CN117904204A - 一种携带Pdxl、Ngn3和MafA基因的重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3及其构建与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种携带Pdxl、Ngn3和MafA基因的重组腺相关病毒质粒pAAV8‑M3及其构建与应用。合成Linker 2A寡核苷酸多顺反子序列克隆至pENTER质粒，得到重组质粒pENTER‑2A；将Ngn3基因、Pdx1基因、MafA基因克隆至重组质粒pENTER‑2A，得到重组质粒pENTER‑M3；将重组质粒pENTER‑M3与AAV8表达载体进行LR重组反应，得到重组腺相关病毒质粒pAAV8‑M3。本发明采用腺相关病毒AAV8型做为基因载体，延长了目的基因的作用时间，提高了重编程效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种携带Pdxl、Ngn3和MafA基因的重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3及其构建与应用。
背景技术
2008年，Zhou Q等首先提出了利用携带Pdx1、Ngn3和MafA基因的重组腺病毒Ad-M3C诱导小鼠胰腺外分泌腺细胞成为β细胞的重编程方案，利用Ad-M3C直接注射于小鼠胰腺近脾区域，感染小鼠胰腺外分泌腺细胞，使其重编程为与β样细胞，无论在大小、形态及超微结构方面都与内源性胰岛β细胞相似(Zhou Q,Brown J,Kanarek A,et al.In vivoreprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.[J].Nature,2008,455(7213):627-32.)。但该方案存在以下不足：该方案中应用腺病毒作为载体，病毒滴度较低，在应用中需要使用浓缩试剂盒进行大规模的病毒液浓缩与纯化，研究成本增加；Pdx1、Ngn3和MafA基因重组腺病毒Ad-M3C在重编程过程中，由于腺病毒本身不整合细胞核的瞬时作用特点，使Ad-M3C作用时效较短，无法持续维持重编程进行，效率较低，从而影响胰岛素分泌功能以及维持血糖稳态。因此，提高重编程效率，满足临床应用需求是要解决的关键。
Pdx1、Ngn3和MafA基因是胰腺β细胞发育过程中三个关键转录因子，它们的表达对β细胞功能成熟至关重要，并且可以通过重塑局部脉管系统和分泌胰岛素来改善高血糖症。AAV8型腺相关病毒是源于非致病的野生型腺相关病毒，其生物安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，特别是在体内表达外源基因时能提高表达效率、延长作用的持久性，能够有效改善腺病毒瞬时表达的弊端，目前已不需要腺病毒的辅助，操作便捷，病毒滴度更高，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。2023年11月，James M.Wilson研究组发现，整合的载体基因组可能有助于AAV给药后在灵长类动物肝脏中的长期表达。研究人员对静脉注射AAV8和AAVrh10载体超过两年的非人灵长类动物进行了评估，结果表明，AAV介导的转基因在灵长类动物中的表达分为两个阶段——首先是来自外显子基因组，其表达量高但持续时间短，随后可能是来自整合载体，表达低得多但稳定持续(Jenny A.Greig et al.2023.Integrated vectorgenomes may contribute to long-term expression in primate liver after AAVadministration.Nature Biotechnology:2023-11-06https://www.nature.com/articles/s41587-023-01974-7)。
本发明为提高重编程效率和持续性，选择AAV8型腺相关病毒做为新的载体，构建携带Pdx1、Ngn3和MafA基因的重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3。
发明内容
本发明的目的在于提供一种携带Pdxl、Ngn3和MafA基因的重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3及其构建与应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3，所述重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3以AAV8表达载体为骨架，且携带Pdxl、Ngn3和MafA基因。
上述一种重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3的构建方法，包括以下步骤：
1)将Linker 2A寡核苷酸多顺反子序列克隆至pENTER质粒，得到重组质粒pENTER-2A；
