特定抗原-抗体相互作用的解离速率。KD是解离速率(也称为“分离速率(off-rate)(koff)”)与缔合速率(或“结合速率(on-rate)(kon)”)的比率。因此，KD等于koff/kon，并且表示为摩尔浓度(M)。由此可见，KD越小，结合的亲和力越强。因此，与1nM的KD相比，1M的KD指示弱结合亲和力。抗体的KD值可使用本领域中已建立的方法来确定。一种用于确定抗体KD的方法是通过使用表面等离子体共振(surface plasmonresonance，SPR)，通常使用生物传感器系统，例如Biacore.RTM.系统。
术语“效力”是生物活性的量度，并且可被指定为IC50，或与抗原OSMR缀合的抗体或抗体药物抑制如本文中所述的OSMR活性测定中测得的活性之50％的有效浓度。
如本文中使用的短语“有效量”或“治疗有效量”是指实现期望治疗结果所必需的量(在剂量以及施用时间段和施用手段下)。有效量至少是赋予对象治疗益处所必需的活性剂的最小量，但小于毒性量。
如本文中使用的术语“抑制”或“中和”就本发明的抗体分子的生物活性而言意指抗体基本上拮抗、禁止、阻止、抑制、减缓、破坏、消除、停止、降低或逆转例如被抑制的那些(包括但不限于抗体分子与OSMR的生物活性或结合相互作用)的进展或严重程度的能力。
“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是用于并入多核苷酸插入物的载体的接受者。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，并且由于天然的、意外的或故意的突变，后代可以不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组DNA互补物中)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。
如本文中使用的“载体”意指能够在宿主细胞中递送并且优选地表达一种或更多种目的基因或目的序列的构建体。载体的一些实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、黏粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体、以及某些真核细胞例如生产细胞(producer cell)。
除非另外指出，否则如本文中使用的术语“治疗”意指逆转、减轻、抑制这样的术语所应用的疾病或病症或者这样的疾病或病症的一种或更多种症状的进展、延缓其进展、延缓其发作，或者预防其。除非另外指出，否则如本文中使用的术语“治疗”是指如上所限定的治疗行为。术语“治疗”还包括对象的辅助和新辅助治疗。为了避免疑问，本文中提及“治疗”包括提及治愈性、姑息性和预防性治疗。为了避免疑问，本文中提及“治疗”还包括提及治愈性、姑息性和预防性治疗。
应当理解，无论本文中在何处使用语言“包括/包含”描述实施方案，还提供了根据“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他情况下的类似实施方案。
在根据马库什组(Markush group)或其他替代分组描述本发明的一些方面或一些实施方案的情况下，本发明不仅涵盖作为整体列出的整个组，还单独涵盖该组的每个成员和主组的所有可能子组，还涵盖缺少一个或更多个组成员的主组。本发明还设想明确排除在所要求保护的本发明中的任何组成员中的一个或更多个。
除非另有定义，否则如本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。在整个说明书和权利要求书中，词语“包含/包括”或其变化形式将被理解为意味着包括所陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数形式，并且复数术语应包括单数形式。术语“例如(e.g.)”或“例如(for example)”之后的任何实例并不意味着是详尽的或限制性的。
除非另外指出，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域的技术之内。
本发明通过以下实施例进行举例说明。应当理解，具体实施例、物质、量和操作应根据如本文中所阐述的本发明的范围和精神来广义地解释。
实施例
包括以下实施例以说明本发明的某些实施方案。
实验操作和方法
除非另有说明，否则从下文中所述实验和实施例产生的数据可见于(“OncostatinM Receptor-Targeted Antibodies SupressSTAT3 Signaling and Inhibit OvarianCancer Growth”,Geethadevi et al.,2021,Cancer Res.,81:5336-52；其通过引用整体并入本文)。
患者和组织样品：卵巢癌组织和正常卵巢组织样品获自威斯康星医学院弗罗德特医院(Froedtert Hospital,Medical College of Wisconsin)的癌症中心和妇产科(Cancer Center and Department of Obstetrics&Gynecology)。所有人样品都是在威斯康星医学院机构审查委员会(Institutional Review Board，IRB)批准之后，在知情同意的情况下从患者中收集的。
表1.TMA组群的患者特征。
TMA数据集特征 总结
卵巢癌患者 N＝110
年龄 48.27±1.31岁
性别 女性
肿瘤组织病理学图像系列的数目 N＝110
组织病理学图像核心的数目 N＝150
NAT核心的数目 N＝20
正常卵巢组织核心的数目 N＝10
转移性组织核心的数目 N＝10(8％)
边缘组织核心的数目 N＝7(5.6％)
良性组织核心的数目 N＝18(14.4％)
等级
1级 N＝6(5.45％)
2级 N＝23(21％)
1级至2级 N＝3(2.72％)
3级 N＝20(18.18％)
4级 N＝0
不可分级 N＝58(52.72％)
高级别浆液性卵巢癌 N＝23(20.9％)
低级别浆液性卵巢癌 N＝4(3.64％)
阶段
I期 N＝29(26.36％)
II期 N＝26(23.64％)
III期 N＝24(21.82％)
细胞系：人卵巢癌细胞HEYA8购自MD Anderson癌症中心，Houston，TX，USA的表征细胞系储库(Characterized Cell Line repository)。OVCAR4、OVCAR5、OVCAR8和CaOV3购自国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)。NIH-OVCAR3和SKOV3购自ATCC/PBCF储库。THP1细胞系购自ATCC。MCAS细胞系接收自MD Anderson癌症中心，Houston，Texas，USA的Gordon Mills。FTE187和FTE188由Dr.Jinsong Liu(MD Anderson癌症中心，Houston，TX)友情提供。PEO1和PEO4由西北大学(Northwestern University)，Chicago，Illinois，USA的Daniela E Matei友情提供。HEK293-FT细胞系购自Thermo FisherScientific。未转化的成纤维细胞系(GM15859)购自Cornell医学研究所(CornellInstitute for Medical Research)，NJ，USA。RF24接收自Dr.Arjan W.Griffioen，VU大学医学中心(VU University Medical Center)，Amsterdam，Netherlands。卵巢表面上皮细胞(ovarian surface epithelial cell，OSE)是通过刮擦(scraping)从两名患有良性妇科病理状况的患者获得的正常卵巢组织的表面上皮而进行培养的。所有细胞系均在Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)(Sigma Aldrich)中培养。FTE187和FTE188在1:1的MCDB 105和培养基199(Thermo Scientific)中培养。NIHOVCAR3在含有HEPES的RPMI-1640培养基(ATCC)中培养。IOSE细胞在培养基199/MCDB 105(1:1，Sigma)中培养，所述培养基补充有15％ FBS、1％pen-strep、10ng/mL人表皮生长因子(Peprotech，NJ)、0.5g/mL氢化可的松(Sigma)、5g/mL牛胰岛素(Sigma)、34g蛋白质/mL牛垂体提取物(Life Technologies)(Barger et al.,2015)。OSE细胞在补充有15％ FBS的MEBM培养基(Lonza,Basel,Switzerland)中培养。成纤维细胞在含有Earle盐和非必需氨基酸和10％灭活FBS的Eagle最小必需培养基中培养。巨噬细胞在含有HEPES和2-巯基乙醇(0.05mM)的RPMI-1640培养基中培养。所有细胞系均在10％胎牛血清(AtlantaBiologicals,GA,USA)、或所提及的并且补充有1％ Pen-strep(Thermo FisherScientific Inc.,Waltham,MA,USA)的其他中如前所述(Parashar and Geethadevi et al2019)在37℃下在含有5％ CO2的湿润培养箱中培养。细胞系通过短串联重复序列(shorttandem repeat，STR)谱(IDEXX BioAnalytics)进行认证，并使用MycoSensor PCR检测试剂盒(Agilent,Santa Clara,CA)进行支原体检测。
单细胞/细胞核RNA-seq分析：在本研究中分析了来自单细胞/细胞核RNA-seq数据的总共17个人卵巢癌样品。数据集OvD1-10x、OvD2-10x和OvD3-10x-nuc是单一患者卵巢癌样品。前两个数据集是10x基于微滴的单细胞RNA-seq(scRNA-seq)，并且第三个是10x基于微滴的单细胞核RNA-seq(snRNA-seq)数据。这些是从(Izar et al.,2020)获得的，其中GEO登录号GSE140819(分别为GSM4186985、GSM4186986和GSM4186987)。使用h5格式的原始计数矩阵及其在元数据文件中的相应细胞注释用于分析。数据集OvD4-10x-mult和OvD5-SS2分别是n＝6(但为在多个时间取样下的8个样品)和n＝9的多患者卵巢癌样品。但一名患者在OvD4-10x-mult和OvD5-SS2数据集中是共用的。第一个数据集是10x基于微滴的scRNA-seq，并且第二个是基于板的高深度SMART-seq2(SS2)scRNA-seq。log-tpm归一化数据和注释是从(Slyper et al.,2020)获得的，其中GEO登录号GSE146026。
使用Seurat v2.4来分析数据集(Butler et al.,2018；Stuart et al.,2019)。对于OvD1、OvD2和OvD3数据集，仅考虑细胞注释元数据文件中存在的细胞和至少3个细胞中存在的基因。使用‘LogNormalize’和比例因子1e4对数据进行归一化。‘ScaleData’通过回归UMI计数和检测到的线粒体基因百分比来进行。OvD4和OvD5是log-tpm归一化数据集，并且没有进行进一步归一化。‘ScaleData’是使用默认参数来进行的。对于所有数据集，其余步骤都是相似的。进行‘FindVariableGenes’以检测约2000个高度可变的基因。“RunPCA”步骤使用默认参数，并且“PCElbowPlot”用于检测“FindClusters”和“RunUMAP”的大量PCA维度。从文献和带有“wilcox”检验和其他默认参数的“FindAllMarkers”命令中确定细胞类型特异性标志物。使用Seurat中可用的可视化方法和ggplot2 R包中的自定义代码来生成图形。
配体-受体相互作用分析：CellPhoneDB(Efremova et al.,2020)是配体与受体之间相互作用以及分子亚单位结构信息的精选储库。这些细节被整合到统计框架中，以推断单细胞转录组数据中的细胞-细胞通信网络。使用CellPhoneDB v.2.0.0，并遵循推荐的用于准备输入文件的程序(Efremova et al.,2020)。简言之，对数归一化的基因表达数据和细胞类型特征(cell type identities)的元数据(先前使用聚类和细胞类型特异性标志物获得)被用作输入。然后使用带有默认参数的‘cellphonedb method statistical_analysis’命令来确定配体-受体相互作用。使用ggplot2 R包来使相互作用可视化。
抗体：用于Western印迹的OSMRβ抗体(Santa Cruz Biotechnologies,#sc-271695)(1:700稀释)。用于IHC的OSMR抗体(Proteintech，#10982-1-AP)(1:50稀释)。用于IHC的OSM抗体(Proteintech，#27792-1-AP)(1:50稀释)。用于Western印迹的STAT3(磷酸Y705)抗体(Cell Signaling，#9145)(1:1000稀释)。用于Western印迹的STAT3(磷酸S727)抗体(Cell Signaling Technology，#9134)(1:1000稀释)。用于Western印迹的STAT3抗体(Cell Signaling Technology，#9139)(1:1,000稀释)。用于Western印迹的LIFR抗体(R&DSystems，#AF-249-NA)(1:5000稀释)。用于Western印迹的IL31抗体(Invitrogen，ThermoScientific，#PA5-47391)(1:5000稀释)。用于Western印迹的IL6ST/gp130抗体(SantaCruz Biotechnologies，#sc-376280)(1:500稀释)。用于Western印迹的PCNA抗体(SantaCruz Biotechnologies，#sc-25280)(1:1,000稀释)。用于Western印迹的BCLxL抗体(CellSignaling Technology，#2764)(1:1,000稀释)。用于Western印迹的BCL2抗体(CellSignaling Technology，#15071)(1:1,000稀释)。用于Western印迹的细胞色素c抗体(CellSignaling Technology，#11940)(1:1,000稀释)。用于Western印迹的P27抗体(CellSignaling Technology，#3686)(1:1,000稀释)。用于Western印迹的β-肌动蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnologies，#sc-8432)(1:1,000稀释)。
siRNA，慢病毒包装和HEYA8细胞转导：两个靶向人OSMR编码区的非重叠siRNA，IL6R、CNTFR、IL27RA和IL11RA的各一个siRNA，以及非特异性si对照购自Sigma Aldrich(Lafayette,CO)；以及LIFR、IL6ST和IL31RA的siRNA购自Ambion(Life Technologies)。使用RNAiMAX(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据制造商的指南，将SiRNA引入到细胞中。siRNA的序列在表2中示出。
表2.siRNA序列。
基因 序列
OSMR siRNA#1：5’-GUA ACU GCA UUC AAC UUG A-3’(SEQ ID NO：235)
OSMR siRNA#2：5’-CCA GAU CAG UAG GAU UGA A-3’(SEQ ID NO：236)
IL6ST 5’-CCU CAU GCA CUG UUG AUU A-3’(SEQ ID NO：237)
LIFR 5’-CCA CCU UCC AAA AUA GCG A-3’(SEQ ID NO：238)
IL31RA 5’-CAA UGA ACA CUA ACC A-3’(SEQ ID NO：239)
