CN117904055A

CN117904055A - 原代细胞基因编辑

Info

Publication number: CN117904055A
Application number: CN202410054719.7A
Authority: CN
Inventors: 凯尔·马丁·雅各比; 亚历克西斯·弗兰祖索夫; 史蒂芬妮·曼德尔-卡什曼
Original assignee: Parkert Pharmaceutical Co
Current assignee: Parkert Pharmaceutical Co
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2024-04-19
Also published as: US10584357B2; JP2021501581A; JP2024009805A; JP7397791B2; EP3703712A1; CN111918659A; US20200299730A1; US20210395783A1; US10550406B2; AU2018357861A1; US20190376091A1; WO2019089610A1; BR112020008704A2; US20200165634A1; CA3081320A1; RU2020116585A3; MX2020004541A; TW201934754A; US20190376086A1; SG11202004026QA

Abstract

提供了用于原代细胞的核酸酶介导的基因编辑的方法和组合物，所述方法和组合物不使用病毒介导的递送。还提供了使用经编辑的原代细胞的治疗方法。

Description

原代细胞基因编辑

本申请是申请日为2018年10月30日、申请号为201880085053.4、发明名称为“原代细胞基因编辑”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年10月30日提交的美国临时申请第62/579,113号和于2017年10月30日提交的美国临时申请第62/579,114号的权益，这些申请中的每一个出于所有目的特此通过引用以其整体并入。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经通过EFS-Web提交，并且该序列表通过引用以其整体并入本文。于2019年7月25日生成的所述ASCII副本被命名为087520.0104SequenceListings.txt并且大小为57,432字节。

背景

基因靶向是一种通过其可以直接编辑基因组的方法，为工程化细胞产品、修复引起遗传疾病的突变或创造突变来研究基因提供了途径。基因靶向依赖于在携带所期望的改变的序列的同源修复模板DNA连同靶向感兴趣基因座的位点特异性核酸酶一起的递送后的同源重组。

基因靶向已被用于人类原代T细胞，以产生具有新颖特异性的T细胞。在这些情况下，已经使用AAV递送同源修复模板DNA。该DNA包含对新表位特异性的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的编码序列。当这些序列被靶向TCRα基因座(通常)或TCRβ基因座时，研究人员可以实现内源TCR的同时敲除(并去除对应的特异性)，以及新蛋白(和对应的特异性)的敲入。这一过程用于规模化产生用于治疗用途的CAR T细胞和TCR T细胞。然而，AAV产生需要大量的时间，成本高，难度大，而且监管严格，限制了其应用。

先前已经描述了用裸质粒DNA进行基因编辑，但是仅在永生化细胞系的背景下，提出原代细胞中的毒性问题。这些问题可能起源于研究人员使用mRNA来递送核酸酶，其表现出一定的毒性，连同DNA一起进一步降低了细胞的存活力。这些问题也可能起源于这样的事实，即DNA递送效率取决于DNA的大小，并且载体可能没有被适当地优化。此外，已知大多数研究实验室使用的基于试剂盒的质粒制品中常见的DNA杂质会导致细胞毒性，这可能阻碍了使用质粒DNA作为同源修复模板的进展。直到最近，DNA纯化和递送技术才得到改进(例如，质粒疫苗的出现，以及优化的电穿孔方案和设备，诸如核转染)。

转座子也已被用来将DNA插入人类原代T细胞，但是以非特异性的方式(更类似于逆转录病毒递送)进行。在这种情况下，待被随机插入基因组的裸DNA作为裸质粒DNA递送。然而，高毒性和低效率是该方法的局限性。通过同源重组在人类原代T细胞中进行基因编辑也已在先前描述过(例如，Schumann等人Proc Natl Acad Sci U S A.2015Aug 18；112(33)：10437-42)，然而仅在非常小的编辑或修复的情况下，例如20个核苷酸或更少核苷酸的情况下进行。经由同源重组通过核糖核蛋白(RNP)复合体的电穿孔进行的基因编辑也已在先前描述过，例如在Kim等人(Genome Res.2014Jun；24(6)：1012-9)和国际公布第WO2016/123578号中描述过，然而，在使用线性模板的每一种情况下仅证明了12个核苷酸的相对小的插入(或基因组序列的替代)。对于除了T细胞以外的原代细胞，诸如造血干细胞和自然杀伤(NK)细胞，还未很好地描述过用于更大编辑的组合物和方法。本领域缺乏在原代细胞中进行大编辑的有效方法，从而潜在地限制了基因编辑的治疗应用。

因此，本领域非常需要改进的用于介导细胞(诸如人类原代细胞和人类原代T细胞)中基因编辑的组合物和方法。

概述

本文提供了修饰的细胞，所述修饰的细胞包含：包含外源核苷酸序列的环状多核苷酸，外源核苷酸序列包含：a)编码基因的至少一部分的核苷酸序列；b)与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，与内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进内源基因组靶基因座处的同源重组，并且其中修饰的细胞基本上不含病毒介导的递送组分。在一些实施方案中，修饰的细胞还包含整合的核苷酸序列，其中整合的核苷酸序列包含与编码基因的至少一部分的核苷酸序列相同的序列，整合的核苷酸序列被整合在内源基因组靶基因座处，并且整合的核苷酸序列被取向为使得基因的至少一部分能够被表达。在一些实施方案中，修饰的细胞还包含能够裂解内源基因组靶基因座内的指定的核苷酸序列的核酸酶组合物。

本文还提供了包含T细胞的修饰的细胞，所述T细胞包含：a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；c)编码第一接头多肽序列的核苷酸序列；d)编码第二接头多肽序列的核苷酸序列；其中编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列以及编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被整合到内源TCR-α基因座中，编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列、以及编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被取向为使得多肽序列的每一个能够被表达为单一多肽，其中第二接头多肽序列位于TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列之间，第一接头多肽和第二接头多肽是能够在T细胞中被裂解使得TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列各自形成单独的多肽的可裂解接头多肽，其中单独的多肽能够缔合在一起形成功能性TCR，其中修饰的细胞基本上不含病毒介导的递送组分，并且其中内源TCR-β基因座被破坏。

本文还提供了包含T细胞的修饰的细胞，所述T细胞包含：a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；c)编码第一接头多肽序列的核苷酸序列；d)编码第二接头多肽序列的核苷酸序列；其中编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列以及编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被整合到内源TCR基因座中，编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列、以及编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被取向为使得多肽序列的每一个能够被表达为单一多肽，其中第二接头多肽序列位于TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列之间，并且第一接头多肽和第二接头多肽是能够在T细胞中被裂解使得TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列各自形成单独的多肽的可裂解接头多肽，其中单独的多肽能够缔合在一起形成功能性TCR。在一些实施方案中，修饰的细胞还包含含有外源核苷酸序列的环状多核苷酸，外源核苷酸序列包含：a)编码以下的核苷酸序列：编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列、以及编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列；b)与内源TCR基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与内源TCR基因座的第二个区域相同的核苷酸序列，并且与内源TCR基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进内源TCR基因座处的同源重组。在一些实施方案中，修饰的细胞基本上不含病毒介导的递送组分。在一些实施方案中，修饰的细胞还包含能够裂解内源TCR基因座内的指定的核苷酸序列的核酸酶组合物。

在一些实施方案中，修饰的细胞还包含突变，所述突变产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因。在一些实施方案中，包括在基因的编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：导致被翻译的蛋白的读框改变的移码突变、引起氨基酸被终止密码子取代的无义突变、以及导致一种氨基酸被另一种氨基酸取代的错义突变。在一些实施方案中，产生无功能基因的突变包括在基因的非编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：改变由基因编码的mRNA产物的表达的突变、以及改变由基因编码的mRNA产物的稳定性的突变。在一些实施方案中，修饰的细胞还包含能够裂解修饰的细胞内的第二指定的核苷酸序列的第二核酸酶组合物。

在一些实施方案中，核酸酶组合物包含选自由以下组成的组的核酸酶：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)家族核酸酶或其衍生物、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)或其衍生物以及归巢内切核酸酶(HE)或其衍生物。在一些实施方案中，CRISPR家族核酸酶是Cas9核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶组合物包含预先形成的蛋白复合体。在一些实施方案中，核酸酶组合物包含能够在修饰的细胞内表达核酸酶的核苷酸载体。在一些实施方案中，核酸酶组合物包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。在一些实施方案中，crRNA包含指导RNA(gRNA)，其中gRNA与所述指定的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA在单一多核苷酸上。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA在分开的多核苷酸上。

在一些实施方案中，编码基因的至少一部分的核苷酸序列或编码的多肽序列的表达由内源基因组靶基因座或内源TCR基因座内的内源启动子指导。在一些实施方案中，编码基因的至少一部分的核苷酸序列或编码的多肽序列的表达由外源启动子指导。在一些实施方案中，外源启动子选自由以下组成的组：哺乳动物启动子、人类启动子、病毒启动予、来自逆转录病毒或慢病毒的长末端重复序列(LTR)来源启动子、两个启动子的融合体、两个启动子部分的融合体(fusions of two portions of promoters)、MMLV LTR启动子、HIV LTR启动子、MCMV LTR启动子、EF1a启动子、MND启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、小分子诱导型启动子、四环素诱导型启动子、小分子条件性启动子、Cre-LoxP条件性启动子系统、Flp-FRT条件性启动子系统和他莫昔芬条件性启动子系统。

在一些实施方案中，编码基因的至少一部分的核苷酸序列、编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列或编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列的长度大于或等于100个碱基。在一些实施方案中，编码基因的至少一部分的核苷酸序列、编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列或编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列的长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于400个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于800个碱基、长度大于或等于1500个碱基、长度大于或等于2000个碱基或者长度大于或等于4000个碱基。

在一些实施方案中，与内源基因组靶基因座或内源TCR基因座的第一区域相同的核苷酸序列的长度大于或等于50个碱基、长度大于或等于100个碱基、长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于300个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于1000个碱基或者长度大于或等于2000个碱基。

在一些实施方案中，与内源基因组靶基因座或内源TCR基因座的第二区域相同的核苷酸序列的长度大于或等于50个碱基、长度大于或等于100个碱基、长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于300个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于1000个碱基或者长度大于或等于2000个碱基。

在一些实施方案中，与内源基因组靶基因座或内源TCR基因座的第一区域相同的核苷酸序列和与内源基因组靶基因座或内源TCR基因座的第二区域相同的核苷酸序列各自长度大于或等于600个碱基。

在一些实施方案中，在核苷酸序列的整合后，指定的核苷酸序列被破坏。

在一些实施方案中，与内源基因组靶基因座或内源TCR基因座可操作地缔合的内源基因的表达被破坏。

在一些实施方案中，修饰的细胞还包含能够增加同源重组率的另外的试剂。在一些实施方案中，能够增加同源重组率的另外的试剂包括同源重组修复途径的激活剂、非同源末端连接(NHEJ)修复途径的抑制剂或其组合。

在一些实施方案中，修饰的细胞还包含能够增加修饰的细胞的存活力的另外的试剂。在一些实施方案中，能够增加修饰的细胞的存活力的另外的试剂包括核酸感知途径(nucleic acid sensing pathway)的抑制剂。在一些实施方案中，核酸感知途径包括选自以下的组：TLR9核酸感知途径、AIM2核酸感知途径、IFI16核酸感知途径、cGAS核酸感知途径和胞质核酸感知途径。在一些实施方案中，核酸感知途径的抑制剂包括寡核苷酸拮抗剂。在一些实施方案中，寡核苷酸拮抗剂包含序列TTAGGG或其串联重复序列。

在一些实施方案中，环状多核苷酸包括质粒或纳米质粒。在一些实施方案中，质粒具有少于500个碱基的载体骨架，并且其中载体骨架是这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列不是编码基因的至少一部分的核苷酸序列、不是编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、不是编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列、不是编码第一接头多肽和第二接头多肽的核苷酸序列、不是与第一内源靶基因组基因座或内源TCR基因座相同的核苷酸序列、并且不是与第二内源靶基因组基因座或内源TCR基因座相同的核苷酸序列。

在一些实施方案中，环状多核苷酸不是聚合酶链式反应(PCR)扩增的多核苷酸。

在一些实施方案中，内源基因组靶基因座或内源TCR基因座包含编码区。在一些实施方案中，内源基因组靶基因座或内源TCR基因座包含内含子。

在一些实施方案中，内源基因组靶基因座或内源TCR基因座包括T细胞受体(TCR)-α基因座。在一些实施方案中，由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因是被破坏的TCR-β基因。

在一些实施方案中，内源基因组靶基因座或内源TCR基因座包括TCR-β基因座。在一些实施方案中，由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因是被破坏的TCR-α基因。

在一些实施方案中，内源基因组靶包括免疫检查点基因座。在一些实施方案中，免疫检查点基因座选自由以下组成的组：PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3和VISTA。

在一些实施方案中，基因的至少一部分包含接头序列。在一些实施方案中，接头序列编码可裂解接头多肽序列，其中在表达后，可裂解接头多肽被裂解，使得仅由基因的至少一部分编码的多肽被产生。在一些实施方案中，可裂解接头多肽中的任一个包含弗林蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，接头序列中的任一个包含选自由以下组成的组的2A核糖体跳跃元件：T2A、E2A、P2A和F2A。在一些实施方案中，可裂解接头多肽中的任一个包含Gly-Ser-Gly接头，任选地其中Gly-Ser-Gly接头是2A核糖体跳跃元件的N末端，并且任选地其中Gly-Ser-Gly接头呈从N末端至C末端的弗林蛋白酶裂解位点：Gly-Ser-Gly接头：2A核糖体跳跃元件取向。

在一些实施方案中，接头序列、编码第一接头多肽序列的核苷酸序列或编码第二接头多肽序列的核苷酸序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。

在一些实施方案中，接头序列、编码第一接头多肽序列的核苷酸序列或编码第二接头多肽序列的核苷酸序列包含外源启动子。

在一些实施方案中，其中接头序列、编码第一接头多肽序列的核苷酸序列或编码第二接头多肽序列的核苷酸序列包含剪接受体序列。

在一些实施方案中，基因的至少一部分、编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列或编码TCR基因的至少一部分的核苷酸序列包含编码信号肽的核苷酸序列，其中信号肽被可操作地连接至由基因的至少一部分编码的多肽、TCR-α多肽序列、TCR-β多肽序列或由TCR基因的至少一部分编码的多肽。在一些实施方案中，信号肽是外源信号肽，任选地，其中外源信号肽是人类生长激素信号肽。

在一些实施方案中，第一接头多肽序列和第二接头多肽序列包含相同的接头多肽序列。在一些实施方案中，编码相同的接头多肽序列的编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列包含密码子趋异的核苷酸序列，并且其中编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽的核苷酸序列相对于彼此是密码子趋异的。

在一些实施方案中，基因的至少一部分编码编码区。在一些实施方案中，编码区选自由以下组成的组：调节免疫系统的因子、细胞因子、调节T细胞功能的因子、促进T细胞存活的因子、促进T细胞功能的因子和免疫检查点抑制剂。

在一些实施方案中，基因的至少一部分编码非编码区。在一些实施方案中，非编码区选自由以下组成的组：shRNA、siRNA、miRNA、调节免疫系统的因子、细胞因子、调节T细胞功能的因子、促进T细胞存活的因子和促进T细胞功能的因子。在一些实施方案中，基因的至少一部分包括TCR基因的至少一部分。在一些实施方案中，TCR基因的至少一部分包含：a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；和c)编码第二接头序列的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列或TCR基因的至少一部分选自由以下组成的组：鼠源化(murinized)TCR、人源化TCR、结构域交换的TCR、点突变的TCR、具有能够形成二硫键的工程化半胱氨酸的工程化TCR、针对在人类中的表达而优化的密码子优化的TCR、针对密码子使用和去除RNA不稳定性元件而优化的序列优化的TCR、TCR基因的可变区序列、嵌合抗原受体(CAR)和单链TCR的至少一部分。

在一些实施方案中，TCR-α多肽序列、TCR-β多肽序列或由TCR基因的至少一部分编码的多肽被工程化为展示出相对于内源TCR多肽序列与第二外源TCR多肽序列更大程度的缔合，任选地，其中TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列被工程化为展示出相对于内源TCR多肽序列与彼此更大程度的缔合。

在一些实施方案中，编码的多肽序列呈从N末端至C末端的接头：TCR-α：第二接头：TCR-β取向。在一些实施方案中，编码的多肽序列呈从N末端至C末端的接头：TCR-β：第二接头：TCR-α取向。

在一些实施方案中，基因的至少一部分、编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列或编码TCR基因的至少一部分的核苷酸序列包含密码子趋异的核苷酸序列，并且其中密码子趋异的核苷酸序列相对于内源核苷酸序列是密码子趋异的。

在一些实施方案中，修饰的细胞包括免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包括T细胞。在一些实施方案中，T细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞、肿瘤浸润性T细胞、工程化T细胞、调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、α-βT细胞和γ-δT细胞。在一些实施方案中，其中免疫细胞包括自然杀伤细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选自由以下组成的组：B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤T细胞。

在一些实施方案中，修饰的细胞包括干细胞。在一些实施方案中，干细胞包括造血干细胞。在一些实施方案中，干细胞包括造胚胎干细胞。

在一些实施方案中，修饰的细胞是原代细胞。

在一些实施方案中，修饰的细胞是分离的细胞，其中分离的细胞是从受试者分离的。在一些实施方案中，受试者已知或疑似患有癌症。

在一些实施方案中，修饰的细胞包括人类细胞或人类来源的细胞。

在一些实施方案中，修饰的细胞是离体培养的细胞。在一些实施方案中，离体培养的细胞包括经刺激的细胞。在一些实施方案中，经刺激的细胞包括细胞因子刺激的T细胞，任选地，其中细胞因子刺激的T细胞包括CD3刺激的T细胞、CD28刺激的T细胞或CD3和CD28刺激的T细胞。在一些实施方案中，细胞因子刺激的T细胞是在IL7、IL15或其组合的存在下培养的。在一些实施方案中，细胞因子刺激的T细胞是在IL2的存在下培养的。在一些实施方案中，细胞因子刺激的T细胞在基本上不含IL2的培养基中培养。

在一些实施方案中，修饰的细胞不含整合的病毒，其中整合的病毒与病毒介导的递送组分可操作地缔合。在一些实施方案中，修饰的细胞的表面上的MHC I类不含来源于病毒介导的递送组分或整合的病毒的肽，其中整合的病毒与病毒介导的递送组分可操作地缔合。

在一些实施方案中，修饰的细胞还包含含有第二外源核苷酸组合物的第二环状多核苷酸，第二外源核苷酸组合物包含：a)编码第二基因的至少一部分的核苷酸序列；b)与第二内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与第二内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，并且与第二内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进第二内源基因组靶基因座处的同源重组。在一些实施方案中，修饰的细胞还包含第二整合的核苷酸序列，其中第二整合的核苷酸序列包含与编码第二基因的至少一部分的核苷酸序列相同的序列，第二整合的核苷酸序列被整合在第二内源基因组靶基因座处，并且第二整合的核苷酸序列被取向为使得第二基因的至少一部分能够被表达。

本文还提供了包含本文描述的任一种修饰的细胞的细胞群体，其中大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％的群体包含整合的核苷酸序列。在一些实施方案中，修饰的细胞在整合的核苷酸序列的整合后没有经历分选、选择或分离。

本文还提供了一种细胞群体，所述细胞群体包含：整合的核苷酸序列，其中整合的核苷酸序列包含基因的至少一部分，整合的核苷酸序列被整合在内源基因组靶基因座处，并且整合的核苷酸序列被取向为使得基因的至少一部分能够被表达，其中细胞群体基本上不含病毒介导的递送组分，并且其中群体中大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％的T细胞包含整合的核苷酸序列。在一些实施方案中，T细胞在整合的核苷酸序列的整合后没有经历分选、选择或分离。

在一些实施方案中，细胞群体还包含能够裂解内源TCR基因座内的指定的核苷酸序列的核酸酶组合物。

在一些实施方案中，细胞群体还包含含有外源核苷酸序列的环状多核苷酸，外源核苷酸序列包含：a)编码基因的至少一部分的核苷酸序列；b)与内源基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与内源基因座的第二区域相同的核苷酸序列，并且与内源基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进内源基因座处的同源重组。

在一些实施方案中，细胞群体是至少1×10⁶个T细胞、至少2×10⁶个T细胞、至少5×10⁶个T细胞、至少1×10⁷个T细胞或至少5×10⁷个T细胞。

在一些实施方案中，细胞群体还包含突变，所述突变产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因。在一些实施方案中，产生无功能基因的突变包括在基因的编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：导致被翻译的蛋白的读框改变的移码突变、引起氨基酸被终止密码子取代的无义突变、以及导致一种氨基酸被另一种氨基酸取代的错义突变。在一些实施方案中，产生无功能基因的突变包括在基因的非编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：改变由基因编码的mRNA产物的表达的突变、以及改变由基因编码的mRNA产物的稳定性的突变。

在一些实施方案中，核酸酶组合物包含选自由以下组成的组的核酸酶：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)家族核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)或其衍生物以及归巢内切核酸酶(HE)或其衍生物。在一些实施方案中，CRISPR家族核酸酶是Cas9核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶组合物包含预先形成的蛋白复合体。在一些实施方案中，核酸酶组合物包含能够在细胞群体内表达核酸酶的核苷酸载体。在一些实施方案中，核酸酶组合物包含指导RNA，所述指导RNA在指定的核苷酸序列处指导核酸酶介导的裂解。在一些实施方案中，指导RNA包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA在单一多核苷酸上。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA在分开的多核苷酸上。

