CN117915942A - 用补体旁路途径抑制剂治疗镰状细胞病或β地中海贫血的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗镰状细胞病(SCD)、β地中海贫血(BT)、镰状细胞BT的方法、用途和组合物。更特别地，本发明涉及使用抗体或其片段、核酸分子、肽、小分子或适配体等补体途径组分(例如，因子P(备解素))抑制剂治疗患有SCD、BT或镰状细胞BT的患者。

Description

用补体旁路途径抑制剂治疗镰状细胞病或β地中海贫血的 方法

背景技术

镰状细胞病(SCD)是全球最常见的单基因疾病。在一些形式下，这种疾病是由β珠蛋白基因中的突变引起的，例如，β珠蛋白基因中的导致位置6处谷氨酸被缬氨酸取代的单核苷酸突变，该基因也是导致β地中海贫血(BT)和镰状细胞BT的原因。尽管广泛认识到该疾病的根本原因，但控制SCD症状的可用治疗选择很少。SCD的两个主要表现，贫血和血管闭塞危象(VOC)，影响SCD患者的死亡率、发病率和生活质量。尽管SCD患者有两种经批准的治疗选择，羟基脲和L-谷氨酰胺，但它们通常被认为是减弱疾病症状的次优方案。因此，在本领域中对治疗此类病症存在需要。

发明内容

本文描述了特异性或基本上特异性结合补体途径组分(例如，因子P(备解素))并且选择性阻断旁路补体途径激活的组合物。通过抑制该旁路补体途径的功能活性，例如，通过抑制备解素，本文所述的旁路补体途径抑制剂(例如，抗因子P单价抗体或其片段)抑制旁路补体途径诱导的攻膜复合物的组装。此外，单个备解素分子与备解素抑制剂的选择性结合可以减少由聚集引起的不期望的免疫复合物。因此，备解素(例如，备解素单体或多聚体)的选择性靶向可转而改善镰状细胞病(SCD)、β地中海贫血(BT)或镰状细胞BT患者的临床益处。

本披露部分地基于以下发现，旁路补体途径的抑制剂，例如像因子P(备解素)抑制剂，可以减弱甚至停止SCD的症状。通过使用已建立的SCD实验室模型(经受缺氧条件的Townes SS小鼠)，本披露首次证明，用抗备解素抑制剂治疗动物抑制了SCD的病理生理学，关于：(1)抑制红细胞(RBC)上的补体沉积；(2)减弱血管内溶血；和/或降低VOC的严重程度。更特别地，使用已建立的细胞模型，本披露显示了，通过用抗备解素单克隆抗体(MAb)预处理逆转了在缺氧条件下SCD小鼠RBC中C5b9和C3的补体片段沉积增强。此外，通过用抗备解素MAb预处理有效减弱了在缺氧条件下血管内溶血水平的增加(通过血浆乳酸脱氢酶(LDH)活性、游离血红素和游离血红蛋白和/或总胆红素水平测定)。第三，通过用抗备解素MAb预处理有效降低了在缺氧条件下SCD小鼠的肺和肝等重要器官的血管中血管闭塞的增加，而在用缓冲液预处理的假(对照)SCD小鼠中未观察到这种影响。这些数据表明，抗补体抗体(如抗备解素抗体)在细胞和器官水平上均保护SCD动物免受损伤。本披露提供的科学证据支持补体抑制剂(尤其是备解素拮抗剂，如抗备解素抗体)在治疗SCD和相关病症(诸如BT和镰刀BT)中的用途。

在一个方面，本披露的特征是一种治疗受试者中SCD的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的包括补体旁路途径抑制剂的组合物。

在另一方面，本披露的特征是一种治疗受试者中BT的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的包括补体旁路途径抑制剂的组合物。

在另一方面，本披露的特征是一种治疗受试者中镰状细胞BT的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的包括补体旁路途径抑制剂的组合物。

在前述方面中任一项的一些实施例中，该补体旁路途径抑制剂选自由抗体或其抗原结合片段、肽、小分子、核酸分子和适配体组成的组。

在前述方面中任一项的一些实施例中，该补体旁路途径抑制剂是备解素抑制剂。

在前述方面中任一项的一些实施例中，该备解素抑制剂是抗备解素抗体或其抗原结合片段。

在前述方面中任一项的一些实施例中，该抗备解素抗体或其抗原结合片段包括：

CDR-H1(SEQ ID NO:2)、CDR-H2(SEQ ID NO:3)和CDR-H3(SEQ ID NO:4)。

在前述方面中任一项的一些实施例中，该抗备解素抗体或其抗原结合片段包括：CDR-H1(SEQ ID NO:7)、CDR-H2(SEQ ID NO:8)、CDR-H3(SEQ ID NO:9)、CDR-L1(SEQ ID NO:10)、CDR-L2(SEQ ID NO:11)和CDR-L3(SEQ ID NO:12)；CDR-H1(SEQ ID NO:13)、CDR-H2(SEQ ID NO:14)、CDR-H3(SEQ ID NO:15)、CDR-L1(SEQ ID NO:16)、CDR-L2(SEQ ID NO:17)和CDR-L3(SEQ ID NO:18)；CDR-H1(SEQ ID NO:19)、CDR-H2(SEQ ID NO:20)、CDR-H3(SEQID NO:21)、CDR-L1(SEQ ID NO:22)、CDR-L2(SEQ ID NO:23)和CDR-L3(SEQ ID NO:24)；或CDR-H1(SEQ ID NO:25)、CDR-H2(SEQ ID NO:26)、CDR-H3(SEQ ID NO:27)、CDR-L1(SEQ IDNO:29)、CDR-L2(SEQ ID NO:29)和CDR-L3(SEQ ID NO:30)。

在前述方面中任一项的一些实施例中，该抗备解素抗体包括：SEQ ID NO:43的重链(HC)和SEQ ID NO:44的轻链(LC)；SEQ ID NO:45的HC和SEQ ID NO:46的LC；SEQ ID NO:47的HC和SEQ ID NO:48的LC；SEQ ID NO:49的HC和SEQ ID NO:50的LC；SEQ ID NO:51的HC和SEQ ID NO:52的LC；或SEQ ID NO:53的HC和SEQ ID NO:44的LC。

在前述方面中任一项的一些实施例中，该抗备解素抗体或其抗原结合片段包括：SEQ ID NO:6的抗FP VHH组分；SEQ ID NO:6的序列；SEQ ID NO:31的V_HH；SEQ ID NO:32的V_HH；SEQ ID NO:33的V_HH；或SEQ ID NO:34的V_HH。

在前述方面中任一项的一些实施例中，该肽抑制补体因子C3。

在前述方面中任一项的一些实施例中，该小分子是补体因子D抑制剂。

在前述方面中任一项的一些实施例中，该组合物包括补体抑制剂和药学上可接受的载剂。

在任何前述方面的一些实施例中，该方法降低了该受试者的血管内溶血。

在前述方面的一些实施例中，SCD包括溶血性贫血或急性VOC事件。在一些实施例中，VOC事件是肺VOC和/或肝VOC。例如，在一些实施例中，该肺VOC表现为急性胸腔综合征(ACS)和/或慢性肺病；和/或该肝VOC表现为严重腹痛和/或肝功能障碍。

在任何前述方面的一些实施例中，该受试者呈现腹部鼓胀、右上腹痛或急性疼痛性肝肿大。

在任何前述方面的一些实施例中，该受试者是被诊断为患有SCD、BT或镰状细胞BT的人患者。

在任何前述方面的一些实施例中，该人患者未满18岁。

在前述方面的一些实施例中，该患有SCD的受试者被诊断为具有β珠蛋白基因中的突变。例如，在一些实施例中，该β珠蛋白基因中的突变是β珠蛋白基因中的单核苷酸突变。在一些实施例中，该β珠蛋白基因中的单核苷酸突变导致相对于如下的SEQ ID NO:1在位置6处谷氨酸被缬氨酸取代：VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH。

在前述方面的一些实施例中，该SCD包括红细胞(RBC)中的补体沉积。例如，在一些实施例中，该SCD包括RBC中的C5b9沉积。

在前述方面的一些实施例中，该SCD包括血管内溶血(IVH)。在一些实施例中，该IVH的特征在于包括LDH、胆红素、游离血红蛋白和游离血红素的至少一种标志物的增加。

在任何前述方面的一些实施例中，在向该受试者施用该补体旁路途径抑制剂后，该受试者表现出SCD、BT或镰状细胞BT表型的降低。例如，在一些实施例中，该SCD表型包括导致血管组织损害的炎症或细胞毒性增加；VOC事件触发的疼痛加剧；或SCD患者的死亡率或发病率增加。

在任何前述方面的一些实施例中，该组合物通过静脉内施用。

在另一方面，本披露的特征是一种用于在缺氧条件下提高细胞活力或降低细胞死亡的方法，该方法包括使该细胞与有效量的包含补体旁路途径抑制剂的组合物接触。

在前述方面的一些实施例中，在体内接触这些细胞。

在前述方面的一些实施例中，该细胞是镰状细胞

在任何前述方面的一些实施例中，SCD的特征在于选自以下的特征：(a)补体C3和/或C5b9在受影响细胞(例如，RBC)中的沉积增加，尤其是在触发条件(例如，缺氧)下；(b)新生血管溶血增加，尤其是在触发条件(例如，缺氧)下，其中溶血增加的特征在于血浆LDH活性/水平、游离血红素和/或游离血红蛋白水平和/或总胆红素水平的增加；或(c)VOC的严重程度增加，尤其是在触发条件(例如，缺氧)下。

在任何前述方面的一些实施例中，用补体抑制剂治疗导致选自以下的结果：(a)抑制或逆转该SCD受试者的RBC中C3和C5b9的补体片段沉积，例如在缺氧条件下；(b)减弱或逆转缺氧条件下血管内溶血(如测量到血浆LDH活性/水平、游离血红素和/或游离血红蛋白水平和/或总胆红素水平增加)的水平；或(c)降低或逆转该SCD受试者的肺、肾、肝和脾等重要器官血管中的血管闭塞。例如，在一些实施例中,与用羟基脲治疗该受试者相比，用补体抑制剂治疗导致来自(a)-(c)的至少一个结果的改善。

在另一方面，本披露的特征是一种包括补体旁路途径抑制剂的组合物，该组合物用于在治疗受试者的SCD或与之相关的症状中使用，特别是用于提高血细胞的活力，这些血细胞含有使其易受缺氧或低氧胁迫影响的一个或多个突变，例如，正常血红蛋白A(α2β2)到血红蛋白S(α2β6Val2)的突变或RBC的β珠蛋白基因中的突变。

在另一方面，本披露的特征是一种包括补体旁路途径抑制剂的组合物，该组合物用于在缺氧条件下提高细胞活力或降低细胞死亡中使用。

在前述方面的一些实施例中，补体旁路途径抑制剂是备解素抑制剂。

在前述方面的一些实施例中，备解素抑制剂选自包括抗备解素抗体或包含与备解素结合的至少一个部分的双特异性抗体的组。在前述方面中任一项的一些实施例中，该补体旁路途径抑制剂是选自由小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA和反义寡核苷酸组成的组的核酸分子。在一些实施例中，该核酸分子与编码补体C3的内源性核酸序列的一部分互补。

本披露至少部分地基于以下惊人发现，补体抑制剂(例如，备解素抑制剂，例如，抗备解素抗体、核酸分子、肽、小分子或适配体)提供令人惊讶的能力来减弱与SCD、BT或镰状细胞BT相关的发病机制。与包含羟基脲(HU)的标准治疗方案相比，对抗备解素抗体疗法的比较评估表明，在缺氧条件下，该抗备解素抗体在减弱镰状细胞小鼠中C3沉积和伴随的C5b9沉积的方面优于HU。使用本文所述的组合物和方法，补体蛋白(例如，备解素)可以被有效抑制，以治疗SCD、BT或镰状细胞BT。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。本专利或专利申请公开的带有一个或多个彩色附图的副本将根据要求并且并支付必要的费用后由官方提供。

为了更完整地理解本文披露的原理及其优点，现在联合附图参考以下描述。

图1显示了镰状红细胞(RBC)上的补体旁路途径(CAP)造成镰状细胞病理。RBC是CAP激活的位点，该激活触发表面的C3调理作用以及补体介导的RBC溶血。血管内溶血不仅导致贫血，而且通过从RBC释放游离血红素造成CAP激活的进一步扩大。镰状RBC的C3调理作用也通过血管外溶血促进贫血。此外，C3调理作用是VOC的关键机制基础，这被以下事实所证明，C3调理作用可通过磷脂酰丝氨酸(PS)在镰状RBC上的暴露来促成，并且通过增强其与激活的内皮细胞上的粘附分子诸如P选择素和补体受体3(CR3或Mac-1)的相互作用来促进VOC。

图2显示了在SCD的体内小鼠模型中研究VOC中补体激活的抑制作用的实验概要。Townes SS小鼠在缺氧处理前十天用PBS(媒介物)或“14E1”(抗备解素)进行四次预防性处理，并且在缺氧处理后处死，然后在常氧条件下静止一小时。在媒介物处理亚组中，动物未暴露于缺氧条件，并且持续保持在常氧条件(基线)。安乐死后，从动物中收获血液样品和关键器官，以测量RBC上补体沉积水平、血管内溶血和VOC的严重程度。

图3显示了条形图，这些条形图显示暴露于缺氧条件的镰状细胞RBC上缺氧诱导的补体片段沉积的基于流式细胞术的分析以及抗备解素单克隆抗体对补体沉积的影响。图中显示了正常、缺氧(对照)、缺氧+羟基脲和缺氧+抗备解素(14E1)预处理下补体片段水平(从左到右)的变化。右侧分图显示C3/C3b/iC3b水平，而左侧分图显示C5b9水平。

图4显示了条形图，这些条形图显示14E1单克隆抗体对SCD动物中缺氧诱导的血管内溶血的影响。图中显示了正常、缺氧(对照)、缺氧+羟基脲和缺氧+抗备解素(14E1)预处理下溶血标志物水平(从左到右)的变化。测量了以下溶血标志物：乳酸脱氢酶(LDH)(左上分图)；胆红素(右下分图)；游离血红蛋白(左下分图)；和游离血红素(右上分图)。

图5显示了缺氧诱导的肺血管闭塞和14E1单克隆抗体处理的效果的数据。左边是各种条件下(从上到下)小鼠肺中镰状细胞(SS)RBC的代表性显微照片：常氧、缺氧(对照)、缺氧+羟基脲和缺氧+14E1预处理。PE抗小鼠TER-119和DAPI用作荧光探针。右侧分图显示了使用标准软件量化图像荧光密度的条形图。

图6显示了缺氧诱导的肾血管闭塞和14E1单克隆抗体处理的效果的数据。左边是各种条件下(从左到右)小鼠肾中SS RBC的代表性显微照片：常氧、缺氧(对照)、缺氧+羟基脲和缺氧+14E1预处理。PE抗小鼠TER-119和DAPI用作荧光探针。右侧分图显示了使用标准软件量化图像荧光密度的条形图。

图7显示了缺氧诱导的肝血管闭塞和14E1单克隆抗体处理的效果的数据。左边是各种条件下(从左到右)小鼠肝中SS RBC的代表性显微照片：常氧、缺氧(对照)、缺氧+羟基脲和缺氧+14E1预处理。PE抗小鼠TER-119和DAPI用作荧光探针。右侧分图显示了使用标准软件量化图像荧光密度的条形图。