IL6R 5’-CCA GUA GUG UCG GGA GCA A-3’(SEQ ID NO：240)
CNTFR 5’-GCC ACA AUG CCA CAG CUA U-3’(SEQ ID NO：241)
IL27RA 5’-GAG UUG GAC CCU UGG GCG A-3’(SEQ ID NO：242)
IL11RA 5’-CUG AGU UCU GGA GCC AGU A-3’(SEQ ID NO：243)
为了建立稳定的细胞系，靶向人OSMR编码区的两个非重叠的pLKO.1-shOSMR表达质粒
(pLKO.1-puro-shOSMR#1 TRCN0000058687，克隆ID：NM_003999.1-2459s1c1，5’CCGGGCATTGATTGTGGACAACCTACTCGAGTAGGTTGTCCACAATCAATGCTTTITG3’(SEQID NO：244)和/>pLKO.1-puro-shOSMR#2：TRCN0000289933克隆ID：NM_003999.1-2857s21c1，5’CCGGCGAGTTGACTAAGCCTAACTACTCGAGTAGTTAGGCTTAGTCAACTCGTTTTTG-3’)(SEQ ID NO：245)
和人pLKO.1-puro空载体对照质粒(目录号SHC001V)购自SigmaAldrich(Saint Louis，MO)。为了产生慢病毒颗粒，使用Lipofectamine 2000将pLKO.1-shOSMR表达质粒和pLKO.1-对照质粒与三种慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG(Addgene)共转染到HEK293-FT细胞系(Thermo Scientific，Inc.)中。在转染之后48小时收集有能力的慢病毒。为了产生稳定的OSMR敲低细胞，将包含shOSMR的滴定的慢病毒颗粒转导到传代至60％至70％汇合的HEYA8-Luc+细胞中，并使用嘌呤霉素(最终浓度＝8g/mL)和聚凝胺(8μg/mL)一起选择感染的细胞。使用OSMR抗体通过Western印迹检查每个shOSMR的转导效率。使用最有效的shRNA构建体用于产生OSMR敲低稳定细胞系，其通过用嘌呤霉素(8g/ml；持续超过2周)来选择。为了结果的一致性，每两个月用嘌呤霉素对有效的shHeya8-Luc+细胞系进行选择。
OSMR过表达质粒制备：为了建立稳定的过表达细胞系，靶向人OSMR编码区的pUNO1-OSMR(#puno1-hosmr)载体和非特异性对照pUNO1-对照(#puno1-mcs)载体购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)。使用Lipofectamine 2000将过表达pUNO1-OSMR和pUNO1-对照质粒转染在HEYA8-Luc+和OVCAR5细胞系中，并且使用杀稻瘟素(Blasticidin)(最终浓度＝10μg/mL)来选择转染的克隆。使所选择的OSMR过表达克隆经受Western印迹分析以检查效率。
实施例1-特异性抗体的产生、筛选和纯化。
噬菌体文库淘选针对OSMR的抗体：使用了OSMR蛋白(Sino Biologicals，11226-H08H)用于通过淘选大的人scFv噬菌体展示抗体文库进行抗体选择。文库是根据从多个供体的PBMC和扁桃体中提取的cDNA内部构建的。在每轮噬菌体淘选中，将50μg蛋白质包被在MaxiSorp免疫管上，并通过8％的乳封闭。将噬菌体通过8％的乳预封闭，然后与预包被在免疫管上的抗原一起孵育。在用PBST和PBS洗涤之后，将噬菌体通过三乙胺(triethylamine，TEA)洗脱。对洗脱物进行滴定并感染大肠杆菌TG1用于噬菌体扩增以用于下一轮淘选。在具有提高的洗涤严格性的第2轮淘选中进行类似的操作。在2轮淘选之后，将噬菌体洗脱物用于感染大肠杆菌TG1以生长单菌落以用于通过QPix420系统(Molecule Devices)进行挑选和用于噬菌体制备。
噬菌体ELISA：通过夹心ELISA进行特异性抗体前导物的筛选。挑取总共1504个单菌落以制备用于与OSMR进行ELISA结合的噬菌体。将ELISA板用在PBS中的1μg/mL的OSMR抗原进行包被，在4℃下过夜。在37℃下将板用5％的乳封闭2小时，并在室温下将噬菌体用5％的乳预封闭1小时。在封闭之后，将噬菌体添加到ELISA板的孔中，并在37℃下孵育2小时。将HRP缀合的小鼠抗M13二抗以1:1000稀释在5％的乳中并添加到孔中，用于在37℃下孵育1小时。将板在每个孵育步骤之间洗涤3次，并在显色之前洗涤5次。将TMB底物添加到孔(100μl/孔)中用于显色5分钟。使用H2SO4来终止反应。
IgG表达和纯化：对噬菌体ELISA中呈阳性的总共500个噬菌体克隆的scFv区进行了测序。在分析互补决定区(CDR)之后，获得了35个具有独特氨基酸序列的scFv，并使其进一步经受转化为完整的IgG1重链和轻链构建体。根据制造商的说明，将这些构建体共转染Expi293细胞以用于表达重组抗体。在7天之后，通过亲和色谱使用蛋白A树脂将抗体纯化。产生了总共26个抗体用于进一步的实验。
用BLI进行亲和力测量：为了进行抗体亲和力测量，将抗体(20μg/mL)加载到蛋白G生物传感器上持续150秒。在动力学缓冲液的短基线之后，将加载的生物传感器暴露于一系列重组OSMR浓度(0.41nM至900nM)，并使用背景减除来校正传感器漂移。所有实验均在1,000rpm下在摇动下进行。从仅加载有抗体的参考生物传感器测量背景波长移动。使用ForteBio的数据分析软件将数据拟合至1:1结合模型，以得到缔合速率和解离速率。使用koff/kon比率来计算Kd。
实施例2-用单克隆抗体治疗癌症
动物研究：所有动物工作均根据由威斯康星医学院的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准的方案进行。为了比较OSM、LIF和IL31对卵巢癌生长的能力，将HEYA8-Luc+细胞用载剂/PBS、OSM(100ng/mL)、LIF(100ng/mL)和IL31(50ng/mL)体外处理24小时，并皮下(subcutaneously，s.c)注射(1×105个细胞/动物)到4至6周龄的无胸腺雌性裸鼠(Nu/Nu)(Envigo，Madison，WI，USA)的每胁侧。将小鼠用载剂/PBS、OSM(250ng/kg b.w)、LIF(250ng/kg b.w)和IL31(250ng/kg b.w)每周两次进行腹膜内(intraperitoneally，i.p)处理，持续总共5周。每周一次使用游标卡尺测量可触及的肿瘤。在终点切除肿瘤，将其称重并进行Western印迹分析。通过公式V＝(W(2)×L)/2计算肿瘤体积。
为了研究稳定敲低OSMR对卵巢癌肿瘤进展的作用，将shOSMR#1-Heya8-Luc+细胞(3×104个细胞/动物)和sh对照-HEYA8-Luc+细胞用27号针腹膜内注射到4至6周龄的无胸腺雌性裸鼠(Nu/Nu)(Envigo，Madison，WI，USA)(N＝7/组)中。使用Xenogen IVIS100成像系统(Caliper Life Sciences Inc，Waltham，MA)通过生物发光成像每周一次监测小鼠的肿瘤生长。所有小鼠在5周结束时或濒死时被安乐死。收获肿瘤并称重，使用IVIS100对肿瘤结节和转移至远端器官的总数目进行计数并成像。将肿瘤切除，并随后进行IHC、Western印迹和qPCR。从两组中收集血清用于OSM ELISA。
为了测试抗OSMR抗体的体内效力和处理之后的总存活效率，将Heya8-Luc+细胞(3×104个细胞/动物)用27号针腹膜内注射到4至6周龄的无胸腺雌性裸鼠(Nu/Nu)(Envigo，Madison，WI，USA)中。通过生物发光成像IVIS100监测小鼠的肿瘤生长，并在注射后7天之后，将小鼠随机分成每组7只小鼠(效力测试)和每组10只小鼠(存活研究)。将小鼠用对照IgG每周两次腹膜内处理。
在有或没有OSM(250ng/kg b.w)的情况下每周两次B14 mAb或B21mAb，持续五周。所有抗体克隆均以10mg/kg b.w的浓度每周两次地给予，持续5周。所有小鼠在5周结束时或濒死时被安乐死。收获肿瘤并称重，使用IVIS100对肿瘤结节和转移至远端器官的总数目进行计数并成像。将肿瘤切除并进行IHC、Western印迹和qPCR。对于存活研究，在5周之后停止处理，并且对存活进展进行监测持续总共100天。
迁移和侵袭测定：通过如先前所述(Jagadish et al.,2015)进行细胞迁移和侵袭测定来分析稳定OSMR过表达或敲低的作用。将悬浮在无血清培养基中的HEYA8细胞(1×105)接种到1mg/mL经基质胶包被的(侵袭)或未包被的(迁移)细胞培养插入物(8-μm；Millipore,Billerica,MA)中。将含有10％ FBS的培养基添加至下室。在存在细胞周期抑制剂丝裂霉素C(5μg/ml)的情况下，在trans-well室中分别进行12小时或16小时的迁移和侵袭测定。使用棉签将细胞从上室中去除。将侵袭或迁移的细胞通过5％戊二醛固定，并且以20％甲醇中的0.5％结晶紫染色并拍照。然后将膜移出并溶解在10％乙酸中，并在微板读取仪中在560nm处进行定量。
肿瘤细胞的三维(3-D)培养：如先前所述(Parashar et al.,2019)将肿瘤细胞培养为3-D球状体。将细胞收获，计数并接种到超低附着24孔培养板(Corning Life Science，目录号3261)上，并悬浮在1:1ClonaCell培养基:DMEM中。根据需要，所接种的细胞和所形成的球状体在完全培养基中培养多至两周。除非特别说明，否则每两天补充培养基。
集落形成测定：集落形成测定如先前所述(Jagadish et al.,2016)并在有一些修改的情况下进行。简言之，在处理之前24小时，将细胞以每孔400个细胞接种到含有完全生长培养基的六孔板中，并培养10天。在第十天，将集落用5％戊二醛固定并用20％甲醇中的0.5％结晶紫染色。将包含集落的板用水洗涤并干燥，随后进行成像。将集落用10％乙酸溶解并通过读取560nm处的吸光度进行定量。
CCK8细胞生存力测定：将一千个细胞接种到96孔板的每个孔中。在处理48小时之后，根据制造商的指南，将细胞用PBS洗涤并与CCK8试剂在37℃下在5％ CO2培养箱中一起孵育4小时。在460nm处测量吸光度。
伤口愈合测定：伤口愈合测定如先前所述(Kanojia et al.,2013)并在有一些修改的情况下进行。简言之，将细胞接种在6孔板上并在相应处理之后生长至汇合。随后，用移液管尖端轻轻刮擦单层以产生机械伤口。在至少32小时时获取三至五个选定视野的相衬图像。使用Image J软件分析图像。
使用活细胞Incucyte分析仪进行细胞生存力测定和受体内化：使用活细胞成像系统(Essen BioScience,Ann Arbor,MI)Romano et al,2018)用于评估增殖。简言之，将3×103个有生存力的HEYA8细胞以四个重复接种在含有完全培养基的96孔板(TPP)中。在血清饥饿之后，在有或没有抗OSMR抗体(10μg/mL)的情况下用对照IgG(10μg/mL)或OSM(100ng/mL)刺激来处理细胞，并与经1:200稀释的/>Annexin V红色凋亡试剂(Essen Bioscience)一起孵育48小时的时间。使用IncuCyte通过每6小时每孔拍摄3张视野图像来实时测量细胞生存力。使用/>S3软件进行掩蔽。使用/>Base软件分析界面模块(Essen Bioscience)进行基于红色凋亡细胞数目的红细胞计数。
对于受体内化，将抗OSMR抗体B14和B21(各10μg/mL)用pH敏感的FabFluor(红色)试剂(Essen Bioscience)按照制造商的说明进行标记，并在存在OSM(100ng/mL)的情况下添加至血清饥饿的卵巢癌细胞。也将细胞在存在和不存在重组OSM(100ng/mL)的情况下用同种型对照IgG(10μg/mL)处理。然后将细胞在IncuCyte活细胞分析系统中监测24小时。用FabFluor红色试剂标记的抗体在中性pH(细胞外)下是非荧光的。在适当的时间，如果抗体-受体复合物被内化，则由于内体和溶酶体区室的酸性pH，用pH敏感染料标记的抗体在胞质内以簇的形式发红色荧光，然后使用S3软件对其进行分析。
Western印迹分析和蛋白质阵列：如先前所述(Parashar et al)，将细胞在冰冷的PBS中洗涤两次，并在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Aldrich)的RIPA缓冲液(150mMNaCl，0.1％ SDS，1％ NP-40，1％脱氧胆酸钠)(Santa Cruz Biotechnologies)中裂解。使用BCA试剂盒(Thermo Fisher Scientific)确定总蛋白质浓度，并且将30μg蛋白通过预制(pre-cast)4％至12％ SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上。在通过5％脱脂乳(Bio-Rad，Hercules，CA)封闭之后，将膜与指定的一抗和相应的HRP缀合的二抗(Cell Signaling Technology)在4℃下孵育过夜。使用化学发光检测试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)检测免疫反应性信号。
根据制造商说明，使用Proteome Profiler人凋亡阵列试剂盒(目录号ARY009；R&DSystems)来分析凋亡相关蛋白谱并且使用人磷酸激酶抗体阵列试剂盒(目录号ARY003B；R&D Systems)来分析被OSM磷酸化的蛋白质或由抗OSMR抗体对磷酸化的抑制。简言之，在存在OSM的情况下用对照IgG、OSM(10g/mL)和抗OSMR抗体B14和B21(各10μg/mL)处理24小时(蛋白激酶阵列)和48小时(凋亡阵列)之后，从OVCAR4细胞中分离的总蛋白质首先与阵列膜一起在4℃下孵育过夜，随后与生物素化检测抗体混合物一起在室温下孵育1小时。然后将膜暴露于X射线胶片并通过Image J软件(National Institutes of Health,Bethesda,USA)进行定量。
二聚化测定：二聚化测定如先前所述(Bublil et al.,2010；Turk and Chapkin,2015)并在有一些修改的情况下进行。将HEYA8和OVCAR4细胞接种过夜并在70％至80％汇合时，血清饥饿过夜并用对照IgG、B14和B21 mAb预处理4小时，然后在存在OSM(100ng/mL)的情况下在冰上刺激60分钟以阻止二聚化受体的内化。将细胞裂解物与非可透过性交联剂、3mM双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸盐[BS3(Pierce)]、交联剂在冰上孵育30分钟，并随后用250mM甘氨酸猝灭。将细胞用冰冷的PBS洗涤，并将细胞使用如先前所述的RIPA缓冲液裂解。将预澄清的裂解物使用与Dynabead(Thermo Fisher Scientific)结合的抗OSMR抗体在4℃下免疫沉淀过夜，并使用1×Laemmli样品缓冲液洗脱，并在6％ SDS/PAGE上分离蛋白质。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上并用OSMR、IL6ST或IL31RA抗体进行免疫印迹。
受体内化：受体内化如先前所述(Phuchareon et al.,2015)并在有一些修改的情况下进行。简言之，将细胞接种在100mm培养皿中，并且一旦黏附，则将细胞在无血清的情况下培养16小时，并用对照IgG和抗OSMR抗体(各10μg/mL)以及OSM(100ng/mL)处理6小时。将细胞用冰冷的PBS洗涤，并使用Mem-PERTM Plus膜蛋白提取试剂盒(Thermo FisherScientific)根据制造商的指南将膜和胞质蛋白级分分离。使用BCA试剂盒来确定各级分中的蛋白质浓度，并且通过8％ SDS-PAGE对来自各级分的30μg蛋白质裂解物进行分离。