在一些实施方案中，细胞群体还包含能够裂解细胞群体内的第二指定的核苷酸序列的第二核酸酶组合物。

在一些实施方案中，编码的多肽序列的表达由内源基因组靶基因座内的内源启动子指导。在一些实施方案中，编码的多肽序列的表达由外源启动子指导。在一些实施方案中，外源启动子选自由以下组成的组：哺乳动物启动子、人类启动子、病毒启动子、来自逆转录病毒或慢病毒的长末端重复序列(LTR)来源启动子、两个启动子的融合体、两个启动子部分的融合体、MMLV LTR启动子、HIV LTR启动子、MCMV LTR启动子、EF1a启动子、MND启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、小分子诱导型启动子、四环素诱导型启动子、小分子条件性启动子、Cre-LoxP条件性启动子系统、Flp-FRT条件性启动子系统和他莫昔芬条件性启动子系统。

在一些实施方案中，编码基因的至少一部分的核苷酸序列的长度大于或等于100个碱基。在一些实施方案中，编码基因的至少一部分的核苷酸序列的长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于400个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于800个碱基、长度大于或等于1500个碱基、长度大于或等于2000个碱基或者长度大于或等于4000个碱基。

在一些实施方案中，与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列的长度大于或等于50个碱基、长度大于或等于100个碱基、长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于300个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于1000个碱基或者长度大于或等于2000个碱基。

在一些实施方案中，与内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列的长度大于或等于50个碱基、长度大于或等于100个碱基、长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于300个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于1000个碱基或者长度大于或等于2000个碱基。

在一些实施方案中，与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列和与内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列各自长度大于或等于600个碱基。

在一些实施方案中，细胞群体还包含能够增加同源重组率的另外的试剂。

在一些实施方案中，细胞群体还包含能够增加细胞群体的存活力的另外的试剂。

在一些实施方案中，内源基因组靶基因座包含编码区。在一些实施方案中，内源基因组靶基因座包含内含子。

在一些实施方案中，内源基因组靶基因座包括T细胞受体(TCR)-α基因座。在一些实施方案中，由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因是被破坏的TCR-β基因。

在一些实施方案中，内源基因组靶基因座包括TCR-β基因座。在一些实施方案中，由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因是被破坏的TCR-α基因。

在一些实施方案中，基因的至少一部分包含接头序列。在一些实施方案中，接头序列编码可裂解接头多肽序列，其中在表达后，可裂解接头多肽被裂解，使得仅由基因的至少一部分编码的多肽被产生。在一些实施方案中，可裂解接头多肽序列包含选自由以下组成的组的2A核糖体跳跃元件：T2A、E2A、P2A和F2A。在一些实施方案中，可裂解接头多肽包含弗林蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，可裂解接头多肽包含Gly-Ser-Gly接头，任选地其中Gly-Ser-Gly接头是2A核糖体跳跃元件的N末端，并且任选地其中Gly-Ser-Gly接头呈从N末端至C末端的弗林蛋白酶裂解位点：Gly-Ser-Gly接头：2A核糖体跳跃元件取向。

在一些实施方案中，接头序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。

在一些实施方案中，接头序列包含外源启动子序列。

在一些实施方案中，接头序列包含剪接受体序列。

在一些实施方案中，基因的至少一部分包含第一接头多肽序列和第二接头多肽序列。在一些实施方案中，第一接头多肽序列和第二接头多肽序列包含相同的接头多肽序列。在一些实施方案中，编码相同的接头多肽序列的编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列包含密码子趋异的核苷酸序列，并且其中编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽的核苷酸序列相对于彼此是密码子趋异的。

在一些实施方案中，基因的至少一部分编码非编码区。在一些实施方案中，非编码区选自由以下组成的组：shRNA、siRNA、miRNA、调节免疫系统的因子、细胞因子、调节T细胞功能的因子、促进T细胞存活的因子和促进T细胞功能的因子。

在一些实施方案中，基因的至少一部分包括TCR基因的至少一部分。在一些实施方案中，TCR基因的至少一部分包含：a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；和c)编码第二接头序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列或TCR基因的至少一部分选自由以下组成的组：鼠源化TCR、人源化TCR、结构域交换的TCR、点突变的TCR、具有能够形成二硫键的工程化半胱氨酸的工程化TCR、针对在人类中的表达而优化的密码子优化的TCR、针对密码子使用和去除RNA不稳定性元件而优化的序列优化的TCR、TCR基因的可变区序列、嵌合抗原受体(CAR)和单链TCR的至少一部分。在一些实施方案中，TCR-α多肽序列、TCR-β多肽序列或由TCR基因的至少一部分编码的多肽被工程化为展示出相对于内源TCR多肽序列与第二外源TCR多肽序列更大程度的缔合，任选地，其中TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列被工程化为展示出相对于内源TCR多肽序列与彼此更大程度的缔合。在一些实施方案中，编码的多肽序列呈接头：TCR-α：第二接头：TCR-β取向。在一些实施方案中，编码的多肽序列呈接头：TCR-β：第二接头：TCR-α取向。在一些实施方案中，编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列或编码TCR基因的至少一部分的核苷酸序列包含密码子趋异的核苷酸序列，并且其中密码子趋异的核苷酸序列相对于内源核苷酸序列是密码子趋异的。

在一些实施方案中，细胞群体包括人类细胞或人类来源的细胞。

在一些实施方案中，细胞群体包括免疫细胞群体。在一些实施方案中，免疫细胞群体包括T细胞群体。在一些实施方案中，T细胞群体选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞、肿瘤浸润性T细胞、工程化T细胞、调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、α-βT细胞和γ-δT细胞。在一些实施方案中，免疫细胞群体包括自然杀伤细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体包括选自由以下组成的组的群体：B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤T细胞。

在一些实施方案中，细胞群体包括干细胞群体。在一些实施方案中，干细胞群体包括造血干细胞群体。在一些实施方案中，干细胞群体包括胚胎干细胞群体。

在一些实施方案中，细胞群体是原代细胞。

在一些实施方案中，细胞群体是分离的细胞群体，其中分离的细胞群体是从受试者分离的。在一些实施方案中，受试者已知或疑似患有癌症。

在一些实施方案中，细胞群体包括离体培养的细胞。在一些实施方案中，离体培养的细胞包括经刺激的细胞。在一些实施方案中，经刺激的细胞包括细胞因子刺激的T细胞，任选地，其中细胞因子刺激的T细胞包括CD3刺激的T细胞、CD28刺激的T细胞或CD3和CD28刺激的T细胞。在一些实施方案中，细胞因子刺激的T细胞是在IL7、IL15或其组合的存在下培养的。在一些实施方案中，细胞因子刺激的T细胞是在IL2的存在下培养的。在一些实施方案中，细胞因子刺激的T细胞在基本上不含IL2的培养基中培养。

在一些实施方案中，细胞群体还包含第二整合的核苷酸序列，其中第二整合的核苷酸序列包含与编码第二基因的至少一部分的核苷酸序列相同的序列，第二整合的核苷酸序列被整合在第二内源基因组靶基因座处，并且第二整合的核苷酸序列被取向为使得第二基因的至少一部分能够被表达。在一些实施方案中，细胞群体还包含含有第二外源核苷酸组合物的第二环状多核苷酸，第二外源核苷酸组合物包含：a)编码第二基因的至少一部分的核苷酸序列；b)与第二内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与第二内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，其中与第二内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进第二内源基因组靶基因座处的同源重组。

本文还提供了一种用于有相应需要的受试者的治疗方法，其中治疗包括施用治疗有效剂量的本文描述的任何修饰的细胞或任何细胞群体。在一些实施方案中，修饰的细胞或细胞群体来源于受试者。在一些实施方案中，修饰的细胞或细胞群体相对于受试者是同种异体的。

本文还提供了一种用于遗传修饰细胞的方法，所述方法包括以下步骤：1)提供包含单一多核苷酸的核苷酸组合物，所述单一多核苷酸包含：a)编码基因的至少一部分的核苷酸序列；b)与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，与内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进内源基因组靶基因座处的同源重组，编码基因的至少一部分的核苷酸序列被取向为使得基因的至少一部分能够在组合物整合到内源基因组靶基因座中之后被表达；和2)提供能够裂解内源基因组靶基因座内的指定的核苷酸序列的核酸酶组合物；3)使细胞与核苷酸组合物和核酸酶组合物接触，4)通过除了用病毒感染细胞以外的手段将核苷酸组合物和核酸酶组合物递送到细胞中。在一些实施方案中，该方法还包括提供能够在细胞内裂解第二指定的核苷酸序列的第二核酸酶组合物，其中在接触步骤中使第二核酸酶组合物与细胞接触，并且在递送步骤中将第二核酸酶组合物递送到细胞中。在一些实施方案中，裂解导致突变，所述突变产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因。在一些实施方案中，产生无功能基因的突变包括在基因的编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：导致被翻译的蛋白的读框改变的移码突变、引起氨基酸被终止密码子取代的无义突变、以及导致一种氨基酸被另一种氨基酸取代的错义突变。在一些实施方案中，产生无功能基因的突变包括在基因的非编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：改变由基因编码的mRNA产物的表达的突变、以及改变由基因编码的mRNA产物的稳定性的突变。在一些实施方案中，该方法还包括：提供第二核苷酸组合物，第二组合物包含：a)编码第二基因的至少一部分的核苷酸序列；b)与第二内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与第二内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列全部都在单一多核苷酸上，与第二内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进第二内源基因组靶基因座处的同源重组，编码第二基因的至少一部分的核苷酸序列被取向为使得第二基因的至少一部分能够在组合物整合到第二内源基因组靶基因座中之后被表达，并且在接触步骤中使第二核苷酸组合物与细胞接触，并且在递送步骤中将第二核苷酸组合物递送到细胞中。

在一些实施方案中，核酸酶组合物包含选自由以下组成的组的核酸酶：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)家族核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)或其衍生物以及归巢内切核酸酶(HE)或其衍生物。在一些实施方案中，CRISPR家族核酸酶是Cas9核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶组合物包含预先形成的蛋白复合体。在一些实施方案中，核酸酶组合物包含能够在细胞内表达核酸酶的核苷酸载体。在一些实施方案中，在使细胞与核苷酸组合物和核酸酶组合物接触和递送步骤之间，接触步骤少于60分钟、少于45分钟、少于30分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟、少于5分钟或少于1分钟。

在一些实施方案中，递送步骤选自由以下组成的组：电穿孔、转染、通过物理手段使细胞膜变形、脂质纳米颗粒(LNP)、病毒样颗粒(VLP)和声处理。在一些实施方案中，递送步骤包括电穿孔。在一些实施方案中，编码的多肽序列的表达由内源基因组靶基因座内的内源启动子指导。在一些实施方案中，编码的多肽序列的表达由外源启动子指导。在一些实施方案中，外源启动子选自由以下组成的组：哺乳动物启动子、人类启动子、病毒启动子、来自逆转录病毒或慢病毒的长末端重复序列(LTR)来源启动子、两个启动子的融合体、两个启动子部分的融合体、MMLV LTR启动子、HIV LTR启动子、MCMV LTR启动子、EF1a启动子、MND启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、小分子诱导型启动子、四环素诱导型启动子、小分子条件性启动子、Cre-LoxP条件性启动子系统、Flp-FRT条件性启动子系统和他莫昔芬条件性启动子系统。

在一些实施方案中，基因的至少一部分的长度大于或等于100个碱基。在一些实施方案中，基因的至少一部分的长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于400个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于800个碱基、长度大于或等于1500个碱基、长度大于或等于2000个碱基或者长度大于或等于4000个碱基。

在一些实施方案中，与内源基因组靶基因座的第一区域或第二区域相同的核苷酸序列的长度是50个碱基、长度是100个碱基、长度是200个碱基、长度是400个碱基、长度是600个碱基、长度是800个碱基、长度是1500个碱基、长度是2000个碱基或长度是4000个碱基。

在一些实施方案中，在整合后，指定的核苷酸序列被破坏。

在一些实施方案中，与内源基因组靶基因座可操作地缔合的内源基因的表达被破坏。

在一些实施方案中，该方法还包括能够增加同源重组率或存活力的另外的试剂。

在一些实施方案中，单一多核苷酸选自由以下组成的组：环状质粒、线性DNA片段、微环和ssDNA。在一些实施方案中，环状质粒具有少于500个碱基的载体骨架，其中载体骨架包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列不是编码基因的至少一部分的核苷酸序列、不是与第一内源基因组靶基因座相同的核苷酸序列，也不是与第二内源基因组靶基因座相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，单一多核苷酸不是聚合酶链式反应(PCR)扩增的多核苷酸。在一些实施方案中，单一多核苷酸基本上不含污染物。在一些实施方案中，单一多核苷酸基本上不含降低细胞存活力的组分。

在一些实施方案中，内源基因组靶基因座包含编码区。在一些实施方案中，其中内源基因组靶基因座包含内含子。

在一些实施方案中，内源基因组靶基因座是T细胞受体(TCR)-α基因座。在一些实施方案中，内源基因组靶基因座是TCR-β基因座。在一些实施方案中，内源基因组靶基因座是免疫检查点基因座。在一些实施方案中，免疫检查点基因座选自由以下组成的组：PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3和VISTA。

在一些实施方案中，基因的至少一部分包含接头序列。在一些实施方案中，接头序列编码可裂解接头多肽序列，其中在表达后，可裂解接头多肽被裂解，使得仅由基因的至少一部分编码的多肽被产生。在一些实施方案中，可裂解接头多肽序列包含选自由以下组成的组的2A核糖体跳跃元件：T2A、E2A、P2A和F2A。

在一些实施方案中，可裂解接头多肽序列包含弗林蛋白酶裂解位点序列。在一些实施方案中，接头序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，接头序列包含外源启动子。在一些实施方案中，接头序列还包含剪接受体序列。

在一些实施方案中，基因的至少一部分包括TCR基因的至少一部分。在一些实施方案中，TCR基因的至少一部分选自由以下组成的组：鼠源化TCR、人源化TCR、结构域交换的TCR、点突变的TCR、具有能够形成二硫键的工程化半胱氨酸的工程化TCR、针对在人类中的表达而优化的密码子优化的TCR、针对密码子使用和去除RNA不稳定性元件而优化的序列优化的TCR、TCR基因的可变区序列、嵌合抗原受体(CAR)和单链TCR的至少一部分。在一些实施方案中，TCR基因的至少一部分包含：a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；和c)编码第二接头序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，TCR-α多肽序列选自由以下组成的组：鼠源化TCR-α、人源化TCR-α、结构域交换的TCR-α、点突变的TCR-α、具有能够形成二硫键的工程化半胱氨酸的工程化TCR-α、针对在人类中的表达而优化的密码子优化的TCR-α、嵌合抗原受体(CAR)、以及针对密码子使用和去除RNA不稳定性元件而优化的序列优化的TCR-α。在一些实施方案中，TCR-β多肽序列选自由以下组成的组：鼠源化TCR-β、人源化TCR-β、结构域交换的TCR-β、点突变的TCR-β、具有能够形成二硫键的工程化半胱氨酸的工程化TCR-β、针对在人类中的表达而优化的密码子优化的TCR-β、嵌合抗原受体(CAR)、以及针对密码子使用和去除RNA不稳定性元件而优化的序列优化的TCR-β。在一些实施方案中，编码的多肽序列呈接头：TCR-α：第二接头：TCR-β取向。在一些实施方案中，编码的多肽序列呈接头：TCR-β：第二接头：TCR-α取向。在一些实施方案中，第二接头序列包含可裂解接头多肽序列。在一些实施方案中，可裂解接头多肽序列包含选自由以下组成的组的2A核糖体跳跃元件：T2A、E2A、P2A和F2A。在一些实施方案中，可裂解接头多肽序列包含弗林蛋白酶裂解位点序列。在一些实施方案中，第二接头序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，第二接头序列包含外源启动子。

在一些实施方案中，基因的至少一部分选自由以下组成的组：shRNA、siRNA、miRNA、调节免疫系统的因子、细胞因子、调节T细胞功能的因子、促进T细胞存活的因子、促进T细胞功能的因子和免疫检查点抑制剂。

在一些实施方案中，第二基因的至少一部分包括TCR基因的至少一部分。

在一些实施方案中，修饰的细胞是原代细胞。

本文还提供了通过本文描述的任何方法产生的修饰的细胞，其中修饰的细胞包含整合的核苷酸序列，其中整合的核苷酸序列包含与编码基因的至少一部分的核苷酸序列相同的序列，整合的核苷酸序列被整合在内源基因组靶基因座处，并且整合的核苷酸序列被取向为使得基因的至少一部分能够被表达。

通过本文描述的任何方法产生的细胞群体，其中群体中大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％的细胞包含整合的核苷酸序列，其中整合的核苷酸序列包含与编码基因的至少一部分的核苷酸序列相同的序列，整合的核苷酸序列被整合在内源基因组靶基因座处，并且整合的核苷酸序列被取向为使得基因的至少一部分能够被表达。

在一些实施方案中，细胞在整合的核苷酸序列的整合后没有经历分选、选择或分离。在一些实施方案中，细胞群体在递送步骤后的存活力是至少10％、至少20％、至少40％、至少60％或至少80％。在一些实施方案中，存活力是在递送步骤后4天进行评估的。在一些实施方案中，存活力通过AOPI染色来评估。

本文还提供了一种用于有相应需要的受试者的治疗方法，其中治疗包括施用治疗有效剂量的由本文描述的任何方法产生的任何细胞或细胞群体。在一些实施方案中，细胞或细胞群体来源于受试者。在一些实施方案中，细胞或细胞群体相对于受试者是同种异体的。

本文还提供了一种用于遗传修饰细胞的方法，所述方法包括以下步骤：1)提供一种核苷酸组合物，所述核苷酸组合物包含：a)编码基因的至少一部分的核苷酸序列；b)与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，其中基因的至少一部分的长度是100个碱基，所述核苷酸序列全部都在单一多核苷酸上，与内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进内源基因组靶基因座处的同源重组，编码基因的至少一部分的核苷酸序列被取向为使得基因的至少一部分能够在组合物整合到内源基因组靶基因座中之后被表达；和2)提供能够裂解内源基因组靶基因座内的指定的核苷酸序列的CRISPR/Cas9核酸酶组合物；3)使T细胞与核苷酸组合物和CRISPR/Cas9核酸酶组合物接触，和4)通过电穿孔将核苷酸组合物和CRISPR/Cas9核酸酶组合物递送到T细胞中。

本文还提供了一种产生具有指定的T细胞受体的修饰的T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：1)提供一种核苷酸组合物，所述核苷酸组合物包含：a)编码TCR-α多肽序列的至少一部分的核苷酸序列；b)编码TCR-β多肽序列的至少一部分的核苷酸序列；c)编码第一接头多肽序列的核苷酸序列；d)编码第二接头多肽序列的核苷酸序列；e)与内源TCR基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和f)与内源TCR基因座的第二区域相同的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列全部都在单一多核苷酸上，与内源TCR基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进内源TCR基因座处的同源重组，编码TCR-α多肽序列的至少一部分的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的至少一部分的核苷酸序列、以及编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被取向为使得多肽序列的每一个能够在组合物整合到内源TCR基因座中之后被表达为单一多肽，第一接头多肽序列位于TCR-α多肽序列的至少一部分、TCR-β多肽序列的至少一部分和第二接头多肽序列之前，第二接头多肽序列位于TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列之间，并rTCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列各自形成单独的多肽，其中单独的多肽能够缔合在一起形成功能性TCR；2)提供能够裂解内源TCR基因座内的指定的核苷酸序列的核酸酶组合物；3)使T细胞与核苷酸组合物和核酸酶组合物接触，和4)将核苷酸组合物和核酸酶组合物递送到T细胞中。

在一些实施方案中，该方法还包括提供能够在T细胞内裂解第二指定的核苷酸序列的第二核酸酶组合物，其中在接触步骤中使第二核酸酶组合物与T细胞接触，并且在递送步骤中将第二核酸酶组合物递送到T细胞中。在一些实施方案中，裂解导致突变，所述突变产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因。在一些实施方案中，产生无功能基因的突变包括在基因的编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：导致被翻译的蛋白的读框改变的移码突变、引起氨基酸被终止密码子取代的无义突变、以及导致一种氨基酸被另一种氨基酸取代的错义突变。在一些实施方案中，产生无功能基因的突变包括在基因的非编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：改变由基因编码的mRNA产物的表达的突变、以及改变由基因编码的mRNA产物的稳定性的突变。

在一些实施方案中，该方法还包括：提供第二核苷酸组合物，第二组合物包含：a)编码基因的至少一部分的核苷酸序列；b)与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列全部都在单一多核苷酸上，与内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进内源基因组靶基因座处的同源重组，编码基因的至少一部分的核苷酸序列被取向为使得基因的至少一部分能够在组合物整合到内源基因组靶基因座中之后被表达，并且在接触步骤中使第二核苷酸组合物与T细胞接触，并且在递送步骤中将第二核苷酸组合物递送到T细胞中。

在一些实施方案中，核酸酶组合物包含选自由以下组成的组的核酸酶：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)家族核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)或其衍生物以及归巢内切核酸酶(HE)或其衍生物。在一些实施方案中，CRISPR家族核酸酶是Cas9核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶组合物包含预先形成的蛋白复合体。在一些实施方案中，核酸酶组合物包含能够在T细胞内表达核酸酶的核苷酸载体。在一些实施方案中，在使T细胞与核苷酸组合物和核酸酶组合物接触和递送步骤之间，接触步骤少于60分钟、少于45分钟、少于30分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟或少于5分钟。

在一些实施方案中，递送步骤选自由以下组成的组：电穿孔、转染、通过物理手段使细胞膜变形、脂质纳米颗粒(LNP)、病毒样颗粒(VLP)和声处理。在一些实施方案中，递送步骤包括电穿孔。

在一些实施方案中，编码TCR-α多肽序列的至少一部分的核苷酸序列或编码TCR-β多肽序列的至少一部分的核苷酸序列的长度大于或等于100个碱基。在一些实施方案中，编码TCR-α多肽序列的至少一部分的核苷酸序列或编码TCR-β多肽序列的至少一部分的核苷酸序列的长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于400个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于800个碱基、长度大于或等于1500个碱基、长度大于或等于2000个碱基或者长度大于或等于4000个碱基。