图8显示了缺氧诱导的脾血管闭塞和14E1单克隆抗体处理的效果的数据。左边是各种条件下(从左到右)小鼠脾中SS RBC的代表性显微照片：常氧、缺氧(对照)、缺氧+羟基脲和缺氧+14E1预处理。PE抗小鼠TER-119和DAPI用作荧光探针。右侧分图显示了使用标准软件量化图像荧光密度的条形图。

图9显示了在SCD的体内小鼠模型中研究VOC中补体激活的抑制作用的实验概要。Townes SS小鼠被分成五组，并且在血红素处理前十天用PBS(媒介物)或14E1单克隆抗体进行四次预防性处理。将动物暴露于50μmol/Kg的血红素中三小时，然后处死动物。在其中一个媒介物处理组中，动物未暴露于血红素，并且作为基线。安乐死后，从动物中收获血液样品和关键器官，以测量RBC上补体沉积水平、血管内溶血和血管闭塞的严重程度。

图10显示了条形图，这些条形图显示抗备解素抗体对SCD动物中血红素诱导的血管内溶血的影响。图中显示了正常(对照)、血红素、血红素+抗备解素抗体预处理下溶血标志物水平(从左到右)的变化。测量了以下溶血标志物：胆红素(最左侧)；乳酸脱氢酶(LDH)(中心)；和游离血红蛋白(最右侧)。****P<0.0001；***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05。

图11显示了条形图，这些条形图显示抗备解素抗体对SCD动物中血红素诱导的血管内溶血的影响。图中显示了正常、血红素以及血红素+抗备解素抗体预处理的补体片段水平(从左到右)的变化。左侧分图显示了C3/C3b/iC3b沉积，而右侧分图显示了C5b9沉积。***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05。

图12显示了关于肺中血红素诱导的血管闭塞和抗备解素抗体处理的效果的数据。左边是各种条件下(从左到右)小鼠肺中镰状细胞(SS)RBC的代表性显微照片：正常(对照)、血红素和血红素+抗备解素抗体预处理。右侧分图显示了使用标准软件量化图像荧光密度的条形图。****P<0.0001；***P<0.001。

图13显示了关于肝中血红素诱导的血管闭塞和抗备解素抗体处理的效果的数据。左边是各种条件下(从左到右)小鼠肺中镰状细胞(SS)RBC的代表性显微照片：正常(对照)、血红素和血红素+抗备解素抗体预处理。右侧分图显示了使用标准软件量化图像荧光密度的条形图。****P<0.0001；***P<0.001；*P<0.05。

图14显示了基于流式细胞术的关于镰状RBC上血红素诱导的补体沉积的数据以及抗备解素抗体处理的效果。左边是散点图，显示了iC3b在各种条件下的沉积，包括正常、血红素和血红素+抗备解素抗体。右侧是量化iC3b沉积的条形图。****P<0.0001。

图15显示了基于流式细胞术的关于镰状RBC上血红素诱导的补体沉积的数据以及抗备解素抗体处理的效果。左边是散点图，显示了C5b9在各种条件下的沉积，包括正常、血红素和血红素+抗备解素抗体预处理。右侧是量化C5b9沉积的条形图。**P<0.01。

图16显示了条形图，这些条形图显示暴露于血红素的内皮细胞上血红素诱导的补体片段沉积的基于流式细胞术的分析以及抗备解素抗体对补体沉积的影响。图中显示了正常、血红素以及血红素+抗备解素抗体预处理的补体片段水平(从左到右)的变化。左侧分图显示了C3/C3b/iC3b沉积，而右侧分图显示了C5b9沉积。ns＝不显著。****P<0.0001。

具体实施方式

本披露部分基于以下发现，即补体蛋白因子P(备解素)在镰状细胞病(SCD)的发展和/或表现中的作用，该病是一种危及生命的疾病，患者的生活质量较差。利用公认的动物模型(例如Towne’s SCD小鼠模型，其中小鼠血红蛋白α和β基因被含有具有单个氨基酸替换(Glu→Val)的镰状细胞突变(β^S)的相应人基因替换)，本申请首次证明了补体旁路途径(CAP)抑制剂(例如，抗备解素抗体)迄今未被认识到的作用，用于体内SCD或与之相关的症状的有效改善。

定义

在详细描述本披露之前，应当理解，本披露不限于特定的组合物或生物系统，这些当然可以改变。还应理解的是，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并不意图进行限制。

如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非内容另有明确指示，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“分子”任选地包括两个或多个此类分子的组合，诸如此类。

术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任何和所有可能组合，以及在备选方案(“或”)中解释时组合的缺少。

应当理解，本文所述的本披露的方面和实施例包括“包含”、“由……组成”和“基本上由……组成”方面和实施例。

术语“约”是指该值的正负10％的范围，例如，“约5”是指4.5至5.5，除非本披露的上下文另有指示或与这种解释不一致。例如，在诸如“约49、约50、约55”之类的数值列表中，“约50”是指延伸到前一个和后一个数值之间的一个或多个间隔的一半以下的范围，例如，超过49.5到低于52.5。

术语“基本上”意味着足以达到预期目的。因此，术语“基本上”允许相对于绝对或完全状态、尺寸、测量值、结果等诸如此类如本领域普遍技术人员所预料的微小、不明显的变化，但不会明显影响整体性能(例如，+/-10％)。

在本披露提供数值范围的情况下，意图是该范围的上限和下限之间的每个中间值以及该所述范围内的任何其他所述值或中间值均包含在本披露中。例如，如果规定了1mM到8mM的范围，则意在明确披露2mM、3mM、4mM、5mM、6mM和7mM。

术语“受试者”可以是任何动物，例如，哺乳动物。受试者可以是例如人、非人灵长类动物(例如，猴、狒狒或黑猩猩)、马、母牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠或小鼠。包括例如，转基因动物或基因改变(例如，敲除或敲入)的动物。

如本文所用，“需要预防”、“需要治疗”或“有需要”的受试者是指根据适当的医务工作者(例如，就人而言，是医生、护士或护理工作者；在非人哺乳动物的情况下，则是兽医)的判断将从给定的治疗(例如用于治疗补体介导的疾病或障碍的特定治疗剂或预防剂或诊断剂)中合理获益的人。

如本文所用，术语“治疗(“treat”或“treating”)”是指提供干预，例如，为受试者提供任何类型的医疗或外科管理。可以提供治疗以逆转、缓解、抑制障碍或病症的进展，预防或降低障碍或病症的可能性；或逆转、缓解、抑制或预防障碍或病症的一种或多种症状或表现(例如，病理生理学)的进展，预防或降低该障碍或病症的一种或多种症状或表现的可能性。“预防”是指使得在至少一些个体中至少在一段时间内不发生障碍或病症，或其症状或表现。治疗可以包括在出现指示补体介导的病症的一种或多种症状或表现后，向受试者施用补体抑制剂(例如，备解素抑制剂)，例如以逆转、缓解、降低病症严重程度和/或抑制或预防病症进展和/或逆转、缓解、降低病症的一种或多种症状或表现的严重程度和/或抑制病症的一种或多种症状或表现。根据本文所述的方法，可以将补体抑制剂(例如，备解素抑制剂)施用于已患补体介导的疾病的受试者或相对于普通人群成员而言患这种障碍的风险增加的受试者。这种抑制剂(例如，备解素抑制剂)可以预防性施用，即在病症的任何症状或表现出现之前施用。典型地，在这种情况下，例如，当暴露于补体激活状况(例如，缺氧)时，该受试者将面临发展该病症的风险。

术语“症状”是指疾病、疾患、损伤或某些在体内不正常的指示。症状由经历症状的个体感觉到或注意到，但可能不容易被其他人(例如，非卫生保健专业人员)注意到。术语“体征”也指某些在体内不正常的指示，其可以被医生、护士或其他卫生保健专业人员看到。

当与药剂(例如，药物)联合使用时，术语“施用(“administration”或“administering”)”是指将该药剂直接递送到细胞或靶组织中或其上，或将该药剂提供给患者，从而影响它靶向的组织。

术语“接触”是指使药剂(例如，抗备解素抗体)和靶标(例如，因子P)彼此足够接近，以便一方对另一方施加生物效应(例如，抑制靶标)。在一些实施例中，术语接触意味着药剂与靶标的结合。

如本文所用，术语“抑制剂”或“拮抗剂”是指抑制另一种物质(例如，补体组分，诸如备解素)的表达、活性和/或水平的物质，诸如抗体、核酸、适配体和小分子。当两种物质对同一生理功能产生相反的影响时，就会发生功能或生理对抗。化学拮抗或灭活是两种物质之间中和它们的作用的反应，例如，抗体与抗原的结合，其防止抗原作用于其靶标。处置拮抗是指改变物质的处置(其吸收、生物转化、分布或排泄)，使得较少药剂到达靶标或它在那里的持久性被降低。术语“抑制”或“降低”或其语法变体是指靶标的特定水平或活性的降低或减弱，例如，靶标的水平或活性很少或基本上不可检测到(最多是微不足道的量)。这种类型的抑制剂的实例是抗体、干扰RNA分子，诸如siRNA、miRNA和shRNA。除了包含抑制补体蛋白(例如，备解素)表达的物质外，备解素抑制剂的额外的实例包括减弱编码补体蛋白(例如，备解素)的内源性基因的转录的物质，诸如小分子。在一些实施例中，该抑制剂不是补体C5抑制剂。

如本文所用，关于基因的术语“破坏”是指防止功能基因产物的形成。如果基因产物实现了其正常(野生型)功能，那么它就是有功能的。该基因的破坏防止了由该基因编码的功能因子的表达，并且可能包含该基因编码的序列中的一个或多个碱基的插入、缺失或取代，和/或在动物中表达基因所必需的启动子和/或操作子。被破坏的基因可以通过例如以下而被破坏：从动物基因组中去除基因的至少一部分、改变该基因以防止该基因编码的功能因子表达、干扰RNA、或外源性基因表达显性负因子。内源性备解素的破坏可以例如通过使用以下来完成：抗备解素抗体、核酸分子、siRNA、shRNA、miRNA、反义寡核苷酸、适配体和基因编辑技术。

如本文所用，术语“内源性”描述了在特定生物体(例如，人)或生物体内特定位置(例如，器官、组织或细胞，诸如人细胞)中天然发现的分子(例如，代谢物、多肽、核酸或辅因子)。

如本文所用，术语“抗体”是指对抗原例如补体蛋白具有高结合亲和力的抗体或其功能部分或片段。该术语以最广泛的意义使用，包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab’)2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rlgG)片段、单链抗体片段，包括单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语涵盖任何类别或亚类的天然的、基因工程改造的和/或以其他方式修饰的抗体，包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”或“HuMab”是指显示单一结合特异性并且具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。

术语“单结构域抗体”，也称为结构域抗体、VHH、VNAR或sdAb，是一种由单个单体可变抗体结构域组成并且在常规Fab区中缺少轻链以及重链的CH结构域的抗体。sdAb可以从例如骆驼科(例如，单峰骆驼、骆驼、美洲驼和羊驼)重链抗体的VHH结构域和软骨鱼(例如，鲨鱼)重链抗体的VNAR结构域(称为免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR))产生。可替代地，sdAb可以通过将人或小鼠的正常IgG的二聚体可变结构域通过骆驼化几个关键残基而分裂成单体来产生。

术语“抗原”是指可特异性结合抗体或其抗原结合片段的任何分子，例如，蛋白质或其片段。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等人Protein Eng[蛋白质工程].8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“抗原片段”是指可以被抗原特异性抗体识别的抗原部分。

术语“抗原结合片段”是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体和抗原之间特异性结合的氨基酸。抗原结合片段通常包含可变重链(VH)互补决定区(CDR)1-3(VHCDR1-3)，任选地与可变轻链(VL)CDR 1-3(VLCDR1-3)一起。对于某些抗原，抗原结合结构域或抗原结合片段可仅结合抗原的一部分。被抗体特异性识别和结合的抗原的部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域和抗原结合片段包括Fab(抗原结合的片段)；F(ab')2片段，即具有两个在铰链区通过二硫桥连接的Fab片段的二价片段；Fv片段；单链Fv片段(scFv)(参见，例如，Bird等人Science[科学]242:423-426,1988；和Huston等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883,1988)；具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；dAb(Ward等人,Nature[自然]341:544-546,1989)。该Fab片段具有在恒定区之间通过二硫键共价连接的VH-CH1和VL-CL结构域。该Fv片段较小，并且具有非共价连接的VH和VL结构域。为了克服非共价连接的结构域解离的趋势，可以构建scFv。该scFv含有柔性多肽，它将(1)VH的C末端连接到VL的N末端，或(2)VL的C末端连接到VH的N末端。15-mer(Gly4Ser)3肽可用作接头，但本领域已知其他接头。在不含轻链的骆驼科抗体的情况下，抗原结合片段包含VHH的CDR。抗原结合片段可以使用常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段以获得效用。抗原结合片段可以通过重组DNA技术，或通过酶或化学切割完整的免疫球蛋白产生。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中序列高变和/或形成结构定义环(“高变环”)的每个区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在HCVR中(H1、H2、H3)，三个在LCVR中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或参与抗原识别。示例性高变环在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)在L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65、和H3的95-102处发生。(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学目的蛋白质序列],第5版马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院公共卫生服务(1991))。除HCVR中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。

如本文所用，术语“干扰RNA”是指抑制靶RNA转录物表达的RNA，诸如siRNA、miRNA或shRNA，例如，通过(i)退火至靶RNA转录物，从而形成核酸双链体；和(ii)促进核酸酶介导的RNA转录物降解和/或(iii)减缓、抑制或防止RNA转录物的翻译，诸如通过在空间上阻止功能性核糖体RNA转录物复合物的形成或以其他方式减弱靶RNA转录物中功能性蛋白质产物的形成。本文所述的干扰RNA可以以例如单链或双链寡核苷酸的形式或以含有编码该干扰RNA的转基因的载体(例如，病毒载体)的形式提供给患者，例如患有SCD或本文所述相关障碍的人患者。示例性干扰RNA平台例如描述于Lam等人,Mol.Ther.Nucleic Acids[分子疗法核酸]4:e252(2015)；Rao等人,Adv.Drug Deliv.Rev.[先进药物输送评论]61:746-769(2009)；和Borel等人,Mol.[分子]22:692-701(2014)，其中每一个的披露内容通过引用以其全文并入本文。

术语“小分子”是指分子量小于约2500amu、小于约2000amu、小于约1500amu、小于约1000amu或小于约750amu的有机分子。在一些实施例中，小分子包含一个或多个杂原子。

本文中使用的术语“适配体”是指连接到特定靶标的寡核苷酸(通常是RNA分子)。“适配体”可以指寡核苷酸适配体(例如，RNA适配体)。如本文所用，术语“适配体”是指基于其结合其他分子的能力从随机池中选择的DNA或RNA分子。已经选择了结合核酸、蛋白质、小有机化合物甚至整个生物体的适配体。适配体数据库保存在aptamer(dot)icmb(dot)utexas(dot)edu/的万维网上。

如本文所用，术语“人备解素”是指在血浆中发现的一种469个氨基酸的可溶性糖蛋白，其具有七个血小板应答蛋白I型重复序列(TSR)，N末端结构域TSR0是截短结构域。人备解素是一种53kDa的蛋白质，包括一个信号肽(氨基酸1-28)和六个不相同的TSR重复序列，每个TSR重复序列约60个氨基酸，如下所示：氨基酸80-134(TSR1)、氨基酸139-191(TSR2)、氨基酸196-255(TSR3)、氨基酸260-313(TSR4)、氨基酸318-377(TSR5)和氨基酸382-462(TSR6)。备解素是通过将棒状单体寡聚成环状二聚体、三聚体和四聚体而形成的。在GenBank数据库中，人备解素的氨基酸序列的登录号如下：对于人备解素，参见，例如，GenBank登录号AAA36489、NP—002612、AAH15756、AAP43692、S29126和CAA40914。备解素是旁路补体激活级联的正调节因子。备解素的已知结合配体包括C3b、C3bB和C3bBb(Blatt,A.等人,Immunol.Rev.[免疫学评论],274:172-90,2016)。