细胞上Western测定：将细胞以每孔5×104个细胞的密度接种在96孔(黑色板)上。在血清饥饿之后，将细胞用B14和B21抗体(各10μg/mL)以及OSM(100ng/mL)处理。还将细胞在有和没有OSM(100ng/mL)的情况下用同种型对照IgG(各10μg/mL)处理16小时，并且用冰冷的PBS洗涤并用4％多聚甲醛固定。将细胞在LICOR封闭缓冲液中封闭1小时，并与针对OSMR胞外结构域的一抗(1:100稀释，目录：11226-RP02Sino Biologicals，Wayne，PA)以及Na+K+ATP酶(Santa Cruz Biotechnologies)一起在4℃下孵育过夜。将细胞进一步用PBS洗涤并与二抗680RD驴抗兔(红色)(1:800稀释)和/>800CW山羊抗小鼠IgG(绿色)(1:200稀释)(LI-COR,Lincoln,Nebraska)一起孵育1小时并在Odyssey扫描仪(LI-COR)上显影。使用Li-Cor image studio软件对荧光强度进行定量。
细胞因子ELISA：血清中的OSM水平通过人OSM ELISA试剂盒(R&D systems)根据制造商的指南并如先前所述(Parashar et al.,2019)来确定。从荷瘤小鼠中收集血液并使其在室温下凝结30分钟，然后在4℃下以16,000×g离心10分钟并抽吸出血清。简言之，将抗人OSM抗体预包被在微孔上。使样品或标准品中存在的人OSM与吸附至微孔的抗体结合。在孵育之后，将未结合的生物组分在洗涤步骤期间去除。添加生物素缀合的抗人OSM抗体并使其与由第一抗体捕获的人OSM结合。在孵育之后，将未结合的生物素缀合的抗人OSM抗体在洗涤步骤期间去除。添加链霉亲和素HRP并使其与生物素缀合的抗人OSM抗体结合。形成的有色产物与样品或标准品中存在的人OSM的量成比例。通过添加酸来终止反应并在450nm处测量吸光度。
组织微阵列(tissue microarray，TMA)和免疫组织化学：由5μm的来自卵巢癌患者的组织切片、正常卵巢组织切片和正常邻近卵巢组织切片组成的经福尔马林固定经石蜡包埋(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded，FFPE)组织阵列核心(OV1005bt和OV1004)购自USBiomax Inc(Rockville,MD)。针对来自荷瘤小鼠的组织切片中的蛋白质表达，将组织在福尔马林罐中固定过夜并对切片进行石蜡包埋。使用苏木精和伊红(hematoxylin andeosin，H&E)染色对来自所有处理组的组织进行复染。
TMA如先前所述(Chen et al.,2020)进行。简言之，将切片通过分级醇进行脱蜡和再水化。将切片在3％ H2O2中孵育以降低内源性过氧化物酶活性，并使用抗原提取缓冲液(IHC World，Woodstock，MD)进行抗原提取60分钟。将切片在山羊血清中封闭。用一抗(1:60稀释的OSMR和OSM，1:100稀释的Ki67、pSTAT3和经切割的胱天蛋白酶3)在4℃下进行孵育过夜，随后用AP缀合的二抗(Vector Labs)在室温下孵育1小时。使用Vectastain ABC-AP试剂盒(Vector Labs，Burlingame，CA)和载体红色碱性磷酸酶底物试剂盒I(Vector Labs，Burlingame，CA)根据制造商的方案进行染色。蛋白质表达通过IHC评分(0至5)表示，每个切片的IHC评分是通过将阳性细胞(强红色染色)百分比的评分(0≤5％，1＝6％至20％，2＝21％至40％，以及3＝41％至60％，4＝61％至80％，5＝81％至100％)和强度评分：0(负)、1(弱)、2至3(中度)和3.1至4(高)和4.1至5(极高)相加来计算的。
实时PCR和基于qPCR的阵列分析：使用TRIzol试剂(Life Technologies，Carlsbad，CA)提取总RNA并在Nanodrop 2000(Thermo Scientific)上对其进行定量。使用用于RT-qPCR的iScript逆转录Supermix(Bio-Rad)对1微克的总RNA进行逆转录。使用Bio-Rad CFX连接实时PCR系统(Bio-Rad)用iTaq通用型SYBR Green Supermix(Bio-Rad)根据制造商的说明进行实时PCR。使用ΔΔCT方法来确定mRNA的丰度(其中Cq是阈值循环)。mRNA表达相对于β-肌动蛋白(ACTB)mRNA归一化。所使用引物的序列在表3中示出。
表3.qPCR引物的列表
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基因集富集分析：对于基因集富集分析(Gene set enrichment analysis，GSEA)，卵巢癌的基因表达数据从TCGA项目获得。基因的表达通过每百万映射读取每千碱基外显子模型的片段(fragments per kilobase of exon model per million reads mapped，FPKM)来测量。在计算基因表达与OSM或OSMR之间的皮尔逊相关系数(Pearson CorrelationCoefficient，PCC)之后，所有基因都基于PCC进行排序，并随后经受GSEA分析(Subramanianet al.,2005)。计算每个功能集的富集评分(Enrichment score，ES)，这反映了基因集在基因排序列表顶部或底部处的过度表现的程度。归一化富集评分(normalized enrichmentscore，NES)是基于1000个排列计算的。在此，考虑了来自MSigDB的癌症标志基因集，并将错误发现率＜0.001的基因集视为选择标准(Liberzon et al.,2015；Subramanian et al.,2005)。
统计学分析：基于细胞培养的实验重复至少三次(三次生物重复)，并且所有数据均以平均值±SE表示。使用GraphPad Prism通过未配对的双尾Student t检验来评估显著性。动物模型中两个处理组之间的比较分析通过单因素ANOVA随后是Dunnett多重比较检验来进行。通过对数秩(Mantel–Cox)检验对存活模型中所处理的动物进行统计学分析。P值＜0.05(*)、＜0.01(**)、＜0.001(***)和＜0.0001(****)的差异被认为具有统计学显著性。
目前已知OSMR在卵巢癌细胞和癌症相关成纤维细胞中差异表达。为了鉴定在卵巢癌细胞和癌症相关细胞中差异表达的可靶向IL6家族受体，本发明人分析了人卵巢癌患者样品的基于微滴的三个单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集(OvD1-10x、OvD2-10x和OvD4-10x-mult)和一个单细胞核RNA测序(snRNA-seq)数据集(OvD3-nuc)(Izar et al.,2020；Slyper et al.,2020)并确定了所有IL6家族受体(例如IL6ST、OSMR、IL27RA、LIFR、IL11RA、IL6R、CNTFR和IL31RA)的表达。在这些基于微滴的数据集中有9名患者和11个样品，其中本发明人发现与免疫细胞相比，OSMR及其二聚化配偶体IL6ST在卵巢癌细胞、癌症相关成纤维细胞和内皮细胞中是最高的高度表达受体。
虽然基于微滴的scRNA-seq和snRNA-seq具有高测序覆盖率，然而，这两种方法都表现出一些局限性，因为测序中低深度覆盖率导致基因丢失的高可能性(Ziegenhain etal.,2017)。因此，本发明人使用了来自n＝9名人卵巢癌患者的基于板的、低丢失和高深度SMART-seq2(SS2)scRNA-seq数据(OVD5_SS2)，并确定了来自10X数据集的结果。该分析再次确定了OSMR和IL6ST是癌细胞中最高高度表达的IL6家族受体。本发明人还观察到OSMR在卵巢癌细胞和癌症相关成纤维细胞中高度表达，而在巨噬细胞中表达程度较低。值得注意的是，本发明人发现OSMR的配体OSM主要由巨噬细胞产生。
接下来，使用CellPhoneDB(Efremova et al.,2020)确定了OvD5-SS2数据集中不同细胞类型之间的所有已知的配体-受体相互作用，并选择了涉及IL6家族配体及其受体的所有相互作用。在此，发现OSMR、IL6ST、LIFR、IL11RA和IL6R显示出与其由巨噬细胞和成纤维细胞表达的配体的显著细胞-细胞相互作用。
然而，LIFR和IL11RA在极少数卵巢癌细胞中表达，而IL6R在所有细胞类型中普遍表达并且在免疫细胞中特别高。值得注意的是，IL6ST也在所有细胞类型中高度表达，而其二聚化配偶体OSMR主要在卵巢癌细胞、肿瘤相关内皮细胞和成纤维细胞中高度表达。分析还显示出IL6ST与多种IL6家族配体例如OSM、IL6和IL11相互作用，这导致IL6ST与多种IL6家族受体例如OSMR、LIFR、IL6R和IL11RA、CNTFR和IL27R的二聚化(Rose-John，2018)。出乎意料地，本发明人发现OSMR仅与OSM相互作用并与IL6ST异二聚化。虽然IL6ST在卵巢癌细胞中高度表达，但其与用于免疫细胞的重要功能的多种趋化因子和细胞因子受体二聚化的能力限制了其作为高度特异性癌症靶标的潜力。因此，提出了表征和关注OSMR功能的长期需求，OSMR是在卵巢癌细胞中第二多且高度表达的IL6家族受体，其作为用于治疗卵巢癌的治疗途径。
通过OSMR进行的OSM信号传导是卵巢癌病理特征的关键机制。在一组卵巢癌细胞系中检查到了OSMR受体亚家族(包括IL6ST、LIFR、IL31RA和OSMR)的蛋白质水平，并且发现与输卵管上皮细胞(例如FTE细胞系)相比，OSMR在大多数侵袭性卵巢癌细胞中高度上调，而IL6ST受体也在大多数细胞系中高度表达，然而在FTE与卵巢癌细胞之间的表达没有显著变化。结合单细胞分析结果，本发明人发现LIFR和IL31RA在卵巢癌细胞系中表达不佳。
为了进一步验证OSMR和IL6ST对于卵巢癌细胞中的致癌信号传导至关重要，本发明人确定了所有OSMR亚家族受体(OSMR、IL6ST、IL31RA和LIFR)和其他IL6家族受体在卵巢癌组织和邻近正常组织中的蛋白质表达。结果表明与正常邻近组织(normal adjacenttissue，NAT)相比，OSMR在癌组织中高度且差异表达；然而注意到了IL6ST在所有样品中高度表达，并且在NAT与卵巢癌组织之间没有差异表达。与单细胞/细胞核RNA-seq数据集类似，本发明人发现LIFR表达不佳，并且其水平在NAT与癌组织之间没有变化。发现IL31RA在正常组织和卵巢癌组织二者中几乎不表达或不表达。接下来，确定了所分泌的OSM对OSMR与其自身和与IL6ST的二聚化(其是卵巢癌中致癌信号传导的第一过程)的作用，并发现OSM刺激改善了OVCAR4和HEYA8卵巢癌细胞中OSMR-OSMR和OSMR-IL6ST之间的二聚化。
不受理论的束缚，本发明人发现卵巢癌中成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞中OSMR的表达提高，表明所述成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞与肿瘤细胞的缔合或相互作用是上调成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞中OSMR表达的潜在原因。根据这一假设，本发明人确定了单独生长的或与正常卵巢上皮细胞(OSE)和卵巢癌细胞(HEYA8和OVCAR4)共培养的成纤维细胞、巨噬细胞(THP1)和内皮细胞(RF24)中OSMR家族受体的mRNA表达。出乎意料地，本发明人发现结果表明，与单独培养或与OSE细胞共培养的细胞相比，当与卵巢癌细胞共培养时，OSMR和IL6ST二者在内皮细胞和成纤维细胞中高度上调，并在巨噬细胞中适度上调；然而本发明人观察到，当与卵巢癌细胞共培养时，在成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞中表达的IL31RA的表达有低至中等的变化。观察到当与癌细胞共培养时，LIFR和IL6R分别在内皮细胞和巨噬细胞中高度上调。综上所述，结果表明在成纤维细胞、内皮细胞中表达的OSMR和IL6ST的表达提高可能是由于它们与癌细胞的缔合。
为了进一步确定OSM家族受体在卵巢癌细胞和TME中的细胞二者中对致癌特征的重要性，本发明人敲低了卵巢癌细胞中和TME中的细胞(例如成纤维细胞、内皮细胞(RF24)和巨噬细胞(THP1))中的所有IL6亚家族基因，并确定了细胞增殖和迁移。结果表明OSMR的缺失相当地降低了卵巢癌细胞的增殖(图6a)和迁移(图6e)(＞70％)，但对非癌细胞的增殖和迁移没有发挥任何主要作用(图68b至6d和图6e至6h)。还观察到，与OSMR的敲低相比，IL6ST和IL6R的敲低将卵巢癌细胞的增殖和迁移降低低至中等水平(图6a、6b和6e)，然而还注意到IL6ST和IL6R的缺失显著抑制了成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞系的增殖和迁移(图6b至6d和图6e至6h)。综上所述，数据精确地表明与其他IL6家族受体相比，OSMR是卵巢癌细胞增殖和迁移的重要调节因子。
基因集富集分析(GSEA)(Liberzon et al.,2015)还显示出，在TCGA卵巢癌组群中，高水平的OSM和OSMR与功能注释标志(例如上皮至间充质转化和IL6/JAK/STAT3信号传导途径)相关(图7a)。同时，使用由110个卵巢肿瘤(表1)组成的组织微阵列(TMA)进行的免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)显示，与低级别浆液性卵巢癌相比，高级别浆液性卵巢癌患者样品中OSMR高表达。结果还表明，与正常和NAT组织相比，OSMR在恶性I期、II期和III期卵巢癌组织中高度表达，而未观察到在卵巢癌组织中OSM表达的分期差异(图7b)。还发现在三维培养中，与IL31和LIF相比，OSM提高了卵巢癌球状体的球状体形成能力和尺寸(图7c)。重要的是，在HEYA8卵巢癌细胞中与LIF和IL31相比，OSM刺激延长了STAT3的Y705部分和S727部分二者的磷酸化。同时，与体内LIF和IL31治疗相比，OSM迅速促进了HEYA8癌细胞的生长。
为了研究卵巢癌细胞中OSMR激活对OSM的下游作用，本发明人用重组人OSM刺激了高水平表达OSMR的OVCAR4细胞，并进行了磷酸化蛋白质组阵列，并且确定了45种蛋白质的磷酸化。在该测定中，结果表明OSM刺激提高了数种关键蛋白质包括CREB、ERK、STAT3、Akt、p70s6激酶的磷酸化，其中pSTAT3-Y705是上调最多的磷蛋白(图8a和8b)。通过使用pUNO1-OSMR质粒在HEYA8和OVCAR5卵巢癌细胞中过表达OSMR来表征OSMR的致癌作用。首先，使用过表达OSMR的细胞的裂解物来制备免疫印迹，并观察到在OSMR过表达之后STAT3的Y705和S727部分的磷酸化显著提高(图8c和8d)。OSMR还促进了两种细胞系的集落形成、迁移、侵袭、伤口愈合能力和球状体形成能力(图6e至6j)。
敲低OSMR降低了卵巢癌细胞的致癌特征并抑制了卵巢癌细胞的生长和转移。
接下来，确定OSMR的敲低是否降低STAT3的磷酸化以及癌细胞的生长、迁移和侵袭。结果表明shRNA介导的OSMR沉默降低了STAT3在S727和Y705部分处的磷酸化。接下来本发明人确定了OSMR是否是OSM作用所需要的。与OSM在对照细胞中的作用相比，OSM刺激不能在用shOSMR稳定敲低的细胞中激活STAT3的磷酸化。类似地，OSM刺激在用shOSMR敲低的细胞中不诱导对球状体形成、集落形成能力、细胞迁移或侵袭的任何作用，这再次确定了OSMR是OSM作用所需要的。
HEYA8肿瘤在小鼠中很少产生腹水；因此，使用了产生腹水的鼠卵巢癌细胞系BR-Luc来研究OSMR对腹水中OSM水平的作用。为此，将使用shOSMR来稳定耗竭OSMR的BR-Luc鼠细胞系或对照细胞腹膜内注射到同基因FVB小鼠(n＝6/组)中。在注射6周之后收集腹水。在表现出低腹水或无腹水的小鼠中使用3ml PBS进行腹膜洗涤，然后通过ELISA确定OSM水平。值得注意的是，与对照组相比，OSMR的耗竭导致无腹水或非常少的腹水。为了比较腹膜中OSM的水平，本发明人对腹水中或无腹水的那些小鼠的腹膜洗涤液中的OSM进行了定量，并且发现携带OSMR耗竭细胞的小鼠在腹膜洗涤液中表达少量OSM。结合卵巢癌临床样品的单细胞分析，本发明人发现与上皮细胞和成纤维细胞相比，巨噬细胞群在荷BR-Luc瘤小鼠的腹膜洗涤液和腹水二者中均表达高水平的OSM。综上所述，这些结果表明OSMR耗竭抑制了STAT3磷酸化、OSM水平和随后的肿瘤生长。