在一些实施方案中，与内源TCR基因座的第一区域或第二区域相同的核苷酸序列的长度是50个碱基、长度是100个碱基、长度是200个碱基、长度是400个碱基、长度是600个碱基、长度是800个碱基、长度是1500个碱基、长度是2000个碱基或长度是4000个碱基。

在一些实施方案中，在整合后，指定的核苷酸序列被破坏。

在一些实施方案中，与内源TCR基因座可操作地缔合的内源基因的表达被破坏。

在一些实施方案中，单一多核苷酸选自由以下组成的组：环状质粒、线性DNA片段、微环和ssDNA。在一些实施方案中，环状质粒具有少于500个碱基的载体骨架，其中载体骨架是这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列不是编码TCR-α多肽序列的至少一部分的核苷酸序列、不是编码TCR-β多肽序列的至少一部分的核苷酸序列，也不是编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，单一多核苷酸不是聚合酶链式反应(PCR)扩增的多核苷酸。在一些实施方案中，单一多核苷酸基本上不含污染物。

在一些实施方案中，内源TCR基因座包含编码区。在一些实施方案中，内源TCR基因座包含内含子。

在一些实施方案中，内源TCR基因座包括TCR-α基因座。在一些实施方案中，内源TCR基因座包括TCR-β基因座。

在一些实施方案中，第一接头序列包含可裂解接头多肽序列，其中在表达后，可裂解接头多肽被裂解，使得仅由编码TCR-α多肽序列的至少一部分、TCR-β多肽序列的至少一部分和第二接头多肽序列的核苷酸序列编码的多肽被产生。在一些实施方案中，可裂解接头多肽序列包含选自由以下组成的组的2A核糖体跳跃元件：T2A、E2A、P2A和F2A。在一些实施方案中，可裂解接头多肽序列包含弗林蛋白酶裂解位点序列。在一些实施方案中，第一接头多肽序列包含IRES。在一些实施方案中，第一接头序列包含剪接受体序列。

在一些实施方案中，第二接头序列包含可裂解接头多肽序列，其中在表达后，可裂解接头多肽被裂解，使得TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列各自形成单独的多肽，其中单独的多肽能够缔合在一起形成功能性TCR。在一些实施方案中，可裂解接头多肽序列包含选自由以下组成的组的2A核糖体跳跃元件：T2A、E2A、P2A和F2A。在一些实施方案中，可裂解接头多肽序列包含弗林蛋白酶裂解位点序列。

在一些实施方案中，第二接头序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，第二接头序列包含外源启动子。

在一些实施方案中，TCR-α多肽序列选自由以下组成的组：鼠源化TCR-α、人源化TCR-α、结构域交换的TCR-α、点突变的TCR-α、具有能够形成二硫键的工程化半胱氨酸的工程化TCR-α、针对在人类中的表达而优化的密码子优化的TCR-α、嵌合抗原受体(CAR)、以及针对密码子使用和去除RNA不稳定性元件而优化的序列优化的TCR-α。

在一些实施方案中，TCR-β多肽序列选自由以下组成的组：鼠源化TCR-β、人源化TCR-β、结构域交换的TCR-β、点突变的TCR-β、具有能够形成二硫键的工程化半胱氨酸的工程化TCR-β、针对在人类中的表达而优化的密码子优化的TCR-β、嵌合抗原受体(CAR)、以及针对密码子使用和去除RNA不稳定性元件而优化的序列优化的TCR-β。

在一些实施方案中，编码的多肽序列呈第一接头：TCR-α：第二接头：TCR-β取向。在一些实施方案中，编码的多肽序列呈接头：TCR-β：第二接头：TCR-α取向。

在一些实施方案中，如果指定的核苷酸序列在内源TCR-α基因座内，则第二指定的核苷酸序列在内源TCR-β基因座内。

在一些实施方案中，如果指定的核苷酸序列在内源TCR-β基因座内，则第二指定的核苷酸序列在内源TCR-α基因座内。在一些实施方案中，第二指定的核苷酸序列在免疫检查点基因座内。在一些实施方案中，基因的至少一部分选自由以下组成的组：shRNA、siRNA、miRNA、细胞因子、促进T细胞存活的因子、促进T细胞功能的因子和免疫检查点抑制剂。

本文还提供了一种用于指导内源基因组靶基因座处的同源重组的核苷酸组合物，所述核苷酸组合物包含环状多核苷酸，所述环状多核苷酸包含：a)编码基因的至少一部分的核苷酸序列；b)与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列全部都在单一多核苷酸上，与内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进内源基因组靶基因座处的同源重组，编码基因的至少一部分的核苷酸序列被取向为使得基因的至少一部分能够在组合物整合到内源基因组靶基因座中之后被表达。在一些实施方案中，编码基因的至少一部分的核苷酸序列的长度大于或等于100个碱基。在一些实施方案中，编码基因的至少一部分的核苷酸序列的长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于400个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于800个碱基、长度大于或等于1500个碱基、长度大于或等于2000个碱基或者长度大于或等于4000个碱基。

在一些实施方案中，环状多核苷酸包括质粒或纳米质粒。在一些实施方案中，质粒具有少于500个碱基的载体骨架，并且其中载体骨架是这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列不是编码基因的至少一部分的核苷酸序列并且不是与第一内源靶基因组基因座相同的核苷酸序列。

在一些实施方案中，内源基因组靶基因座或内源TCR基因座包括T细胞受体(TCR)-α基因座。在一些实施方案中，内源基因组靶基因座或内源TCR基因座包括TCR-β基因座。

在一些实施方案中，基因的至少一部分包含接头序列。在一些实施方案中，接头序列编码可裂解接头多肽序列，其中在表达后，可裂解接头多肽被裂解，使得仅由基因的至少一部分编码的多肽被产生。在一些实施方案中，可裂解接头多肽中的任一个包含弗林蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，接头序列中的任一个包含选自由以下组成的组的2A核糖体跳跃元件：T2A、E2A、P2A和F2A。在一些实施方案中，可裂解接头多肽中的任一个包含Gly-Ser-Gly接头，任选地其中Gly-Ser-Gly接头是2A核糖体跳跃元件的N末端，并且任选地其中Gly-Ser-Gly接头呈从N末端至C末端的弗林蛋白酶裂解位点：Gly-Ser-Gly接头：2A核糖体跳跃元件取向。在一些实施方案中，接头序列、编码第一接头多肽序列的核苷酸序列或编码第二接头多肽序列的核苷酸序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，接头序列、编码第一接头多肽序列的核苷酸序列或编码第二接头多肽序列的核苷酸序列包含外源启动子。

在一些实施方案中，编码第一接头多肽序列的核苷酸序列或编码第二接头多肽序列的核苷酸序列包含剪接受体序列。

在一些实施方案中，基因的至少一部分包含编码信号肽的核苷酸序列，其中信号肽被可操作地连接至由基因的至少一部分编码的多肽、TCR-α多肽序列、TCR-β多肽序列或由TCR基因的至少一部分编码的多肽。在一些实施方案中，信号肽是外源信号肽，任选地，其中外源信号肽是人类生长激素信号肽。

在一些实施方案中，基因的至少一部分包括TCR基因的至少一部分。在一些实施方案中，TCR基因的至少一部分包含：a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；和c)编码第二接头序列的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列或TCR基因的至少一部分选自由以下组成的组：鼠源化TCR、人源化TCR、结构域交换的TCR、点突变的TCR、具有能够形成二硫键的工程化半胱氨酸的工程化TCR、针对在人类中的表达而优化的密码子优化的TCR、针对密码子使用和去除RNA不稳定性元件而优化的序列优化的TCR、TCR基因的可变区序列、嵌合抗原受体(CAR)和单链TCR的至少一部分。

若干附图视图的简述

考虑到以下描述和附图，本发明的这些及其他特征、方面和优势将变得更好地理解，其中：

图1示出了表示用于将ZsGreen报告物整合到TRAC基因座中的一般编辑策略的示意图。一般TCRα基因座靶向策略使用同源修复模板，该同源修复模板含有编码在环状纳米质粒中的无启动子的ZsGreen和截短的LNGRF编码序列，该无启动子的ZsGreen和截短的LNGRF编码序列侧接1kb左和右同源臂(“HR臂”)并且被P2A序列分开，以及5’P2A序列将ZsGreen和LNGRF盒与TCRα基因座序列分开。

图2示出了ZsGreen整合的一般编辑时间线。

图3示出了使用整合到TRAC基因座中的ZsGreen报告物对T细胞的编辑效率。

图4示出了表示用于将新抗原特异性TCR构建体(neoTCR)整合到TCRα基因座中的一般靶向策略的示意图。

图5示出了用于将新抗原特异性TCR构建体(neoTCR)整合到TCRα基因座中的新抗原特异性TCR构建体设计。图5A示出了整合前的靶TCRα基因座(内源TRAC，上图)及其CRISPRCas9靶位点(横条纹，裂解位点由箭头指示)，以及具有编码neoTCR的多核苷酸的环状质粒HR模板(下图)，编码neoTCR的多核苷酸位于左和右同源臂(分别为“LHA”和“RHA”)之间。图5B示出了在TCRα基因座中的整合的neoTCR(上图)、转录和剪接的neoTCR mRNA(中图)、以及表达的neoTCR的翻译和加工(下图)。

图6示出了用于编辑T细胞插入neoTCR构建体的一般编辑时间线。

图7示出了用于确认neoTCR构建体到TCRα基因座的精确基因组整合的内-外PCR(in-out PCR)技术(一般策略，上图)和在琼脂糖凝胶上可视化的PCR扩增产物(下图)。

图8示出了通过流式细胞术的MART-1neoTCR的表达。图8A示出了使用MART-1特异性dextramer染色的MART-1neoTCR的表达。图8B示出了在第10天使用MART-1特异性dextramer染色对MART-1neoTCR的编辑结果的概要。

图9示出了在针对IFNγ(左图)和IL-2(右图)的抗原特异性细胞因子产生测定中对工程化T细胞的评估。

图10示出了在抗原特异性增殖测定(图10A)和抗原特异性T细胞介导的杀伤测定(图10B)中对工程化T细胞的评估。

图11示出了表达MART-1或NY-ESO neoTCR的工程化T细胞是使用慢病毒转导程序产生的(图11，上图)，或者表达MART-1neoTCR的工程化T细胞是使用小规格或大规格使用电穿孔介导的HR编辑产生的(图11，下图)。

图12示出了在抗原特异性T细胞介导的杀伤测定中对工程化T细胞的评估。每组中从上到下的柱：未用关联肽(cognate peptide)脉冲的非关联MHC HLA-A01；用10μM MART1脉冲的非关联MHC HLA-A01；未用关联肽脉冲的关联MHC HLA-A02；用10μM MART1脉冲的关联MHC HLA-A01；组成型表达MART-1关联抗原肽的HLA-A02靶细胞。

图13示出了使用纯化的环状质粒DNA和由PCR产生的线性dsDNA作为HR模板的相对HR介导的编辑效率。图13A示出了标准的PCR产物(上图)和半保护的PCR产物(下图)。图13B示出了使用环状质粒、标准的PCR产物和半保护的PCR产物用于HR模板的编辑效率。

图14示出了如通过细胞计数(左)或AOPI染色(右)评估的使用购买的(“pUC57”)或内部(in-house)纯化的(“内部pUC57”)的T细胞存活力。

图15示出了如通过Neo12特异性dextramer染色检测到的Neo12neoTCR的表达。

图16示出了如通过Neo12特异性dextramer染色检测到的Neo12neoTCR的表达。

图17示出了如通过特异性dextramer染色检测到的neoTCR MART-1、Neo12和NY-ESO的表达。

图18示出了neoTCR整合到供体来源的T细胞中。图18A示出了在健康供体或患者来源的T细胞中如通过特异性dextramer染色检测到的neoTCR MART-1、Neo12、和NY-ESO的编辑效率(作为CD8+％)。图18B示出了健康供体来源的T细胞中neoTCR neo12的编辑效率(作为CD8+％)。

图19示出了如通过检测不结合泛TCR抗体的CD3复合体评估的CD4+细胞和CD8+细胞的编辑效率。

图20示出了整合的neoTCR和内源TCR的表面表达水平。图20A示出了使用同一抗体(CD3)染色的内源TCR(左直方图)和Neo12 neoTCR(右直方图)的MFI直方图。图20B示出了neoTCR MART-1、Neo12和NY-ESO与内源TCR相比的表面表达水平分析。*每细胞的TCR表达水平基于文献。

图21示出了如通过使用对来自新鲜分离的PBMC和使用Prodigy平台分离的T细胞的大规格编辑的Neo12特异性dextramer染色评估的Neo12neoTCR的表达。

图22示出了使用用肽脉冲的靶细胞(表达HLA-A02的K562细胞)评估编辑的T细胞的一般策略。

图23示出了使用被工程化为表达以HLA复合体(pHLA)预先形成的肽的靶细胞(表达HLA-A02的K562细胞)评估编辑的T细胞的一般策略。

图24示出了在抗原特异性T细胞介导的杀伤测定中对工程化T细胞的评估。*与表达靶新抗原的体内肿瘤相比，脉冲肽在体外在靶细胞上仅被短暂展示。

图25示出了在抗原特异性增殖测定中对工程化T细胞的评估。图25A示出了显示增殖的代表性直方图，其中分裂细胞百分比在图25B中被计算。

图26示出了在针对细胞因子IFNγ(图26A)、IL-2(图26B)、TNFα(图26C)和IL-6(图26D)的抗原特异性细胞因子产生测定中对工程化T细胞的评估。

图27示出了使用供体来源的T细胞对经编辑的T细胞的评估。图27A示出了来自健康供体和患者供体的T细胞的编辑效率。图27B示出了针对来源于健康供体和患者供体的T细胞的抗原特异性T细胞介导的杀伤测定。图27C示出了针对来源于健康供体和患者供体的T细胞的抗原特异性增殖测定。图27D示出了针对来源于健康供体和患者供体的T细胞的抗原特异性细胞因子产生测定。

图28示出了使用供体来源的T细胞对经编辑的T细胞的评估。图28A示出了表达Neo12 neoTCR或MART-1neoTCR的供体T细胞的编辑效率。图28B示出了针对表达Neo12neoTCR或MART-1neoTCR的供体T细胞的抗原特异性T细胞介导的杀伤测定。图28C示出了针对表达Neo12 neoTCR或MART-1neoTCR的供体T细胞的抗原特异性增殖测定。

图29示出了在制造后14天(左图)和2个月(右图)时，针对表达Neo12neoTCR或MART-1neoTCR的供体T细胞的抗原特异性T细胞介导的杀伤测定，具有相当的效率。

图30示出了针对表达Neo12 neoTCR(图30A)或MART-1neoTCR(图30B)的经编辑的T细胞的Isoplexis分析。图30C示出了工程化T细胞对细胞因子应答的贡献(左图)和产生每种细胞因子的T细胞的百分比(右图)。

图31示出了使用的HSC编辑的一般工作流程。

图32示出了在琼脂糖凝胶上可视化的用于确认neo12 neoTCR构建体到HSC的TCRα基因座的精确基因组整合的内-外PCR技术PCR扩增产物。

图33示出了显示在第11天，来自整合到NK细胞的TCRα基因座的ZsGreen报告物的ZsGreen表达的代表性图。

图34示出了在琼脂糖凝胶上可视化的用于确认整合到NK细胞的TCRα基因座的ZsGreen报告物的精确基因组整合的内-外PCR技术PCR扩增产物。

发明详述

定义

如本文使用的，“抗原”包括任何抗原，包括患者特异性新抗原。抗原包括任何能够诱导免疫应答的物质。

如本文使用的，“抗原特异性T细胞”是指通过赋予它们其抗原特异性的T细胞受体(TCR)彼此区分的细胞。

如本文使用的，“抗原复合体”、“抗原MHC”、“抗原MHC复合体”、“重组抗原MHC复合体”、“肽MHC”、“p/MHC”和“pHLA”可互换使用，以指在抗原结合沟(groove)中具有肽的重组主要组织相容性复合体。如本文使用的，术语MHC包括但不限于被称为人类白细胞抗原(HLA)的人类MHC。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指有效改善疾病症状的量，例如有效抑制肿瘤生长的量。

术语“改善”是指治疗疾病状态，例如癌性疾病状态的任何治疗有益结果，包括其预防、严重程度或进展减轻、缓解或治愈。

术语“原位”是指发生在与活生物体分开生长的活细胞中的过程，例如在组织培养中生长的过程。

术语“体内”是指发生在活生物体中的过程。

如本文使用的术语“哺乳动物”包括人类和非人类两者，并且包括但不限于人类、非人类灵长类动物、犬科动物(canines)、猫科动物(felines)、鼠科动物(murines)、牛科动物(bovines)、马科动物(equines)和猪科动物(porcines)。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”百分比是指当针对最大的对应性比较和比对时，具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列，如使用下文描述的序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或者技术人员可得的其他算法)或通过视觉检查测量的。取决于应用，“同一性”百分比可以存在于被比较的序列区域内，例如，于功能结构域内，或者，可选地，存在于两个被比较的序列的全长内。

对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如需要则指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的最佳序列比对可以如下进行，例如，通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson&Lipman，Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似度检索方法、通过这些算法的计算机化执行(在Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)或通过视觉检查(一般参见Ausubel等人)。

适合于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，所述BLAST算法被描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。用于进行BLAST分析的软件为通过美国国家生物技术信息中心(<www.ncbi.nlm.nih.gov/＞)可公开获得的。

“保守取代”或“保守氨基酸取代”是指氨基酸被化学或功能相似的氨基酸取代。提供相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。通过示例的方式，在一些实施方案中，表1-4中提供的氨基酸组被认为是彼此的保守取代。

表1.在某些实施方案中，被认为是彼此保守取代的选择的氨基酸组。

酸性残基	D和E
		碱性残基	K、R和H
亲水性不带电荷：残基	S、T、N和Q
		脂肪族不带电荷残基	G、A、V、L和I
非极性不带电荷的残基	C、M和P
		芳香族残基	F、Y和W

表2.在某些实施方案中，被认为是彼此保守取代的另外选择的氨基酸组。

第1组	A、S和T
		第2组	D和E
第3组	N和Q
		第4组	R和K
第5组	[、L和M
		第6组	F、Y和W

表3.在某些实施方案中，被认为是彼此保守取代的进一步选择的氨基酸组。

A组	A和G
		B组	D和E
C组	N和Q
		D组	R、K和H
E组	I、L、M、V
		F组	F、Y和W
G组	S和T
		H组	C和M

另外的保守取代可以见于，例如，Creighton，Proteins：Structures andMolecular Properties第2版(1993)W.H.Freeman&Co.，New York，NY中。通过对亲本蛋白中的氨基酸残基进行一个或更多个保守取代而产生的蛋白被称为“保守修饰的变体”。

术语“氨基酸”是指二十种常见的天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)；组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thhr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。

除非特别陈述或从上下文中另外明显，否则如本文使用的术语“约”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以被理解为在陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。

术语“基本上不含”被理解为意指相关总组合物中存在的少于统计显著量的组分(例如，污染物或病毒组分)，包括在相关总组合物中处于检测不到水平的组分(即，“不含”)。少于统计显著量可以指不能视作组分存在相关组合物中具有统计置信度，诸如p值大于0.1、0.05或0.01的检测水平。如果组合物含有按质量/体积百分比浓度计少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％或0.0001％的组分，则该组合物可以基本上不含该组分。

必须注意，除非上下文另外清楚地指示，否则如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指示物。

修饰的细胞

本文提供了修饰的细胞，例如，包括修饰以添加和/或去除遗传元件而不使用病毒递送系统的人类原代细胞。

在一个方面，修饰的细胞包含：包含外源核苷酸序列的环状多核苷酸，外源核苷酸序列包含：a)编码基因的至少一部分的核苷酸序列；b)与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，与内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进内源基因组靶基因座处的同源重组，并且其中修饰的细胞基本上不含病毒介导的递送组分。修饰的细胞还可以包含整合的核苷酸序列，其中整合的核苷酸序列包含与编码基因的至少一部分的核苷酸序列相同的序列，整合的核苷酸序列被整合在内源基因组靶基因座处，并且整合的核苷酸序列被取向为使得基因的至少一部分能够被表达。

在另一个方面，提供了一种修饰的细胞，所述修饰的细胞包含：T细胞，所述T细胞包含：a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；c)编码第一接头多肽序列的核苷酸序列；d)编码第二接头多肽序列的核苷酸序列；其中编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列以及编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被整合到内源TCR-α基因座中，编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列、以及编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被取向为使得多肽序列的每一个能够被表达为单一多肽，其中第二接头多肽序列位于TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列之间，第一接头多肽和第二接头多肽是能够在T细胞中被裂解使得TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列各自形成单独的多肽的可裂解接头多肽，其中单独的多肽能够缔合在一起形成功能性TCR，其中修饰的细胞基本上不含病毒介导的递送组分，并且其中内源TCR-β基因座被破坏。修饰的T细胞还可以包含含有外源核苷酸序列的环状多核苷酸，外源核苷酸序列包含：a)编码以下的核苷酸序列：编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列、以及编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列；b)与内源TCR基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与内源TCR基因座的第二个区域相同的核苷酸序列，并且与内源TCR基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进内源TCR基因座处的同源重组。