如本文所用，术语“小鼠备解素”是指血浆中发现的457个氨基酸的可溶性糖蛋白，其具有七个TSR，N末端结构域TSR0被截短。小鼠备解素是一种50kDa的蛋白质，包括一个信号肽(氨基酸1-24)和六个不相同的TSR，每个TSR约60个氨基酸，如下所示：氨基酸73-130(TSR1)、氨基酸132-187(TSR2)、氨基酸189-251(TSR3)、氨基酸253-309(TSR4)、氨基酸311-372(TSR5)和氨基酸374-457(TSR6)。小鼠备解素是通过棒状单体低聚成环状二聚体、三聚体和四聚体而形成的。例如，在GenBank数据库(GenBank登录号P11680和S05478)中发现小鼠备解素的氨基酸序列。

如本文所用，术语“旁路补体途径”是指补体激活的三种途径之一(其他途径是经典途径和凝集素途径)。该旁路补体途径通常被细菌、寄生虫、病毒或真菌激活，尽管IgAAb和某些IgL链也被报道激活了这一途径。

如本文所用，术语“旁路补体途径失调”是指旁路补体途径提供宿主对病原体的防御且清除免疫复合物和受损细胞以及进行免疫调节的能力的任何异常。旁路补体途径失调可发生在液相中以及细胞表面，并且可导致补体过度激活或调节不足，两者都会导致组织损伤。

如本文所用，术语“由旁路补体途径失调介导的疾病”是指由旁路补体途径失调引起的身体功能、系统或器官的中断、停止或障碍。此类疾病将受益于用本文所述的组合物或配制品治疗。在一些实施例中，该疾病是由旁路补体途径提供宿主对病原体的防御且清除免疫复合物和受损细胞以及进行免疫调节的能力的任何异常引起的。本文还包括由旁路补体途径的一种或多种组分或由旁路补体途径产生的产物的失调直接或间接介导的疾病。

如本文所用，术语“旁路补体途径依赖性攻膜复合物组装”是指作为旁路补体途径激活的结果而形成的末端复合物，并且包括补体组分C5、C6、C7、C8和C9。攻膜复合物(MAC)的组装导致细胞裂解。

如本文所用，术语“旁路补体途径依赖性溶血”是指由增加的旁路补体途径依赖性MAC组装和/或红细胞上的沉积介导的红细胞裂解。

术语“样品”或“生物样品”是指从受试者获得的任何实体(例如，含有细胞、血液、血浆、血清或其他血液级分、淋巴、尿液、脑脊液、腹水、唾液、母乳、眼泪、阴道排液、羊水、灌洗液、精液、腺体分泌物、渗出液、囊肿和粪便内容物的组合物)。

诸如补体抑制剂(例如，备解素抑制剂)等活性剂的“有效量”是指足以引发所期望生物反应(或相当于抑制不期望的生物反应)的活性剂的量。有效的特定药剂的绝对量可以根据诸如期望的生物学终点、要递送的药剂、靶组织等因素而变化。“有效量”可以单剂量施用或多剂量施用。例如，治疗剂的有效量可以是足以缓解障碍的至少一种症状的量。有效量可以是足以减缓慢性和进展性障碍进展的量，例如，增加该障碍的一种或多种症状或体征出现之前的时间，或增加患有该障碍的个体达到一定程度损伤之前的时间。有效量可以是足以允许比不存在药剂时更快或更大程度地从疾病中恢复的量。为了本披露的目的，有效量的药物、化合物或药物组合物是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床上下文中所理解的，有效量的补体抑制剂(例如，备解素抑制剂)或其药物组合物可以与或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物联合使用。因此，在施用一种或多种治疗剂的上下文中，可以考虑“有效量”，如果与一种或多种其他药剂联合使用，可以或已经达到期望的结果，则可以考虑以有效量施用单一补体抑制剂(例如，备解素抑制剂)。

如本文所用，“活性”指多肽的保留天然或天然存在的多肽的生物活性的一种或多种形式，其中“生物”活性指由天然或天然存在的多肽引起的生物功能(例如，酶功能)。

“药学上可接受的”载剂是指由非生物学或其他不期望的材料组成的载剂。术语“载剂”在本文中一般用于指除一种或多种活性剂以外的药物配制品中存在的任何组分，因此包括稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填料、着色剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。类似地，本文所提供的分子的“药学上可接受的”盐或变体(例如，酯)是在生物学上或在其他方面不期望的盐或变体。

如本文所用，术语“盐”是指本主题披露的化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或通过将游离碱形式的纯化化合物与合适的有机或无机酸单独反应并且分离由此形成的盐来制备。药学上可接受的碱加成盐可用金属或胺(诸如碱金属和碱土金属氢氧化物)形成或由有机胺形成。用作阳离子的金属的实例包括但不限于钠、钾、镁、钙等。合适的胺的实例包括但不限于N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。盐可由无机酸硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物(诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷等)制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲磺酸萘酯、葡庚酸盐、乳糖酸盐、十二烷基磺酸盐和羟乙基磺酸盐等。盐也可以由有机酸制备，诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、烷二酸、芳香酸、脂族和芳香族磺酸等。代表性盐包括乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、苯甲酸甲酯、二硝基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、乙酸苯酯、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”或其变体是指在合理的医学判断范围内，适用于与受试者(例如，人受试者)接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应等，与合理的益处/风险比相称，并且对其预期用途有效的那些盐，以及本披露的化合物的两性离子形式(如果可能)。因此，药学上可接受的盐可以包括基于碱金属和碱土金属的阳离子，诸如钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。还考虑氨基酸的盐，如精氨酸盐、葡萄糖酸盐、半乳糖醛酸盐等。

如本文所用，术语“诊断”是指可以确定受试者是否可能患有给定疾病或病症(包括但不限于SCD和相关疾病和障碍)的方法。熟练的技术人员通常根据一个或多个诊断指标进行诊断，例如标志物，其存在、不存在、量或量的变化指示疾病或病症的存在、严重程度或不存在。其他诊断指标可以包括患者病史；身体症状，例如生命体征或表型、基因型或环境或遗传因素的无法解释的变化。熟练的技术人员会理解，术语“诊断”是指将发生某些病程或结果的可能性增加；也就是说，与没有表现出给定特征(例如，诊断指标的存在或水平)的个体相比，表现出该特征的患者更可能发生那一病程或结果。本披露的诊断方法可以独立使用，或与其他诊断方法组合使用，以确定病程或结果是否更可能发生在表现出给定特征的患者中。

术语“细胞”是指组织的基本组成部分，诸如人、猴、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、山羊、猪、狗、猫、雪貂、母牛、绵羊、马等的细胞。这些细胞可以是二倍体或单倍体(即，性细胞)。这些细胞也可以是多倍体、非整倍体或无核细胞。该细胞可以来自特定组织或器官，诸如血液、心脏、肺、肾、肝、骨髓、胰腺、皮肤、骨、静脉、动脉、角膜、血液、小肠、大肠、脑、脊髓、平滑肌、骨骼肌、卵巢、睾丸、子宫、脐带等。该细胞还可以是血小板、骨髓细胞、红细胞、淋巴细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、心肌、骨骼肌细胞、内分泌细胞、神经胶质细胞、神经元、分泌细胞、屏障功能细胞、收缩细胞、吸收细胞、粘膜细胞、角膜缘细胞、干细胞(全能、多能(pluripotent或multipotent))、未受精或受精卵母细胞、精子等。包括正常细胞和转化细胞。

术语“镰状细胞病”或“SCD”在本领域中具有其一般含义，并且指的是一种遗传性血液障碍，其中红细胞呈现异常、僵硬的镰刀状。红细胞镰变降低细胞的灵活性，并且导致各种危及生命的并发症的风险。术语包括镰状细胞贫血、血红蛋白SC病和镰状细胞β地中海贫血。

如本文所用，“β地中海贫血(“beta thalassemia”或“βthalassemia”)”是指一种由于血红蛋白β链合成减少或缺失而导致的遗传性血液障碍。这是β珠蛋白基因中或附近的一个或多个突变的结果。术语“血管闭塞”或“VOC”在本领域中具有其一般含义，例如，与SCD的常见并发症有关，该SCD导致毛细血管闭塞和流向器官的血流受限，从而导致缺血、血管功能障碍、组织坏死和/或器官损害。VOC通常是血管闭塞性危象的一个组成部分，但也可能更为有限，临床上无症状，并且不会导致血管闭塞性危机住院。如本文所用，术语“血管闭塞性危象”是指SCD的疼痛并发症，导致住院，与毛细血管闭塞和器官血流受限相关，导致缺血、严重疼痛、坏死和器官损害。

术语“急性胸腔综合征”是一种通常以发热、胸痛和胸片上出现新浸润为特征的病症。在SCD上下文中，术语“慢性肺病”通常表现为影像学间质异常、肺功能受损，最严重的表现为肺动脉高压。

如本文所用，术语“溶血性贫血”是指红细胞数(RBC)/mm或100mL血液中血红蛋白的量低于正常值的任何情况，例如，由于红细胞的破坏。如本文所用，术语“血小板减少症”是指血液中循环的血小板数量低于血小板正常范围的病症。

术语“补体沉积”是指导致补体(例如，C5b9或C3b)沉积在靶细胞(例如，RBC)上的活性或事件，以此方式触发血液中含有补体相关蛋白组的一系列级联(补体激活途径)。此外，补体激活产生的蛋白质片段可以诱导免疫细胞的迁移、吞噬和激活。相关的下游事件包括，例如，(a)靶细胞溶血，导致血细胞中血红素释放和/或贫血；或(b)C3调理作用，其可能导致吞噬作用和血管外溶血(EVH)；调理细胞与激活的内皮细胞的粘附；和/或中性粒细胞和血小板的激活。

在SCD上下文中，术语“触发”包括引发、传播或加剧疾病症状或病理(诸如血管闭塞性危象)的任何事件或现象。代表性的实例包括例如酸中毒、缺氧和脱水，所有这些都增强了SS血红蛋白的细胞内聚合(J.H.Jandl,Blood:Textbook of Hematology[血液：血液学教科书],第2版,利特尔&布朗出版社(Little,Brown and Company),波士顿,1996,第544-545页)。

“确定核酸水平”是指通过本领域已知的方法直接或间接检测核酸(例如，mRNA)。测量mRNA水平的方法通常包括但不限于RNA印迹法、核酸酶保护测定(NPA)、原位杂交(ISH)、RT-PCR和RNA测序(RNA-Seq)。

“确定蛋白质水平”是指通过本领域已知的方法直接或间接检测蛋白质。测量蛋白质水平的方法通常包括但不限于蛋白质印迹法、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、免疫荧光、表面等离子共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组化分析、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱、液相色谱(LC)-质谱、微细胞测定、显微镜检术、荧光激活细胞分选(FACS)和流式细胞术，以及基于蛋白质性质的测定，包括但不限于酶活性或与其他蛋白配偶体的相互作用。

术语“溶血性疾病”是指细胞裂解、细胞损害和炎症在疾病病理中起作用的任何障碍或疾病。溶血性疾病也是一种炎症性障碍或疾病，其中旁路途径(AP)激活导致细胞裂解、细胞损害和炎症。溶血性疾病包括以红细胞和/或血小板的病理性裂解为特征的疾病。无核细胞诸如红细胞和血小板受到充分裂解。红细胞的裂解会释放许多标志物，例如，血红素、血红蛋白、LDH、胆红素，其中一些标志物可能会产生血液和器官的病理结果。有核细胞诸如中性粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞可以被MAC攻击，但不会完全裂解。术语“血管内溶血”是指无核细胞和有核细胞的裂解，这是由AP激活以及细胞表面上相关的C5b-9的产生和沉积引起的。术语“血管外溶血”是指C3b沉积导致的细胞裂解和通过补体受体清除。C3b通过激活经典途径和旁路途径产生。本披露涉及经由旁路补体途径产生的C3b。

术语“静脉内”通常意味着“在静脉内”，指的是通过脉管系统进入受试者的靶细胞或组织。在静脉内(IV)疗法中，将液体物质直接施用至静脉中。与其他施用途径相比，静脉内途径可能是全身递送药剂的最快途径。一些药物、输血和非肠道(例如，非消化性)营养物使用标准递送系统静脉内施用。

术语“缺氧”是指氧气水平低于正常水平的情况，诸如低于正常氧气水平的21％、15％、12％、9％、6％、3％或2％。相比之下，“常氧”是指氧气水平基本接近正常水平的情况，例如，在正常水平的+/-10％范围内。

如本文所用，术语“检测”是指通过样品中的一个或多个参数的测量值来确定与样品相关的一个值或一组值的过程，并且可以进一步包括将测试样品与参考样品进行比较。根据本披露，补体标志物的检测包括鉴定、测定、测量和/或定量一种或多种标志物。

如本文所用，术语“可能性”通常是指概率、相对概率、存在或不存在或程度。

如本文所用，术语“标志物”是指可以作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预(例如，用补体抑制剂治疗)的药理学反应的指标而被客观测量的特征。标志物的代表性类型包括，例如标志物的结构(例如，序列或长度)或数量的分子变化，包含，例如标志物的水平、浓度、活性或特性的变化。

如本文所用，术语“对照”是指测试样品的参考，如对照健康受试者或未经治疗的受试者，诸如此类。如本文所用，“参考样品”是指用于比较的可能患有或可能不患有疾病的组织或细胞的样品。因此，“参考”样品因此提供了一个基础，另一个样品(例如，来自SCD患者的血液)可以与之进行比较。相反，“测试样品”是指与参考样品相比较的样品。参考样品不必是无病的，诸如当参考样品和测试样品取自按时间分开的同一患者时。

术语“水平”可以指二元(例如，不存在/存在)、定性(例如，不存在/低/中/高)或表明特定分子种类的存在的定量信息(例如，与数量、频率或浓度成比例的值)。蛋白质或核酸(例如，mRNA)的“水平降低”或“水平增加”是指与参考相比蛋白质或核酸(例如，mRNA)水平的降低或增加(例如，与参考相比，降低或增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约150％、约200％、约300％、约400％、约500％或更多；降低或增加了超过约10％、约15％、约20％、约50％、约75％、约100％或约200％；降低或增加了低于约0.01倍、约0.02倍、约0.1倍、约0.3倍、约0.5倍、约0.8倍或更低；或增加了超过约1.2倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.8倍、约2.0倍、约3.0倍、约3.5倍、约4.5倍、约5.0倍、约10倍、约15倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍、约1000倍或更多)。可以将样品中的蛋白质水平以相对于总蛋白质或核酸(例如，mRNA)的质量/体积(例如，g/dL、mg/mL、μg/mL、ng/mL)或百分比表示。

如本文所用，疾病或障碍的术语“处于风险中”是指倾向于经历特定疾病的受试者(例如，人)。这种倾向可能是遗传的(例如，或由于其他因素(例如，环境条件、高血压、活动水平、代谢综合征等)。因此，不意欲将本披露限于任何特定风险，也不意欲将本披露限于与补体相关的任何特定类型的病症或功能障碍(例如，镰状细胞病)。