为了确定OSMR表达的缺失对卵巢癌体内生长的作用，将萤光素标记的sh对照-HEYA8细胞或shOSMR-HEYA8细胞腹膜内注射到裸鼠(n＝7只小鼠/组)中，并使用体内成像系统(in vivo imaging system，IVIS)通过生物发光成像对癌细胞的生长进行监测长至5周。活的动物中的IVIS成像显示，OSMR敲低抑制了约70％的卵巢癌细胞生长，特别是在最后两个时间点。同时，还发现OSMR沉默显著降低了肿瘤重量和肿瘤负荷以及在多种器官部位包括网膜、腹膜、肝周、脾周和盆腔部位处的转移的发生率。与OSMR敲低抑制卵巢癌生长的结果一致，IHC和免疫印迹分析显示出，这些小鼠中OSMR的稳定敲低显著降低了细胞增殖标志物Ki67并提高了凋亡标志物经切割胱天蛋白酶-3的水平。另外，本发明人发现，与sh对照相比，OSMR表达的缺失导致磷酸化STAT3水平的损失。值得注意的是，与相应的对照相比，OSMR的缺失还导致增殖标志物PCNA和抗凋亡标志物BCL-xl和BCl2的水平的降低。接下来，检查了从荷HEYA8-对照或HEYA8-shOSMR瘤的小鼠中收集的血清中所分泌OSM的水平，并且观察到与对照相比，从荷HEYA8-shOSMR瘤的小鼠中收集的血清中OSM水平显著降低。综上所述，结果表明OSMR沉默抑制了蛋白质的水平，降低了卵巢癌细胞在体外和体内二者中的生长和转移。
抑制卵巢癌细胞生长的抗OSMR抗体的开发和筛选
针对与OSMR胞外结构域的结合活性，对噬菌体展示的单链可变片段(scFv)抗体文库进行淘选，并通过ELISA在抗原特异性结合命中物中筛选之后选择与重组OSMR结合的所有阳性scFv抗体克隆。将对OSMR表现出高结合亲和力的scFv克隆随后转化为全长IgG1抗体。
在长至48小时的多个时间点在存在OSM的情况下用10μg/mL抗体处理癌细胞之后，针对其对卵巢癌细胞生存力的作用，鉴定并筛选了对OSMR胞外结构域具有显著高结合亲和力的所有26个阳性全长抗体克隆。将STAT3的有效抑制剂WP1066用作阳性对照，并且将对照IgG用作同种型对照。在筛选中，观察到名为B14、B18和B21的三种抗体是诱导即使在存在OSM的情况下生长的OVCAR4细胞的凋亡的最有效抗体。接下来，使用CCK8细胞生存力测定来确定OVCAR4细胞在B14、B18和B21抗体处理之后的细胞生存力，并且发现B14、B18和B21抗体克隆的IC50为约10μg/mL。然后，通过ELISA分析了这些抗体与细胞表面人OSMR蛋白的结合亲和力，并且发现抗体B21和B14表现出50％有效浓度(effective concentration 50％，EC50)，B14和B21抗体的50％有效浓度分别为1.45和1.17nM。出乎意料的是，B18抗体克隆没有显示出与OSMR的任何特异性结合。选择B14和B21抗体以进一步表征它们对细胞信号传导、肿瘤生长和转移的作用。重要的是，B14和B21处理二者均降低了磷酸-蛋白激酶阵列中pSTAT3(S727和Y705)、pAkt、p70s6激酶、WNK1、PYK2、RSK1/2/3和PLC-1蛋白的磷酸化水平，其中B21对抑制这些致癌激酶更有效。还注意到B21抗体上调了导致细胞周期阻滞和细胞死亡的蛋白质(例如TRAIL R1/DR4和TRAIL R1/DR5、P21、BAX、p27/Kip1以及经切割胱天蛋白酶3)的水平；而抑制了促存活蛋白质例如BCl2和BClxL的水平。相比之下，B14抗体在选定时间点仅上调p27和经切割胱天蛋白酶3，而其比B21抗体更多降低BCL2和BCLxL的水平。使用流式细胞术通过Annexin V FITC/PI测定进一步证实了这些发现，所述测定还显示在存在OSM的情况下用B14和B21抗OSMR抗体处理16小时之后，早期和晚期凋亡细胞显著提高。
接下来，通过使用经B14和B21 mAb处理的HEYA8和OVCAR4细胞的裂解物进行免疫印迹来验证了在蛋白激酶阵列中观察到的数种关键致癌激酶的抑制。发现B14和B21处理降低了磷酸-STAT3蛋白和促存活标志物例如PCNA和BCL-xL；而提高了凋亡标志物例如细胞色素c和p27的水平。
与磷酸-蛋白阵列数据一致，免疫印迹也显示出B14和B21抗体降低了JAK1(Y1034/1035)和JAK-2(Y1007/1008)、PI3K的p85亚基(Y458)、AKT(S473)和ERK(T202/Y204)的磷酸化水平。
为了进一步评价B14和B21抗体的体外抗癌作用，检查了这些抗体对HEYA8细胞的球状体形成能力以及OVCAR4细胞和HEYA8细胞二者的集落形成的作用，并观察到B14和B21抗体降低了OVCAR4和HEYA8细胞的集落形成3D形态发生能力。值得注意的是，B14和B21 mAb在HEYA8细胞中抑制了卵巢癌干性的关键标志物，例如CD133(Prominin)、CD44、CD113(c-KIT)和ALDH1。为了确定在卵巢癌细胞中观察到的对抗OSMR抗体的作用是通过OSMR及其下游靶标STAT3运作的，本发明人处理了在敲低OSMR的HEYA8细胞中最有效的抗OSMR抗体克隆。如所预期的，B21 mAb仅在对照细胞中有效，而B21 mAb没有降低OSMR耗竭细胞的生存力、球状体形成能力、迁移和集落形成。同时，在对照细胞中在经B21处理之后OSMR的水平和STAT3的磷酸化降低，但在HEYA8-shOSMR细胞中没有改变。
抗OSMR抗体在卵巢癌细胞中消除了OSMR的二聚化并促进了OSMR的内化和降解
为了研究B14和B21单克隆抗体(mAb)是否抑制OSM诱导的OSMR与IL6ST的二聚化，使免疫沉淀的OSMR-IL6ST异二聚体复合物在用抗OSMR抗体或对照IgG处理之后进行交联。值得注意的是，发现B14和B21在HEYA8细胞和OVCAR4细胞二者中显著消除了OSMR与IL6ST之间的二聚化。值得注意的是，当免疫沉淀OSMR时，B14和B21 mAb处理不影响OSMR与由IL31诱导的IL31RA的二聚化。接下来，本发明人通过细胞上Western测定确定了B14和B21抗体的处理是否改变细胞膜上OSMR表达的水平。在此，通过在存在OSM的情况下用对照IgG、B14或B21处理OVCAR4和HEYA8细胞24小时来评估卵巢癌细胞中B14和B21抗体在OSMR胞外结构域上的结合。然后将细胞固定并使用第二且市售的用IR Dye-680RD(红色荧光)抗体标记的抗OSMR抗体进行免疫染色，并对细胞表面上的OSMR水平进行定量。在该测定中，发现B14和B21 mAb的处理显著降低了HEYA8和OVCAR4卵巢癌细胞二者表面上完整OSMR的存在，这可能是由于OSMR的内化和降解。
因此，决定使用分离自HEYA8卵巢癌细胞的胞质和膜级分，通过对OSMR及其二聚化配偶体IL6ST进行免疫印迹来进一步确定B14和B21mAb的结合是否可介导OSMR的内化和降解，所述HEYA8卵巢癌细胞在存在OSM的情况下用B14和B21抗体处理。出乎意料地，结果显示B14和B21抗体二者都促进OSMR内化到胞质中。然后在补充方法中验证了抗体介导的OSMR内化，其中使用Incucyte活细胞分析仪来实时监测OSMR从细胞表面至胞质的内化。在此使用了用pH敏感的Incucyte FabFluor红色试剂预标记的B14和B21 mAb。与约7.4(中性pH)的胞外pH相比，当OSMR标记的抗体内化到胞质中或当定位于内体或溶酶体时(其中pH为酸性(约6.3至4.7))，FabFluor红色标记的抗体产生红色荧光。B14和B21抗体降低了细胞表面上完整OSMR的量并促进其内化。基于FabFluor红色标记抗体的测定表明，在HEYA8和OVCAR4细胞二者中B14和B21抗体二者在处理之后约12小时均诱导OSMR从细胞表面至胞质的内化。接下来，本发明人对在存在OSM的情况下用对照IgG、B14和B21进行处理并用OSMR和LAMP1(溶酶体标志物)进行免疫染色的OVCAR4细胞进行了共聚焦显微术。已经确定，与对照IgG相比，B14和B21抗体处理促进了OSMR内化到胞质中并与LAMP1(作为溶酶体降解的指示)共定位。综上所述，结果表明B14和B21抗OSMR抗体二者的处理是抑制OSMR通过其与IL6ST二聚化而介导的致癌作用的强拮抗剂。
抗OSMR抗体的体内递送降低了卵巢癌细胞的生长和腹膜扩散
为了评价B14和B21抗OSMR mAb的体内治疗作用，本发明人将体外验证的抗OSMR抗体注射到无胸腺裸鼠中，在所述无胸腺裸鼠中腹膜内接种了具有稳定表达的萤光素酶报道子的HEYA8卵巢癌细胞。在每周两次腹膜内接种癌细胞之后第7天用对照IgG、B14或B21抗体(10mg/kg体重)处理小鼠。由于小鼠来源的OSM不与人OSMR结合(Adrian-Segarra et al.,2018)，因此这些小鼠每周两次腹膜内地补充重组人OSM(250ng/kg体重)以及B14和B21抗体处理。通过生物发光成像对所有小鼠的癌细胞生长进行监测持续五周。外源性OSM的处理促进了体内卵巢癌细胞的生长。与体外发现一致，与单独用对照IgG抗体处理的小鼠或者接受外源性OSM以及对照IgG的小鼠相比，B14和B21抗体的处理降低了癌细胞的总负荷、肿瘤结节的数目和转移的发生率。值得注意的是，存活分析表明，与经同种型对照IgG处理的小鼠相比，用B14和B21处理的荷HeyA8细胞的小鼠表现出更好的总存活(对数秩检验p值＜0.0001)，并且中位存活分别为约60天和超过100天。相比之下，与单独的对照IgG处理组相比，经OSM以及对照IgG抗体刺激的小鼠表现出不佳的存活，并且中位存活为29天。使用收集到的癌组织进行的免疫组织化学分析和/或Western印迹显示，与在有和没有OSM的情况下经对照IgG处理的小鼠相比，B21抗体处理在降低OSMR、pSTAT3表达、增殖标志物Ki67和抗凋亡标志物BCLxl方面比B14抗体更有效。还发现，与OSM刺激组相比、或者当与B14抗体组或在有和没有OSM的情况下对照IgG组相比时，B21抗体处理上调了癌组织中细胞死亡标志物经切割胱天蛋白酶3的水平。值得注意的是，当用这些抗体克隆处理时，本发明人没有在小鼠中发现任何不利的毒性，如所例示的在所有处理组中在体重、丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、胆红素、白蛋白、肌酸激酶、总蛋白水平和器官(肾、肝、肺、心脏、脑和脾)的组织病理学方面均无显著变化。
对OSMR家族基因网络的早期研究主要集中在通过OSM和/或OSMR失调的针对肿瘤发生的信号传导机制上(Richards,2013；Tanaka and Miyajima,2003)。然而，开发OSMR作为治疗靶标的潜力没有得到充分探索。根据本公开内容，本发明人已经确定了所有IL6家族受体在卵巢癌中的作用，并发现与卵巢癌中IL6家族受体的其他成员相比，OSMR是重要的治疗倾向(liability)。评价了OSMR家族受体的所有三种配体例如OSM、IL31和LIF对STAT3磷酸化的动力学的作用，并发现与IL31和LIF相比，OSM通过延长STAT3的活化而提供了稳健的致癌信号传导。
使用根据本公开内容的单细胞测序的能力，目前已知与肿瘤微环境中的其他细胞相比，OSMR主要在卵巢癌细胞和癌症相关成纤维细胞中表达。不受理论的束缚，该研究提出了对卵巢癌细胞的生长和进展至关重要的两种范例：(i)在癌细胞中运作的致癌成瘾的范例，其取决于OSMR水平的升高及其与其配体OSM的相互作用；以及(ii)通过OSMR运作的下游致癌信号传导的范例，并且该范例通过OSMR与IL6ST在OSM结合之后的二聚化来介导。因此，将OSMR用作有吸引力的靶标以用于消除致癌信号传导，这可通过阻止OSMR与IL6ST的二聚化以及通过促进其在癌细胞中的内化和降解来执行。一种可改善卵巢癌结局的可能的治疗策略是使用单克隆抗体(mAb)，所述抗体选择性靶向肿瘤细胞，而在非肿瘤细胞中亲和力较低。与血液癌症和实体恶性疾病(例如乳腺癌和结直肠癌)相比，基于mAb的治疗尚未被证明对治疗卵巢癌有效。因此，以治疗卵巢癌患者作为可行的治疗方法为目标，本发明人开发了一组抗OSMR抗体，并在体外和/或体内二者中测试了这些抗体在抑制通过STAT3介导的致癌信号传导以及肿瘤细胞生长和转移方面的效力。
本发明人发现OSMR与IL6ST的二聚化是OSM诱导的针对肿瘤生长和进展的信号传导提示的关键步骤。因此，可消除OSM与OSMR的结合及其与IL6ST的二聚化的药剂可抑制肿瘤进展。值得注意的是，本公开内容的抗体，例如B14和B21克隆，例如能够阻断OSM诱导的OSMR与IL6ST的二聚化。FDA已经开发并批准了用于实体瘤的数种mAb。其中之一是广泛使用的曲妥珠单抗(Trastuzumab)(又名赫赛汀(Herceptin))。
与本公开内容的抗体在抑制受体异二聚化方面类似，曲妥珠单抗是针对HER2的胞外结构域(ERBB2)产生的人源化单克隆抗体，并且已知其通过与HER2的胞外结构域(ERBB2)结合来抑制ERBB2与其他EGFR家族成员之间的配体非依赖性异二聚化(Nahta et al.,2004)。发现曲妥珠单抗在抑制表达HER2的癌细胞中的致癌信号传导方面有效，并且当单独施用或与化学治疗组合施用时，曲妥珠单抗在临床中广泛用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌患者(Burris et al.,2011；Nahta et al.,2004)。抗OSMR单克隆抗体用于治疗具有高OSMR水平的那些卵巢癌患者的用途应提供潜在的益处，例如避免在正常组织中通过传统化学治疗剂或通过非选择性靶向癌细胞引起的细胞毒性副作用。
据报道，抗体与跨膜受体结合，阻断其与配体的结合，并通过受体内化和降解抑制肿瘤生长(Ben-Kasus et al.,2009)。出乎意料地，本发明人发现B14和B21抗体与OMSR受体的结合阻断了OSMR二聚化但通过识别内吞机制然后分选到溶酶体中进行降解而潜在地诱导了其内化。这些作用最终导致下游效应物例如STAT3、PI3K-Akt-mTOR和MEK-ERK蛋白的磷酸化和活化降低，这些效应物对肿瘤生长和进展是重要的。数种治疗性抗体与通过内在(或线粒体)途径诱导凋亡有关，导致细胞色素从线粒体释放、抗凋亡Bcl-2家族蛋白下调、以及周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制剂上调(Ben-Kasus et al.,2007)。曲妥珠单抗的促凋亡活性归因于对ERBB2下游的组成型激活的MAP激酶和Akt途径的抑制，以及TRAIL诱导的凋亡(Cuello et al.,2001)。与这些发现类似，观察到本公开内容的B14和/或B21抗体克隆抑制BCl2的水平，并上调p27、经切割胱天蛋白酶3、TRAIL受体和细胞色素c的水平。同样地并且如所预期的，B14和/或B21的处理在体内降低了卵巢癌细胞的生长和腹膜扩散，其中该处理抑制了OSMR、磷酸化STAT3、BCL-xL的水平并诱导了经切割胱天蛋白酶3的水平。
OSMR在卵巢癌细胞中高度表达(Geethadevi et al.,2021)。
另外，OSM参与长期致癌信号传导激活和卵巢癌生长。OSMR敲低在体内降低卵巢癌细胞的生长和接种(Geethadevi et al.,2021)。此外，OSMR的单克隆抗体(mAb)通过阻断OSMR的二聚化来消除OSM介导的致癌特征，并且抗OSMR抗体消除OSMR与IL6ST的异二聚化并诱导OSMR的内化和降解(Geethadevi et al.,2021)。另外，抗OSMR抗体降低了OSM介导的肿瘤生长和转移，并提高了荷有卵巢癌的小鼠的总存活率。
图5。
目前已知使用抗OSMR抗体对OSMR进行的靶特异性抑制消除了顺铂抗性，如例如通过以下观察结果表明的。
制瘤素M及其受体OSMR在顺铂抗性卵巢癌细胞中上调。
为了鉴定侵袭性和化学抗性型卵巢癌细胞中上调的炎性细胞因子，对亲本和顺铂抗性A2780卵巢癌细胞二者中的所有细胞因子、白介素、趋化因子、其受体和下游效应基因进行了qPCR阵列(图1A)。在该阵列中，本发明人鉴定出在84种基因中有66种基因在截止值在两个方向上≥1.5倍数变化差异之后分析的两个组中差异表达(图1A)。