在另一个方面，提供了修饰的T细胞，所述修饰的T细胞包含：a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；c)编码第一接头多肽序列的核苷酸序列；d)编码第二接头多肽序列的核苷酸序列；其中编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列以及编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被整合到内源TCR基因座中，编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列、以及编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被取向为使得多肽序列的每一个能够被表达为单一多肽，其中第二接头多肽序列位于TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列之间，并且第一接头多肽和第二接头多肽是能够在修饰的T细胞中被裂解使得TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列各自形成单独的多肽的可裂解接头多肽，其中单独的多肽能够缔合在一起形成功能性TCR。修饰的T细胞还可以包含含有外源核苷酸序列的环状多核苷酸，外源核苷酸序列包含：a)编码以下的核苷酸序列：编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列、以及编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的核苷酸序列；b)与内源TCR基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与内源TCR基因座的第二个区域相同的核苷酸序列，并且与内源TCR基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进内源TCR基因座处的同源重组。修饰的T细胞可以基本上不含病毒介导的递送组分。

细胞修饰和基因组编辑

通常，修饰的细胞被修饰为使得它们被基因组编辑或能够被基因组编辑。例如，可以使用核酸酶介导的基因编辑系统对修饰的细胞进行基因组编辑以表达外源基因。因此，修饰的细胞可以包含裂解内源基因组靶基因座(包括内源TCR基因座)内的指定的核苷酸序列的核酸酶组合物。如果将外源多核苷酸(例如，外源基因或其部分)整合到修饰的细胞的基因组中，则可以认为细胞被修饰。如果细胞含有一种或更多种通常用于核酸酶介导的基因编辑的组分，即含有能够促进基因组编辑的组分(例如，核酸酶、同源修复模板、CRISPR系统核苷酸等)，则可以认为细胞被修饰。如果细胞含有一个或更多个非模板化突变(例如，与整合的外源多核苷酸分开的突变)，诸如一个或更多个破坏内源靶基因座的非模板化突变，则可以认为细胞被修饰。多种修饰不是相互排斥的，即修饰的细胞可以具有整合的外源多核苷酸(例如，外源基因或其部分)，以及一种或更多种通常用于核酸酶介导的基因编辑的组分，诸如那些促进外源多核苷酸整合的组分。

在说明性实例中，修饰的T细胞可以具有编码外源TCR序列的整合的多核苷酸、靶向内源TCR基因座的CRISPR/Cas9 RNP和编码外源TCR序列的同源修复模板(HRT)。在另一个说明性实例中，修饰的细胞可以具有靶向内源TCR基因座的CRISPR/Cas9 RNP和编码外源TCR序列的同源修复模板(HRT)。

在另一个说明性实例中，修饰的细胞可以具有编码外源序列(例如，基因的至少一部分)的整合的多核苷酸、靶向内源基因座的CRISPR/Cas9 RNP和编码外源序列的同源修复模板(HRT)。在另一个说明性实例中，修饰的细胞可以具有靶向内源基因座的CRISPR/Cas9RNP和编码外源序列的同源修复模板(HRT)。

在另一个说明性实例中，修饰的造血干细胞(HSC)可以具有编码外源序列(例如，基因的至少一部分)的整合的多核苷酸、靶向内源基因座的CRISPR/Cas9 RNP和编码外源序列的同源修复模板(HRT)。在另一个说明性实例中，修饰的HSC可以具有靶向内源基因座的CRISPR/Cas9 RNP和编码外源序列的同源修复模板(HRT)。

在另一个说明性实例中，修饰的自然杀伤(NK)细胞可以具有编码外源序列(例如，基因的至少一部分)的整合的多核苷酸、靶向内源基因座的CRISPR/Cas9 RNP和编码外源序列的同源修复模板(HRT)。在另一个说明性实例中，修饰的NK细胞可以具有靶向内源基因座的CRISPR/Cas9 RNP和编码外源序列的同源修复模板(HRT)。

内源基因的破坏

修饰的细胞可以被修饰为使得无功能基因被产生或能够被产生。

由核酸酶组合物产生的导致无功能基因的突变可以是模板化基因组编辑的结果，例如同源重组DNA修复机制的结果。被基因组编辑为在基因组靶基因座处表达外源多核苷酸(例如基因)的修饰的细胞，也可以破坏与内源基因组靶基因座可操作地缔合的内源基因的表达。例如，由基因组靶基因座编码的内源基因可以被功能性缺失(例如，内源基因或其部分的去除/内源基因或其部分被整合的外源基因替代)或功能性破坏(例如，外源基因在内源基因或其部分内的整合使得内源基因的转录和/或翻译被破坏)。在说明性实例中，编码TCR的外源基因可以被整合在内源TCR基因座，诸如编码TCRα恒定区的外显子中，使得内源TCR基因的表达被破坏。被破坏的表达可以是与未修饰的细胞相比编码内源基因的mRNA的表达减少，或者可以是与未修饰的细胞相比内源基因的翻译减少。被破坏的表达可以是与未修饰的细胞相比编码内源基因的mRNA的可检测的表达的消除，或者可以是与未修饰的细胞相比内源基因的可检测的翻译的消除。

修饰的细胞可以具有包括非模板化突变(例如，与整合的外源多核苷酸分离的突变)的修饰，所述突变产生由指定的核苷酸序列(即，基因组靶基因座)编码的无功能基因。由核酸酶组合物产生的导致无功能基因的突变可以是非模板化基因组缺失的结果，例如核酸酶裂解诱导的非同源末端连接(NHEJ)DNA修复机制导致基因组插入或缺失(也称为插入/缺失(indels))。可产生无功能基因的突变包括基因的编码区中的突变(例如，导致被翻译的蛋白的读框改变的移码突变、引起氨基酸被终止密码子取代的无义突变、或导致一种氨基酸被另一种氨基酸取代的错义突变)或者非编码区中的突变(例如，改变由基因编码的mRNA产物的表达的突变、或改变由基因编码的mRNA产物的稳定性的突变)。修饰可以包括能够在修饰的细胞中产生非模板化突变的核酸酶组合物(例如，能够裂解指定的核苷酸序列的核酸酶组合物)。

多重修饰

修饰的细胞可以具有多于一种修饰，例如，在修饰的细胞中多于一个基因组基因座处的修饰。例如，修饰的细胞可以在多于一个基因组基因座处具有多于一个整合的外源多核苷酸，诸如修饰的细胞还包含第二整合的核苷酸序列，其中第二整合的核苷酸序列包含与编码第二基因的至少一部分的核苷酸序列相同的序列，第二整合的核苷酸序列被整合在第二内源基因组靶基因座处，并且第二整合的核苷酸序列被取向为使得第二基因的至少一部分能够被表达。修饰的细胞可以具有促进第二外源多核苷酸整合的组分，诸如包含第二外源核苷酸组合物的第二环状多核苷酸和/或第二核酸酶组合物，所述第二外源核苷酸组合物包含：a)编码第二基因的至少一部分的核苷酸序列；b)与第二内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与第二内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，并且与第二内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进第二内源基因组靶基因座处的同源重组，所述第二核酸酶组合物能够在修饰的细胞内裂解第二指定的核苷酸序列。通常，修饰的细胞不限于仅一个或两个整合的核苷酸序列，并且可以包括任何数目的整合的核苷酸序列，诸如1-10个、1-2个、1-3个、2-3个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个整合的核苷酸序列。

同样，修饰的细胞可以具有能够产生1-10个、1-2个、1-3个、2-3个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个整合的核苷酸序列的组分，诸如同源修复模板、核酸酶等。在说明性实例中，“多重”CRISPR介导的基因编辑方法可以被用于通过同时引入多个同源修复模板与多个CRISPR RNP复合体来整合多个基因或其部分，所述CRISPR RNP复合体指导在多个基因组位置处的裂解。多个序列也可以被顺序整合。

修饰的细胞可以具有包括多个非模板化突变(例如，与整合的外源多核苷酸分离的突变)，诸如产生由指定的核苷酸序列(即，基因组靶基因座)编码的无功能基因的多个非模板化突变的修饰。修饰可以包括能够在修饰的细胞中产生多个非模板化突变的核酸酶组合物。例如，修饰的细胞可以具有分别导致两个或三个无功能基因的两个或三个分开的非模板化突变。通常，修饰的细胞可以具有何数目的非模板化突变，例如，分别为4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个分开的非模板化突变。在说明性实例中，“多重”CRISPR介导的基因编辑方法可以被用于通过同时引入多个CRISPR RNP复合体来破坏多个基因，所述多个CRISPR RNP复合体指导在多个基因组位置处的裂解，导致多个非模板化突变。

修饰的细胞可以具有导致多于一个无功能基因的多于一个突变。例如，修饰的细胞可以具有分别导致两个或三个无功能基因的两个或三个分开的突变。通常，修饰的细胞可以具有导致任何数目的无功能基因的任何数目的突变，例如，分别导致4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个无功能基因的4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个分开的突变。在说明性实例中，“多重”CRISPR介导的基因编辑方法可以被用于通过同时引入多个CRISPR RNP复合体来破坏多个基因，所述多个CRISPR RNP复合体指导在多个基因组位置处的裂解，导致多个突变。多个基因也可以被顺序破坏。由核酸酶组合物产生的导致无功能基因的突变可以是模板化基因组编辑的结果，例如同源重组DNA修复机制的结果。由核酸酶组合物产生的导致无功能基因的突变可以是非模板化基因组缺失的结果，例如核酸酶裂解诱导的非同源末端连接(NHEJ)DNA修复机制导致基因组插入或缺失(也称为插入/缺失(indels))。

多重修饰可以包括任何描述的修饰的组合，诸如一个或更多个整合的核苷酸序列与一个或更多个非模板化突变的组合。在说明性实例中，“多重”CRISPR介导的基因编辑方法可以被用于通过同源定向修复(homology directed repair)整合一个或更多个基因或其部分(即，同时引入多个同源修复模板与指导在多个基因组位置处的裂解的多个CRISPRRNP复合体)，同时破坏多个基因(即，同时引入多个CRISPR RNP复合体，所述多个CRISPRRNP复合体指导在多个基因组位置处的裂解，导致多个非模板化突变，例如，多个插入/缺失)两者。整合和破坏可以被顺序进行。

作为具有多重修饰的修饰的细胞的说明性实例，修饰的T细胞具有整合在TCRα基因座中的TCR表达盒和使得TCRβ基因座是无功能基因的被破坏的TCRβ基因座。作为另一个说明性实例，具有多重修饰的修饰的细胞的说明性实例，修饰的T细胞具有整合在TCRβ基因座中的TCR表达盒和使得TCRα基因座是无功能基因的被破坏的TCRα基因座。

靶基因座

在内源基因组靶基因座处，即在修饰的细胞内的特定基因组位置，诸如感兴趣的特定基因或感兴趣的特定核苷酸序列处，对修饰的细胞进行基因组编辑或能够进行基因组编辑。内源基因组靶基因座可以是基因的编码区。内源基因组靶基因座可以是基因的非编码区，诸如内含子。内源基因组靶基因座可以是除了通常与典型基因缔合的基因组区域以外的非编码基因组区域，诸如编码非编码功能性RNA、重复DNA元件、逆转录病毒元件、假基因等的一个或更多个区域。

细胞群体

在特定方面，提供了细胞群体(例如，T细胞群体)。细胞群体可以包含本文描述的任何修饰的细胞。修饰的细胞可以在细胞的异质群体和/或不同细胞类型的异质群体中。关于基因组编辑的细胞百分比，细胞群体可以是异质的。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％包含整合的核苷酸序列。在某些方面，细胞群体包含整合的核苷酸序列，其中整合的核苷酸序列包含基因的至少一部分，整合的核苷酸序列被整合在内源基因组靶基因座处，并且整合的核苷酸序列被取向为使得基因的至少一部分能够被表达，其中细胞群体基本上不含病毒介导的递送组分，并且其中群体中大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于80％或大于90％的细胞包含整合的核苷酸序列。

细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％或大于97％、大于98％、大于99％、大于99.5％或大于99.9％包含整合的核苷酸序列。细胞群体可以这样的群体，所述群体的具有大于20％包含整合的核苷酸序列。细胞群体可以这样的群体，所述群体的具有大于30％包含整合的核苷酸序列。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于60％包含整合的核苷酸序列。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于70％的群体包含整合的核苷酸序列。

细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的10％和70％之间、20％和70％之间、30％和70％之间、40％和70％之间、50％和70％之间、60％和70％之间、10％和80％之间、10％和60％之间、10％和50％之间、10％和40％之间、10％和30％之间、10％和20％之间、20％和80％之间、30％和80％之间、40％和80％之间、50％和80％之间、60％和80％之间、70％和80％之间包含整合的核苷酸序列。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的10％和100％之间、20％和100％之间、30％和100％之间、40％和100％之间、50％和100％之间、60％和100％之间、70％和100％之间、80％和100％之间、90％和100％之间、95％和100％之间、96％和100％之间、97％和100％之间、98％和100％之间、99％和100％之间、99.5％和100％之间包含整合的核苷酸序列。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的10％和70％之间包含整合的核苷酸序列。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的20％和70％之间包含整合的核苷酸序列。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的30％和70％之间包含整合的核苷酸序列。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的10％和80％之间包含整合的核苷酸序列。细胞群体可以这样的群体，所述群体的具有20％和80％之间包含整合的核苷酸序列。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的30％和80％之间包含整合的核苷酸序列。

细胞群体可以是关于具有单个修饰(例如，整合的核苷酸序列)的细胞百分比异质的。细胞群体可以是关于具有第一修饰、第二修饰或第一修饰和第二修饰两者的细胞百分比异质的，例如，作为说明性实例，细胞群体可以是关于具有整合的核苷酸序列、产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变、或整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变两者的细胞百分比异质的。

细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％或大于97％、大于98％、大于99％、大于99.5％或大于99.9％包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于20％包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于30％包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于60％包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于70％包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的10％和70％之间、20％和70％之间、30％和70％之间、40％和70％之间、50％和70％之间、60％和70％之间、10％和80％之间、10％和60％之间、10％和50％之间、10％和40％之间、10％和30％之间、10％和20％之间、20％和80％之间、30％和80％之间、40％和80％之间、50％和80％之间、60％和80％之间、70％和80％之间包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的10％和100％之间、20％和100％之间、30％和100％之间、40％和100％之间、50％和100％之间、60％和100％之间、70％和100％之间、80％和100％之间、90％和100％之间、95％和100％之间、96％和100％之间、97％和100％之间、98％和100％之间、99％和100％之间、99.5％和100％之间包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的10％和70％之间包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的20％和70％之间包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的30％和70％之间包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的10％和80％之间包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的20％和80％之间包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有30％和80％之间包含整合的核苷酸序列和产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。

细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％包含整合的核苷酸序列或产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的10％和70％之间、20％和70％之间、30％和70％之间、40％和70％之间、50％和70％之间、60％和70％之间、10％和80％之间、10％和60％之间、10％和50％之间、10％和40％之间、10％和30％之间、10％和20％之间、20％和80％之间、30％和80％之间、40％和80％之间、50％和80％之间、60％和80％之间、70％和80％之间包含整合的核苷酸序列或产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％或大于97％、大于98％、大于99％、大于99.5％或大于99.9％包含整合的核苷酸序列或产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于20％的群体包含整合的核苷酸序列或产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于30％的群体包含整合的核苷酸序列或产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于60％的群体包含整合的核苷酸序列或产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的群体，所述群体的大于70％的群体包含整合的核苷酸序列或产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。

细胞群体可以具有这样的修饰的细胞，所述修饰的细胞的大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、大于98％或大于99％包含整合的核苷酸序列，还包含产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。细胞群体可以具有这样的修饰的细胞，所述修饰的细胞的10％和70％之间、20％和70％之间、30％和70％之间、40％和70％之间、50％和70％之间、60％和70％之间、10％和80％之间、10％和60％之间、10％和50％之间、10％和40％之间、10％和30％之间、10％和20％之间、20％和80％之间、30％和80％之间、40％和80％之间、50％和80％之间、60％和80％之间、70％和80％之间、10％和90％之间、20％和90％之间、30％和90％之间、40％和90％之间、50％和90％之间、60％和90％之间、70％和90％之间、80％和90％之间、10％和95％之间、20％和95％之间、30％和95％之间、40％和95％之间、50％和95％之间、60％和95％之间、70％和95％之间、80％和95％之间、10％和98％之间、20％和98％之间、30％和98％之间、40％和98％之间、50％和98％之间、60％和98％之间、70％和98％之间、80％和98％之间、10％和99％之间、20％和99％之间、30％和99％之间、40％和99％之间、50％和99％之间、60％和99％之间、70％和99％之间、80％和99％之间、90％和99％之间、95％和99％之间、90％和95％之间以及95％和98％之间包含整合的核苷酸序列，还包含产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变。

细胞群体可以具有这样的修饰的细胞，所述修饰的细胞的大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、大于98％或大于99％包含产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变，还包含整合的核苷酸序列。细胞群体可以具有这样的修饰的细胞，所述修饰的细胞的10％和70％之间、20％和70％之间、30％和70％之间、40％和70％之间、50％和70％之间、60％和70％之间、10％和80％之间、10％和60％之间、10％和50％之间、10％和40％之间、10％和30％之间、10％和20％之间、20％和80％之间、30％和80％之间、40％和80％之间、50％和80％之间、60％和80％之间、70％和80％之间、10％和90％之间、20％和90％之间、30％和90％之间、40％和90％之间、50％和90％之间、60％和90％之间、70％和90％之间、80％和90％之间、10％和95％之间、20％和95％之间、30％和95％之间、40％和95％之间、50％和95％之间、60％和95％之间、70％和95％之间、80％和95％之间、10％和98％之间、20％和98％之间、30％和98％之间、40％和98％之间、50％和98％之间、60％和98％之间、70％和98％之间、80％和98％之间、10％和99％之间、20％和99％之间、30％和99％之间、40％和99％之间、50％和99％之间、60％和99％之间、70％和99％之间、80％和99％之间、90％和99％之间、95％和99％之间、90％和95％之间以及95％和98％之间包含产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因的突变，还包含整合的核苷酸序列。

修饰的细胞可以在为富集特定的修饰(例如，整合外源基因)而修饰后(例如，在基因组编辑后)在细胞群体内被富集。可以使用包括但不限于以下方法来富集群体：荧光激活细胞分选(FACS)(例如，外源基因表达或共表达荧光标志物，或者使用抗体染色群体以确定外源基因的表达或内源基因的损失)、药物选择(例如，外源基因表达或共表达药物选择基因)或亲和纯化(例如，外源基因表达或共表达亲和标签)。

在特定方面，本文描述的同质群体可以在不富集修饰的细胞的情况下实现，即，在细胞修饰后，诸如在核酸酶介导的(例如，CRISPR介导的)基因组编辑后，不进行富集步骤。

细胞群体，特别是修饰后立即获得的细胞群体(其中群体尚未被富集)，可以是至少10个细胞、至少100个细胞、至少1000个细胞、至少10000个细胞、1×10⁶个细胞、至少2×10⁶个细胞、至少5×10⁶个细胞、至少1×10⁷个细胞、至少5×10⁷个细胞、至少1×10⁸个细胞、至少5×10⁸个细胞、至少1×10⁹个细胞或至少5×10⁹个细胞。细胞群体，特别是修饰后立即获得的细胞群体(其中群体尚未被富集)，可以是至少1×10⁷个细胞。细胞群体，特别是修饰后立即获得的细胞群体(其中群体尚未被富集)，可以是至少5×10⁷个细胞。

基因编辑系统

如上描述的，通常，使用核酸酶介导的编辑，修饰细胞被修饰为使得它们被基因组编辑，或者能够被基因组编辑。

通常，核酸酶通过以下来促进编辑：首先指导在特定核酸序列(即，被核酸酶裂解的“指定的核苷酸序列”)，例如基因组序列处的裂解，以及随后是来自基于非模板化的DNA修复，例如核酸酶裂解诱导的非同源末端连接DNA修复机制的编辑结果，或者来自基于模板的修复，例如同源重组DNA修复机制的结果。

多种可以被工程化以促进序列特异性裂解的核酸酶是本领域技术人员已知的并且包括但不限于，成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)家族核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)或其衍生物以及归巢内切核酸酶(HE)或其衍生物。特别地，可以使用CRISPR介导的基因编辑系统，诸如CRISPR/Cas9编辑系统。核酸酶介导的编辑，并且特别是CRISPR介导的编辑，在Adli M(The CRISPR tool kit forgenome editing and beyond.Nat Commun.2018May 15；9(1)：1911)中有更详细的讨论，对于其教导的所有内容通过引用并入本文。

CRISPR介导的基因编辑

通常，CRISPR介导的基因编辑系统包含CRISPR相关(Cas)核酸酶和指导对特定靶序列的裂解的RNA。示例性CRISPR介导的基因编辑系统是CRISPR/Cas9系统，其包含Cas9核酸酶和具有CRISPR RNA(crRNA)结构域和反式激活CRISPR(tracrRNA)结构域的RNA。crRNA通常具有两个RNA结构域：通过与靶序列(“指定的核苷酸序列”)例例如基因组序列的碱基对杂交来指导特异性的指导RNA序列(gRNA)；和与tracrRNA杂交的RNA结构域。tracrRNA可以与核酸酶(例如Cas9)相互作用，并且从而促进核酸酶向基因组基因座的募集。crRNA和tracrRNA多核苷酸可以是分开的多核苷酸。crRNA和tracrRNA多核苷酸可以是单一多核苷酸，也称为单指导RNA(sgRNA)。虽然本文显示的是Cas9系统，但也可以使用其他CRISPR系统，诸如Cpf1系统。核酸酶可以包括其衍生物，诸如Cas9功能性突变体，例如Cas9“切口酶”突变体，其通常仅介导指定的核苷酸序列的单链裂解，而不是通常由Cas9酶产生的完全双链断裂。