如本文所用，“联合”是指除另一种治疗模式外，还施用一种治疗模式。因此，“联合”是指在向个体施用另一种治疗模式之前、期间或之后施用一种治疗模式。

术语“药物组合物”是指呈使得其中含有的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对施用该配制品的受试者具有不可接受的毒性的其他组分的制剂。

如本文所用，术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体结合预定抗原上的表位。通常，当通过BIACORE 3000仪器中的表面等离子共振(SPR)技术确定时，抗体结合的亲和力(KD)约小于10^-7M，诸如约小于10^-8M、10^-9M或10^-10M，甚至更低，这可以例如使用重组CDH11作为分析物和抗体作为配体来进行。在一些实施例中，抗体与预定抗原的结合具有比其与除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的结合亲和力大至少两倍的亲和力。术语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。

如本文所用，“延迟疾病进展”是指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或顺延疾病(诸如癌症)的发展。这种延迟会有不同的时间长度，这取决于病史和/或正在接受治疗的个体。正如本领域技术人员显而易见的那样，充分或显著的延迟实际上可以包括预防，在这种情况下该个体不会发生疾病。例如，晚期癌症(诸如转移的发展)可能会延迟。

如本文所用，术语“转导(“transduction”和“transduce”)”是指将病毒载体构建体或其一部分引入细胞并且随后在该细胞中表达由该载体构建体编码的转基因的方法。

如本文所用，术语“转染”是指通常用于将外源性DNA引入原核或真核宿主细胞的各种技术中任一种，例如，电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、二乙氨基乙基(DEAE)葡聚糖转染、NUCLEOFECTION^TM、挤压蒸发、超声蒸发、光学转染、MAGNETOFECTION^TM、穿刺感染等。

如本文所用，术语“载体”意指包括但不限于表达目的基因或编码序列的核酸分子，例如，编码抗体的编码序列。因此，一种类型的载体是病毒载体，其中可以将额外的DNA区段(例如，转基因，例如，编码本披露的备解素抑制剂的转基因)连接到病毒基因组中，然后可以向受试者施用病毒载体(例如，通过电穿孔，例如，电穿孔到肌肉组织中)，以允许以类似于基因疗法的方式表达转基因。

另一种类型的载体是“质粒”，其是指圆形双链DNA环，可以将额外的DNA区段连接到该环中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入该宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般来说，在重组DNA技术中应用的表达载体通常是质粒的形式。

病理学中的补体系统

补体系统与机体的其他免疫系统联合作用以抵御细胞病原体和病毒病原体的入侵。尽管功能正常的补体系统提供强大防御力来抵御微生物感染，但补体途径的不当调控或激活已牵涉到多种障碍的发病机制。

例如，1967年发表了第一份补体激活可能与SCD有关的报告(Francis和Womack.Am.J.Med.Technol.[美国医学技术杂志]1967；33(2):77-86)。从那时起，研究报告了SCD患者血液中补体衍生片段水平的增加，表明SCD中补体被激活，并且表明补体可能在该疾病的病理生理学中发挥重要作用。

已知SCD病理是由β珠蛋白基因的错义突变引起的，导致珠蛋白分子外表面的谷氨酸被缬氨酸取代。这种氨基酸取代使得镰状细胞血红蛋白(HbS)不易溶解，并且在脱氧时易于聚合。因此，携带聚合HbS的红细胞(例如，红细胞；RBC)不易变形，并且可能阻塞微血管。这种血管闭塞导致组织缺血和梗死，代表SCD患者发病和死亡的主要原因。SCD的临床表现远远超出纯合子珠蛋白突变。研讨会发现，镰状(SS)RBC与正常RBC不同，可以在体外粘附于受刺激的内皮细胞，并且SS-RBC的粘附与SCD的临床严重程度相关。随后的研究已经认识到血浆因子(诸如补体蛋白)在SS-RBC粘附到内皮中的重要性。在SCD的模型系统中，已经表明补体蛋白之一C5a在缺氧/再氧合诱导后被激活(例如，参见Vercellotti等人,Am.J.Hematol[美国血液学杂志],94:3(2019),327-338)，进一步表明补体蛋白可能直接参与该障碍的发病机制。然而，重要的是，补体系统在SCD发病机制或其模型中的直接因果作用尚未得到证实。

β珠蛋白基因的突变也会导致其他疾病，包括，例如，β地中海贫血(BT)。然而重型BT是由含有导致β珠蛋白产生完全缺失的突变的β珠蛋白基因的两个等位基因引起的，中间型BT是归因于β珠蛋白链产生的减少和/或突变β珠蛋白链的产生。BT是一种导致慢性贫血(例如，RBC缺乏)的疾病，这可能表明补体蛋白在遗传相关障碍BT的发病机制中发挥了额外的作用。

本披露至少部分地基于以下惊人发现，补体抑制剂(例如，备解素抑制剂，例如，抗备解素抗体、核酸分子、肽、小分子或适配体)提供令人惊讶的能力来减弱与SCD、BT或镰状细胞BT相关的发病机制。如本文所述，本披露至少部分地基于以下发现，即用补体抑制剂(例如，备解素抑制剂)预处理有效地减弱SCD相关的发病机制，包括缺氧诱导的C5b9沉积、血管内溶血(IVH)以及重要器官诸如肺和肝中血管堵塞的程度。鉴于SCD的病理生理学普遍存在，这些特性特别有益，SCD的病理生理学包括贫血、氧化应激、溶血、炎症和血管闭塞。使用本文所述的组合物和方法，可以有效地抑制补体蛋白(例如，备解素)以治疗SCD。

补体蛋白

有至少25种补体蛋白，它们是血浆蛋白和膜辅因子的复杂集合。血浆蛋白占脊椎动物血清中珠蛋白的约10％。补体组分通过在一系列复杂但精确的酶切割和膜结合事件中相互作用来实现其免疫防御功能。由此引起的补体级联使得具有调理、免疫调节和溶解功能的产物产生。

补体级联可以通过经典途径(CP)、凝集素途径或旁路途径(AP)进行。CP通常通过抗体识别和结合靶细胞上的抗原位点来引发。凝集素途径通常由甘露糖结合凝集素(MBL)与高甘露糖底物的结合引发。AP可以不依赖于抗体，并且由病原体表面上的某些分子引发。这些途径在C3转化酶处汇聚，在此处补体组分C3被活性蛋白酶切割以产生C3a和C3b。

补体组分C3的自发水解也可导致AP C3转化酶引发，补体组分C3在血液的血浆级分中含量丰富。这个过程称为“怠速运转(tickover)”，通过C3中硫酯键的自发切割形成C3i或C3(H₂0)。支持激活的C3结合和/或具有中性或正电荷特征的表面(例如，细菌细胞表面)的存在促进了怠速运转。C3(H₂0)的形成允许血浆蛋白因子B的结合，这反过来又允许因子D将因子B切割成Ba和Bb。Bb片段仍然与C3结合，形成含有C3(H₂0)Bb的复合物-“液相”或“引发”C3转化酶。虽然只产生少量，但液相C3转化酶可以将多种C3蛋白切割成C3a和C3b，并导致C3b的产生及其随后与表面(例如，细菌表面)的共价结合。与表面结合的C3b结合的因子B被因子D切割，从而形成含有C3b,Bb的与表面结合的AP C3转化酶复合物。

AP C5转化酶((C3b)₂,Bb)在向AP C3转化酶添加第二C3b单体后形成。第二C3b分子的作用是结合C5并将其呈递以供Bb切割。AP C3和C5转化酶通过添加三聚体蛋白备解素而稳定化。备解素促进C3b与因子B的缔合，并且为C3bBb在细胞表面上的组装提供了集中点。备解素还抑制因子I造成的因子H介导的C3b切割。它与预先形成的旁路途径C3转化酶结合；然而，备解素结合并不是形成功能性旁路途径C3或C5转化酶所必需的。

CP C3转化酶是在补体组分C1(C1q、C1r和C1s的复合物)与结合靶抗原(例如，微生物抗原)的抗体相互作用后形成的。C1的C1q部分与抗体-抗原复合物的结合导致C1的构象变化，从而激活C1r。活性C1r然后切割C1相关的C1，产生活性丝氨酸蛋白酶。活性C1s将补体组分C4切割成C4b和C4a。与C3b一样，新生成的C4b片段包含高反应性硫醇，它很容易与目标表面(例如，微生物细胞表面)上的合适分子形成酰胺或酯键。C1s还将补体组分C2切割成C2b和C2a。由C4b和C2a形成的复合物是CP C3转化酶，它能够将C3加工成C3a和C3b。CP C5转化酶(C4b、C2a、C3b)是在将C3b单体添加到CP C3转化酶后形成的。

除了在C3和C5转化酶中的作用外，C3b还通过与存在于抗原呈递细胞(如巨噬细胞和树突细胞)表面的补体受体相互作用，发挥调理素的作用。C3b的调理功能通常被认为是补体系统最重要的抗感染功能之一。具有阻断C3b功能的遗传病变的患者容易受到多种病原生物体的感染，而在补体级联序列中的较后具有病变的患者，例如，具有阻断C5功能的病变的患者被发现仅更容易感染奈瑟菌，然后只是稍微更容易。

AP和CP C5转化酶将C5切割成C5a和C5b。C5的切割释放C5b，这允许形成切割末端补体复合物C5b-9。C5b与C6、C7和C8结合以在靶细胞表面形成C5b-8复合物。在结合几个C9分子后，形成攻膜复合物(MAC，C5b-9，末端补体复合物(“TCC”))。当足够数量的MAC插入靶细胞膜时，它们产生的开口(MAC孔)介导靶细胞的快速渗透裂解。

C5的切割也会释放C5a，这已被证明是一种有效的过敏毒素和趋化因子。

补体途径抑制剂

本文所述的组合物结合并且抑制补体途径的组分，并且可用于治疗SCD、BT或镰状细胞BT。例如，备解素是旁路补体途径的正调节因子。本文描述了结合并抑制补体蛋白(例如，备解素)并且可用于治疗SCD、BT或镰状细胞BT的组合物。

本领域已知许多方法来确定化合物是否调节补体途径组分的表达或活性，例如，以确定化合物是否是补体抑制剂(例如，备解素抑制剂)。该补体组分活性测定可以是基于细胞的、基于细胞提取物的(例如，微粒体测定)、无细胞测定(例如，转录测定)或使用基本上纯化的蛋白质。例如，化合物作为补体蛋白抑制剂的鉴定可以使用补体蛋白(例如，备解素)肝微粒体测定进行，例如，如以下所述：Shanklin等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:2510-2514,1991或Miyazaki等人J.Biol.Chem.[生物化学杂志]275:30132-30138,2000。在一些情况下，基于液相色谱/质谱(LC/MS)的方法可用于测量补体蛋白的活性(例如，备解素活性)，例如，如以下所述：Dillon等人Anal.Chim.Acta.[分析化学学报]627(1):99-104,2008。可以使用高通量测定，例如，如以下所述：Soulard等人Anal.Chim.Acta.[分析化学学报]627(1):105-111,2008。美国专利号7,790,408中描述了测量补体蛋白的活性的仍进一步方法。

可以使用任何合适的方法来确定化合物是否与补体途径组分(例如，备解素)结合，例如，质谱、表面等离子共振或免疫测定(例如，免疫沉淀或酶联免疫吸附测定)。

可以使用任何合适的方法来确定化合物是否调节补体途径组分(例如，备解素)的表达，例如，RNA印迹法、蛋白质印迹法、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、质谱或RNA测序。

补体抑制剂模式

旁路补体途径抑制剂可以选自多种不同模式。补体抑制剂可以是抗体、核酸分子(例如，DNA分子或RNA分子，例如，mRNA或抑制性RNA分子(例如，短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA))或杂交DNA-RNA分子)、肽、小分子(例如，备解素小分子抑制剂)、信号级联抑制剂、信号级联激活剂或表观遗传修饰剂)或适配体。这些模式中的任何一种都可以是针对以下的补体抑制剂：补体蛋白的靶向(例如，抑制)功能；补体表达；补体结合；或补体信号传导。核酸分子或小分子可以包括修饰。例如，该修饰可以是化学修饰，例如，与标志物(例如，荧光标志物或放射性标志物)缀合。该修饰还可以包括与抗体缀合以将该药剂靶向特定细胞或组织。此外，该修饰可以是化学修饰、包装修饰(例如，包装在纳米颗粒或微粒内)或靶向修饰。

I.抗补体旁路途径抗体

本文描述了在补体旁路途径中抑制蛋白质的抗补体旁路途径抗体、抗体衍生物(例如，工程化抗体、人化抗体、嵌合抗体、取代抗体、人源化抗体等)及其抗体片段。本文所述的抑制性抗体(例如，中和、阻断或耗竭)可以抑制例如补体旁路途径中的蛋白质。

例如，本文所述的是单价抗备解素抗体、抗体衍生物(例如，工程化抗体、人化抗体、嵌合抗体、经取代抗体、人源化抗体等)及其抗体片段，其抑制备解素(补体旁路途径的正调节因子)，并且随后破坏C3和C5转化酶酶复合物的稳定性。本文所述的抑制性抗体(例如，中和、阻断或耗竭)可以抑制例如备解素与C3b、C3Bb和C3bBb的结合。例如，本文所述的抗备解素抗体或其抗原结合片段是通过与备解素结合而降低或阻断备解素的活性和/或功能的抗体。此类多肽可以具有本文所述的抑制性备解素抗体的互补决定区(CDR)中的一个或多个或全部(参见，例如，下表1)，或具有本文所述的重链(HC)、轻链(LC)、重链可变区(HCVR)或轻链可变区(LCVR)中的一种或多个(参见，例如，下表2)。抑制备解素导致旁路途径补体激活降低，这表明对患有旁路途径失调疾病(其中该旁路途径被过度激活)的患者具有治疗益处。例如，该抗备解素抗体或其抗原结合片段可通过调节镰状细胞活性而有益于SCD、BT或镰状细胞BT的治疗。

表1：抗备解素抗体的示例性CDR序列

SEQ ID NO:	CDR	序列
			2	CDR-H1	GRISSIIHMA
3	CDR-H2	RVGTTVYADSVKG
			4	CDR-H3	LQYEKHGGADY
7	CDR-H1	GFSLTTYGVH
			8	CDR-H2	VIWSGGDTDYNASFIS
9	CDR-H3	NKDYYTNYDFTMDY
			10	CDR-L1	KSSQSVLYSSNQKNFLA
11	CDR-L2	WASTRES
			12	CDR-L3	HQYLSSYT
13	CDR-H1	GYTFIDYWIE
			14	CDR-H2	EIFPGSGTINHNEKFK
15	CDR-H3	EGLDY
			16	CDR-L1	SASSSVSYIY
17	CDR-L2	DTSTLAS
			18	CDR-L3	QQWSRNPFT
19	CDR-H1	GFSLTSYGVH
			20	CDR-H2	VIWSGGSTDYNAAFIS
21	CDR-H3	NKDFYSNYDYTMDY
			22	CDR-L1	KSSQSVLYSSNQKNFLA
23	CDR-L2	WASTRES
			24	CDR-L3	HQYLSSYT
25	CDR-H1	GYT*TAYGIN
			26	CDR-H2	YIYIGNGYTDYNEKFKG
27	CDR-H3	SGWDEDYAMDF
			28	CDR-L1	RASENIYSYLA
29	CDR-L2	HAKTLAE
			30	CDR-L3	QHHYGPPPT