在这66种差异表达的基因中，已确定MYC、OSMR、CSF1、SRC、TNF、OSM、EGFR、FASLG、PIM1和STAT3是在顺铂抗性A2780细胞中上调的前10种基因。相比之下，已确定在顺铂抗性A2780细胞中仅少数基因下调，并发现BAX、SOCS3、FAS、CSF3、IL1A、SOCS1和PIAS3是上-下(top-down)调节的基因(图1A)。引人注目的是，顺铂抗性型的A2780细胞表达高水平的制瘤素M(OSM)、其受体制瘤素M受体(OSMR)及其下游效应物JAK2和STAT3。相比之下，顺铂抗性型的A2780细胞表达低水平的PIAS3，PIAS3是活化的STAT3的蛋白抑制剂(图1A和图1B)。这些数据表明OSM信号传导是卵巢癌进展和转移的重要机制。为了进一步验证OSM或OSMR的表达，在铂抗性型卵巢癌细胞(对顺铂敏感的PEO1和对顺铂有抗性的PEO4)以及在患者来源的子宫内膜样卵巢癌细胞系SL3和A2780中的蛋白质水平(图1C)，并确定了顺铂抗性卵巢癌细胞系中OSMR和OSM蛋白水平的提高。
为了进一步表征OSM、OSMR及其下游效应物在对顺铂有抗性的卵巢癌中的作用。OSM属于IL-6家族配体，其包括白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-11(Interleukin-11，IL-11)、白介素-31(Interleukin-31，IL-31)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、瘦素(OB)、心肌营养因子-1(CT-1)、新的神经营养因子-1/B细胞刺激因子-3或心肌营养因子样细胞因子(CLC)、和神经生成素(neuropoietin，NP)。通过多重细胞因子ELISA确定了野生型和顺铂抗性型A2780和SL-3中IL-31、OSM、IL-6和LIF的分泌水平，并发现OSM是IL-31、OSM和LIF中上调最多的细胞因子并且甚至与IL6和IL8相比更高(图1D)。OSM诱导其受体OSMR与IL6ST(也称为gp130)的异二聚化是启动和激活下游信号传导途径(例如JAK-STAT途径)的早期事件。为了检查OSM在启动OSMR-IL6ST异二聚化中的作用，在A2780敏感型和A2780-CP(对OSM刺激有响应)中进行了交联二聚化测定，然后用膜不可渗透的化学交联剂BS3处理(图1E)。使用捕获OSMR-IL6ST二聚化受体复合物的特异性抗OSMR抗体进行进一步免疫沉淀，在两种细胞中都产生了OSMR的二聚体和单体以及IL6ST的二聚体。注意到OSM诱导的OSMR异二聚化在A2780-CP中比在A2780敏感型中相对升高，这可能是OSMR在A2780-CP顺铂抗性细胞中高表达的结果(图1E)。评价了A2780敏感型和A2780-CP以及OVCAR8敏感型和OVAR8-Cis中STAT3的磷酸化水平，并且发现A2780-Cis和OVCAR8-Cis细胞系中STAT3(Y705、S737位点)的磷酸化(图1F)。
用抗OSMR抗体的处理在体外和体内二者中均增强了卵巢癌细胞的顺铂处理
数据显示，与敏感细胞系相比，OSMR和OSM在顺铂抗性卵巢癌细胞A2780-Cis、OVACR8-Cis和SL-3-Cis中高度表达(图1C)。为了评价B21抗OSMR抗体是否使卵巢癌细胞对顺铂处理敏感，本发明人测试了B21单独或与顺铂组合的作用。首先，在A2780、OVCAR8和SL3卵巢癌细胞系的亲本和顺铂抗性型二者中确定了B21的细胞生存力的作用。发现顺铂在A2780-Cis、OVCAR8-Cis和SL-3-Cis中的IC50分别为10.40μM、13.55μM和7.37μM，而顺铂在亲本A2780、OVCAR8和SL3细胞系中的IC50分别为2.04μM、1.74μM和1.21μM(图2A至C)。值得注意的是，B21抗体的处理在A2780-Cis、OVCAR8-Cis和SL-3-Cis中分别将顺铂抗性细胞中的IC50降低至3.57μM、6.59μM和1.59μM，而B21在顺铂敏感的亲本型细胞中没有使顺铂的IC50发生任何显著变化(图2D至F)。
为了表征B21抗体对A2780-Cis和SL-3-Cis在低附着板中持续15天的球状体形成能力的作用。在此，所处理的A2780-CP和SL3-CP细胞系在存在OSM的情况下用B14和B21 mAb处理，并且发现当监测15天时，与B14 mAb和OSM单独处理或对照IgG相比，经B21处理的细胞显著降低了肿瘤形成能力(图3A至B)。接下来，将B21抗体与顺铂组合，并且观察到与单独用顺铂处理的球状体相比，该组合显著降低了肿瘤细胞的球状体形成能力并导致球状体崩解(图3C至D)。还通过在存在对照IgG、顺铂和对照IgG、和顺铂以及B21抗体的情况下，在使用ClonaCell悬浮培养基在低附着板中提高细胞数的情况下，在A2780-CP和SL-3-CP卵巢癌细胞二者中进行有限稀释测定来确定B21 mAb对癌症干性或肿瘤起始能力(tumorinitiating capacity，TIC)效应的作用。在该测定中，确定了B21 mAb处理在所有系列稀释中一致地显著降低球状体形成能力约90％(图3E至F)，表明阻断OSMR信号传导将抑制TIC。另外，B14和B21 mAb即使在存在OSM的情况下也降低了OVCAR8和OVCAR8-Cis的集落形成能力(图4A)。令人感兴趣的是，我们发现与OSM单独处理相比，B14和B21抗体在A2780和SL3抗性细胞系中显著降低了OSMR的表达以及pSTAT3在Y705和S727处的磷酸化(图4B)。
鉴于B21 mAb对在体外抑制卵巢癌细胞生长和顺铂增敏效力的作用，来表明B21mAb在体内的作用。将稳定表达萤光素酶报道子的A2780敏感或A2780顺铂抗性(A2780-Cis)细胞系腹膜内注射到无胸腺裸鼠中，并每周一次使用生物发光监测肿瘤负荷(图5A)。然后将小鼠随机分成五组，并且单独用B21 mAb或顺铂(每两周5mg/kg体重)或者用其组合进行处理，并用重组OSM刺激小鼠。与单独用OSM刺激的荷A2780卵巢癌的小鼠相比，B21 mAb或顺铂降低了A2780卵巢癌的生长，而当B21与顺铂组合时，没有显著性降低(图5A和图5C)。与A2780敏感细胞相比，A2780-CP细胞在裸鼠中表现出侵袭性生长，其中单独的顺铂不抑制A2780-CP肿瘤的生长和转移(图5B和图5D)。重要的是，B21 mAb与顺铂一起处理与单一处理相比进一步降低了肿瘤重量(图5E至F)。针对OSMR及其下游靶标的水平，分析了从上述组中提取的肿瘤组织的免疫印迹。在A2780-CP肿瘤中在B21与顺铂组合处理下，存在OSMR和磷酸化STAT3的显著降低(图5G)。在用B21单独和与顺铂组合处理的A2780-CP中PCNA表达水平降低，表明了在用抗OSMR抗体和顺铂组合处理的肿瘤中提高了细胞凋亡以及降低了细胞增殖。这些结果表明了当B21抗OSMR抗体与顺铂组合治疗卵巢癌(特别是侵袭性顺铂抗性型)时存在强效协同作用。
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上述及图中举例说明的实施方案仅以实例的方式呈现，并且不旨在作为对本公开内容的概念和原则的限制。因此，本领域普通技术人员将理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，对元素及其配置和布置进行多种改变是可能的。本公开内容的多种特征和方面在所附权利要求书中阐述。

Claims (84)

1.分离的单克隆抗体，其中所述抗体与OSMR特异性结合，并且其中所述抗体与以下竞争结合OSMR的表位：B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，H11，H12，H13，H14，H15，或H16单克隆抗体。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
(a)第一VH CDR，其与以下的VH CDR1具有至少80％同一性：
B01(SEQ ID NO：1)，B02(SEQ ID NO：4)，B03(SEQ ID NO：7)，B04(SEQ ID NO：10)，B05(SEQ ID NO：13)，B06(SEQ ID NO：16)，B07(SEQ ID NO：19)，B08(SEQ ID NO：22)，B09(SEQID NO：25)，B10(SEQ ID NO：28)，B12(SEQ ID NO：31)，B13(SEQ ID NO：34)，B14(SEQ IDNO：37)，B16(SEQ ID NO：40)，B17(SEQ ID NO：43)，B18(SEQ ID NO：46)，B19(SEQ ID NO：49)，B21(SEQ ID NO：52)，H09(SEQ ID NO：55)，H10(SEQ ID NO：58)，H11(SEQ ID NO：61)，H12(SEQ ID NO：64)，H13(SEQ ID NO：67)，H14(SEQ ID NO：70)，H15(SEQ ID NO：73)，或H16(SEQ ID NO：76)；
(b)第二VHCDR，其与以下的VHCDR2具有至少80％同一性：
B01(SEQ ID NO：2)，B02(SEQ ID NO：5)，B03(SEQ ID NO：8)，B04(SEQ ID NO：11)，B05(SEQ ID NO：14)，B06(SEQ ID NO：17)，B07(SEQ ID NO：20)，B08(SEQ ID NO：23)，B09(SEQID NO：26)，B10(SEQ ID NO：29)，B12(SEQ ID NO：32)，B13(SEQ ID NO：35)，B14(SEQ IDNO：38)，B16(SEQ ID NO：41)，B17(SEQ ID NO：44)，B18(SEQ ID NO：47)，B19(SEQ ID NO：50)，B21(SEQ ID NO：53)，H09(SEQ ID NO：56)，H10(SEQ ID NO：59)，H11(SEQ ID NO：62)，H12(SEQ ID NO：65)， H13(SEQ ID NO：68)，H14(SEQ ID NO：71)，H15(SEQ ID NO：74)，或H16(SEQ ID NO：77)；
(c)第三VHCDR，其与以下的VHCDR3具有至少80％同一性：
B01(SEQ ID NO：3)，B02(SEQ ID NO：6)，B03(SEQ ID NO：9)，B04(SEQ ID NO：12)，B05(SEQ ID NO：15)，B06(SEQ ID NO：18)，B07(SEQ ID NO：21)，B08(SEQ ID N0：24)，B09(SEQID NO：27)，B10(SEQ ID NO：30)，B12(SEQ ID N0：33)，B13(SEQ ID NO：36)，B14(SEQ IDNO：39)，B16(SEQ ID NO：42)，B17(SEQ ID NO：45)，B18(SEQ ID NO：48)，B19(SEQ ID NO：51)，B21(SEQ ID NO：54)，H09(SEQ ID NO：57)，H10(SEQ ID NO：60)，H11(SEQ ID NO：63)，H12(SEQ ID NO：66)，H13(SEQ ID NO：69)，H14(SEQ ID NO：72)，H15(SEQ ID NO：75)，或H16(SEQ ID NO：78)；
(d)第一VLCDR，其与以下的VLCDR1具有至少80％同一性：
B01(SEQ ID NO：79)，B02(SEQ ID NO：81)，B03(SEQ ID NO：83)，B04(SEQ ID NO：85)，B05(SEQ ID NO：87)，B06(SEQ ID NO：89)，B07(SEQ ID NO：91)，B08(SEQ ID NO：93)，B09(SEQ ID NO：95)，B10(SEQ ID NO：97)，B12(SEQ ID NO：99)，B13(SEQ ID NO：101)，B14(SEQID NO：103)，B16(SEQ ID NO：105)，B17(SEQ ID NO：107)，B18(SEQ ID NO：109)，B19(SEQID NO：111)，B21(SEQ ID NO：113)，H09(SEQ ID NO：115)，H10(SEQ ID NO：117)，H11(SEQID NO：119)，H12(SEQ ID NO：121)，H13(SEQ ID NO：123)，H14(SEQ ID NO：125)，H15(SEQID NO：127)，或H16(SEQ ID NO：129)；
(e)第二VLCDR，其与由GNS，DNN，DAS，SHN，DAT，SNN，NNN，RNN，EDN，AAS，DVS，LGS，QDN，WDS，或PDC组成的三肽的VLCDR2具有至少80％同一性；和
(f)第三VLCDR，其与以下的VLCDR3具有至少80％同一性：
B01(SEQ ID NO：80)，B02(SEQ ID NO：82)，B03(SEQ ID NO：84)，B04(SEQ ID NO：86)，B05(SEQ ID NO：88)，B06(SEQ ID NO：90)，B07(SEQ ID NO：92)，B08(SEQ ID NO：94)，B09(SEQ ID NO：96)，B10(SEQ ID NO：98)，B12(SEQ ID NO：100)，B13(SEQ ID NO：101)，B14(SEQ ID NO：104)，B16(SEQ ID NO：106)，B17(SEQ ID NO：108)，B18(SEQ ID NO：110)，B19(SEQ ID NO：112)，B21(SEQ ID NO：1 14)，H09(SEQ ID NO：116)，H10(SEQ ID NO：118)，H11(SEQ ID NO：120)，H12(SEQ ID NO：122)，H13(SEQ ID NO：124)，H14(SEQ ID NO：126)，H15(SEQ ID NO：128)，或H16(SEQ ID NO：130)。
3.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO：1相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO：2相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO：3相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO：79相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽GNS；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:80相同。
4.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:4相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:5相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:6相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:81相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽DNN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:82相同。
5.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:7相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:8相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:9相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:83相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽DAS；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:84相同。