通常，CRISPR系统的组分彼此相互作用以形成核糖核蛋白(RNP)复合体来介导序列特异性裂解。在一些CRISPR系统中，每种组分可以分开生产，并且用于形成RNP复合体。在一些CRISPR系统中，每种组分可以在体外分开产生，并且在体外彼此接触(即，“复合”)以形成RNP复合体。然后体外产生的RNP可以被引入(即，“递送”)到细胞的胞质溶胶和/或细胞核中，例如T细胞的胞质溶胶和/或细胞核中。体外产生的RNP复合体可以通过多种手段递送至细胞，所述手段包括但不限于电穿孔、脂质介导的转染、通过物理手段使细胞膜变形、脂质纳米颗粒(LNP)、病毒样颗粒(VLP)和声处理。在特定实例中，体外产生的RNP复合体可以使用基于Nucleofactor/电穿孔的递送系统递送至细胞。其他电穿孔系统包括，但不限于，MaxCyte电穿孔系统、Miltenyi CliniMACS电穿孔系统、Neon电穿孔系统和BTX电穿孔系统。CRISPR核酸酶，例如Cas9，可以使用本领域技术人员已知的多种蛋白产生技术在体外产生(即合成和纯化)。CRISPR系统RNA，例如sgRNA，可以使用本领域技术人员已知的多种RNA产生技术诸如体外转录或化学合成在体外产生(即合成和纯化)。

体外产生的RNP复合体可以以不同的核酸酶与gRNA的比例进行复合。例如，体外产生的RNP复合体可以使sgRNA与Cas9蛋白以1∶1-1∶9之间的Cas9：sgRNA摩尔比例，诸如1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8或1∶9的Cas9：sgRNA摩尔比例复合来形成。体外产生的RNP复合体可以使sgRNA与Cas9蛋白以约1∶1、约1∶2、约1：3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8或约1∶9的Cas9：sgRNA摩尔比例复合来形成。

体外产生的RNP复合体也可以在CRISPR介导的编辑系统中以不同的量使用。例如，根据期望待编辑的细胞的数目，可以调整添加的总RNP量，诸如在反应中当编辑大量(例如，5×10⁷个)细胞时减少添加的RNP复合体的量。

在一些CRISPR系统中，每种组分(例如，Cas9和sgRNA)可以由多核苷酸分开编码，并且每种多核苷酸被引入细胞。在一些CRISPR系统中，每种组分可以由单一多核苷酸(即，多启动子或多顺反子载体，参见下文对示例性多顺反子系统的描述)编码并引入细胞。编码CRISPR组分的每种多核苷酸在细胞内表达(例如，核酸酶的翻译和CRISPR RNA的转录)后，RNP复合体可以在细胞内形成，并且然后可以指导位点特异性裂解。

一些RNP可以被工程化为具有促进RNP递送到细胞核的部分。例如，Cas9核酸酶可以具有核定位信号(NLS)结构域，使得如果Cas9 RNP复合体被递送到细胞的胞质溶胶中或者在Cas9翻译和随后的RNP形成后，NLS可以促进Cas9 RNP进一步运输到核中。

本文描述的修饰的细胞可以使用非病毒方法进行修饰，例如，本文描述的核酸酶和CRISPR介导的基因编辑系统可以使用非病毒方法递送至细胞。虽然病毒介导的递送(例如，基于腺病毒、逆转录病毒和慢病毒的递送方法)已经被用于递送核酸酶和CRISPR介导的基因编辑系统，但是病毒介导的系统可能会受到病毒系统的影响，该病毒系统还引入了导致免疫原性的组分。例如，病毒介导的递送组分可以包括能够整合到基因组中的病毒或病毒来源的核苷酸序列。因此，本文描述的修饰的细胞可以基本上不含病毒介导的递送组分。术语“基本上不含病毒介导的递送组分”被理解为意指相关总组合物(例如，细胞或细胞群体)中存在少于统计显著量的一种或更多种病毒介导的递送组分，包括在相关总组合物中处于检测不到水平的病毒介导的递送组分(即，“本文描述的修饰的细胞可以不含病毒介导的递送组分”)。少于统计显著量可以指不能视作相关组合物中存在病毒介导的递送组分具有统计置信度，诸如p值大于0.1、0.05或0.01的检测水平。病毒介导的递送组分可以包括病毒蛋白，诸如病毒结构蛋白(例如衣壳、包膜和/或膜融合蛋白)。通常，所有来源于整合的病毒序列或来自引入的病毒蛋白的肽都有可能通过细胞表面上的MHC分子，特别是MHC I类等位基因来呈现，并且能够随后导致免疫原性。在治疗环境中，诸如过继细胞疗法，免疫原性可对治疗功效产生负面影响。因此，非病毒递送方法在修饰和编辑用于过继细胞疗法诸如过继T细胞疗法的细胞方面可能是有利的。因此，在特定方面，修饰的细胞的表面上的MHC I类可以不含来源于病毒介导的递送组分或整合的病毒的肽，其中整合的病毒与病毒介导的递送组分可操作地缔合。

在一些CRISPR系统中，可以提供多于一种CRISPR组合物，使得各自分开靶向在多于一个指定的核苷酸序列处的同一基因或一般基因组基因座。例如，可以提供两种分开的CRISPR组合物来指导在彼此一定距离内的两个不同的指定的核苷酸序列处的裂解，彼此一定距离诸如彼此少于或等于10个碱基对、少于或等于20个碱基对、少于或等于30个碱基对、少于或等于40个碱基对、少于或等于50个碱基对、少于或等于100个碱基对、少于或等于200个碱基对、少于或等于300个碱基对、少于或等于400个碱基对、少于或等于500个碱基对、少于或等于1,000个碱基对、少于或等于2,000个碱基对、少于或等于5,000个碱基对或者少于或等于10,000个碱基对。在一些CRISPR系统中，可以提供多于一种CRISPR组合物，使得各自分开靶向同一基因或一般基因组基因座的相对链。例如，可以提供两种分开的CRISPR“切口酶”组合物来指导在同一基因或一般基因组基因座的相对链处的裂解。

基因编辑中的同源定向修复(HDR)

不希望受理论束缚，通常，用于引入外源基因的核酸酶介导的基因编辑系统利用细胞的天然DNA修复机制，特别是同源重组(HR)修复途径。简言之，在基因组DNA受到损伤(通常是双链断裂)后，细胞可以通过在DNA合成期间使用另一种DNA来源作为模板修复损伤来解决损伤，另一种DNA来源在其5’末端和3’末端处具有相同或基本相同的序列。在自然环境中，HDR可以使用存在于细胞中的另一条染色体作为模板。在基因编辑系统中，外源多核苷酸被引入细胞中用作同源重组模板(HRT或HR模板)。通常，在模板化HDR期间，被包含在HRT的5’和3’互补末端之间的任何最初不存在于具有损伤的染色体中的另外的外源序列(例如，基因或基因的一部分)可以被掺入(即，“整合”)到给定的基因组座位中。因此，用于给定基因组基因座的典型HR模板具有与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列、与内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列、以及编码基因(例如，感兴趣的外源基因)的至少一部分的核苷酸序列。

在一些实例中，HR模板可以是线性的。线性HR模板的实例包括但不限于，线性化质粒载体、ssDNA、合成的DNA和PCR扩增的DNA

在特定实例中，HR模板可以是环状的，诸如质粒或纳米质粒。不希望受理论束缚，环状HR模板可以比类似的线性模板具有特别的优势，诸如增加的稳定性、减少的合成误差(例如，在PCR扩增期间)以及易于制造。如本文显示的，环状HR模板相对于类似的线性模板(例如，类似大小的线性模板)可以具有改进的编辑效率。环状模板可以包括超螺旋模板。

不希望受理论束缚，通常，所使用的HR模板越大，同源重组(HR)修复途径的总体效率就越低。因此，限制HR模板的大小可能是有利的，诸如通过从HR模板，特别是从环状模板中去除外来的核苷酸序列。例如，可以使用长度少于500个碱基的载体骨架(即除了基因或其部分以外的所有核苷酸序列)，诸如除去了除抗生素抗性标记和复制起点以外的所有外来序列的载体。

在环状HR模板的说明性实例中，使用NanoplasmidS^TM (Nature Technology)。Nanoplasmid^TM是Nature Technology Corp的商标。不含抗生素的RNA-OUT选择载体和细胞系分别在世界专利申请WO2008153733和同等的美国、欧洲和澳大利亚专利：US 2010/0303859；EP2333091；和AU 2008262478中被更详细描述，对于其教导的所有内容在此通过引用以其整体并入。Nanoplasmid^TM载体和细胞系在以下根据专利合作条约的世界专利中另外更详细描述：PCT/US 13/000259；PCT/US 13/00067；和PCT/US 13/00068，对于其教导的所有内容在此通过引用以其整体并入。

不希望受理论束缚，通常，HR模板中的杂质可能导致修饰的细胞的编辑效率和/或修饰的细胞的存活力降低。因此，基于检测限(limits of detection)，所使用的HR模板可以基本上不含杂质(例如，除了HR模板的DNA以外的任何组分)或者不含污染物。杂质可以包括但不限于纯化过程相关的杂质(例如，来自缓冲液的盐或溶剂等)、除了HR模板以外的DNA和其他核酸以及来自用于产生HR模板的残余宿主细胞(例如细菌细胞，诸如大肠杆菌(E.coli))的残余污染物，诸如内毒素、残余宿主细胞蛋白、残余宿主细胞RNA、残余宿主细胞gDNA和残余宿主细胞脂质或糖类。

HR模板的同质性(例如，不含除了HR模板以外的DNA和其他核酸的HR模板的纯度)可以通过琼脂糖凝胶电泳评估，并且当如通过琼脂糖凝胶电泳评估纯度为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少98％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％纯时，通常可以被认为基本上不含除了HR模板以外的DNA和其他核酸。当如通过琼脂糖凝胶电泳评估纯度为至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％纯时，HR模板可以被认为基本上不含除了HR模板以外的DNA和其他核酸。

HR模板的内毒素污染可以通过鲎变形细胞溶解产物(Limulous amoebocytelysate)(LAL)测定评估，并且当检测到少于1000EU/mg、少于900EU/mg、少于800EU/mg、少于700EU/mg或少于600EU/mg时，通常可以被认为基本上不含内毒素。当检测到少于450EU/mg、少于400EU/mg、少于350EU/mg、少于300EU/mg、少于250EU/mg、少于200EU/mg、少于150EU/mg、少于100EU/mg或少于50EU/mg时，HR模板被认为基本上不含内毒素。当检测到少于500EU/mg时，HR模板被认为基本上不含内毒素。

残余的宿主细胞蛋白可以通过Micro BCA评估。当少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％或少于0.1％的组合物包含残余的宿主细胞蛋白时，HR模板被认为基本上不含残余的宿主细胞蛋白。当少于2％的组合物包含残余的宿主细胞蛋白时，HR模板被认为基本上不含残余的宿主细胞蛋白。

残余的宿主细胞RNA可以通过琼脂糖凝胶电泳并且用SYBR金染色评估。当少于10％、少于7.5％、少于5％、少于2.5％、少于1％、少于0.5％或少于0.1％的组合物包含残余的宿主细胞RNA时，HR模板被认为基本上不含残余的宿主细胞RNA。当少于5％的组合物包含残余的宿主细胞RNA时，HR模板被认为基本上不含残余的宿主细胞RNA。

残余的宿主细胞基因组DNA可以通过qPCR评估。当少于10％、少于7.5％、少于5％、少于2.5％、少于1％、少于0.5％或少于0.1％的组合物包含残余的宿主细胞基因组DNA时，HR模板被认为基本上不含残余的宿主细胞基因组DNA。当少于5％的组合物包含残余的宿主细胞基因组DNA时，HR模板被认为基本上不含残余的宿主细胞基因组DNA。

过程相关的杂质(例如来自缓冲液的盐或溶剂等)可以通过本领域已知的方法评估

残余的宿主细胞脂质或糖类可以通过本领域已知的方法评估

HR模板可以通过光谱学评估。当通过光谱学评估A₂₆₀/A₂₈₀比率为1.8、1.8+/-.001、1.8+/-.01或1.8+/-.1时，HR模板被认为基本上不含污染物。

可以使用本领域已知的其他测定来评估HR模板纯度。如通过本领域已知的测定评估的，HR模板可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％纯。如通过本领域已知的测定评估的，HR模板可以是至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％纯的。如通过本领域已知的测定评估的，HR模板可以是在95％和100％之间、96％和100％之间、97％和100％之间、98％和100％之间、99％和100％之间、99.5％和100％之间或99.9％和100％之间纯的。

HR模板可以通过本领域技术人员已知的方法纯化，所述方法包括但不限于基于硅胶柱的纯化、酚氯仿提取、色谱纯化(例如，HPLC)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化及其组合。

在HDR后，靶序列(“指定的核苷酸序列”)可以被去除，使得内源基因组靶基因座不再能够被裂解。例如，HR模板上编码的外源核苷酸序列可缺少给定核酸酶裂解的靶序列。

HR臂

相对于待引入的外源序列，存在于HR模板5’和3’末端的相同或基本上相同的序列(即，与内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列)通常被称为臂(HR臂)。HR臂可以与内源基因组靶基因座的区域相同(即100％相同)。在一些实例中，HR臂可以与内源基因组靶基因座的区域基本上相同(例如，与内源基因组靶基因座的区域至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％相同)。虽然可以使用基本上相同的HR臂，但是HR臂相同可能是有利的，因为HDR途径的效率可能受具有少于100％同一性的HR臂影响。

尽管HR臂通常可以是任何长度，但实际考虑因素，诸如HR臂长度和整体模板大小对整体编辑效率的影响，也可以被考虑在内。与内源基因组靶基因座的第一区域相同或基本上相同的核苷酸序列(即5’HR臂)可以是长度大于或等于50个碱基、长度大于或等于100个碱基、长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于300个碱基、长度大于或等于400个碱基、长度大于或等于500个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于700个碱基、长度大于或等于800个碱基、长度大于或等于900个碱基、长度大于或等于1000个碱基、长度大于或等于1100个碱基、长度大于或等于1200个碱基、长度大于或等于1300个碱基、长度大于或等于1400个碱基、长度大于或等于1500个碱基、长度大于或等于1600个碱基、长度大于或等于1700个碱基、长度大于或等于1800个碱基、长度大于或等于1900个碱基、长度大于或等于2000个碱基。与内源基因组靶基因座的第一区域相同或基本上相同的核苷酸序列(即5’HR臂)的长度可以大于或等于300个碱基。与内源基因组靶基因座的第一区域相同或基本上相同的核苷酸序列(即5’HR臂)的长度可以大于或等于600个碱基。与内源基因组靶基因座的第一区域相同或基本上相同的核苷酸序列(即5’HR臂)的长度可以大于或等于1000个碱基。与内源基因组靶基因座的第一区域相同或基本上相同的核苷酸序列(即5’HR臂)的长度可以大于或等于2000个碱基。

与内源基因组靶基因座的第二区域相同或基本上相同的核苷酸序列(即3’HR臂)可以是长度大于或等于50个碱基、长度大于或等于100个碱基、长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于300个碱基、长度大于或等于400个碱基、长度大于或等于500个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于700个碱基、长度大于或等于800个碱基、长度大于或等于900个碱基、长度大于或等于1000个碱基、长度大于或等于1100个碱基、长度大于或等于1200个碱基、长度大于或等于1300个碱基、长度大于或等于1400个碱基、长度大于或等于1500个碱基、长度大于或等于1600个碱基、长度大于或等于1700个碱基、长度大于或等于1800个碱基、长度大于或等于1900个碱基、长度大于或等于2000个碱基。与内源基因组靶基因座的第二区域相同或基本上相同的核苷酸序列(即3’HR臂)的长度可以大于或等于300个碱基。与内源基因组靶基因座的第二区域相同或基本上相同的核苷酸序列(即3’HR臂)的长度可以大于或等于600个碱基。与内源基因组靶基因座的第二区域相同或基本上相同的核苷酸序列(即3’HR臂)的长度可以大于或等于1000个碱基。与内源基因组靶基因座的第二区域相同或基本上相同的核苷酸序列(即3’HR臂)的长度可以大于或等于2000个碱基。

与内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同或基本上相同的每个核苷酸序列可以是相同的大小或不同的大小。例如，与内源基因组靶基因座的第一区域相同或基本上相同的核苷酸序列和与内源基因组靶基因座的第二区域相同或基本上相同的核苷酸序列可以各自长度大于或等于600个碱基。

与内源基因组靶基因座的第一区域或第二区域相同或基本上相同的核苷酸序列可以与紧邻裂解位点的内源基因组靶基因座的区域(即，指定的核苷酸序列)相同或基本上相同。与内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同或基本上相同的核苷酸序列可以各自与紧邻裂解位点的内源基因组靶基因座的区域(即，指定的核苷酸序列)相同或基本上相同。与内源基因组靶基因座的第一区域或第二区域相同或基本上相同的核苷酸序列可以与在裂解位点一定距离内的内源基因组靶基因座的区域(即，指定的核苷酸序列)相同或基本上相同，所述距离彼此为诸如1个碱基对、少于或等于2个碱基对、少于或等于3个碱基对、少于或等于4个碱基对、少于或等于5个碱基对、少于或等于6个碱基对、少于或等于7个碱基对、少于或等于8个碱基对、少于或等于9个碱基对、少于或等于10个碱基对、少于或等于15个碱基对、少于或等于20个碱基对、少于或等于50个碱基对或者少于或等于100个碱基对。与内源基因组靶基因座的第一区域或第二区域相同或基本上相同的核苷酸序列可以与在裂解位点的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个碱基对内的内源基因组靶基因座的区域相同或基本相同。

外源序列

编码基因(例如，感兴趣的外源基因)的至少一部分的核苷酸序列通常可以是任何感兴趣的外源核苷酸序列。例如，感兴趣的外源核苷酸序列可以是短序列，例如长度是3-100个核苷酸。感兴趣的外源核苷酸序列可以是单一核苷酸。此外，感兴趣的外源核苷酸序列可以是长序列，例如长度是500-3000个核苷酸。感兴趣的外源核苷酸序列可以编码或不编码多肽序列。此外，可以将感兴趣的外源核苷酸序列插入细胞中，使得其在插入后形成嵌合基因。例如，可以将外源受体部分符合读框地插入内源受体编码序列中，以产生嵌合受体编码序列，该嵌合受体编码序列在编辑后包括可操作地连接至内源细胞内部分的外源受体部分(例如，用于信号转导)。

在一些实例中，基因或其部分可以是蛋白编码核苷酸序列(即，编码多肽序列的核苷酸序列)。通常，可以使用任何蛋白编码核苷酸。在一些实例中，蛋白编码核苷酸序列编码在自体细胞疗法(例如，自体T细胞疗法)中有用的蛋白。在一些实例中，蛋白编码核苷酸序列可以包括但不限于调节免疫系统的因子、细胞因子、调节T细胞功能的因子、促进T细胞存活的因子、促进T细胞功能的因子或免疫检查点抑制剂。蛋白(特别是分泌蛋白或膜结合蛋白)编码核苷酸序列可以包括编码信号肽的核苷酸序列。信号肽可以是对由蛋白编码核苷酸序列编码的蛋白内源的。信号肽可以是对由蛋白编码核苷酸序列编码的蛋白外源的，诸如人类生长激素信号肽。

在一些实例中，基因或其部分可以是非蛋白编码核苷酸序列。通常，可以使用任何非蛋白编码核苷酸序列。在一些情况下，非蛋白编码核苷酸序列可以是在自体细胞疗法(例如，自体T细胞疗法)中有用的核苷酸序列。在一些情况下，非蛋白编码核苷酸序列可以包括但不限于shRNA、siRNA、miRNA和lncRNA。

尽管编码基因(例如，感兴趣的外源基因)的至少一部分的核苷酸序列通常可以是任何大小，但实际考虑因素，诸如基因大小对总模板大小和随后的总编辑效率的影响，可以被考虑在内。因此，在特定方面，本文提供了修饰的细胞，所述修饰的细胞被基因组编辑或能够被基因组编辑，以比先前描述特别是当使用非病毒递送方法时更高的HR效率(efficiency rates)(例如，更高百分比的群体具有整合的多核苷酸序列)表达长度大于或等于100个碱基的外源基因。提高的HR效率同样适用于长度大于100个碱基的基因，诸如引入长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于400个碱基、长度大于或等于500个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于750个碱基的外源序列、长度大于或等于1000个碱基、长度大于或等于1500个碱基、长度大于或等于2000个碱基、长度大于或等于3000个碱基或者长度大于或等于4000个碱基的外源序列。基因的至少一部分的长度可以大于或等于800个碱基。基因的至少一部分的长度可以大于或等于1600个碱基。

外源序列的长度可以在100-200个碱基之间、长度在100-300个碱基之间、长度在100-400个碱基之间、长度在100-500个碱基之间、长度在100-600个碱基之间、长度在100-700个碱基之间、长度在100-800个碱基之间、长度在100-900个碱基之间或者长度在100-1000个碱基之间。外源序列的长度可以在100-2000个碱基之间、长度在100-3000个碱基之间、长度在100-4000个碱基之间、长度在100-5000个碱基之间、长度在100-6000个碱基之间、长度在100-7000个碱基之间、长度在100-8000个碱基之间、长度在100-9000个碱基之间或者长度在100-10,000个碱基之间。外源序列的长度可以在1000-2000个碱基之间、长度在1000-3000个碱基之间、长度在1000-4000个碱基之间、长度在1000-5000个碱基之间、长度在1000-6000个碱基之间、长度在1000-7000个碱基之间、长度在1000-8000个碱基之间、长度在1000-9000个碱基之间或者长度在1000-10,000个碱基之间。