*可以是任何天然存在的氨基酸

在一些实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含含有VHCDR1-3和VLCDR1-3的全套CDR。例如，在第一方面，抗备解素抗体或其抗原结合片段可以包含：分别含有SEQ ID No:7、8和9的VHCDR1-3序列，和分别含有SEQ ID No:10、11和12的VLCDR1-3序列(FP1)。在第二方面，抗备解素抗体或其抗原结合片段可以包含：分别含有SEQ ID No:13、14和15的VHCDR1-3序列，和分别含有SEQ ID No:16、17和18的VLCDR1-3序列(FP2)。在第三方面，抗备解素抗体或其抗原结合片段可以包含：分别含有SEQ ID No:19、20和21的VHCDR1-3序列，和分别含有SEQ IDNo:22、23和24的VLCDR1-3序列(FP3)。在第四方面，抗备解素抗体或其抗原结合片段可以包含：分别含有SEQ ID No:25、26和27的VHCDR1-3序列，和分别含有SEQ ID No:28、29和30的VLCDR1-3序列(FP4)。

在一些实施例中，本披露涉及单价抗备解素抗体及其抗原结合片段的用途。代表性实例提供在WO 2018140956和美国公开号2019/0352381中，其披露内容通过引用并入本文。在第一方面，单价抗体或其抗原结合片段可以包含：分别含有SEQ ID NO:2、3和4的VHCDR1-3序列。在一个实施例中，本披露涉及分离的单价抗体或其抗体片段，其中该抗体或其抗体片段结合人备解素。在特定实施例中，该抗体或片段是骆驼科抗体。在特定实施例中，该抗体或片段是单结构域抗体。在特定实施例中，该抗体或片段抑制人备解素的活性。

在一些实施例中，该抗备解素抗体包括双特异性抗体，特别是迷你抗体。在WO2018140956中提供了双特异性抗备解素迷你抗体的代表性类型，其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，该双特异性迷你抗体包含特异性结合第一抗原(例如，备解素或其抗原片段)的序列(例如，CDR)和特异性结合第二抗原(例如，白蛋白或其抗原片段)的序列(例如，CDR)。该备解素结合序列和该白蛋白结合序列的方向可以颠倒，即，相对于迷你抗体的氨基到羧基末端，该一个或多个备解素结合序列可以在该一个或多个白蛋白结合序列之前或之后(优选地在之后)。在一些实施例中，备解素结合序列仅包含抗备解素抗体的抗体重链CDR(CDRH1-3)，例如，分别是SEQ ID NO:2-4的序列。优选地，这些备解素结合CDR位于迷你抗体的C末端。在一些实施例中，经由接头(例如，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的接头)，将一个或多个备解素结合序列与白蛋白结合序列连接(例如，缀合)。在特定的实施例中，该抗备解素抗体包含SEQ ID NO:6的迷你抗体序列。

表2：抗备解素抗体的示例性可变区序列

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本文所述的抗备解素抗体可以通过使用全长备解素、备解素多肽和/或使用携带抗原性备解素表位的肽(例如，备解素多肽的片段)来制备。备解素肽和多肽可作为天然多肽、重组或合成重组多肽分离并且用于产生抗体。所有可用于产生抗备解素抗体的抗原都可用于产生单价抗体。合适的单价抗体形式和制备它们的方法是本领域已知的(例如，WO2007/048037和WO 2007/059782，其全部内容通过引用并入本文)。

该抗备解素抗体可以是单克隆抗体或源自单克隆抗体。可通过已知技术制备针对选定抗原的合适的单克隆抗体(“Monoclonal Antibodies:A manual of techniques,”[“单克隆抗体：技术手册”],Zola(CRC出版社,1988)；“Monoclonal HybridomaAntibodies:Techniques and Applications,”[“单克隆杂交瘤抗体：技术和应用”],Hurrell(CRC出版社,1982)，其全部内容通过引用并入本文)。

在其他实施例中，该抗体可以是单结构域抗体，诸如V_HH。此类抗体天然存在于例如骆驼科和鲨鱼中(Saerens,D.等人,Curr.Opin.Pharmacol.[当代药理学观点],8:600-8,2008)。骆驼科抗体描述在例如美国专利号5,759,808；5,800,988；5,840,526；5,874,541；6,005,079；和6,015,695中，其中每一个的全部内容通过引用并入本文。克隆和分离的V_HH结构域是一种稳定的多肽，特征是具有原始重链抗体的完全抗原结合能力。V_HH结构域以其独特的结构和功能特性将常规抗体的优势(高靶向特异性、高靶向亲和力和低固有毒性)与小分子药物的重要特征(抑制酶和接近受体裂缝的能力)组合起来。此外，它们是稳定的，有可能通过注射以外的方式进行施用，更容易制造，并且可以人源化(美国专利号5,840,526；美国专利号5,874,541；美国专利号6,005,079、美国专利号6,765,087；EP 1589107；WO 97/34103；WO 97/49805；美国专利号5,800,988；美国专利号5,874,541和美国专利号6,015,695，其中每一个的全部内容通过引用并入本文)。这种V_HH可以具有下表3中所述的多肽。

表3：示例性抗备解素V_HH

在一些实施例中，当抗备解素结合结构域具有暴露的N末端时，N末端谷氨酰胺可以转化为环化焦谷氨酸酯。此类修饰是本领域已知的(参见，例如，Liu等人,The Journalof Biological Chemistry[生物化学杂志]286(13:11211-11217,2011))。

V_HH可以包括一个或多个氨基酸修饰。本文所述的氨基酸修饰包括本领域已知的所有氨基酸修饰(参见，例如，Liu等人,The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]286(13:11211-11217,2011)和Manning等人,Pharmaceutical Research[药学研究]27(4):544-575,2010)。在所有上下文中，将包括特定氨基酸的已知转化，例如，在融合多肽的加工或纯化过程中，例如，暴露的N末端谷氨酰胺转化为焦谷氨酸酯。

Ia.抗备解素抗体片段和衍生物

一些天然存在的抗体包括两个抗原结合结构域，因此是二价的。在蛋白酶消化后已鉴定出天然存在的抗体的许多较小的抗原结合片段。例如，这些包括“Fab片段”(V_L-C_L-C_H1-V_H)、“Fab'片段”(具有重链铰链区的Fab)和“F(ab')₂片段”(由重链铰链区域接合的Fab'片段的二聚体)。已使用重组方法来产生此类片段，并且产生甚至更小的抗体片段，例如，被称为“单链Fv”(可变片段)或“scFv”的那些，由通过合成肽接头(V_L-接头-V_H)接合的V_L和V_H组成。Fab片段、Fab'片段和scFv片段对于抗原结合是单价的，因为它们各自只包含含有一个V_H/V_L二聚体的一个抗原结合结构域。甚至更小的单价抗体片段是dAb，仅包括单个免疫球蛋白可变结构域，例如，V_H或V_L，其单独特异性结合抗原，即，不需要分别互补的V_L或V_H结构域。dAb独立于其他V结构域结合抗原；然而，dAb可以以与其他V_H或V_L结构域同源或异源的多聚体存在，其中其他结构域对于该dAb的抗原结合不是必需的，即该dAb独立于额外的V_H或V_L结构域结合抗原。

Ib.接头

在本披露中，接头用于接合多肽或蛋白质结构域和/或相关的非蛋白质部分。在一些实施例中，接头是至少两个多肽构建体之间的键合或连结，例如，使得两个多肽构建体以串联系列彼此接合(例如，与第二多肽或单价抗体连接的单价抗体)。接头可以将一个抗体构建体的N末端或C末端连接到第二个多肽构建体的N末端或C末端。

接头可以是简单的共价键(例如，肽键)、合成聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)或由化学反应(例如，化学缀合)产生的任何类型的键。在接头是肽键的情况下，一个蛋白质结构域的C末端的羧酸基团可以在缩合反应中与另一蛋白质结构域N末端的氨基反应以形成肽键。特别地，该肽键可以通过本领域公知的常规有机化学反应由合成手段形成，或通过宿主细胞天然产生形成，其中编码两个蛋白质的DNA序列的多核苷酸序列(例如，串联系列中的两个抗体构建体)可以通过宿主细胞中必要的分子机制(例如，DNA聚合酶和核糖体)直接转录和翻译成编码两种蛋白质的连续多肽。

在接头是合成聚合物(例如，PEG聚合物)的情况下，该聚合物可以在每一端用反应性化学官能团官能化，以与两个蛋白质连结端的末端氨基酸反应。

在接头(除了上述肽键)由化学反应制成的情况下，化学官能团，例如，胺、羧酸、酯、叠氮化物或本领域中常用的其他官能团，可以分别合成地连接到一种蛋白质的C末端和另一种蛋白的N末端。然后，这两个官能团可以通过合成化学手段反应形成化学键，从而将两个蛋白质连结在一起。此类化学缀合程序对于本领域技术人员来说是常规的。

两个肽构建体之间的接头可以是例如包含1-200(例如，1-4、1-10、1-20、1-30、1-40、2-10、2-12、2-16、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200)个氨基酸的氨基酸接头。合适的肽接头是本领域已知的，并且包括例如含有柔性氨基酸残基诸如甘氨酸和丝氨酸的肽接头。在某些实施例中，接头可以包含单个基序或多个不同或重复的基序。

在一些实施例中，该接头是聚甘氨酸接头。在一些实施例中，聚甘氨酸接头包括序列GGGGE(SEQ ID NO:5)。

Ic.双特异性构建体

本披露特征还在于其中两种抗原结合多肽被连接的双特异性构建体。此类双特异性构建体可以包括通过接头连结到第二多肽(例如，第二单价抗体)的抗备解素结合多肽(例如，单价抗体)。该第二多肽可以增强双特异性构建体的体内稳定性。在一些实施例中，该第二多肽是白蛋白结合分子、白蛋白结合肽、抗白蛋白抗体(例如，单价抗体)、抗人血清白蛋白或其修饰形式。白蛋白结合肽是本领域已知的，例如描述于WO 2007/106120(参见表1至9)和Dennis等人,2002,J Biol.Chem.[生物化学杂志]277:35035-35043中，其披露内容通过引用并入本文。

在一些实施例中，该第二多肽是增强构建体的体内稳定性的Fc结构域。

在一些实施例中，单价抗备解素抗体与单价抗白蛋白抗体连接。该单价抗备解素抗体可通过其N末端或C末端与该单价抗白蛋白抗体的N末端或C末端连接。

Id.示例性抗备解素抗体

在一些实施例中，抗备解素/抗人血清白蛋白双特异性构建体包含SEQ ID NO:6的六个CDR序列(SEQ ID NO:2、3和4以及55、56和57)。

在一些实施例中，双特异性构建体的抗人血清白蛋白组分包含CDR序列GRPVSNYA(SEQ ID NO:55)、INWQKTAT(SEQ ID NO:56)和AAVFRVVAPKTQYDYDY(SEQ ID NO:57)。

在一些实施例中，抗备解素双特异性构建体包含以下的序列：

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)。

在一些实施例中，抗备解素双特异性构建体包含以下的序列：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSLEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:35)。

在一些实施例中，抗备解素双特异性构建体包含以下的序列：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:36)。

在一些实施例中，抗备解素双特异性构建体包含以下的序列：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGDGGGGDGGGGEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:37)。

在一些实施例中，抗备解素双特异性构建体包含以下的序列：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:38)。

在一些实施例中，抗备解素双特异性构建体包含以下的序列：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWVRQAPGKQRELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:39)。

在一些实施例中，抗备解素双特异性构建体包含以下的序列：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGDGGGGDGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:40)。

在一些实施例中，抗备解素双特异性构建体包含以下的序列：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:41)。

在一些实施例中，抗备解素双特异性构建体包含以下的序列：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGDGGGGDGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWVRQAPGKQRELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:42)。

在一些实施例中，当抗备解素结合结构域或抗人血清白蛋白结合结构域具有暴露的N末端时，N末端谷氨酰胺可以转化为环化焦谷氨酸酯。此类修饰是本领域已知的(参见，例如，Liu等人,The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]286(13:11211-11217,2011))。

融合蛋白可以包括一个或多个氨基酸修饰。本文所述的氨基酸修饰包括本领域已知的所有氨基酸修饰(参见，例如，Liu等人,The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]286(13:11211-11217,2011)和Manning等人,Pharmaceutical Research[药学研究]27(4):544-575,2010)。在所有上下文中，将包括特定氨基酸的已知转化，例如，在融合多肽的加工或纯化过程中，例如，暴露的N末端谷氨酰胺转化为焦谷氨酸酯。

在一些实施例中，特定构建体的抗备解素由以下序列编码：

CAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCAGACCCGTGTCCAATTACGCCGCTGCCTGGTTCCGGCAGGCCCCTGGCAAAGAGAGAGAGTTCGTCAGCGCCATCAACTGGCAGAAAACCGCCACCTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCTGTGTTCCGGGTGGTGGCCCCCAAGACCCAGTACGACTACGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCATCTGGCGGAGGGGGAGAAGGCGGGGGAGGGGAAGGGGGAGGCGGCGAAGTCCAGCTGCTGGAATCTGGGGGCGGACTGGTGCAGCCAGGCGGCTCCCTCAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCCGGATCAGCAGCATCATCCACATGGCCTGGTTTAGACAGGCTCCCGGAAAAGAACGCGAGCTGGTGTCCGAGATCTCCAGAGTGGGCACCACCGTGTATGCCGACTCCGTGAAAGGCAGATTCACAATCTCCCGCGACAACAGCAAGAATACTCTGTATCTCCAGATGAATAGCCTGAAGCCCGAAGATACAGCCGTCTACTATTGCAACGCCCTGCAGTACGAGAAGCACGGCGGAGCCGACTATTGGGGACAGGGAACACTCGTGACAGTGTCTAGCTGATGA(SEQ ID NO:54)。

II.核酸

IIa.抑制性RNA

在一些实施例中，补体抑制剂是抑制性RNA分子，例如，其通过RNA干扰(RNAi)途径起作用。抑制性RNA分子可以降低补体蛋白(例如，补体C3、因子B或备解素)的表达水平(例如，蛋白质水平或mRNA水平)。例如，抑制性RNA分子包括siRNA、shRNA和/或miRNA，其靶向全长补体C3、因子B或备解素。siRNA是通常具有约19-25个碱基对长度的双链RNA分子。shRNA是一种含有通过RNAi降低靶基因表达的发夹弯的RNA分子。shRNA可以通过转染、电穿孔或转导以质粒(例如，病毒或细菌载体)的形式递送至细胞。微小RNA是通常具有约22个核苷酸长度的非编码RNA分子。miRNA与mRNA分子上的靶位点结合并且沉默该mRNA，例如，通过引起mRNA的切割、mRNA的失稳或抑制mRNA翻译。在一些实施例中，该抑制性RNA分子降低补体蛋白功能的水平和/或活性。在其他实施例中，该抑制性RNA分子降低功能正调节因子的抑制剂的水平和/或活性。

抑制性RNA分子可以被修饰，例如，以含有修饰的核苷酸，例如，2'-氟、2'-邻甲基、2'-脱氧、未锁定核酸、2'-羟基、硫代磷酸、2'-硫尿苷、4'-硫尿嘧啶核苷或2'-脱氧尿嘧啶核苷。在不受特定理论约束的情况下，相信某些修饰可以增加核酸酶抗性和/或血清稳定性或降低免疫原性。