2)在Ngn3基因片段前添加6×His标签基因，得到6×His-Ngn3基因片段，将6×His-Ngn3基因片段和入门质粒pENTER-2A用限制性内切酶AsiSI和SpeI双酶切后连接，得到重组质粒pENTER-2A-Ngn3；将Pdx1基因片段和重组质粒pENTER-2A-Ngn3用限制性内切酶BamHI酶切后连接，得到重组质粒pENTER-2A-Ngn3-Pdx1；在MafA基因片段前添加Flag标签基因，得到Flag-MafA基因片段，将Flag-MafA基因片段和重组质粒pENTER-2A-Ngn3-Pdx1用限制性内切酶ClaI酶切后连接，得到重组质粒pENTER-M3；
3)将重组质粒pENTER-M3与AAV8表达载体进行LR重组反应，得到重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3；
所述Linker 2A寡核苷酸多顺反子序列如SEQ ID NO.1所示。
所述Ngn3基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述Pdx1基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述MafA基因序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的显著优点在于：
1)本发明采用腺相关病毒AAV8型做为基因载体，延长了目的基因的作用时间，提高了重编程效率。
2023年11月，James M.Wilson研究组发表了对静脉注射AAV8和AAVrh10载体超过两年的非人灵长类动物中发现非免疫原性转基因实现了高度转导的研究成果，尽管在最初的90天内表达量有所下降，但达到了较低但稳定的状态。超过10％的肝细胞含有载体DNA的单个核域，尽管转基因表达消失了，但这些核域仍然存在。免疫原性转基因的载体DNA和RNA减少幅度更大。每100个细胞中就有1个细胞在广泛分布的位点上检测到载体序列的基因组整合，包括复杂的聚合结构。这项研究表明，AAV介导的转基因在灵长类动物中的表达效率和持续性都得到了提高(Jenny A.Greig et al.2023.Integrated vector genomes maycontribute to long-term expression in primate liver afterAAVadministration.Nature Biotechnology:2023-11-06https://www.nature.com/articles/s41587-023-01974-7)。
2)本发明采用腺相关病毒AAV8型做为基因载体，可特异性表达于胰腺部位，使目的基因的作用更高效，减少其免疫源性带来的不利影响，且病毒浓度较腺病毒高，操作更便捷高效，大大降低了成本。
AAV已成为目前最有潜力的基因传递工具，与其他递送载体相比，AAV更安全，驱动治疗基因表达的时期最长。现阶段研究人员已发现12种人类AAV血清型(AAV1至AAV12)和100多种非人类灵长动物AAV血清型。不同AAV血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列和组织特异性，因而其识别与结合的细胞表面受体也相应有很大差别，这也导致不同血清型转染的组织类型、细胞类型和感染效率也各不相同。不同血清型具有不同的组织亲噬性
Cheng H等研究证明，AAV8在胰腺中具有相对较高的转导效率。AAV8对胰腺的转导效率优于AAV1、AAV2、AAV5血清型，且持续表达时间较长；进一步通过胰腺导管给药观察不同血清型的组织分布发现AAV8可以高效转导胰腺组织，并且转导效率呈剂量依赖式增加(Henrique Cheng,et al.2007.Efficient and persistent transduction of exocrineand endocrine pancreas y adeno-associated virus type 8.Journal of BiomedicalScience 14:585-594)。总的来说，胰腺研究中，不同AAV血清型转导效率与AAV载体选择、启动子以及给药方式等因素密切相关，AAV8在各方面具有明显的优势。
3)本发明采用Pdx1、Ngn3和MafA基因作为目的基因，能促进胰腺外分泌腺细胞向β细胞转分化，有利于血糖稳态的维持。
糖尿病的发病机制中的核心关键是功能性胰腺β细胞容量的丢失，无法分泌足够的胰岛素以保持机体的血糖稳态，1型糖尿病主要是免疫介导的β细胞凋亡导致的胰岛素绝对缺乏。2型糖尿病是在胰岛素抵抗的同时伴有不同程度的β细胞功能异常和凋亡。因此，寻找一种新的供体来源细胞作为的种子细胞成为研究趋势。而细胞重编程技术使一种细胞类型转换为另一种细胞类型，提供了一种补充胰腺β细胞容量的新的思路。本研究中利用细胞重编程技术，选择了三种胰腺β细胞发育过程中的关键转录因子Pdx1、Ngn3和MafA的特定组合。胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreatic and duodenal homeobox factor1，Pdx1)是同源域转录因子家族的成员，胰岛内分泌细胞发育的关键基因之一，在胰腺分化过程中起到“总开关”的作用[19～20]。