外源序列的长度可以大于或等于10个碱基、长度大于或等于20个碱基、长度大于或等于30个碱基、长度大于或等于40个碱基、长度大于或等于50个碱基、长度大于或等于60个碱基、长度大于或等于70个碱基、长度大于或等于80个碱基、长度大于或等于90个碱基或者长度大于或等于95个碱基。外源序列的长度可以在1-100个碱基之间、长度在1-90个碱基之间、长度在1-80个碱基之间、长度在1-70个碱基之间、长度在1-60个碱基之间、长度在1-50个碱基之间、长度在1-40个碱基之间或者长度在1-30个碱基之间。外源序列的长度可以在1-20个碱基之间、长度在2-20个碱基之间、长度在3-20个碱基之间、长度在5-20个碱基之间、长度在10-20个碱基之间或者长度在15-20个碱基之间。外源序列的长度可以在1-10个碱基之间、长度在2-20个碱基之间、长度在3-10个碱基之间、长度在5-10个碱基之间、长度在1-5个碱基之间或者长度在1-15个碱基之间。外源序列的长度可以是15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、110个、115个、120个、125个、150个、175个、200个、225个或250个碱基。外源序列的长度可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个碱基。

在其中引入多个外源序列的实例中，多个外源序列可以是不同的大小，例如，第一外源序列可以大于或等于100个碱基，并且第二外源序列可以大于或等于100个碱基，或者第一外源序列可以大于或等于100个碱基，并且第二外源序列可以少于100个碱基(例如，长度在1-100个碱基之间)。

基因的至少一部分可以在整合到内源基因组靶基因座中之后被表达。

在一些实例中，HR模板不编码启动子序列。编码基因的至少一部分的核苷酸序列的表达可以由内源基因组靶基因座内的内源启动子指导，即基因的至少一部分被整合到内源基因组靶基因座中，使得内源启动子被可操作地连接至基因的至少一部分。在说明性实例中，编码TCR的外源序列可以被整合到TCR基因组基因座，诸如TCRα恒定区编码外显子中，使得内源TCRα启动子被可操作地连接至TCR。

在一些实例中，HR模板编码被可操作地连接至基因的至少一部分的外源启动子序列。外源启动子的实例包括但不限于，哺乳动物启动子、人类启动子、病毒启动子、来自逆转录病毒或慢病毒的长末端重复序列(LTR)来源启动子、两个启动子的融合体、两个启动子部分的融合体、MMLV LTR启动子、HIV LTR启动子、MCMV LTR启动子、EF1a启动子、MND启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、小分子诱导型启动子、四环素诱导型启动子、小分子条件性启动子、Cre-LoxP条件性启动子系统、Flp-FRT条件性启动子系统和他莫昔芬条件性启动子系统。外源启动子可以是组成型的。外源启动子可以是可诱导型的，诸如可由小分子(例如四环素及衍生物)诱导的。外源启动子可以是条件性的，诸如在基因组重排后有活性的启动子(例例如，Cre-LoxP和FLP-Frt系统)。外源启动子可以是细胞类型依赖的，即仅在特定细胞群体中指导表达。外源启动子可以是哺乳动物的，包括人类的。外源启动子可以是病毒的。

外源序列可以具有接头序列。例如，外源序列可以具有在整合到内源基因组靶基因座中之后将基因的至少一部分连接至内源序列的接头序列。接头可以编码可裂解接头多肽序列，其中在表达后，可裂解接头多肽被裂解，使得仅由基因的至少一部分编码的多肽作为单独的多肽被产生。可裂解肽的实例包括弗林蛋白酶裂解位点和TEV裂解位点。在一些实例中，可裂解接头包括进一步促进裂解的多肽序列，诸如柔性接头(例如，Gly-Ser-Gly序列)。在另一个实例中，接头可以编码2A核糖体跳跃元件，例如T2A、E2A、P2A和F2A，使得仅由基因的至少一部分编码的多肽在翻译期间作为单独的多肽被产生。在另一个实例中，接头可以编码内部核糖体进入位点(IRES)，使得仅由基因的至少一部分编码的多肽在翻译期间作为单独的多肽被产生。接头可以编码剪接受体，诸如病毒剪接受体。

HR模板可以编码与内源核苷酸序列密码子趋异的外源多核苷酸。例如，密码子趋异的序列可以被密码子优化以促进编码的蛋白的表达增加。密码子趋异的序列可以是密码子趋异的，以去除可能导致基因组不稳定性的序列元件，诸如促进重组的序列元件(例如，重组信号序列)。

多顺反子和多启动子系统

外源序列可以是多顺反子的，即可以由单一mRNA转录物产生多于一个单独的多肽。通过使用各种接头，外源序列可以是多顺反子的，例如，编码第一基因的至少一部分的核苷酸序列可以被连接至编码第二基因的至少一部分的核苷酸序列，诸如呈第一基因：接头：第二基因的5’至3’取向。例如，接头可以编码可裂解接头多肽序列，其中在表达后，可裂解接头多肽被裂解，使得由第一基因和第二基因编码的单独的多肽被产生。可裂解肽的实例包括弗林蛋白酶裂解位点和TEV裂解位点。在一些实例中，可裂解接头包括进一步促进裂解的多肽序列，诸如柔性接头(例如，Gly-Ser-Gly序列)。在另一个实例中，接头可以编码2A核糖体跳跃元件，例如T2A、E2A、P2A和F2A，使得由第一基因和第二基因编码的单独的多肽在翻译期间被产生。在另一个实例中，接头可以编码内部核糖体进入位点(IRES)，使得由第一基因和第二基因编码的单独的多肽在翻译期间被产生。接头可以编码剪接受体，诸如病毒剪接受体。通常，多顺反子系统可以使用任何数目的接头或接头组合，诸如以上描述那些，来表达任何数目的基因或其部分(例如，外源序列可以编码第一基因、第二基因和第三基因，每个基因被接头分开，使得由第一基因、第二基因和第三基因编码的单独的多肽被产生。在使用多个相同接头的多顺反子系统中，接头可以编码相同的多肽序列，但具有密码子趋异的核苷酸序列。

外源序列可以具有多个开放阅读框(ORF)，即可以由外源序列产生多于一个分开的mRNA转录物。通过使用多个启动子，外源序列可以具有多个ORF，例如，第一启动子可以被可操作地连接至编码第一基因的至少一部分的核苷酸序列，并且第二启动子可以被可操作地连接至编码第二基因的至少一部分的核苷酸序列。如本文使用的“接头”可以指以上描述的多顺反子接头、被可操作地连接至以上描述的另外的ORF的另外的启动子或者连接第一多肽序列和第二多肽序列的多肽。

第二基因可以是本文描述的任何外源序列(参见外源序列部分)。

另外的试剂

在一些实例中，修饰的细胞(或待修饰的细胞)可以与促进HDR修复(即，增加同源重组率和/或效率)的试剂接触(例如，用其培养)，促进HDR修复包括相对于其他DNA修复途径，诸如NHEJ，促进HDR修复。促进HDR修复的试剂包括但不限于同源重组修复途径的激活剂、非同源末端连接(NHEJ)修复途径的抑制剂或其组合。

通常，本文描述的细胞修饰和编辑技术对修饰的细胞可能是有毒的(即，降低其存活力)。因此，在一些情况下，提供能够增加修饰的细胞存活力的试剂对于总体编辑效率，特别是HR编辑效率可以是有利的。能够增加存活力的试剂可以包括核酸感知途径的抑制剂，诸如TLR9核酸感知途径、AIM2核酸感知途径、IFI16核酸感知途径、cGAS核酸感知途径和胞质核酸感知途径的抑制剂。不希望受理论束缚，这些核酸感知途径的抑制剂可以减少对各种引入(即递送)的核酸(例如，HR模板和sgRNA)的细胞应答(例如，固有免疫信号传导途径)，并且细胞应答的减少可以提高存活力。在说明性实例中，能够增加存活力的试剂可以是寡核苷酸拮抗剂，诸如具有串联重复序列TTAGGG的拮抗剂A151。能够增加存活力的试剂可以包括除了细胞培养物中提供的因子以外的因子，诸如修饰T细胞以表达存活力因子(例如，促进细胞存活的因子)，例如在Portt等人(Biochim Biophys Acta.2011Jan；1813(1)：238-59)中更详细描述的那些因子，对于其教导的所有内容通过引用并入本文。

修饰的T细胞

在特定方面，修饰的细胞是修饰的T细胞。通常，修饰的T细胞可以被修饰为使得它们在任何内源基因组靶基因座处被基因组编辑，或能够被基因组编辑。内源基因组靶基因座可以是内源TCR基因座。内源TCR基因座可以是TCR-α基因座或TCR-β基因座。内源基因组靶基因座可以是免疫检查点基因座，诸如PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3和VISTA基因座。

通常，修饰的T细胞可以被修饰为使得它们可以被基因组编辑，或能够被基因组编辑，以表达任何感兴趣的外源基因。例如，感兴趣的外源基因(“基因的至少一部分”)可以包括TCR基因的至少一部分，诸如TCR-α基因或TCR-β基因或其部分。TCR基因可以包括TCR-α基因和TCR-β基因两者。TCR-α基因和TCR-β基因可以通过接头连接(参见以上多顺反子系统中描述的接头)。TCR基因可以包括TCR-γ基因或TCR-δ基因或其部分。TCR基因可以包括TCR-γ基因和TCR-δ基因两者。TCR基因可以包括但不限于，鼠源化TCR、人源化TCR、结构域交换的TCR、点突变的TCR、具有能够形成二硫键的工程化半胱氨酸的工程化TCR、针对在人类中的表达而优化的密码子优化的TCR、针对密码子使用和去除RNA不稳定性元件而优化的序列优化的TCR、TCR基因的可变区序列、嵌合抗原受体(CAR)或单链TCR。TCR基因可以包括以下的至少一部分：鼠源化TCR、人源化TCR、结构域交换的TCR、点突变的TCR、具有能够形成二硫键的工程化半胱氨酸的工程化TCR、针对在人类中的表达而优化的密码子优化的TCR、针对密码子使用和去除RNA不稳定性元件而优化的序列优化的TCR、TCR基因的可变区序列、嵌合抗原受体(CAR)或单链TCR。TCR基因可以包括这样的TCR基因，其被工程化为展示出相对于内源TCR多肽序列与第二外源TCR多肽序列更大程度的缔合，诸如TCR-α多肽序列和TCR-β多肽序列被工程化为展示出相对于内源TCR多肽序列与彼此更大程度的缔合。

在特定方面，修饰的T细胞具有：a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；c)编码第一接头多肽序列的核苷酸序列；d)编码第二接头多肽序列的核苷酸序列。在一个实例中，编码的多肽序列呈从N末端至C末端的接头：TCR-α：第二接头：TCR-β取向。在一个实例中，编码的多肽序列呈从N末端至C末端的接头：TCR-β：第二接头：TCR-α取向。

TCR基因可以是识别MHC上递呈的疾病特异性表位的TCR(例如，连接的TCR-α和TCR-β构建体)。TCR基因可以是识别MHC等位基因上递呈的癌症特异性表位的TCR(例例如，TCR-α链和TCR-β链两者)，诸如识别MHC等位基因上递呈的癌症特异性新表位(新抗原)的TCR。通常，TCR识别是指TCR以足够的亲和力结合抗原-MHC复合体，使得TCR结合或多种TCR结合的组合(即，TCR成簇)可以导致免疫应答。用于鉴定识别新表位，特别是患者特异性新表位的TCR的方法和组合物在WO2018165475中更详细描述，通过引用以其整体并入本文。此外，可用于鉴定患者样品中是否存在新抗原特异性T细胞的方法可与本文描述的方法组合使用，例如，如美国公布第2017/0003288号和PCT/US17/59598中描述的方法，通过引用以其整体并入本文。

通常，修饰的T细胞可以是任何T细胞。修饰的T细胞可以是人类T细胞。修饰的T细胞可以是人类来源的T细胞，诸如永生化的T细胞或离体发育的T细胞(例如胸腺器官培养发育的细胞)。修饰的T细胞可以是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞、肿瘤浸润性T细胞或工程化T细胞。修饰的T细胞可以是调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞(例如Th1细胞、Th2细胞或Th17细胞)、α-β T细胞或γ-δT细胞。修饰的T细胞可以是幼稚T细胞、干细胞记忆T细胞、中枢记忆T细胞、移行记忆T细胞(transitional memory T cell)、效应记忆T细胞或效应T细胞。修饰的T细胞可以是原代T细胞。

可以从受试者(诸如已知或疑似患有癌症的受试者)中分离修饰的T细胞，诸如原代T细胞。T细胞分离方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于基于细胞表面标志物表达的分选技术，诸如FACS分选、阳性分离技术(例如CD4和/或CD8)和阴性分离(例如CD3)、磁分离及其组合。用于分离T细胞的来源包括但不限于血液、PBMC、通过清血法收集的血液(例如leukopak)和肿瘤组织。

修饰的T细胞可以是培养的T细胞，诸如离体培养的T细胞。修饰的T细胞可以是离体培养的原代T细胞，诸如从受试者分离的原代T细胞。培养的T细胞可以用一种或更多种细胞因子培养。培养的T细胞可以用IL2、IL7、IL15或其组合培养。例如，培养的T细胞可以用IL2培养。在另一个实例中，培养的T细胞可以用IL7和IL15培养。在另一个实例中，培养的T细胞可以用IL2、IL7和IL15培养。在另一个实例中，培养的T细胞可以在没有(基本上不含)IL2的情况下用IL7和IL15培养。在另一个实例中，培养的T细胞可以用单独的IL21培养，或用IL21与IL2、IL7和/或IL15的组合(例如，IL21与IL2组合、与IL7组合、与IL15组合或与IL7和IL15组合)培养。培养的T细胞可以被刺激，例如，用一种或更多种刺激性分子(例如，受体激动剂)培养。刺激性分子包括但不限于CD3和CD28。在实例中，培养的T细胞可以用CD3刺激(CD3刺激的T细胞)。在另一个实例中，培养的T细胞可以用CD28刺激(CD28刺激的T细胞)。在另一个实例中，培养的T细胞可以用CD3和CD28两者刺激(CD3和CD28刺激的T细胞)。刺激性分子可以被固定在表面上，诸如板表面(板结合)或珠表面(珠结合)。

在说明性实例中，修饰的T细胞可以是基因组编辑为表达识别特异性表位(即抗原)的TCR的原代T细胞，所述特异性表位(即抗原)诸如肿瘤抗原、新抗原、肿瘤新抗原、病毒抗原、磷酸抗原、细菌抗原、微生物抗原或其组合。

在说明性实例中，修饰的T细胞可以是基因组编辑为表达识别癌症特异性表位的TCR的原代T细胞，所述TCR诸如识别在MHC等位基因上递呈的癌症特异性新表位(新抗原)的TCR。如本文使用的，术语“新抗原”是具有使其与对应的野生型亲本抗原不同的至少一种改变(例如通过肿瘤细胞中的突变或肿瘤细胞特异性的翻译后修饰)的抗原。新抗原可以包括多肽序列或核苷酸序列。突变可以包括移码或非移码掺入/缺失、错义或无义取代、剪接位点改变、基因组重排或基因融合，或产生neoORF的任何基因组或表达改变。突变也可以包括剪接变体。肿瘤细胞特异性翻译后修饰可以包括异常磷酸化。肿瘤细胞特异翻译后修饰也可以包括蛋白酶体产生的剪接抗原(参见Liepe等人，A large fraction of HLA class Iligands are proteasome-generated spliced peptides：Science.2016Oct 21；354(6310)：354-358.)。可以通过分析来自受试者的肿瘤、病毒或细菌测序数据来鉴定一个或更多个体细胞突变，诸如使用计算机(in silico)预测算法分析测序数据来选择新抗原。预测算法可以是预测受试者的新抗原和MHC等位基因之间的结合的MHC结合算法。

在另一个说明性实例中，修饰的T细胞可以是从受试者分离并且基因组编辑为表达识别癌症特异性表位的TCR的原代T细胞，所述TCR诸如识别在受试者的MHC等位基因上递呈的癌症特异性新表位(新抗原)的TCR。

在另一个说明性实例中，修饰的T细胞可以是从受试者分离并且基因组编辑为表达识别癌症特异性表位的TCR的原代T细胞，所述TCR诸如识别被预测在受试者的MHC等位基因上递呈的癌症特异性新表位(新抗原)的TCR。MHC递呈预测方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于通过将测序数据与质谱和MHC递呈预测组合(例如，美国公布第2017/0199961号，对于其教导的所有内容通过引用并入本文)，以及将测序数据与MHC结合亲和力预测组合(例如，授权的美国专利9，115,402，对于其教导的所有内容通过引用并入本文)来鉴定新抗原。

在另一个说明性实例中，修饰的T细胞可以是相对于受试者为同种异体并且基因组编辑为表达识别癌症特异性表位的TCR的原代T细胞，所述TCR诸如识别在受试者的MHC等位基因上递呈的癌症特异性新表位(新抗原)的TCR。同种异体T细胞可以是HLA分型并且与受试者匹配的(HLA匹配的)，诸如在期望通过施用修饰的T细胞来降低免疫原性的实例中。人类白细胞抗原(HLA)分型可以由患者的肿瘤或血液样品确定。常见存在于人类群体中的HLA也可以包括在新抗原预测算法中，诸如在高加索人(Caucasian)中的HLA-A*02、HLA-A*24、HLA-A*01；HLA-B*35、HLA-B*44、HLA-B*51；DRB1*11、DRB1*13、DRB1*07，在afro-brazialians中的HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*30；HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*44；DRB1*13、DRB1*11、DRB1*03，以及在亚洲人中的HLA-A*24、HLA-A*02、HLA-A*26；HLA-B*40、HLA-B*51、HLA-B*52；DRB1*04、DRB1*15、DRB1*09。还可以使用HLA等位基因的特异性配对。存在于人类群体中的常见等位基因在Bardi等人(Rev Bras Hematol Hemoter.2012；34(1)：25-30)中进一步描述，对于其教导的所有内容通过引用并入本文。HLA信息可以与鉴定的推定的新抗原肽序列一起用于MHC结合的预测算法，如Fritsch等人，2014，Cancer Immunol Res.，2：522-529中更详细描述的，其完整内容通过引用并入本文。

修饰的原代细胞

在特定方面，修饰的细胞是修饰的原代细胞。通常，修饰的原代细胞可以被修饰为使得它们在任何内源基因组靶基因座处被基因组编辑，或能够被基因组编辑。通常，修饰的原代细胞可以被修饰，使得它们可以被基因组编辑，或能够被基因组编辑，以表达任何感兴趣的外源基因。

通常，修饰的原代细胞可以是任何原代细胞。示例性原代细胞包括干细胞、人类干细胞、胚胎干细胞和免疫细胞(例如造血细胞)。免疫细胞的实例包括但不限于，B细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤(NK)细胞。免疫细胞可以是NK细胞。免疫细胞可以是NK-T细胞。免疫细胞可以包括适应性免疫系统和/或固有免疫系统的细胞。干细胞，包括人类干细胞，可以是造血干细胞。

修饰的原代细胞可以是人类原代细胞。修饰的原代细胞可以是肿瘤浸润性原代细胞或工程化原代细胞。修饰的原代细胞可以是原代T细胞。修饰的原代细胞可以是造血干细胞(HSC)。修饰的原代细胞可以是自然杀伤细胞。修饰的原代细胞可以是任何体细胞。

可以从受试者，诸如已知或疑似患有癌症的受试者分离修饰的原代细胞。原代细胞分离方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于基于细胞表面标志物表达的分选技术，诸如FACS分选、阳性分离技术和阴性分离、磁分离及其组合。

修饰的原代细胞可以是培养的原代细胞，诸如离体培养的原代细胞。修饰的原代细胞可以是离体培养的原代细胞，诸如从受试者分离的原代细胞。培养的原代细胞可以用一种或更多种细胞因子培养。

同源修复定向细胞编辑方法

在一个方面，提供了用于遗传修饰细胞的方法。

用于遗传修饰细胞的方法可以包括提供本文描述的任何HR模板，提供本文描述的任何核酸酶组合物，使本文描述的任何细胞(例如，T细胞、原代细胞、HSC或NK细胞)与HR模板和核酸酶组合物接触，并且将HR模板和核酸酶组合物递送到细胞中，特别是通过除了病毒介导的递送以外的递送手段。在使细胞与HR模板和核酸酶组合物接触和递送步骤之间，接触步骤可以少于60分钟、少于45分钟、少于30分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟、或少于5分钟或少于1分钟。递送手段可以包括本文描述的用于递送CRISPR介导的系统的任何所描述的方法，诸如本文描述的用于递送RNP复合体的方法。如以上描述的，可以将多个HR模板和/或核酸酶组合物递送到细胞中，诸如将多个HR模板和/或核酸酶组合物同时递送到细胞中。

不希望受理论束缚，通常(并且如在HR模板纯度的上下文中所讨论的)，在编辑过程期间引入的杂质和污染物可能导致修饰的细胞的编辑效率和/或修饰的细胞的存活力降低。例如，来自培养细胞的残余培养基可能在编辑过程中引入杂质和污染物。因此，用于遗传修饰细胞的方法可以包括为减少或消除残余培养基而采取的步骤。

在说明性实例中，用于遗传修饰人类原代T细胞(例如，从人类受试者分离的T细胞)的方法可以包括提供编码全TCR(TCR-α和TCR-β两者)的HR模板、能够靶向TCR基因座(例如，TCR-α恒定基因座)的CRISPR RNP复合体，以及使用电穿孔将HR模板和RNP复合体递送到T细胞中。

还提供了能够产生修饰的细胞群体，诸如本文描述的任何修饰的细胞群体的方法。

治疗方法

在一个方面，还提供了治疗方法。例如，提供了患有癌症的患者的治疗方法。在另一个实例中，基因可以被纠正(例如，被替代，也称为基因疗法或基因替代疗法)，诸如用功能性基因替代无功能基因(例如，血红蛋白病(hemaglobinopathies)的HSC)。本发明的所述方法包括施用治疗有效量的修饰的细胞，诸如基因组编辑的细胞(例如基因组编辑的T细胞)。修饰的细胞可以被配制成药物组合物。除了一种或更多种修饰的细胞以外，这些组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、运载体(carrier)、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。这样的材料应该是无毒的，并且不应该干扰活性成分的功效。运载体或其他材料的确切性质可以取决于施用途径，例如静脉内。