6.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:10相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:11相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:12相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:85相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽DAS；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:86相同。
7.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:13相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:14相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:15相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:87相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽DAS；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:88相同。
8.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:16相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:17相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:18相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:89相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽SHN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:90相同。
9.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:19相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:20相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:21相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:91相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽DAT；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:92相同。
10.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:22相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:23相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:24相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:93相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽SNN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:94相同。
11.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:25相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:26相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:27相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:95相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽NNN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:96相同。
12.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:28相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:29相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:30相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:97相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽RNN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:98相同。
13.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:31相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:32相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:33相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:99相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽EDN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:100相同。
14.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:34相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:35相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:36相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:101相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽SNN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:102相同。
15.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:37相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:38相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:39相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:103相同；
(e)第二VLCDR，其是AAS；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:104相同。
16.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:40相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:41相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:42相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:105相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽DAS；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:106相同。
17.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:43相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:44相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:45相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:107相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽DVS；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:108相同。
18.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:46相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:47相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:48相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:109相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽LGS；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:110相同。
19.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:49相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:50相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:51相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:111相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽SNN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:112相同。
20.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:52相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:53相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:54相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:113相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽AAS；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:114相同。
21.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:55相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:56相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:57相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:115相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽SNN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:116相同。
22.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:58相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:59相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:60相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:117相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽SNN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:118相同。
23.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:61相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:62相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:63相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:119相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽QDN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:120相同。
24.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:64相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:65相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:66相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:121相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽WDS；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:122相同。
25.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:67相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:68相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:69相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:123相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽EDN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:124相同。
26.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:70相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:71相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:72相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:125相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽SNN；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:126相同。