神经源素3(Neurogenin 3，Ngn3)调控早期胰腺发育和内分泌分化程序，对下游基因的活化，相关转录因子表达的启动，促进胰岛细胞的定向分化等过程都起着十分关键的作用。肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A基因(v-mafmusculoaponeuroticfibrosarcoma oncogene homologue A，MafA)是胰岛素启动子，对胰腺生长和β细胞产生胰岛素的功能至关重要，该基因敲除小鼠随年龄增长可发展成为糖尿病，是一种具有亮氨酸拉链结构的转录因子，它属于巨噬细胞激活因子(macrophage activating factor，Maf)家族。该家族分子包括含有4个N末端的酸性转录激活区域(acidic transcriptionactivating domain，TAD)的大Maf蛋白和3个包含bZIP的小Maf蛋白。MafA蛋白属于大Maf蛋白。作为一种转录因子，MafA蛋白的分布和其他转录因子有所不同，它是目前发现的唯一一种β细胞胰岛素基因活化转录因子。胰腺β细胞的成熟和功能的维持都有赖于MafA蛋白的正常表达。MafA蛋白是一种特异的胰岛β细胞核因子，可结合至胰岛素基因启动子区域保守顺式调控元件RIPE3b，作为一种强烈的反式作用因子调控胰岛素的表达(Takatsugu Yamada,et al.2017.Reprogramming Mouse Cells With a Pancreatic Duct Phenotype toInsulin-Producingβ-Like Cells.Endocrinology,156(6):2029–2038.)。
附图说明
图1：Linker 2A寡核苷酸多顺反子结构示意图。
图2a：重组质粒pENTER-M3构建示意图。图2b：重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3构建示意图。
图3：重组质粒pENTER-M3酶切鉴定结果。
图4：重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3测序结果。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
1合成Linker 2A寡核苷酸多顺反子
2A肽是来源于病毒的短肽，一般为18至25个氨基酸，也被称为“自我剪切”肽。2A肽能够使一条转录产物产生多种蛋白，即使融合蛋白通过2A肽自我切割分离，产生多种蛋白质独立地行使各自的功能。目前常用的2A肽有4种：P2A、T2A、E2A和F2A。P2A来源于猪破伤风病毒，T2A来源于猪胸腺病毒，E2A来源于马甲型鼻炎病毒，F2A来源于手足口病病毒。在4种常用的2A肽中，P2A通常具有最高的切割效率(在某些情况下接近100％)，接下来是T2A，其次是E2A和F2A。本发明所选用的2A肽为P2A、T2A和E2A。
本发明提供的Linker 2A寡核苷酸多顺反子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。如图1，Linker 2A寡核苷酸多顺反子有5’至3’方向排列的AsiSI酶切位点识别序列，SpeI酶切位点识别序列，P2A序列，BamHI酶切位点识别序列，T2A序列，ClaI酶切位点识别序列，E2A序列，以及MluI酶切位点识别序列。
2构建入门质粒pENTER-2A
将人工合成的SEQ ID NO.1所示的Linker 2A寡核苷酸多顺反子核苷酸序列和pENTER质粒分别用限制性内切酶AsiSI和MluI双酶切，二者的酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，得到入门质粒pENTER-2A。酶切体系为：1μg pENTER质粒或Linker 2A寡核苷酸多顺反子核苷酸序列，5μl 10×NEBuffer，限制性内切酶AsiSI和MluI各1μl，ddH2O补足至50μl；37℃水浴5～15分钟或者过夜。连接体系为：2μl 5×T4 DNA连接酶缓冲液，0.5U T4 DNA连接酶，50ng酶切后的Linker 2A寡核苷酸多顺反子核苷酸序列，50ng酶切后的pENTER质粒；先25℃孵育1小时，然后65℃孵育10分钟。
3构建重组质粒pENTER-M3
在胰腺发育期间，Ngn3、Pdx1基因表达于胰腺发育早期，而MafA基因则在胰岛素生成细胞成批发育时才有所表达，且Ngn3和Pdx1基因在各种胰岛细胞中都有所表达，而MafA基因是唯一的一种具有强烈胰岛素表达激活特性的胰腺β细胞特异性转录因子。这些胰腺发育的特异性基因，在胰岛新生中都起着相当重要的作用。
以重组腺病毒质粒Addgene plasmid#61041为模板设计引物进行PCR扩增，获得Ngn3基因片段、Pdx1基因片段和MafA基因片段，其中，Ngn3基因片段核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，Pdx1基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，MafA基因片段核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