修饰的细胞可以来源于(例如，分离自)施用治疗的受试者(自体的)。

修饰的细胞可以是相对于施用治疗的受试者同种异体的。如以上描述的，同种异体的修饰的细胞可以是与施用治疗的受试者HLA匹配的。

修饰的细胞可以单独施用，或可以与其他治疗组合施用，根据待治疗的状况，可以同时施用或顺序施用。

核苷酸组合物

本文描述了可用于本发明的基因的多肽和核酸序列，例如基因、载体、外源序列、表达构建体、HR模板。可用于本发明的多肽和核酸序列与本文描述的或本文通过数据库登录号提及的序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。可用于本发明的多肽和核酸序列可以与本文描述的或本文通过数据库登录号提及的序列100％相同。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性百分比”指当比较并针对最大的对应性对齐时，具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列，如使用下文描述的序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或者技术人员可得的其他算法)或通过视觉检查测量的。取决于应用，“同一性”百分比可以存在于被比较的序列的区域内，例如，于功能性结构域内，或者，可选地，存在于被比较的两个序列的全长内。对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如需要则指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的最佳序列比对可以如下进行，例如，通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2∶482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson&Lipman，Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似度检索方法、通过这些算法的计算机化执行(在Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.)或通过视觉检查(通常参见，Ausubel等人)。适合于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST算法，所述BLAST算法在Altschul等人，J.Mol.Biol.215∶403-410(1990)中描述。用于进行BLAST分析的软件为通过美国国家生物技术信息中心(<www.ncbi.nlm.nih.gov/＞)可公开获得的。

在一个方面，提供了用于指导内源基因组靶基因座处的同源重组的核苷酸组合物，诸如本文描述的任何HR模板。

在一个实例中，用于指导内源基因组靶基因座处的同源重组的核苷酸组合物(即，HR模板)包含：a)编码基因的至少一部分的核苷酸序列；b)与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和c)与内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，其中基因的至少一部分的长度是100个碱基，所述核苷酸序列全部都在单一多核苷酸上，与内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进内源基因组靶基因座处的同源重组，并且编码基因的至少一部分的核苷酸序列被取向为使得基因的至少一部分能够在组合物整合到内源基因组靶基因座中之后被表达。核苷酸组合物可以是环状的。

实施例

下文是实施本发明的具体实施方案的实施例。提供以下实施例仅用于说明性目的，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。已努力确保关于使用的数字和序列(例如，量、温度，等)的准确性，但是当然应允许一些实验误差和偏差。

除非另外指示，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的蛋白化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这样的技术在文献中被充分地解释。参见，例如，T.E.Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，currentaddition)；Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编著，Academic Press，Inc.)；Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania：MackPublishing Company，1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)卷A和B(1992)。

实施例1：使用CRISPR编辑T细胞的方法和材料

用于将感兴趣的基因(即，“基因的至少一部分”)掺入内源基因组靶基因座并且对其进行分析的方法和材料描述如下。

T细胞

按照标准Ficoll分离方法从血液分离PBMC(例如，通过清血法收集的leukopak)。按照标准方案将分离的PBMC冷冻成等分试样。作为标准方案的一部分，将冷冻的人类外周血单核细胞(PBMC)解冻并用培养基(TexMACS，3％人类AB血清，含细胞因子)培养，作为标准基因编辑方案的一部分。在该方案的变化形式中，冷冻的PBMC是购买的(AllCells)。第二天，按照制造商的方案，将CD8和CD4阳性T细胞通过使用磁珠(Miltenyi)的阳性选择而富集，作为标准基因编辑方案的一部分。在方案的变化形式中，使用CD3阴性选择或CD62L阳性选择来富集细胞，如下文所示。使用制造商推荐，将富集的细胞用TransAct(CD3/CD28试剂，Miltenyi)以1∶17.5的比例刺激48-72小时，然后电穿孔程序(参见下文)，并且用培养基(TexMACS，3％人类血清，含有各自12.5ng/mL的IL-7和IL-15)培养，并且作为标准基因编辑方案的一部分。

在指示分离患者/供体PBMC的情况下，通过患者清血法收集leukopak细胞。然后将leukopak冷冻，并且随后根据需要解冻，作为标准基因编辑方案的一部分，或者在所述方案的变化形式中，根据指示维持在2-8℃(新鲜)。第二天，将CD8和CD4阳性T细胞通过使用Prodigy平台(Miltenyi)的阳性选择而富集。将富集的细胞如以上培养。

同源重组(HR)模板

Nanoplasmids^TM(Nature Technology)如所标注地使用(表示为“NTC”的HR模板)。Nanoplasmid^TM是Nature Technology Corp的商标。不含抗生素的RNA-OUT选择载体和细胞系分别被世界专利申请WO2008153733和同等的美国、欧洲和澳大利亚专利：US 2010/0303859；EP2333091；和AU 2008262478涵盖，对于其教导的所有内容在此通过引用以其整体并入。根据专利合作条约，Nanoplasmid^TM载体和细胞系另外被以下世界专利涵盖：PCT/US13/000259；PCT/US 13/00067；和PCT/US 13/00068，对于其教导的所有内容在此通过引用以其整体并入。

含有卡那霉素(Kan)抗生素抗性标记和来源于pUC57载体的PBR322复制起点的标准质粒也如所标注地使用(表示为“pUCu”的HR模板)。去除了除了抗生素抗性标记和复制起点以外的外来序列。

在指示的情况下，纯化的HR模板是购买的(Nature Technology)或按照制造商的方案(Maxi kit，Macherey Nagel)使用标准DNA纯化技术“内部”纯化的。

使用的HR模板在表4中描述。除非另外提到，否则所提供的序列包括具有同源臂、基因盒和质粒骨架的完整的HR模板。

表4：同源修复模板序列

核糖核蛋白(RNP)复合体

使用CRISPR spCas9作为核酸酶(Aldevron，sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease)产生RNP复合体。化学合成(Synthego)sgRNA，并且在电穿孔缓冲液中将其从600μM的储备液浓度稀释到120μM的工作浓度。将sgRNA与Cas9蛋白以1∶6Cas9：sgRNA摩尔比复合，并且在室温孵育至少10分钟，并且然后保持冷藏(4℃或冰上)直至使用。

通过将针对感兴趣的靶位点(即内源基因组靶内的指定的核苷酸序列)的gRNA序列整合到在同一核苷酸上包含crRNA和tracrRNA序列两者的sgRNA核苷酸框架中来设计sgRNA。本文使用的sgRNA在下文呈现，其中“(ps)”指示硫代磷酸酯键，并且“m”指示2′O-甲基碱基。

TRAC-l sgRNA(SEQ ID NO：19)：

TRBC-2sgRNA(SEQ ID NO：20)：

电穿孔/核转染

描述用于T细胞基因编辑的电穿孔条件的一般方案概述如下：

注意：可以使用100μL核转染比色皿(目录号V4XP-3012或V4XP-3024)替代20μL比色皿，在这种情况下，细胞数目、转染试剂的量和铺板体积都必须按比例增加。也可以使用替代的电穿孔装置(相应地替代缓冲液和体积)。

程序：

1.通过向48孔板的每个孔中加入1mL T细胞培养基(TexMACS，3％人类血清，含有12.5ng/mL的IL-7和IL-15的每一种)制备样品板(足够的孔用于每个样品和对照[例如模拟和GFP]，加1个仅培养基，再加～10％的额外量)。注意：在方案的变化形式中，细胞用含有IL-2替代IL-7和IL-15的培养基培养，如下文所示。

2.彻底混合后，将1mL培养基等分到孔中。将板放置于37℃的培养箱中。

3.向nucleofector溶液中加入nucleofector补充剂(4.5∶1)。

4.如描述的，在200μL的排管中组装RNP复合体。包括模拟(仅核转染缓冲液)和核转染对照(例如0.5μg GFP质粒)。

5.向每支管中加入适量的HR DNA(通常为0.2-0.4μg/μL)。

6.取出小体积细胞(例如，20μL用于细胞计(cellometer))进行计数，并且将剩余细胞转移到合适的锥形小瓶中，使细胞旋降(spin down)。

7.将细胞在RT以90×g沉淀10分钟。

8.对细胞计数。

9.从沉淀的细胞中去除上清液。

10.将细胞重悬于足够的nucleofector缓冲液中，使得考虑到细胞沉淀物的体积(10M细胞，～15μL)，每个20μL的nucleocuvette将具有50万个和100万个之间的细胞。

11.将细胞分配到含有样品的200μL排管中。培养细胞0-45分钟，通常少于10分钟。

12.将核转染反应物转移到nucleocuvette中。

13.将盖子按到位。

14.从培养箱中取出含有预热培养基的板。

15.对4D单元进行编程以使用EO-115程序，并且将容器以正确的取向(A1顶部有较大的切口)放置入4D-X，并且然后按开始。

16.缓慢地将～100μL温热的细胞培养液从板的相应孔转移到nucleocuvette的孔中(100μL比色皿为500)。

17.将来自每个nucleocuvette中的所有～120μL转移到板上的相应孔中。

18.将细胞培养5-11天(即第7-14天收获)，然后进行随后分析，例如转基因表达、基因组靶向或功能分析(例如，T细胞杀伤或细胞因子产生)。(注意：通常在少于24小时内观察到敲除表型，通常在24-48小时内观察到敲除表型，72小时后表型稳定)。

流式细胞术分析

通过流式细胞术评估细胞中感兴趣基因的表达。对于ZsGreen构建体，评估ZsGreen构建体(GFP)的荧光。对于TCR表达，使用TCR特异性抗体(抗人类TCRα/β抗体克隆IP26 Brilliant Violet 510，Biolegend)对细胞进行染色。对于CD3表达，使用CD3特异性抗体(克隆SK7，Biolegend)对细胞进行染色。对于NK细胞研究，使用CD5(克隆UCHT2，Biolegend)和CD56(克隆5.1H11，Biolegend)。

除非另外提到，通过FSC/SSC、单峰、活细胞(近IR染色)对T细胞进行门控，然后进行特异性门控(例如CD8、dextramer等)。

在指示的情况下，荧光团-MHC三聚体右旋糖酐复合体(也称为“dextramer”)被用于鉴定抗原特异性TCR识别，并且在Bethune等人(BioTechniques 62：123-130Mar.2017)和Bethune等人(eLife 5：2016)中更详细描述，各自对于其教导的所有内容通过引用并入本文。通过使用荧光标记的链霉抗生物素蛋白(Life Technologies，Carlsbad，CA)制备dextramer。用于抗原特异性TCR识别的肽是：ELAGIGILTV(Mart-1F5，SEQ ID NO：5)；YLTHRVDVI(Neo12，SEQ ID NO：6)；SLLMWITQV(NY-ESO 1G4，SEQ ID NO：7)。

慢病毒产生和转导

将NY-ESO(1G4)和MART-1(F5)TCR构建体以TCRa-F2A-TCRb-P2A-Myc271的格式亚克隆到基于pCCLc-MND的慢病毒载体(添加基因#81071)中。Myc271是一种嵌合转导标志物，包含与胞外cMyc表位标签融合的CD271(LNGFR)的跨膜结构域和截短的胞外结构域。通过基于慢病毒的载体及其包装载体(pMD2.G)的瞬时转染，在HEK-293T细胞中产生编码NY-ESO(1G4)和MART-1的慢病毒。转染后48小时，收集病毒，通过0.45μm注射器过滤器过滤，并且用于感染。

如以上描述的，从健康供体的PBMC分离人类CD3+T细胞，刺激24小时，并且然后在细胞因子存在下生长。48小时后，将细胞以每孔2×10^6个细胞接种在250μL具有聚凝胺的培养基中，向其中加入500μL培养基(模拟条件)或特定病毒上清液(pCCLc-MND-F5TCR-Myc271或pCCLc-MND-1G4TCR-Myc271)。将CD3+T细胞在病毒存在下在30℃以800g离心90min，缓慢加速且无制动。离心后，取出500μL培养基，并且加入500μL新鲜培养基或500μL病毒。4天后，测定人类T细胞的TCR表面表达。为了测试表面表达，冲洗细胞并用在FACS缓冲液中的荧光抗体和pHLA多聚体染色，并且通过流式细胞术分析。

存活力分析

使用Nucleocounter NC-200(Chemometic)测量细胞计数和存活力。该仪器利用具有内置移液管以吸取样品体积的盒Via-2，并且用固定在盒内的荧光染料吖啶橙(AO)和4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在样品穿过在盒的读取窗口之前的流体通道时对样品染色，荧光染料吖啶橙(AO)和4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)分别对总细胞群体和死细胞群体染色。在盒被装载到仪器中后，使用为PBMC样品设计的方案，并且报告以细胞/mL计的总细胞计数(从已经接受AO染色的细胞的计数中得出)，并且根据存活力百分比计算活细胞群体(细胞/mL)，存活力百分比是从DAPI标志物阳性的群体的分数中推断出来的。

在存活力测定方案的变化形式中，存活力使用吖啶橙/碘化丙啶(AOPI)和细胞计(Nexcelom)进行评估，如下文所示。

基因组靶向分析

使用内-外PCR技术，通过两对引物(靶向上游衔接点的引物对和下游衔接点引物对)来确认感兴趣的基因在TCRα基因座的精确基因组整合。在工程化T细胞的内-外PCR后检测到具有正确质量的两个扩增序列，确认了整合的neoTCR序列盒在TCRα基因组基因座中的正确插入。

用于内-外PCR技术的引物是

上游正向：TGCTAATCCTCCGGCAAACC(SEQ ID NO：1)

上游反向：TTCTTCAACATCGCCAGCCT(SEQ ID NO：2)

下游正向：CAGCCATCTGTTGTTTGCCC(SEQ ID NO：3)

下游反向：AGCTTTCTGGCGTCCTTAGAAT(SEQ ID NO：4)

从工程化T细胞分离基因组DNA，并且使用标准PCR技术来扩增感兴趣的基因组区域，并且通过凝胶电泳分析PCR产物。

用于功能分析的T细胞/靶细胞共培养

将工程化T细胞(100，000个)与用不同浓度的特定肽(0.01-1000nM的10倍系列稀释)脉冲的表达HLA-A2的靶细胞(25，000个)(效应物与靶比例为4∶1)共培养。在方案的变化形式中，将T细胞(50，000个)与表达HLA-A2的靶细胞(25，000个)以效应物与靶比例为2∶1共培养，如下文所示。将冻干肽(Bio-Synthesis Inc，GenScript)在DMSO中重构至10mM，并且然后在DMSO中进一步稀释至1mM的工作储备液。接下来，使用1mM的起始溶液进行肽的10倍系列稀释(在9μL DMSO中的1μL 1mM工作储备液)，直至达到0.01nM。将靶A2-K562细胞(每肽浓度1M总细胞，1×10⁶个细胞/mL)在15mL锥形管中用1μL系列肽稀释液脉冲，并且在37℃孵育1小时。孵育后，向每个管中加入9mL培养基，并且然后以1000rpm离心5min。将细胞沉淀物用10mL培养基洗涤一次，并且然后重悬于4mL培养基中进行共孵育实验。“无肽”或“0肽”条件没有使用肽。

如指示的，组成型表达匹配和不匹配肽-HLA(pHLA)的靶细胞也用作对照来评估特异性。将K562靶细胞用慢病毒载体转导，所述慢病毒载体编码含有Neo12、MART1或NYESO1肽的HLA肽分子，ZsGreen作为K562细胞的转导标志物。表达的HLA(MHC)肽分子包括单一多肽链，该多肽链具有通过柔性GS接头和二硫键捕获修饰的抗原肽、β2-微球蛋白和HLA-A2结构域的线性组成，如在Bethune等人(eLife 5：2016)中更详细描述的，对于其教导的所有内容通过引用并入本文。

T细胞毒性分析

在共培养T细胞和靶细胞48小时后，使用活/死细胞染色试剂盒(用于流式的活/死近IR存活力染色，目录号NC0584313，ThermoFisher)在黑暗中在4℃将细胞染色20分钟。在具有膜受损的细胞中，染料与细胞内部和细胞表面上两者的游离胺反应，产生强烈的荧光染色。在存活细胞中，染料的反应性仅限于细胞表面的胺，导致较少的荧光强度。活细胞和死细胞之间的强度差异通常大于50倍，允许容易区分。孵育后，将细胞洗涤，用eBioscienceIC固定缓冲液(ThermoFisher，目录号00-8222-49)固定，并且通过流式细胞术分析。

增殖分析

将工程化T细胞用细胞增殖染料e450(ThermoFisher，目录号65-0842-90)预先标记，然后共培养。这种荧光染料与任何含有伯胺的细胞蛋白结合，并且当细胞分裂时，染料在子细胞之间均匀分布，这可以通过染料荧光强度的连续减半来测量。如关于T细胞细胞毒性测定的描述进行共培养测定。在共培养T细胞和靶细胞72小时后，将细胞用eBioscienceIC固定缓冲液(ThermoFisher，目录号00-8222-49)固定，并且通过流式细胞术分析。

细胞因子产生分析

使用细胞因子珠测定(CBA，来自BD BioSciences的BEAD-BASED IMMUNOASSAY)评估共培养的上清液中的细胞因子产生。CBA是一种基于流式细胞术的多重珠免疫测定应用，其通过使用抗体包被的珠有效捕获分析物，允许同时定量多种蛋白。在共培养T细胞和靶细胞24小时后，收集上清液并分析IFNγ、IL-2和TNFα分泌。

实施例2：TCRα基因座中的报告物整合

将ZsGreen报告物构建体整合到TCRα基因座中。图1示出了表示使用的一般编辑策略的示意图。简言之，一般TCRα基因座靶向策略使用编码在环状纳米质粒(参见SEQ ID NO：8)中的同源修复模板，该同源修复模板含有无启动子的ZsGreen和截短的LNGRF编码序列，该无启动子的ZsGreen和截短的LNGRF编码序列侧接1kb左和右同源臂(“HR臂”)并且被P2A序列分开，并且5’P2A序列将ZsGreen和LNGRF盒与TCRα基因座序列分开。图2示出了ZsGreen整合的一般编辑时间线。简言之，如以上描述的，将PBMC解冻，并且使用CD3阴性选择分离人类原代T细胞，并且用抗CD3/抗CD28刺激。如以上描述的，使用靶向内源TCRα基因座(也称为TRAC基因座)的sgRNA形成核糖核蛋白(RNP)复合体。在这里，sgRNA掺入了TRAC gRNA靶向序列GAGAATCAAAATCGGTGAAT (SEQ ID NO：21)。如以上描述的，将HR模板、RNP复合体和T细胞混合并且电穿孔。电穿孔后，用含有IL-2(20ng/mL)的培养基培养细胞。

由于ZsGreen报告物没有启动子，仅精确的框内融合才能产生可检测到的信号。此外，TCRα基因座的正确靶向应该导致伴随的TCRα敲除和表面表达的TCR复合体的损失。实际上，如图3中所示，当包括HR模板和RNP两者时，检测到高百分比(大于22％)的ZsGreen阳性/TCR阴性细胞(图3右图“KO-KI”)。值得注意的是，所有的ZsGreen阳性同时是TCR阴性，表明ZsGreen报告物正确整合到TCRα基因座中。作为对照，RNP的不存在未导致ZsGreen阳性细胞或TCR阴性细胞高于被认为是背景的水平(图3左图)。在多种测试条件下的编辑效率在表5中定量。

表5：使用ZsGreen报告物对T细胞的编辑效率

	TCR+GFP-	TCR+GFP+	TCR-GFP-	TCR-GFP+
					HRDNA+RNP	2.61	0.094	75	22.4
仅HR DNA	96.8	0.071	3.16	0.021
					模拟	98.4	0.00948	1.6	0.00118
仅RNP	18.4	0.023	81.6	0.065
					1μg DNA模板ZsGreen	73	25.6	1.8	0.36

实施例3：在TCRα基因座中的新抗原特异性TCR整合策略

将新抗原特异性TCR构建体(neoTCR)整合到TCRα基因座中。图4示出了表示使用的一般靶向策略的示意图。简言之，一般TCRα基因座靶向策略使用同源修复模板，该同源修复模板含有侧接1kb左和右HR臂的neoTCR编码序列。此外，内源TCRβ基因座被破坏，导致仅表达由neoTCR构建体编码的TCR序列。使用为纳米质粒或pUCu质粒的环状HR模板来应用一般策略。

新抗原特异性TCR构建体设计在图5中图解。靶TCRa基因座(“TRAC(Cα)”)与质粒HR模板一起示出，并且显示了产生的经编辑的序列和下游的mRNA/蛋白产物。显示了靶TCRα基因座(内源TRAC)及其CRISPR Cas9靶位点(横条纹，裂解位点由箭头指示)(图5A，上图)。显示了环状质粒HR模板与编码neoTCR的多核苷酸，其位于左和右同源臂(分别为“LHA”和“RHA”)之间(图5A，下图)。显示了由密码子优化的HR模板引入的TRAC区域(竖条纹)。TCRβ恒定区来源于TRBC2，其被指示为在功能上等同于TRBC1。neoTCR盒中的其他元件包括：2A＝P2A核糖体跳跃元件；F＝在2A上游的弗林蛋白酶裂解位点，其从上游TCRβ蛋白中去除了2A标签；HGH＝人类生长激素信号序列。neoTCR表达基因盒的HR模板包括两个侧翼同源臂，以指导向由CRISPR Cas9核酸酶RNP与TCRα指导RNA靶向的TCRα基因组基因座中的插入。这些同源臂(LHA和RHA)位于neoTCR表达基因盒的neoE特异性TCR序列的侧翼。