27.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:73相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:74相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:75相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:127相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽PDC；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:128相同。
28.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)第一VHCDR，其与SEQ ID NO:76相同；
(b)第二VHCDR，其与SEQ ID NO:77相同；
(c)第三VHCDR，其与SEQ ID NO:78相同；
(d)第一VLCDR，其与SEQ ID NO:129相同；
(e)第二VLCDR，其是三肽AAS；和
(f)第三VLCDR，其与SEQ ID NO:130相同。
29.权利要求2所述的抗体，其中所述抗体包含：
(i)与B01的VH结构域(SEQ ID NO:131)或B01 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B01的VL结构域(SEQ ID NO:157)或B01 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(ii)与B02的VH结构域(SEQ ID NO:132)或B02 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B02的VL结构域(SEQ ID NO:158)或B02 mA的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(iii)与B03的VH结构域(SEQ ID NO:133)或B03 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B03的VL结构域(SEQ ID NO:159)或B03 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(iv)与B04的VH结构域(SEQ ID NO:134)或B04 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B04的VL结构域(SEQ ID NO:160)或E1-80 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(v)与B05的VH结构域(SEQ ID NO:135)或B05 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B05的VL结构域(SEQ ID NO:161)或B05 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(vi)与B06的VH结构域(SEQ ID NO:136)或B06 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B06的VL结构域(SEQ ID NO:162)或B06 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(vii)与B07的VH结构域(SEQ ID NO:137)或B07 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B07的VL结构域(SEQ ID NO:163)或B07 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(viii)与B08的VH结构域(SEQ ID NO:138)或B08 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B08的VL结构域(SEQ ID NO:164)或B08 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(ix)与B09的VH结构域(SEQ ID NO:139)或B09 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B09的VL结构域(SEQ ID NO:165)或B09 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(x)与B10的VH结构域(SEQ ID NO:140)或B10 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B10的VL结构域(SEQ ID NO:166)或B10 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xi)与B12的VH结构域(SEQ ID NO:141)或B12 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B12的VL结构域(SEQ ID NO:167)或B12 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xii)与B13的VH结构域(SEQ ID NO:142)或B13 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B13的VL结构域(SEQ ID NO:168)或B13 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xiii)与B14的VH结构域(SEQ ID NO:143)或B14 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B14的VL结构域(SEQ ID NO:169)或B14 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xiv)与B16的VH结构域(SEQ ID NO:144)或B16 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B16的VL结构域(SEQ ID NO:170)或B16 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xv)与B17的VH结构域(SEQ ID NO:145)或B17 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B17的VL结构域(SEQ ID NO:171)或B17 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xvi)与B18的VH结构域(SEQ ID NO:146)或B18 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B18的VL结构域(SEQ ID NO:172)或B18 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xvii)与B19的VH结构域(SEQ ID NO:147)或B19 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B19的VL结构域(SEQ ID NO:173)或B19 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xviii)与B21的VH结构域(SEQ ID NO:148)或B21 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与B21的VL结构域(SEQ ID NO:174)或B21 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xix)与H09的VH结构域(SEQ ID NO:149)或H09 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与H09的VL结构域(SEQ ID NO:175)或H09 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xx)与H10的VH结构域(SEQ ID NO:150)或H10 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与H10的VL结构域(SEQ ID NO:176)或H10 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xxi)与H11的VH结构域(SEQ ID NO:151)或H11 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与H11的VL结构域(SEQ ID NO:177)或H11 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xxii)与H12的VH结构域(SEQ ID NO:152)或H12 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与H12的VL结构域(SEQ ID NO:178)或H12 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xxiii)与H13的VH结构域(SEQ ID NO:153)或H13 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与H13的VL结构域(SEQ ID NO:179)或H13 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xxiv)与H14的VH结构域(SEQ ID NO:154)或H14 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与H14的VL结构域(SEQ ID NO:180)或H14 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xxv)与H15的VH结构域(SEQ ID NO:155)或H15 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与H15的VL结构域(SEQ ID NO:181)或H15 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域；
(xxvi)与H16的VH结构域(SEQ ID NO:156)或H16 mAb的人源化VH结构域具有至少约80％同一性的VH结构域；和与H16的VL结构域(SEQ ID NO:182)或H16 mAb的人源化VL结构域具有至少约80％同一性的VL结构域。
30.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B01的VH结构域(SEQ ID NO:131)相同的VH结构域和与B01的VL结构域(SEQ ID NO:157)相同的VL结构域。
31.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B02的VH结构域(SEQ ID NO:132)相同的VH结构域和与B02的VL结构域(SEQ ID NO:157)相同的VL结构域。
32.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B03的VH结构域(SEQ ID NO:133)相同的VH结构域和与B03的VL结构域(SEQ ID NO:158)相同的VL结构域。
33.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B04的VH结构域(SEQ ID NO:134)相同的VH结构域和与B04的VL结构域(SEQ ID NO:159)相同的VL结构域。
34.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B05的VH结构域(SEQ ID NO:140)相同的VH结构域和与B05的VL结构域(SEQ ID NO:160)相同的VL结构域。
35.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B06的VH结构域(SEQ ID NO:141)相同的VH结构域和与B06的VL结构域(SEQ ID NO:161)相同的VL结构域。
36.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B07的VH结构域(SEQ ID NO:142)相同的VH结构域和与B07的VL结构域(SEQ ID NO:162)相同的VL结构域。
37.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B08的VH结构域(SEQ ID NO:143)相同的VH结构域和与B08的VL结构域(SEQ ID NO:163)相同的VL结构域。
38.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B09的VH结构域(SEQ ID NO:144)相同的VH结构域和与B09的VL结构域(SEQ ID NO:164)相同的VL结构域。
39.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B10的VH结构域(SEQ ID NO:145)相同的VH结构域和与B10的VL结构域(SEQ ID NO:165)相同的VL结构域。
40.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B12的VH结构域(SEQ ID NO:146)相同的VH结构域和与B12的VL结构域(SEQ ID NO:166)相同的VL结构域。
41.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B13的VH结构域(SEQ ID NO:147)相同的VH结构域和与B13的VL结构域(SEQ ID NO:167)相同的VL结构域。
42.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B14的VH结构域(SEQ ID NO:148)相同的VH结构域和与B14的VL结构域(SEQ ID NO:168)相同的VL结构域。
43.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B16的VH结构域(SEQ ID NO:149)相同的VH结构域和与B16的VL结构域(SEQ ID NO:169)相同的VL结构域。
44.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B17的VH结构域(SEQ ID NO:150)相同的VH结构域和与B17的VL结构域(SEQ ID NO:170)相同的VL结构域。
45.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B18的VH结构域(SEQ ID NO:151)相同的VH结构域和与B18的VL结构域(SEQ ID NO:171)相同的VL结构域。