在Ngn3基因片段前添加6×His标签基因(CACCACCACCACCACCAC)，得到6×His-Ngn3基因片段，将6×His-Ngn3基因片段和入门质粒pENTER-2A分别用限制性内切酶AsiSsI和SpeI双酶切，二者的酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pENTER-2A-Ngn3。将Pdx1基因片段和重组质粒pENTER-2A-Ngn3分别用限制性内切酶BamHI酶切，二者的酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pENTER-2A-Ngn3-Pdx1。在MafA基因片段前添加Flag标签基因(GATTACAAGGACGACGATGACAAG)，得到Flag-MafA基因片段，将Flag-MafA基因片段和重组质粒pENTER-2A-Ngn3-Pdx1分别用限制性内切酶ClaI酶切，二者的酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pENTER-M3(图2a)。
重组质粒pENTER-M3经AsiSI和MluI双酶切得到3000bp的小片段(图3)。
4构建重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3
将重组质粒pENTER-M3和pAAV-CMV-C-H质粒(vigene，货号AV88001)进行LR重组反应，反应产物转化大肠杆菌DH5α后在含有100mg/L氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上筛选阳性克隆，进行PCR鉴定及测序，获得重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3(图2b)。LR重组反应体系为：重组质粒pENTER-M3(50～150ng)1～7μl，pAAV-CMV-C-H质粒(150ng/μl)1μl，LRClonase II酶混合物(Invitrogen，货号11791-020)2μl，pH 8.0的TE缓冲液补液至10μl；25℃反应1小时，然后加入1μl蛋白酶K，37℃反应10分钟。
以重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3为模板，PCR扩增鉴定，PCR引物如下所示：
5’端测序引物：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’，
3’端测序引物：5’-CCTCTACAAATGTGGTATGGC-3’。
DNA扩增产物测序，测序结果与NCBI报道完全一致(图4)，从而获得了重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3，其特征在于：所述重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3以AAV8表达载体为骨架，且携带Pdxl、Ngn3和MafA基因。
2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将Linker 2A寡核苷酸多顺反子序列克隆至pENTER质粒，得到重组质粒pENTER-2A；
2）在Ngn3基因片段前添加6×His标签基因，得到6×His-Ngn3基因片段，将6×His-Ngn3基因片段和入门质粒pENTER-2A用限制性内切酶AsiSlI和SpeI双酶切后连接，得到重组质粒pENTER-2A-Ngn3；将Pdx1基因片段和重组质粒pENTER-2A-Ngn3用限制性内切酶BamHI酶切后连接，得到重组质粒pENTER-2A-Ngn3-Pdx1；在MafA基因片段前添加Flag标签基因，得到Flag-MafA基因片段，将Flag-MafA基因片段和重组质粒pENTER-2A-Ngn3-Pdx1用限制性内切酶ClaI酶切后连接，得到重组质粒pENTER-M3；
3）将重组质粒pENTER-M3与AAV8表达载体进行LR重组反应，得到重组腺相关病毒质粒pAAV8-M3。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述Linker 2A寡核苷酸多顺反子序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述Ngn3基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述Pdx1基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述MafA基因序列如SEQ ID NO.4所示。
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