在一些实施例中，该抑制性RNA分子降低补体蛋白(例如，补体C3、因子B或备解素)的水平和/或活性或功能。在一些实施例中，该抑制性RNA分子抑制补体蛋白(例如，补体C3、因子B或备解素)的表达。在其他实施例中，该抑制性RNA分子增加补体蛋白(例如，补体C3、因子B或备解素)的降解。该抑制性RNA分子可以在体外化学合成或转录。基于非编码RNA诸如核酶、RNA酶P、siRNA和miRNA等的抑制性治疗剂的制备和使用在本领域也是已知的，例如，如以下中所述：Sioud,RNA Therapeutics:Function,Design,and Delivery(Methodsin Molecular Biology)[RNA治疗：功能、设计和递送(分子生物学方法)].哈门那出版社(Humana Press)2010。

IIb.反义

在一种方法中，本发明提供了一种单链寡核苷酸，其具有与补体蛋白(例如，补体C3、因子B或备解素)靶核酸内的等长部分互补的至少6个连续核酸碱基的核酸碱基序列。这种方法通常被称为反义方法。不希望受理论约束，该方法涉及寡核苷酸与靶核酸(例如，分别为备解素前mRNA转录物1或转录物2)的杂交，然后是核糖核酸酶h(RNase h)介导的靶核酸的切割。可替代地，在不希望受理论约束的情况下，这种方法涉及寡核苷酸与靶核酸(例如，分别地，补体C3、因子B或备解素前mRNA转录物1或转录物2)的杂交，从而在空间上阻断靶核酸结合细胞转录后修饰或翻译机制，从而防止靶核酸的翻译。在一些实施例中，该单链寡核苷酸可以作为双链寡核苷酸递送给患者，其中该寡核苷酸与另一个杂交。

III.适配体

在一些实施例中，该补体途径组分抑制剂可以是适配体。可以使用任何合适的适配体。Bock L C等人,Nature[自然]355(6360):564-6(1992)；Hoppe-Seyler F,Butz K“Peptide aptamers:powerful new tools for molecular medicine[肽适配体：分子医学的强大新工具]”.J Mol Med.[分子医学杂志]78(8):426-30(2000)；Cohen B A,Colas P,Brent R.“An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatoriallibrary[从组合文库中分离出的人工细胞周期抑制剂]”.Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊].95(24):14272-7(1998)中描述了适配体的一般描述。

适配体是分离的核酸分子，其通过沃森-克里克碱基配对以外的相互作用以高特异性和亲和力结合一些靶标，诸如蛋白质(例如，激活CAP的因子)。适配体是基于核酸的分子，但适配体与其他核酸分子(诸如基因和mRNA)之间存在根本性差异。在后一种情况下，核酸结构通过其线性碱基序列编码信息，因此该序列对于信息存储功能很重要。相比之下，基于结合特定靶分子，适配体功能取决于特定的二级/三级结构，而不是保守线性碱基序列。也就是说，该适配体是非编码序列。适配体可能具有的任何可编码性都是非常偶然的，并且在适配体与其同源靶标的结合中没有作用。因此，与同一靶标甚至与靶标上的同一位点结合的适配体可以共享类似的线性碱基序列，但大多数不共享。

在一些实施例中，该适配体包括一系列长度约15至约60个核苷酸的核酸适配体，其特异性结合CAP因子并且调节该CAP因子的活性。

这些适配体可包括如本文所述的修饰，包括例如与亲脂性或高分子量化合物(例如，PEG)缀合、掺入帽部分、掺入修饰的核苷酸、和修饰磷酸盐骨架。

在一些实施例中，该适配体是抗C5适配体，例如，Avacincaptad Pegol(ARC-1905；CAS#1491144-00-3和FDA药品#K86ENL12I5)。在一些实施例中，该适配体是还抑制C3转化酶的因子B结合适配体。代表性实例(例如，SL1102和SL1103)提供在Xu等人(J Immunol.[免疫学杂志],206(4):861-873,2021；PMID:33419768)中。

IV.小分子

在一些实施例中，该补体途径组分抑制剂可以是小分子。小分子是通常具有小于约1000道尔顿的分子量的分子，或在一些实施例中，小于约500道尔顿，其中该分子能够将靶分子的活性调节至一些可测量的程度。示例性小分子，例如肽和小分子抑制剂。可以基于功效和特异性选择小分子，例如小分子抑制剂。

在一些实施例中，补体途径抑制剂包括因子D抑制剂。代表性的口服因子D抑制剂披露于WO 2015130838和美国专利号9,732,103中，其披露内容通过引用以其全文并入。其他代表性的因子D抑制剂披露于WO 2017035353和美国专利号10,011,612中，其披露内容通过引用以其全文并入。仍其他代表性因子D抑制剂披露在WO 2018160889和US公开号2020/0071301中，其披露内容通过引用以其全文并入本文。

在一些实施例中，可用于本申请的治疗方法的因子D抑制剂包括达尼科潘(danicopan)(化合物1或其盐)：

在一些实施例中，可用于本申请的治疗方法的因子D抑制剂包括维尔米科潘(vermicopan)(化合物2或其盐)：

在一些实施例中，可用于本申请的治疗方法的因子D抑制剂包括化合物3的因子D抑制剂或其盐：

在一些实施例中，可用于本申请的治疗方法的因子D抑制剂包括化合物4的因子D抑制剂或其盐：

在一些实施例中,该盐是盐酸盐。在一些实施例中，该盐是任何药学上可接受的盐，例如甲苯磺酸盐、硫酸盐等。

V.肽

在一些实施例中，该CAP的抑制剂是肽，例如，环肽、AP通路组分(例如，补体因子C3)的抑制剂。补体因子C3的已知肽抑制剂包括坎普他汀及其衍生物。

肽抑制剂可以是与补体旁路途径中的蛋白(例如补体因子C3)特异性结合的任何肽，或者是抑制或中和其蛋白的功能的蛋白质。肽抑制剂可以使用已知的肽合成方法化学合成，或可以使用重组技术制备和纯化。肽抑制剂可以使用众所周知的技术在没有过度实验的情况下鉴定。在这方面，应当注意，用于筛选肽库中能够特异性结合CAP多肽靶标的肽的技术是本领域众所周知的。

示例性治疗方法

表4和以下段落中提供了治疗SCD、BT或镰状细胞BT的示例性治疗方法：

以下包括治疗SCD、BT或镰状细胞BT患者的示例性方法。

表4.通过调节补体系统治疗SCD、BT或镰状细胞BT的治疗方法

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举例来说，本披露涉及以下用于监测SCD(例如，镰状细胞贫血、BT或镰状BT)的疗法的功效的方法：

(A)一种用抗C1q单克隆抗体治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(B)一种用C1-INH(例如，BERINERT、RUCONEST、CYNRIZE)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(C)(1)一种用抗C1s单克隆抗体(例如，BIVV020或激活的抗C1s抗体)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(C)(2)一种用C1s肽治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(D)一种用抗C2单克隆抗体(例如，PRO-02)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(E)一种用抗MASP-2单克隆抗体(例如，纳索利单抗)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(F)一种用抗MASP-3单克隆抗体(例如，OMS906)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(G)一种用抗因子D(FD)单克隆抗体(例如，兰帕利珠单抗)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(H)一种用口服小分子因子D(FD)抑制剂(例如，达尼科潘(ALXN2040或ACH-4471)或维尔米科潘(ALXN2050或ACH-5228)或第三代FD抑制剂(化合物3))治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(I)一种用小分子因子D(FD)抑制剂(例如，美国专利号9388199中的BCX9930或FD抑制剂，其通过引用并入本文)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(J)一种用因子B(FB)抑制剂(例如，因子B siRNA IONIS-FB-L_RX或α-FB单克隆抗体)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(K)一种用因子B(FB)抑制剂(LNP023)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(L)一种用抗备解素(因子P)单克隆抗体(例如，CLG561)或双特异性抗体(例如，ALXN1820)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(M)一种用因子H(FH)调节剂(例如，小因子H、AMY-201或CR2因子H/TT30)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(N)一种用选自坎普他汀或其衍生物(例如，APL2、APL9或AMY-101)、sCR1/TP10或米罗考普的C3抑制剂治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(O)(1)一种用诺马科潘(nomacopan)(覆盖素；rVA576)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(O)(2)一种用齐芦克布仑(Zilucoplan)(RA101495)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(P)(1)一种用阿瓦科潘(Avacopan)(CCX-168)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(P)(2)一种用抗C5a单克隆抗体(例如，奥仑达利珠(olendalizumab)单抗(ALXN1007)或BDB-001或IFX2)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(Q)(1)一种用选自抗C6单克隆抗体和C6反义RNA的补体C6抑制剂治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(Q)(2)一种用补体C6抑制剂CP010治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

(R)一种用编码可溶性CD59(HMR59)的腺相关载体(AAV)治疗受试者中SCD、BT或镰状细胞BT的方法。

递送

I.表达治疗性补体蛋白抑制剂的病毒载体

病毒基因组提供了丰富的载体来源，可用于将外源性基因有效递送至哺乳动物细胞(例如，镰状细胞)中。病毒基因组是用于基因递送的特别有用的载体，因为通常通过通用或专用转导将包含在这些基因组中的多核苷酸掺入到哺乳动物细胞的核基因组中。这些过程是自然病毒复制周期的一部分，并且不需要添加蛋白质或试剂来诱导基因整合。病毒载体的实例是逆转录病毒(例如，逆转录病毒科病毒载体)、腺病毒(例如，Ad5、Ad26、Ad34、Ad35和Ad48)、细小病毒(例如，腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒诸如正粘病毒(例如，流感病毒)、杆状病毒(例如，狂犬病和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如，麻疹和仙台)、正链RNA病毒诸如小核糖核酸病毒和甲病毒、以及双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、改良安卡拉牛痘(MVA)、鸡痘和金丝雀痘))。例如，其他病毒包括诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒、人乳头状瘤病毒、人泡沫病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例有：禽白血病肉瘤、禽C型病毒、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、肿瘤逆转录病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、α逆转录病毒、γ逆转录病毒、马铃薯病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:Theviruses and their replication[逆转录病毒科：病毒及其复制],Virology[病毒学],第三版(Lippincott Raven,费城,(1996)))。其他实例是鼠科动物白血病病毒、鼠科动物肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、牛科动物白血病病毒、猫科动物白血病病毒、猫科动物肉瘤病毒、禽类白血病病毒、人T细胞白血病病毒、狒狒内源性病毒、长臂猿白血病病毒、梅森菲舍猴病毒(Mason Pfizer monkey virus)、猿猴免疫缺陷病毒、猿猴肉瘤病毒、劳斯肉瘤病毒和慢病毒。例如，在McVey等人(US 5,801,030)中描述了载体的其他实例，其教导内容通过引用并入本文。

Ia.逆转录病毒载体

本文所述的方法和组合物中使用的递送载体可以是逆转录病毒载体。可用于本文所述的方法和组合物的一种类型的逆转录病毒载体是慢病毒载体。慢病毒载体(LV)是逆转录病毒的一个子集，高效转导多种分裂和非分裂细胞类型，赋予转基因稳定、长期的表达。包装和转导LV的优化策略概述见Delenda,The Journal of Gene Medicine[基因医学杂志]6:S125(2004)，其披露内容通过引用并入本文。

基于慢病毒的基因转移技术的使用依赖于携带高度缺失的病毒基因组的重组慢病毒颗粒(其中容纳了目的转基因)的体外生产。特别地，该重组慢病毒通过以下在允许的细胞系中的反式共表达来回收：(1)包装构建体，即表达Gag-Pol前体连同Rev的载体(可替代地反式表达)；(2)表达通常具有异源性质的包膜受体的载体；和(3)转移载体，其由病毒互补DNA(cDNA)组成，该病毒互补DNA失去了所有开放阅读框，但保持复制、包封和表达所需的序列，其中插入待表达的序列。

Ib.腺相关病毒载体

本文所述的组合物的核酸和方法可掺入重组腺相关病毒(rAAV)载体和/或病毒体中，以促进将其掺入细胞(例如，镰状细胞)中。用于本文所述的组合物和方法的rAAV载体是重组核酸构建体(例如，能够在镰状细胞中表达的核酸)，其包括(1)待表达的异源序列和(2)促进异源基因整合和表达的病毒序列。这些病毒序列可包括将DNA复制和包装到病毒体中所需的顺式的AAV序列(例如，功能性反向末端重复序列(ITR))。此类rAAV载体还可以包含标志物或报告基因。有用的rAAV载体具有全部或部分缺失但保留功能性侧翼ITR序列的一个或多个AAV WT基因。该AAV ITR可以是适合于特定应用的任何血清型。例如，使用rAAV载体的方法描述于Tai等人,J.Biomed.Sci.[生物医学科学杂志]7:279(2000)，以及Monahan和Samulski,Gene Delivery[基因递送]7:24(2000)中，其中每一个的披露内容通过引用并入本文，因为它们涉及用于基因递送的AAV载体。

rAAV病毒体的构建已在以下中描述，例如US 5,173,414；US 5,139,941；US 5,863,541；US 5,869,305；US 6,057,152；和US 6,376,237；以及Rabinowitz等人,J.Virol.[病毒学杂志]76:791(2002)和Bowles等人,J.Virol.[病毒学杂志]77:423(2003)，其中每一个的披露内容通过引用并入本文，因为它们涉及用于基因递送的AAV载体。

药物组合物

本文所述的CAP抑配制品(例如，抗体、小分子、核酸分子、肽和适配体)可以配制成例如药物组合物，以适合体内施用的生物相容形式施用给患者，诸如表现出或有发展SCD、BT或镰状细胞BT的风险的人患者。含有例如本文所述的补体蛋白抑制剂(诸如干扰RNA分子)的药物组合物通常包含药学上可接受的稀释剂或载剂。药物组合物可以包含(例如，由其组成)例如无菌盐水溶液和核酸。该无菌盐水通常是药物级盐水。药物组合物可以包含(例如，由其组成)例如无菌水和核酸。该无菌水通常是药物级水。药物组合物可以包含(例如，由其组成)例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)和核酸。该无菌PBS通常是药物级PBS。

在某些实施例中，药物组合物包含一种或多种CAP抑制剂和一种或多种赋形剂。在某些实施例中，赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。

在某些实施例中，补体蛋白抑配制品可与药学上可接受的活性和/或惰性物质混合以制备药物组合物或配制品。用于配制药物组合物的组合物和方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。

在某些实施例中，包含CAP抑制剂的药物组合物包含该抑制剂的任何药学上可接受的盐、抑制剂的酯或此类酯的盐。在某些实施例中，包含补体蛋白抑制剂的药物组合物在施用给受试者(例如，人)时能够(直接或间接)提供生物活性代谢物或其残余物。因此，例如，本披露还涉及抑制剂的药学上可接受的盐、前药、此类前药的药学上可接受的盐和其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。在某些实施例中，前药包括一个或多个连接到补体蛋白抑制剂的缀合物基团，其中该缀合物基团被体内的内源性核酸酶切割。

脂质部分已在多种方法中用于核酸疗法。在某些此类方法中，将该核酸引入由阳离子脂质和中性脂质的混合物制成的预成型脂质体或脂质复合物中。在某些方法中，与单阳离子或聚阳离子脂质的DNA复合物在不存在中性脂质的情况下形成。在某些实施例中，选择脂质部分以增加药剂向特定细胞或组织的分布。在某些实施例中，选择脂质部分以增加药剂向脂肪组织的分布。在某些实施例中，选择脂质部分以增加药剂向肌肉组织的分布。

在某些实施例中，药物组合物包含递送系统。递送系统的实例包括但不限于脂质体和乳剂。某些递送系统可用于制备某些药物组合物，包括那些包含疏水性化合物的药物组合物。在某些实施例中，使用某些有机溶剂，诸如二甲基亚砜。