46.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B19的VH结构域(SEQ ID NO:152)相同的VH结构域和与B19的VL结构域(SEQ ID NO:172)相同的VL结构域。
47.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与B21的VH结构域(SEQ ID NO:153)相同的VH结构域和与B21的VL结构域(SEQ ID NO:173)相同的VL结构域。
48.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与H09的VH结构域(SEQ ID NO:154)相同的VH结构域和与H09的VL结构域(SEQ ID NO:174)相同的VL结构域。
49.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与H10的VH结构域(SEQ ID NO:155)相同的VH结构域和与H10的VL结构域(SEQ ID NO:175)相同的VL结构域。
50.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与H11的VH结构域(SEQ ID NO:156)相同的VH结构域和与H11的VL结构域(SEQ ID NO:176)相同的VL结构域。
51.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与H12的VH结构域(SEQ ID NO:157)相同的VH结构域和与H12的VL结构域(SEQ ID NO:177)相同的VL结构域。
52.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与H13的VH结构域(SEQ ID NO:158)相同的VH结构域和与H13的VL结构域(SEQ ID NO:178)相同的VL结构域。
53.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与H14的VH结构域(SEQ ID NO:159)相同的VH结构域和与H14的VL结构域(SEQ ID NO:179)相同的VL结构域。
54.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与H15的VH结构域(SEQ ID NO:160)相同的VH结构域和与H15的VL结构域(SEQ ID NO:180)相同的VL结构域。
55.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含与H16的VH结构域(SEQ ID NO:161)相同的VH结构域和与H16的VL结构域(SEQ ID NO:181)相同的VL结构域。
56.权利要求29所述的抗体，其中所述抗体是所述
B01，B02，B03，B04，B05，B06，B07，B08，B09，B010，B12，B13，B14，B16，B17，B18，B19，B21，H09，H10，H11，H12，H13，H14，H15，或H16抗体。
57.权利要求1至56中任一项所述的抗体，其中所述抗体是重组的。
58.权利要求1至57中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。
59.权利要求1至56中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。
60.权利要求1至28中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或去免疫化抗体。
61.权利要求1至56中任一项所述的抗体，其中所述抗体与成像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素缀合。
62.权利要求61所述的抗体，其中所述抗体与毒素缀合。
63.权利要求62所述的抗体，其中所述毒素是澳瑞他汀。
64.权利要求62所述的抗体，其中所述毒素是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
65.嵌合抗原受体，其包含与前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体的抗原结合结构域具有至少80％同一性的抗原结合结构域。
66.组合物，其包含在可药用载体中的权利要求1至56中任一项所述的抗体。
67.分离的多核苷酸分子，其包含编码权利要求1至56中任一项所述的抗体的核酸序列。
68.重组多肽，其包含抗体VH结构域，所述抗体VH结构域包含：B01的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:1、2和3)；B02的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:4、5和6)；B03的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:7、8和9)；B04的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:10、11和12)；B05的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:13、14和15)；B06的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:16、17和18)；B07的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:19、20和21)；B08的VH结构域的CDR1至3(SEQ IDNO:22、23和24)；B09的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:25、26和27)；B10的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:28、29和30)；B12的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:31、32和33)；B13的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:34、35和36)；B14的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:37、38和39)；B16的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:40、41和42)；B17的VH结构域的CDR1至3(SEQ IDNO:43、44和45)；B18的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:46、47和48)；B19的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:49、50和51)；B21的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:52、53和54)；H09的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:55、56和57)；H10的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:58、59、60)；H11的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:61、62和63)；H12的VH结构域的CDR1至3(SEQ IDNO:64、65和66)；H13的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:67、68和69)；H14的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:70、71和72)；B15的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:73、74和75)；或者B16的VH结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:76、77和78)。
69.重组多肽，其包含抗体VL结构域，所述抗体VL结构域包含：B01的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:79、三肽GNS和SEQ ID NO:80)；B02的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:81、三肽DNN和SEQ ID NO:82)；B03的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:83、三肽DAS和SEQ ID NO:84)；B04的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:85、三肽DAS和SEQ ID NO:86)；B05的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:87、三肽DAS和SEQ ID NO:88)；B06的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:89、三肽SHN和SEQ ID NO:90)；B07的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:91、三肽DAT和SEQ IDNO:92)；B08的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:93、三肽SNN和SEQ ID NO:94)；B09的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:95、三肽NNN和SEQ ID NO:96)；B10的VL结构域的CDR1至3(SEQ IDNO:97、三肽RNN和SEQ ID NO:98)；B12的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:99、三肽EDN和SEQID NO:100)；B13的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:101、三肽SNN和SEQ ID NO:102)；B14的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:103、三肽AAS和SEQ ID NO:104)；B16的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:105、三肽DAS和SEQ ID NO:106)；B17的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:107、三肽DVS和SEQ ID NO:108)；B18的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:109、三肽LGS和SEQ IDNO:110)；B19的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:111、三肽SNN和SEQ ID NO:112)；B21的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:113、三肽AAS和SEQ ID NO:114)；H09的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:115、三肽SNN和SEQ ID NO:116)；H10的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:117、三肽SNN和SEQ ID NO:118)；H11的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:119、三肽QDN和SEQ IDNO:120)；H12的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:121、三肽WDS和SEQ ID NO:122)；H13的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:123、三肽EDN和SEQ ID NO:124)；H14的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:125、三肽SNN和SEQ ID NO:126)；H15的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:127、三肽PDC和SEQ ID NO:128)；或者H16的VL结构域的CDR1至3(SEQ ID NO:129、三肽AAS和SEQID NO:130)。
70.分离的多核苷酸分子，其包含编码权利要求68或69所述的多肽的核酸序列。
71.宿主细胞，其包含一种或更多种编码权利要求1至56中任一项所述的抗体或者权利要求68或69所述的重组多肽的多核苷酸分子。
72.权利要求71所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。
73.制备抗体的方法，其包括：
(a)在细胞中表达一种或更多种编码权利要求1至56中任一项所述的抗体的VL和VH链的多核苷酸分子；以及
(b)从所述细胞中纯化所述抗体。
74.用于治疗患有癌症的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1至56中任一项所述的抗体。
75.权利要求74所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、皮肤癌脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、上皮癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
76.权利要求74所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
77.权利要求74所述的方法，其中所述癌症是结直肠腺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、乳腺癌、肝细胞癌、卵巢癌、肾的肾透明细胞癌、肺癌或肾癌。
78.权利要求74所述的方法，其中所述抗体在药学上合适的组合物中。
79.权利要求74所述的方法，其中所述抗体全身施用。
80.权利要求74所述的方法，其中所述抗体静脉内、皮内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下或局部施用。
81.权利要求74所述的方法，其还包括向所述对象施用至少第二抗癌治疗。
82.权利要求81所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是手术治疗、化学治疗、放射治疗、冷冻治疗、激素治疗、免疫治疗或细胞因子治疗。
83.权利要求82所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是化学治疗。
84.权利要求83所述的方法，其中所述化学治疗选自卡铂(或顺铂)、紫杉烷例如紫杉醇或多西他赛/>贝伐单抗和聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂(例如但不限于尼拉帕尼/>卢卡帕尼/>和奥拉帕尼)、或其组合。/>
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