在某些实施例中，药物组合物包含一种或多种组织特异性递送分子，其被设计为将本披露的一种或多种药剂递送至特定组织或细胞类型。例如，在某些实施例中，药物组合物包括涂覆有组织特异性抗体的脂质体。

在某些实施例中，药物组合物包含共溶剂系统。此类共溶剂系统中的某些包括例如苄醇、非极性表面活性剂、水混溶性有机聚合物和水相。在某些实施例中，此类共溶剂系统用于疏水性化合物。这种共溶剂系统的非限制性实例是VPD共溶剂系统，它是包含3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨醇酯80^TM和65％w/v聚乙二醇300的纯乙醇溶液。此类共溶剂系统的比例可以改变甚大，而不会显著改变其溶解度和毒性特征。此外，共溶剂组分的特性可以改变：例如，可以使用其他表面活性剂代替聚山梨醇酯80^TM；聚乙二醇的馏分大小可以改变；其他生物相容性聚合物可替代聚乙二醇，例如，聚乙烯吡咯烷酮；并且其他糖或多糖可以取代葡萄糖。

在某些实施例中，制备药物组合物用于通过注射(例如，静脉内)施用。在某些此类实施例中，药物组合物包含载剂并且配制在水溶液中，诸如水或生理相容的缓冲液，诸如Hanks溶液、林格氏液或生理盐水缓冲液。在某些实施例中，包括其他成分(例如，有助于溶解或用作防腐剂的成分)。在某些实施例中，使用合适的液体载剂、悬浮剂等制备可注射悬浮液。某些注射用药物组合物以单位剂量形式存在，例如，在安瓿或多剂量容器中。某些用于注射的药物组合物是油状或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可能含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。适用于注射用药物组合物的某些溶剂包括但不限于亲脂性溶剂和脂肪油(诸如芝麻油)、合成脂肪酸酯(诸如油酸乙酯或甘油三酯)以及脂质体。

试剂盒

本文所述的组合物可在用于治疗SCD、BT或镰状细胞BT的试剂盒中提供。如本文所述，该试剂盒可包括一种或多种AP抑制剂，特别地为备解素抑制剂。该试剂盒可包括指示试剂盒的用户(诸如医师)执行本文所述的任何一种方法的包装说明书。该试剂盒可任选地包括注射器或用于施用组合物的其他装置。在一些实施例中，该试剂盒可以包含一种或多种额外的治疗剂。

实例

以下是本披露的方法的实例。应当理解，根据以上提供的一般描述，可以实施各种其他实施例。

实例1.抑制补体激活在缺氧诱导的血管闭塞危象中的功效

为了证明抑制补体激活在VOC中的功效(图1)，Townes SS小鼠被分成四组，并且在缺氧处理前十天用PBS(媒介物)或14E1(小鼠抗备解素)进行四次预防性处理。图2中提供了代表性实验设置。在缺氧处理后处死动物，然后在常氧条件下静止一小时。在其中一个媒介物处理组中，动物未暴露于缺氧条件，并且在整个实验过程中持续保持在常氧条件，并且作为基线。安乐死后，从动物中收获血液样品和关键器官，以测量RBC上补体沉积水平、血管内溶血和血管闭塞的严重程度。

基于流式细胞术的RBC分析揭示了暴露于缺氧条件的SS RBC中补体片段沉积增加，C5b9和C3都增加(图3)。然而，用抗备解素单克隆抗体(14E1)预处理防止了C5b9沉积的增加。抗备解素MAb防止了缺氧条件下SS RBC中C3b沉积的增加。这一观察结果与备解素是CAP C3和C5转化酶的关键组分以及通过抗备解素mAb处理防止PNH RBC的C3调理作用的概念一致。

接下来，通过各种测定确定血管内溶血水平的变化，包括血浆乳酸脱氢酶(LDH)活性、游离血红素和游离血红蛋白以及总胆红素水平。SCD动物暴露于缺氧条件下触发血管内溶血(IVH)，这通过用抗备解素MAb预处理而有效地防止(图4)。使用公认的标志物诸如LDH、胆红素、游离血红蛋白和游离血红素等来测定IVH。这些通过抗补体疗法抑制SCD小鼠中血管内溶血的数据在SCD患者中具有明确的意义，因为这些溶血生物标志物在SCD患者中得到了充分验证。LDH活性升高与稳定状态下(Kato等人2006)或疼痛VOC事件期间(Ballas和Marcolina 2006)SCD患者的死亡率和发病率相关。此外，据报道，VOC期间儿童LDH活性与疼痛严重程度呈正相关(Najim和Hassan 2011)。类似地，血管内溶血期间释放的未结合血红蛋白和血红素具有高度的炎症性、细胞毒性，并且促进SCD中的血管和组织损害(Merle等人2019；Thomas等人2019)。

接下来，通过RBC的免疫荧光(IF)染色(Ter-119)观察和量化原位血管闭塞的水平。进行测定以测量诸如肺(图5)、肾(图6)、肝(图7)和脾(图8)等重要器官中血管堵塞的程度。SCD小鼠暴露在缺氧条件下显著增加了肺和肝中血管闭塞的强度。与对照(用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理)相比，用抗备解素MAb(14E1)预处理有效地降低了血管闭塞水平。代表性实验的结果显示在显微照片中，并且进一步总结在图5-8的条形图中。

肺中血管闭塞的改善特别相关，因为肺中血管闭塞是急性胸腔综合征(ACS)的潜在原因(Jain,Bakshi,和Krishnamurti 2017)。ACS与儿童镰状细胞相关死亡率和发病率的高风险相关，包括长期住院。所有具有纯合子SCD(HbSS)的儿童中超过一半在生命的第一个十年中至少经历过一次ACS发作(Gill等人1995)。反复发作可能预示着衰弱性慢性肺病的发作(Powars等人1988)。因此，抗备解素对肺中血管闭塞的显著改善为抗补体疗法治疗SCD提供了明确的理论基础。

抗备解素预处理在改善肝中血管闭塞方面也具有深远的影响(图7)。数据显示，当用抗备解素抗体处理小鼠时，体内小鼠模型中缺氧诱导的肝VOC显著降低。

这些数据表明，抗补体抗体，诸如抗备解素抗体，可以保护患有镰状细胞病的动物免受肝VOC的侵害。肝急性VOC是严重腹痛和肝功能障碍的潜在原因(Ebert,Nagar,和Hagspiel 2010)。在因急性血管闭塞危象(胸部、腹部和关节剧烈疼痛)入院的患者中，约39％的病例累及肝脏(Koskinas等人2007)。这些患者呈现腹部鼓胀、右上腹痛或急性疼痛性肝肿大(Koskinas等人2007)。因此，本文所提供的数据进一步支持了用备解素拮抗剂(诸如抗备解素抗体)治疗SCD、BT和镰刀型BT患者。

总之，数据表明镰状RBC通过补体激活发生SCD病理，包括溶血和血管闭塞。此外，使用抗补体疗法，特别是通过使用备解素拮抗剂的疗法，在组织(例如，肺、肾、肝或脾)以及细胞水平上显著改善SCD疾病表型。

实例2.抑制补体激活在血红素诱导的血管闭塞危象中的功效

这项研究使用了129/B6混合遗传背景的雄性Townes S/S小鼠(Wu等人2006)。在Townes S/S小鼠中，小鼠α和β珠蛋白基因座缺失，并且被人α和^Aγβ^S珠蛋白替代。当携带两个拷贝的β^S等位基因(hα/hα::β^S/β^S)时，小鼠会发展为人镰状病表型，血液涂片中可见镰状红细胞(RBC)。繁殖对是从杰克逊实验室获得的。这些动物被安置在想象研究所(ImagineInstitute)的动物护理设施的常规条件下。

为了证明抑制补体激活在VOC中的功效，Townes SS小鼠被分成五组，并且在血红素处理前十天用PBS(媒介物)或者抗备解素mAb(14E1)进行四次预防性处理(图9)。将这些动物暴露于50μmol/Kg的血红素中三小时，然后处死动物(图9)。在其中一个媒介物处理组中，动物未暴露于血红素并且用作基线(图9)。安乐死后，从动物中收获血液样品和关键器官，以测量RBC上补体沉积水平、血管内溶血和血管闭塞的严重程度(图10)。使用内部涂有肝素/EDTA抗凝剂的毛细管通过眼球后出血对小鼠进行静脉切开术。通过颈椎脱位将小鼠安乐死，并且通过左心室灌注1mL盐水溶液。收集肺、肝、肾和脾并且称重。

使用氯化血红素测定试剂盒(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)参考MAK036)测定血浆血红素，通过偶联酶反应确定，得到与血浆中存在的氯化血红素成比例的比色(570nm)产物。将血浆用氯化血红素测定缓冲液1:4稀释至最终体积为50μL。按以下顺序制备反应混合物一式两份：3μL酶混合物、2μL氯化血红素底物、43μL氯化血红素测定缓冲液和2μL氯化血红素探针。血浆中存在的血红素蛋白可以产生背景信号，因此为了控制该变量，通过从反应混合物中省略酶来为每个样品制备空白。将反应混合物添加到96孔板中的样品中，使用水平振动器均匀化，并且在室温下避光孵育30分钟。通过稀释该试剂盒中提供的氯化血红素标准溶液，在96孔板中制备氯化血红素标准溶液。使用Infinite F200 Pro多模式读板仪(帝肯公司(Tecan))在570nm处以动力学模式测量吸光度。通过从每个样品读数中减去空白样品值来去除背景信号，以获得校正的测量值。通过将校正后的测量值绘制成标准曲线来确定该氯化血红素浓度。

通过包括总胆红素、血浆乳酸脱氢酶(LDH)活性和游离血红蛋白在内的多种测量来确定血管内溶血水平。SCD动物暴露于血红素触发血管内溶血，这通过用抗备解素抗体预处理而有效防止(图10)。

基于Jendrassik-Grof方法，使用胆红素测定试剂盒(西格玛奥德里奇公司参考MAK126)测量血浆胆红素。该方法基于胆红素与重氮化氨基磺酸的反应，得到在530nm下测得的比色产物，与样品中存在的胆红素成比例。通过添加含有苯甲酸咖啡因的试剂C来测定总胆红素，苯甲酸咖啡因将胆红素从未缀合的胆红素蛋白复合物中分离出来。用PBS以1:2稀释血浆至最终体积为50μL。工作试剂按以下顺序制备：50μL试剂A、20μL试剂B和130μL试剂C。通过从反应混合物中省略试剂B和C(用盐水溶液代替)，为每个样品制备空白。将反应混合物添加到96孔板中的样品中，使用水平振动器均匀化，并且在室温下避光孵育10分钟。使用Infinite F200 Pro多模式读板仪(帝肯公司)在530nm处测量吸光度。通过从每个样品读数中减去空白样品值来去除背景，以获得校正的测量值。通过以下方程式确定胆红素浓度：[(样品-空白)/(校准品-水)]x 5mg/dL。

在K2 EDTA管(Melet Schloesing实验室)上采集全血。使用冷冻离心机以2,000xg离心15分钟，从血浆中去除细胞。该步骤也会耗尽血浆样品中的血小板。将血浆分成50μL等分试样，并且在-80℃下储存。

使用Pierce LDH细胞毒性测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermofisherScientific)参考88953)测量血浆LDH。通过在15mL锥形管中将0.6mL测定缓冲液与11.4mL基质混合物混合来制备反应混合物。用PBS以1:2稀释血浆至最终体积为50μL。将反应混合物添加到96孔板中的样品中，使用水平振动器均匀化，并且在室温下避光孵育30分钟。通过向每个样品中加入50μL终止溶液来终止反应。使用Infinite F200 Pro多模式读板仪(帝肯公司)在490nm和680nm处测量吸光度。LDH活性确定为[(LDH 490nm)-(LDH 680nm)]。

使用Drabkin试剂(西格玛奥德里奇公司参考D5941)测量血浆血红蛋白。该程序基于在碱性铁氰化钾存在下将血红蛋白及其衍生物(硫血红蛋白除外)氧化为高铁血红蛋白。高铁血红蛋白与氰化钾反应生成氰高铁血红蛋白，其最大吸收波长为540nm。在540nm处测量的颜色强度与总血红蛋白浓度成比例。将血浆转移至96孔板(每个样品20μL)。通过用1,000mL水和0.5mL 30％Brij L23溶液(西格玛目录号B4184)复溶一小瓶Drabkin试剂来制备Drabkin’s溶液。将Drabkin’s溶液(180μL)添加到96孔板中的样品中，使用水平振动器均匀化，并且在室温下避光孵育15分钟。制备在Drabkin’s溶液中的血红蛋白校准曲线。使用Infinite F200 Pro多模式读板仪(帝肯公司)在540nm处测量吸光度。通过从每个样品读数中减去空白样品值来去除背景，以获得校正的测量值。通过将校正后的测量值绘制成校准曲线来确定血红蛋白浓度。

将血液(45μL)与5μL小鼠FcR阻断试剂(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)参考130-092-575)一起孵育10分钟，并且用50μL细胞染色缓冲液(百进生物科技公司(Biolegend)参考420201)1:2稀释。然后用针对Ter-119 Pacific Blue(百进生物科技公司参考116232；1/100稀释)、小鼠TfR1/CD71 PerCP/Cy5.5(百进生物科技公司参考113816；1/100稀释)、C5b9-FITC(圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnologies)参考sc-66190FITC；1/20稀释)或C3-FITC(塞德林公司(Cedarlane)参考CL7631F；1/50稀释)的抗体对样品进行染色。通过Live-Dead(电子生物科学公司(eBioscience))排除死亡细胞。

使用FlowJo软件(Tree Star)通过流式细胞术(Gallios Beckman Coulter)进一步分析细胞。基于流式细胞术的SS RBC分析揭示了暴露于血红素后SS RBC上C5b9和C3沉积的显著增加(图11)。用抗备解素预处理几乎完全防止了C5b9在SS RBC上沉积的增加(图11)。由于C5b9染色代表潜在的攻膜复合物(MAC)形成，预计防止C5b9沉积可降低补体介导的血管内溶血(图11)。接下来，在SS RBC上测量C3沉积。暴露于血红素后C3沉积的增加被抗备解素抗体显著降低(图11)。

将石蜡包埋的肺、脾、肝或肾切片(5μm)在95℃下使用柠檬酸盐缓冲液处理20分钟，以进行脱亲和、再水合和抗原回收(百进生物科技公司参考928502)。用PAP笔界定样品，用高蛋白IHC/ICC阻断缓冲液(电子生物科学公司参考00-4952-54)阻断15分钟，然后与Ter-119(血管捕获RBC的标志物)的一级抗体一起孵育1小时，与alexa fluor-488(百进生物科技公司参考116215；1/100稀释)偶联。将载玻片用TBS吐温-20 0.05％彻底洗涤3X 10分钟，并且用DAPI(赛默飞世尔科技公司参考P36962)的prolong diamond防褪色封固剂封固。在EVOS M5000成像系统(赛默飞世尔科技公司)上以×200的放大率采集图像，并且使用ImageJ软件分析每个区域的正像素。通过阻塞包括肺和肝在内的重要器官中的血管的RBC(Ter-119)的免疫荧光(IF)染色来可视化和量化血管闭塞的强度(分别为图12和图13)。SCD小鼠暴露于血红素显著增加了肺和肝中血管闭塞的强度。与PBS处理相比，用抗备解素单克隆抗体预处理以统计学显著的方式有效地降低了血管闭塞水平。

统计分析研究采用单因素方差分析(ANOVA)检验，然后进行图基检验(多重比较检验)或克鲁斯卡尔-沃利斯检验(非参数)，以分析与对照相比的处理效果。所有统计分析均使用GraphPad软件(v6.00，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)得出。鉴定了p<0.05水平的拒绝无效假设的统计显著性。为了说明的目的，还注释了显著性水平P<0.01和P<0.005。

实例3：补体诱导的C3和C5b-9沉积测定

血红素对SS RBC上补体沉积的诱导及对抗备解素阻断的评估

来自血红蛋白基因(SS)突变纯合子SCD患者的RBC和血清从BioIVT(分别为目录HUMANRBCALSUZN和HMRBC-SCA)和乐天生物科学(Sanguine Biosciences)(研究#24348)获得。明胶弗罗拿缓冲液(GVB)从Boston Bioproducts(目录IBB-300X)获得。Mg-EGTA(目录B106)、C8耗竭的正常人血清(目录A325)和正常人血清(目录NHS)从补体技术公司(Complement Technology)获得。PBS从康宁公司(Corning)(目录21-031-CV)获得。以不同浓度(50uM-800uM)使用猪血红素(西格玛目录51280)来扩大补体激活并且诱导人细胞上的沉积。

所有离心均在4℃下以440xg离心5分钟，并且用多通道移液管抽吸上清液，以避免扰乱松散的RBC团块。

用于在补体抑制测定中使用的血红素的适当浓度的鉴定

将患者SS RBC在PBS中洗涤三次，重新悬浮在GVB、5mM Mg EGTA中，并且以2x 10⁶个细胞/孔的浓度重新分配至无菌V底96孔板。添加自体血清至20％终浓度。以0μM、100μM、200μM、400μM和800μM使用血红素。在37℃ 5％CO₂下孵育20-30分钟后，加入含有10％EDTA的PBS(康宁公司，目录46-030-CI)以终止补体激活。洗涤RBC并且用iC3b抗体染色，如下所述。

对血红素诱导的SS-RBC上的补体沉积的AP阻断

将患者SS RBC在PBS中洗涤两次或三次。为了诱导补体沉积，将RBC以5x 10⁷个细胞/mL重新悬浮在GVB、5mM Mg EGTA(测定缓冲液)中，并将30μL添加到无菌V-96孔中。添加正常人血清至20％终浓度。将补体抑制剂以3.125μM的5X工作储备液在测定缓冲液中稀释，并将10μL添加到含有细胞的孔中。添加猪血红素至400μM，并且将细胞在37℃、5％CO₂下孵育20-30分钟。通过添加150μL/孔的含有10mM EDTA的PBS来终止补体激活。将细胞离心并且用200μL PBS洗涤一次，并且针对以下iC3b和C5b-9沉积进行染色。

对SS-RBC表面上的iC3b和C5b-9沉积的流式细胞术分析

将细胞重新悬浮在50μL/孔iC3b(Quidel，目录A209)或C5b-9抗体(Quidel，目录A239)中，在PBS中稀释至4μg/mL，并且在4℃下孵育20-30分钟，在鞘液中进行流式细胞术染色。用150μL-200μL PBS洗涤细胞两次，重新悬浮在50μL山羊抗小鼠IgG(H+L)-AF488(英杰公司(Invitrogen)目录A11029)中，在PBS中稀释至4μg/mL，并且在4℃下孵育20-30分钟。在一些实验中，以4μg/mL的浓度使用山羊抗小鼠IgG2b AF488(英杰公司，目录A21141)。用150μL-200μL PBS洗涤细胞两次，并且在LSR Fortessa上采集用于流式细胞术分析。

结果

图14显示了基于流式细胞术的关于镰状RBC上血红素诱导的补体沉积的数据以及抗备解素抗体处理的效果。在20％正常人血清(NHS)存在下，将SCD红细胞暴露于400μM血红素。左边是散点图，显示了iC3b在各种条件下的沉积，包括正常、血红素和血红素+抗备解素抗体预处理。右侧是量化iC3b水平的条形图。对于图14所示的数据，注释了****P<0.0001和**P<0.01的显著性水平。图14显示了在存在抗备解素抗体的情况下，iC3b的SCD RBC上的血红素触发补体沉积被阻断了>95％，而C5b-9的被阻断了>85％。

图15显示了基于流式细胞术的关于镰状RBC上血红素诱导的补体沉积的数据以及抗备解素抗体处理的效果。在20％正常人血清(NHS)存在下，将SCD红细胞暴露于400μM血红素。左边是散点图，显示了C5b9在各种条件下的沉积，包括正常、血红素和血红素+抗备解素。右侧是量化C5b9水平的条形图。对于图15所示的数据，注释了**P<0.01的显著性水平。图15显示，在存在抗备解素抗体的情况下，iC3b的SCD RBC上的血红素触发的补体沉积被阻断了>95％，而C5b-9的被阻断了>85％。

如图14和图15所示，镰状细胞患者的红细胞上血红素触发显著水平的iC3b和C5b-9沉积。如通过学生t检验确定，针对iC3b和C5b-9的显著水平分别为P<0.0001和<0.01。在存在抗备解素单克隆抗体的情况下，iC3b的SCD RBC上的血红素触发补体沉积被阻断了>95％，而C5b-9的被阻断了>85％(分别地，P<0.0001和<0.01)。

实例4：AP抑制剂阻断HMEC-1细胞上的血红素诱导的补体沉积

内皮细胞系HMEC-1购自ATCC(CRL 3243)，并且在AcCellerate(目录CBA02，批号92-190318FG01)扩增和储备。这是真皮微血管内皮细胞系。细胞在传代<5时用于实验。

所有离心步骤在室温(RT)下在300g下进行5-7分钟。将HMEC-1细胞以1.5x10⁵个细胞/孔接种到6孔板中的培养基(内皮细胞生长培养基MV2，Promocell公司，目录22022)中，并且使其达到汇合(72小时)。将正常人血清(补体技术公司，目录NHS)掺入1uM抑制剂，使用含有5mM-10mM MgEGTA的活细胞成像溶液(LCIS)(英杰公司，目录A1429DJ)稀释至20％，并且添加到HMEC-1培养基(以代替培养基)中。可替代地，使用不含MgEGTA的LCIS作为测试缓冲液。添加血红素至400μM，混合并且在37℃下孵育20-30分钟。用2mL PBS(康宁公司，目录21-031-CV)冲洗细胞两次，并且用含有10mM EDTA的PBS(康宁公司，目录46-034-CI)分离细胞。将细胞离心，将团块重新悬浮在400μL鞘液(BD生物科学，目录342003)中，并且转移至V底96孔板，一式两份。离心后，将团块重新悬浮在50μL/孔鞘液中，该鞘液含有稀释至4μg/mL的iC3b或C5b-9抗体。几次洗涤后，将细胞与50μL山羊抗小鼠IgG(H+L)AF 488(在鞘液中稀释至4μg/mL)一起在4℃下孵育30分钟。几次洗涤后，在LSR Fortessa上采集细胞用于流式细胞术分析。

结果

图16显示了条形图，这些条形图显示暴露于血红素的内皮细胞上血红素诱导的补体片段沉积的基于流式细胞术的分析以及抗备解素抗体对补体沉积的影响。图中显示了正常、血红素以及血红素+抗备解素预处理的补体片段水平(从左到右)的变化。左侧分图显示了C3/C3b/iC3b沉积，而右侧分图显示了C5b9沉积。对于图16所示的数据，注释了P<0.0001的显著性水平。

如图16所示，血红素有效地触发了iC3b和C5b-9在HMEC-1细胞上的沉积(两者的P<0.0001)。在存在抗备解素抗体的情况下，iC3b的HMEC-1上的沉积被阻断了>70％，而C5b-9的被阻断了>85％(两者的P<0.0001)。

参考文献

以下参考文献通过引用以其全文并入本文：

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其他实施例

应当理解，贯穿本说明书给出的每个最大数值限制都包括每个较低数值限制，就好像这种较低数值限制在本文中被明确地写出一样。贯穿本说明书给出的每个最小数值限制都将包括每个较高数值限制，就好像这些较高数值限制在本文中被明确写出一样。贯穿本说明书给出的每个数值范围都将包括落入这种更宽的数值范围内的每个较窄数值范围，就好像这些较窄数值范围在本文中被明确写出一样。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文描述了用于本披露的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的并不旨在是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目(例如，PUBMED、NCBI、FDA药物或UNIPROT登录号)和其他参考文献通过引用以其整体并入。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。

尽管已经说明和描述了本披露的特定实施例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离本披露的精神和范围的情况下可以进行各种其他变化和修改。因此，旨在在所附权利要求中涵盖在本披露范围内的所有这些变化和修改。

Claims (46)

1.一种治疗受试者中镰状细胞病(SCD)的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的包含补体旁路途径抑制剂的组合物。

2.一种治疗受试者中β地中海贫血(BT)的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的包含补体旁路途径抑制剂的组合物。

3.一种治疗受试者中镰状细胞BT的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的包含补体旁路途径抑制剂的组合物。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该补体旁路途径抑制剂选自由抗体或其抗原结合片段、肽、小分子、核酸分子和适配体组成的组。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该补体旁路途径抑制剂是备解素抑制剂。

6.如权利要求5所述的方法，其中该备解素抑制剂是抗备解素抗体或其抗原结合片段。

7.如权利要求6所述的方法，其中该抗备解素抗体或其抗原结合片段包含：

(a)CDR-H1(SEQ ID NO:2)、CDR-H2(SEQ ID NO:3)和CDR-H3(SEQ ID NO:4)。

8.如权利要求6所述的方法，其中该抗备解素抗体或其抗原结合片段包含：

(a)SEQ ID NO:6的抗FP VHH组分；

(b)SEQ ID NO:6的序列；

(c)SEQ ID NO:31的V_HH；

(d)SEQ ID NO:32的V_HH；

(e)SEQ ID NO:33的V_HH；或

(f)SEQ ID NO:34的V_HH。

9.如权利要求4所述的方法，其中该肽抑制补体因子C3。

10.如权利要求4所述的方法，其中该小分子是补体因子D抑制剂。

11.如权利要求4所述的方法，其中该核酸分子选自由小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA和反义寡核苷酸组成的组。

12.如权利要求11所述的方法，其中该核酸分子与编码补体C3的内源性核酸序列的一部分互补。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该组合物包含补体抑制剂和药学上可接受的载剂。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该方法降低了该受试者的血管内溶血。

15.如权利要求1和4-14中任一项所述的方法，其中该SCD包括溶血性贫血或急性血管闭塞(VOC)事件。

16.如权利要求15所述的方法，其中该受试者呈现腹部鼓胀、右上腹痛或急性疼痛性肝肿大。

17.如权利要求15所述的方法，其中该VOC事件是肺VOC和/或肝VOC。

18.如权利要求17所述的方法，其中：

(a)该肺VOC表现为急性胸腔综合征(ACS)和/或慢性肺病；和/或

(b)该肝VOC表现为严重腹痛和/或肝功能障碍。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中该受试者是被诊断为患有SCD、BT或镰状细胞BT的人患者。

20.如权利要求19所述的方法，其中该人患者未满18岁。

21.如权利要求1所述的方法，其中该患有SCD的受试者被诊断为具有β珠蛋白基因中的突变。

22.如权利要求21所述的方法，其中该β珠蛋白基因中的突变是β珠蛋白基因中的单核苷酸突变。

23.如权利要求22所述的方法，其中该β珠蛋白基因中的单核苷酸突变导致相对于SEQID NO:1在位置6处谷氨酸被缬氨酸取代。

24.如权利要求1所述的方法，其中该SCD包括红细胞(RBC)中的补体沉积。

25.如权利要求24所述的方法，其中该SCD包括RBC中的C5b9沉积。

26.如权利要求1所述的方法，其中该SCD包括血管内溶血(IVH)。

27.如权利要求26所述的方法，其中IVH的特征在于包括乳酸脱氢酶(LDH)、胆红素、游离血红蛋白和游离血红素在内的至少一种标志物的增加。

28.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中当向该受试者施用该补体旁路途径抑制剂时，该受试者表现出SCD表型、BT表型或镰状细胞BT表型的降低。

29.如权利要求28所述的方法，其中该SCD表型包括导致血管组织损害的炎症或细胞毒性增加；VOC事件触发的疼痛加剧；或SCD患者的死亡率或发病率增加。

30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中该组合物通过静脉内施用。

31.一种在缺氧条件下提高细胞活力或降低细胞死亡的方法，该方法包括使这些细胞与有效量的包含补体旁路途径抑制剂的组合物接触。

32.如权利要求31所述的方法，其中在体内接触这些细胞。

33.如权利要求31或32所述的方法，其中这些细胞是镰状细胞。

34.如权利要求31-33中任一项所述的方法，其中该补体旁路途径抑制剂是备解素抑制剂。

35.如权利要求34所述的方法，其中该备解素抑制剂选自由抗备解素抗体或含有至少一个与备解素结合的部分的双特异性抗体组成的组。

36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中SCD的特征在于选自以下的特征：

(a)补体C3和/或C5b9在受影响细胞(例如，RBC)中的沉积增加，尤其是在触发条件(例如，缺氧)下；

(b)新生血管溶血增加，尤其是在触发条件(例如，缺氧)下，其中溶血增加的特征在于血浆LDH活性/水平、游离血红素和/或游离血红蛋白水平和/或总胆红素水平的增加；或

(c)VOC的严重程度增加，尤其是在触发条件(例如，缺氧)下。

37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用补体抑制剂治疗得到选自以下的结果：

(a)抑制或逆转该SCD受试者的RBC中C3和C5b9的补体片段沉积，例如在缺氧条件下；

(b)减弱或逆转缺氧条件下血管内溶血(如测量到血浆LDH活性/水平、游离血红素和/或游离血红蛋白水平和/或总胆红素水平增加)的水平；或

(c)降低或逆转该SCD受试者的肺、肾、肝和脾等重要器官血管中的血管闭塞。

38.如权利要求37所述的方法，其中与用羟基脲治疗该受试者相比，用补体抑制剂治疗导致来自(a)-(c)的至少一个结果的改善。

39.一种包含补体旁路途径抑制剂的组合物，该组合物用于在治疗受试者的SCD或与之相关的症状中使用，特别地用于提高血细胞的活力，这些血细胞含有使其易受缺氧或低氧胁迫影响的一个或多个突变，例如，正常血红蛋白A(α2β2)到血红蛋白S(α2β6Val2)的突变或RBC的β珠蛋白基因中的突变。

40.如权利要求39所述的用于使用的组合物，其中该补体旁路途径抑制剂是备解素抑制剂。

41.如权利要求40所述的用于使用的组合物，其中该备解素抑制剂选自由抗备解素抗体或含有至少一个与备解素结合的部分的双特异性抗体组成的组。

42.如权利要求41所述的用于使用的组合物，其中该核酸分子选自由小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA和反义寡核苷酸组成的组。

43.一种包含补体旁路途径抑制剂的组合物，该组合物用于在缺氧条件下提高细胞活力或降低细胞死亡中使用。

44.如权利要求43所述的组合物，其中该补体旁路途径抑制剂是备解素抑制剂。

45.如权利要求44所述的组合物，其中该备解素抑制剂选自包括抗备解素抗体或含有至少一个与备解素结合的部分的双特异性抗体的组。

46.如权利要求45所述的组合物，其中该补体旁路途径抑制剂是选自由小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA和反义寡核苷酸组成的组的核酸分子。