在整合到基因组中后(图5B，上图)，neoTCR表达基因盒由内源TCRα启动子转录为单一信使RNA，其仍包含来自该个体T细胞的内源TCRα多肽的一部分(图5B，中图)。在这种单一neoTCR信使RNA的核糖体多肽翻译期间，PACT neoTCR序列通过在来源于1型猪捷申病毒(teschovirus)的P2A核糖体跳跃序列处的自裂解而与内源的CRISPR破坏的TCRα多肽解链(图5B，下图)。编码的neoTCRα多肽和neoTCRβ多肽也通过包含在neoTCR表达基因盒中的内源细胞人类弗林蛋白酶和第二自裂解P2A序列基序的裂解而彼此解链(图5B，下图)。neoTCRα多肽和neoTCRβ多肽被信号前导序列(来源于人类生长激素，HGH)单独靶向至内质网，用于多聚体组装和neoTCR蛋白复合体至T细胞表面的运输。包含弗林蛋白酶裂解位点有助于从上游TCRβ链去除2A序列，以减少对TCRβ功能的潜在干扰。在每个2A前包含gly-ser-gly接头(未示出)进一步增强了三种多肽的分开。

另外，三个重复的蛋白序列在HR模板中是密码子趋异的，以促进基因组的稳定性。在TCR基因盒中，两个P2A相对于彼此，以及两个HGH信号序列相对于彼此是密码子趋异的，以促进在离体工程化T细胞的基因组中引入的neoTCR盒序列的稳定性。类似地，TRAC外显子1(竖条纹)的重新引入的5’末端通过去除两个定向重复序列(direct repeats)的间插序列降低了整个盒随时间丢失的可能性。

图6示出了用于编辑插入neoTCR构建体的T细胞的一般编辑时间线。简言之，如以上描述的，按照标准编辑程序培养人类原代T细胞(新鲜或冷冻的)。如以上描述的，形成了使用靶向内源TCRα基因座(也称为TRAC基因座)的sgRNA的核糖核蛋白(RNP)复合体，其中TRAC gRNA靶向序列GAGAATCAAAATCGGTGAAT(SEQ ID NO：21)。此外，如以上描述的，形成了使用靶向内源TCRβ基因座(也称为TRBC基因座)的sgRNA的RNP复合体，其中TRBC gRNA靶向序列GGCTCTCGGAGAATGACGAG(SEQ ID NO：22)。如以上描述的，将HR模板、RNP复合体和T细胞混合并且电穿孔。如以上描述的，然后在细胞因子存在下培养电穿孔的T细胞(即修饰的细胞)。

实施例4：NeoTCR整合(MART-1)

将MART-1neoTCR整合到TCRα基因座中。按照标准电穿孔介导的编辑程序对T细胞进行编辑并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA(SEQ ID NO：9)编码的MART-1neoTCR构建体。

使用内-外PCR技术，通过两对引物(靶向上游衔接点的引物对和下游衔接点引物对)来确认neoTCR构建体在TCRα基因座的精确基因组整合(图7上图中示出的示意图)。在工程化T细胞的内-外PCR后，使用对具有正确质量的两个PCR扩增序列的检测确认了整合的neoTCR序列盒在TCRα基因组基因座中的正确插入。如图7中示出，对于用单独的质粒DNA HR模板处理且无核酸酶的细胞(“仅DNA”)，没有观察到整合。对于用单独的TCRα核酸酶(“KOKI”)或用TCRα加TCRβ核酸酶一起(“KOKI KO”)工程化的细胞，观察到上游(图7左图)和下游(图7右图)衔接点二者的扩增产物。因此，结果表明，在适当的情况下，neoTCR构建体被正确整合，并且内源TCRβ被破坏。

通过流式细胞术评估工程化T细胞的MART-1neoTCR的表达。如图8A中示出的，通过MART-1特异性dextramer染色在小(20μL，图8A左下图)和大(100μL，图8A右下图)编辑规格中检测MART-1neoTCR的表达。当仅使用HR模板没有RNP时(图8A左上图)或当仅使用RNP没有HR模板时(图8A右上图)，仅检测到背景水平的信号。在编辑程序后的不同时间点，可以观察到类似的结果。编辑程序后第4天的基因编辑结果在下表6中定量。编辑程序后第7天的基因编辑结果在下表7中定量。编辑程序后第10天的基因编辑结果在图8B中示出，当提供HR模板和RNP复合体两者时，具有整合的neoTCR(条纹的)。因此，结果表明，当提供HR模板和RNP复合体两者时，neoTCR构建体在整合到TCRα基因座中之后被正确表达。

表6：TCR编辑第4天

	TCR+Dex-	TCR+Dex+	TCR-Dex+	TCR-Dex-
					20ul HR+RNP	10.3	8.5	0.14	81.2
100ul HR+RNP	12.1	11.6	0.45	76.1
					仅RNP*
20ul HR	99	0.23	0	0.77
					模拟	98.7	0,29	0	1.06

*从分析中省略

表7：TCR编辑第7天

	TCR+Dex-	TCR+Dex+	TCR- Dex+	TCR-Dex-
					20ul HR+RNP	8.4	17,4	0.4	73.8
100ul HR+RNP	26.8	28	0.61	44.6
					仅RNP	20.7	0.067	0.22	79
20ul HR	98.2	0.78	0.00154	0.97
					模拟	98.6	0.37	0.00297	1.07

评估工程化T细胞的抗原特异性细胞因子产生。如图9中示出的，当与组成型表达MART-1关联抗原肽的HLA-A02靶细胞(K562)(图9，“K562HLA-A02/MART1”)或用MART-1关联抗原肽脉冲的HLA-A02靶细胞(K562)(图9，“K562 HLA-A02(10μM MART1)”)共孵育时(E∶T比例2∶1)，表达MART-1neoTCR的工程化T细胞产生IFNγ和IL-2两者。当与未用关联肽脉冲的HLA-A02靶细胞共孵育时(图9，“K562 HLA-A02”)或当与表达非关联MHC HLA-A01的靶细胞共孵育时(图9，分别为“K562 HLA-A01(10μM MART1)”和“K562 HLA-A01”)，没有观察到有意义水平的细胞因子产生。因此，表达MART-1neoTCR的工程化T细胞显示了抗原特异性细胞因子的产生。

评估工程化T细胞的抗原特异性增殖和抗原特异性T细胞介导的杀伤。如图10A中示出的，当与使用小(图10A，“MART-1”)或大(图10A，“MART-1(大)”)编辑规格工程化的表达MART-1neoTCR的T细胞共孵育时(E：T比例2∶1)，表达肽特异性pHLA的转导的K562靶细胞显示出很少或没有增殖。相比之下，靶细胞当单独孵育(图10A，“单独的靶细胞”)或与经历模拟编辑程序但未被工程化为表达neoTCR(即，在没有HR模板或RNP的情况下电穿孔)的T细胞共孵育(图10A，“模拟”)时生长。如图10B中示出的，当与使用小(图10B，“MART-1”)或大(图10B，“MART-1(大)”)编辑规格工程化的表达MART-1neoTCR的T细胞共孵育时(E∶T比例2∶1)，靶细胞被杀伤。相比之下，当单独孵育(图10B，“单独的靶细胞”)或与经历模拟编辑程序但未被工程化为表达neoTCR的T细胞共孵育(图10B，“模拟”)时观察到靶细胞的最小死亡。因此，表达MART-1neoTCR的工程化T细胞显示了对靶细胞的抗原特异性杀伤。

实施例5：通过电穿孔和转导的编辑效率的比较

按照标准电穿孔介导的HR编辑程序或慢病毒转导程序，将T细胞工程化为在TCRα基因座处表达neoTCR。对于电穿孔介导的编辑，使用由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA(SEQ ID NO：9)编码的MART-1neoTCR构建体。如图11中示出的，表达MART-1或NY-ESO neoTCR的工程化T细胞是使用慢病毒转导程序产生的(图11，上图)，并且表达MART-1neoTCR的工程化T细胞是使用小规格或大规格使用电穿孔介导的HR编辑产生的(图11，下图)。因此，电穿孔介导的HR编辑产生了相当于或大于慢病毒转导的工程化T细胞的百分比。

评估工程化T细胞的抗原特异性T细胞介导的杀伤。如图12中示出的，当与使用HR介导的编辑(图12，“MART1 TCR HR”)或慢病毒转导(图12，“MART1 TCR lenti”)工程化的表达MART-1neoTCR(F5)的T细胞共孵育时(E：T比例2∶1)，组成型表达MART-1TCR(F5)关联抗原MART-1肽(图12，每组中的下柱)或用MART-1TCR(F5)关联抗原MART-1肽脉冲(图12，每组中从下部数第二柱)的HLA-A02靶细胞被相当地杀伤。相比之下，当与表达非关联NY-ESO TCR的T细胞(图12，“NY-ESO TCR lenti”)共孵育时或与经历模拟编辑程序但未被工程化为表达neoTCR的T细胞(图12，“模拟”)共孵育时，观察到靶细胞的最小死亡。另外，当与未用关联肽脉冲的HLA-A02靶细胞共孵育时(图12，每组中的中间柱)，或当与表达非关联MHC HLA-A01的靶细胞共孵育时(图12，每组中的前两柱，距离上部第二个用10μM MART1脉冲)，没有观察到高于背景水平的杀伤。定量数据在下表8中示出。因此，按照标准电穿孔介导的HR编辑程序或慢病毒转导程序，工程化为表达neoTCR的T细胞显示出相当的杀伤。

表8：通过电穿孔或转导进行编辑后的细胞毒性杀伤

实施例6：使用环状或线性HR模板的编辑效率的比较

测试了使用纯化的环状质粒DNA和由PCR产生的线性dsDNA作为HR模板的相对HR介导的编辑效率。标准PCR产物(图13A上图)以及使用具有核酸酶保护的5’末端(5’末端硫代磷酸酯骨架连接)的引物产生的PCR产物用于产生标准线性dsDNA和“半保护的”线性dsDNA(图13A下图)。将Neo12neoTCR整合到TCRα基因座中。对T细胞进行编辑，其按照标准电穿孔介导的编辑程序进行并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)或线性HR模板Linear_TRAC(1k)P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：12)编码的Neo12 neoTCR构建体。编辑效率通过表达neoTCR (Neo12)的T细胞的百分比评估，如通过Neo12特异性dextramer染色确定的。与线性HR模板(分别为14.3％和14.4％，图13B中柱和右柱)相比，质粒DNA的使用产生了显著更高水平的编辑(47.3％，图13B左柱)，甚至当在一个浓度范围内进行测试时也如此(此处所示的相等质量)。在分开的测试中，测试了线性共价闭合的DNA(dbDNA，Touchlight)，并且展示了与线性开放末端的PCR产物相似的图谱(数据未示出)。因此，这些结果支持了这样的结论：携带与线性HR模板相同的HR靶向序列的环状质粒DNA HR模板支持了相对于线性PCR生成的DNA高～3倍的编辑效率。

实施例7：由不同来源产生的环状HR模板的比较

在标准电穿孔介导的编辑程序中，使用由不同来源产生的环状HR模板来测试存活力。将Neo12 neoTCR整合到TCRα基因座中。通过插入由环状HR模板pUCu-Kan TRAC(1k)_P2A.Neo12.TRBC2opt.f-P2A.TRA(Va)(SEQ ID NO：14)编码的Neo12 neoTCR构建体对T细胞进行编辑，pUCu-Kan TRAC(1k)_P2A.Neo12.TRBC2opt.f-P2A.TRA(Va)(SEQ ID NO：14)以纯化的形式购买(图14“pUC57”，Nature Technology)或用DNA纯化试剂盒内部纯化(图14“内部pUC57”，Maxi kit Macherey Nagel)。如图14中示出的，T细胞通过细胞计数(图14左图)和通过存活力测定(AOPI，图14右图)评估是存活的，其中内部纯化的HR模板实现大于60％的存活力，而购买的HR模板实现大于80％的存活力。

值得注意的是，这些结果与最近发表的报告不一致(Roth，等人[Nature.2018Jul；559(7714)：405-409])，该报告描述了在电穿孔介导的编辑中使用环状质粒HR模板与线性产物相比导致T细胞存活力降低。

实施例8：NeoTCR整合(Neo12)

将Neo12 neoTCR整合到TCRα基因座中。对T细胞进行编辑，其按照标准电穿孔介导的编辑程序进行并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12neoTCR构建体。通过流式细胞术评估工程化T细胞的Neo 12neoTCR的表达。通过Neo12特异性dextramer染色检测Neo12neoTCR的表达。值得注意的是，使用的Neo12构建体被修饰为使得其不被泛TCR抗体结合。如图15中示出的，36.5％的T细胞表达Neo12 neoTCR，并且不表达内源TCR(图15右图)。另外，绝大多数T细胞(96％)的内源TCR的表达被破坏。当T细胞进行模拟编辑程序时，仅检测到背景水平的neoTCR表达信号(图15左图)。

还进行了插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12 neoTCR构建体的另外的编辑实验。工程化的T细胞如以上描述进行评估。如图16中示出的，74.5％的T细胞表达Neo12 neoTCR，并且不表达内源TCR(图16右图)。另外，绝大多数T细胞(98.6％)的内源TCR的表达被破坏。当T细胞进行模拟处理时，仅检测到背景水平的neoTCR表达信号(图16左图)。

实施例9：多种NeoTCR的NeoTCR整合

将多种neoTCR整合到TCRα基因座中。对T细胞进行编辑，其按照标准电穿孔介导的编辑程序进行并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：10)编码的MART-1neoTCR (F5)构建体、由NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12 neoTCR(Neo12)构建体、或由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA(SEQID NO：11)编码的NY-ESO neoTCR(1G4)构建体。通过neoTCR特异性dextramer染色通过流式细胞术对工程化的T细胞评估其各自ne0TCR的表达。这里使用的neoTCR构建体被修饰为使得其不被泛TCR抗体结合。如图17中示出的，39.6％、36.5％和28.5％的T细胞分别表达neoTCR MART-1(F5)、Ne012和NY-ESO(1G4)，而不表达内源TCR(图17分别为左图、中图和右图)。另外，绝大多数T细胞(分别为97.9％、96％和86.6％)的内源TCR的表达被破坏。因此，使用不同neoTCR的T细胞工程化通常产生相似的编辑效率，支持使用本文描述的T细胞编辑方法在不同的TCR表达构建体中编辑效率是可重复的这一结论。

实施例10：患者来源的T细胞中的NeoTCR整合

将多种neoTCR整合到健康或患者(通常使用黑素瘤、结肠直肠癌和肺癌，来自Bio-options和Conversant Bio)来源的T细胞的TCRα基因座中。对T细胞进行编辑，其按照标准电穿孔介导的编辑程序进行并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：10)编码的MART-1neoTCR构建体、由NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12 neoTCR构建体、或由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA(SEQ ID NO：11)编码的NY-ESO neoTCR构建体。通过neoTCR特异性dextramer染色通过流式细胞术对工程化的T细胞评估其各自neoTCR的表达。

如图18A中示出的，对于Neo12构建体和MART-1构建体，来自健康样品或患者样品的T细胞以相似的效率进行编辑。此外，编辑效率在多种测试的neoTCR构建体中相似，以及证明了样品之间可重复的编辑效率。如图18B中示出的，来自健康样品的T细胞以接近75％的效率编辑，插入Neo12neoTCR。

对Neo12 neoTCR进行另外的测试，并且编辑效率结果在表9中示出。具体地，对于患者1来源的T细胞的两个重复样品观察到相似的编辑效率(对于重复#1为36.2％，并且对于重复#2为36.4％)，进一步证明了本文描述的T细胞编辑方法的可重复性。因此，结果证明本文描述的T细胞编辑方法既可广泛应用于多种表达构建体，又在临床环境中可重复。

表9：供体来源细胞的Neo12编辑效率

	模拟1	模拟2	健康1	健康2	患者1#1	患者1#2	患者2
								仅WT％	93.2	93.5	1.6	17.6	6.6	8.4	14.4
WT+Neo12％	0.7	0.4	0.6	0.6	0.7	1.3	1
								无TCR％	6.1	6.1	58.6	63.8	56.5	53.9	60.2
仅Neo12％	0	0	39.2	17.2	36.2	36.4	24.4

模拟＝经历模拟编辑程序

实施例11：CD4和CD8 T细胞中的NeoTCR整合

评估CD4和CD8 T细胞的编辑效率。将Neo12 neoTCR整合到TCRα基因座中。对T细胞进行编辑，其按照标准电穿孔介导的编辑程序进行并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBoptf-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12 neoTCR构建体。值得注意的是，这里使用的Neo12构建体被修饰为使得其不被泛TCR抗体结合。CD8 T细胞的编辑通过Neo12neoTCR的表达评估(Neo12特异性dextramer染色)。Dextramer染色对于检测CD4 T细胞上的neoTCR分子是不够灵敏的，这可能是由于肽被呈递在MHCI类分子上，并且CD8不存在，不能稳定MHC-1/TCR相互作用。因此，CD4T细胞的编辑通过检测不结合泛TCR抗体的CD3复合体评估。如图19中示出的，CD8和CD4 T细胞两者以相似的效率被编辑。因此，结果证明本文描述的T细胞编辑方法可广泛应用于不同的T细胞群体。

实施例12：NeoTCR表达水平

检测多种neoTCR整合到TCRα基因座中后的表面表达水平。对T细胞进行编辑，其按照标准电穿孔介导的编辑程序进行并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：10)HR模板编码的MART-1neoTCR构建体、由NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12 neoTCR构建体、或由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA(SEQ ID NO：11)编码的NY-ESO neoTCR构建体。通过用抗CD3染色，通过流式细胞术评估多种neoTCR和内源TCR的表面表达。

如图20中示出的，整合的neoTCR的表面表达与内源TCR表面表达水平相当。用相同的抗体(CD3)染色的内源TCR(图20A，左直方图)和Ne_o12neoTCR TCR(图20A，右直方图)的平均荧光强度(MFI)流式细胞术图大部分重叠。在图20B中定量了所有三种测试的neoTCR的MFI计算，每一种都显示了与内源TCR水平相当的表面表达。因此，结果证明本文描述的T细胞编辑方法导致插入的表达盒编码的全TCR(即TCRα和TCRβ两者)的表面表达水平与内源表达水平相当。

实施例13：大规格非冷冻T细胞中的Ne0TCR整合

使用Prodigy平台在leukopak细胞和T细胞中收集新鲜分离的PBMC(即未冷冻的)。通过插入由环状HR模板pUCu-KanTRAC(1k)-P2A.Neo12.TRBC2opt.f-P2A.TRA(Va)(SEQ IDNO：14)编码的Neo12 neoTCR构建体对T细胞进行编辑。通过Neo12特异性dextramer染色检测Neo12 neoTCR的表达。

如图21中示出的，41.6％的CD8阳性T细胞表达Neo12构建体。因此，结果证明本文描述的T细胞编辑方法可应用于临床环境。

实施例14：经编辑的T细胞是有功能的

评估经编辑的T细胞的T细胞功能。更具体地，使用用肽脉冲(如图22所示)或者被工程化为表达以HLA复合体预先形成的肽(pHLA，如图23所示)的靶细胞(表达HLA-A02的K562细胞)评估T细胞的细胞因子产生/分泌、T细胞增殖和抗原特异性靶细胞杀伤。

对T细胞进行编辑，其按照标准电穿孔介导的编辑程序进行并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS-P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：10)编码的MART-1neoTCR构建体、由NTC9385R-TRAC(1k)DTS-P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12 neoTCR构建体、或由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA(SEQ ID NO：11)编码的NY-ESO neoTCR构建体。

如描述的，评估工程化的T细胞的抗原特异性T细胞介导的杀伤。如图24中示出的，当靶细胞用它们各自的关联肽以肽浓度依赖的方式脉冲(图24，0-1000ng/ml)或被工程化为表达肽/HLA复合体(图24，pHLA)时，当靶细胞与T细胞共孵育时(E∶T比例4∶1)，靶细胞被杀伤。值得注意的是，被工程化为表达肽/HLA复合体的靶细胞与肽脉冲细胞相比显示出几乎完全的杀伤，这可能是由于由HLA递呈的脉冲肽的瞬时性质，这表明更多的生理学相关背景(例如，抗原肽的非瞬时递呈)可以导致高水平的杀伤。此外，还使用表达肽/HLA复合体的工程化的靶细胞与表达Neo12的T细胞共孵育(E∶T比例4∶1，数据未示出)，使用膜联蛋白V细胞死亡测定证明T细胞的抗原特异性杀伤。因此，工程化T细胞显示了对靶细胞的抗原特异性杀伤。

如描述的，评估工程化T细胞的抗原特异性T细胞增殖。如图25中示出的，当与用Neo12关联肽以肽浓度依赖的方式脉冲(图25A和图25B，0-1000ng/ml)或被工程化为表达肽/HLA复合体(图25B，pHLA)的靶细胞共孵育时(E∶T比例2∶1)，表达Neo12的T细胞增殖。图25A示出了显示增殖的代表性直方图，而分裂细胞百分比在图25B中计算。因此，当与递呈关联肽的靶细胞共孵育时，工程化T细胞显示出抗原特异性增殖。

评估工程化T细胞的抗原特异性细胞因子产生。如图26中示出的，当与用Neo12关联肽以肽浓度依赖的方式脉冲(图26A-图26D，0-1000ng/ml)或被工程化为表达肽/HLA复合体(图26A-图26D，pHLA)的靶细胞共孵育时(E∶T比例4∶1)，表达Neo12的T细胞产生细胞因子。值得注意的是，细胞因子谱显示产生Th1促炎细胞因子IFNγ、IL-2、TNFα和少量IL-6(分别在图26A-图26D中示出)，但没有显示产生Th2细胞因子IL-4或IL-10(数据未示出)。因此，当与靶细胞共孵育时，工程化T细胞显示出抗原特异性促炎性Th1细胞因子谱。

实施例15：经编辑的供体来源的T细胞是有功能的

评估来源于供体的T细胞编辑后的T细胞功能。将Neo12 neoTCR整合到TCRα基因座中。对T细胞进行编辑，其按照标准电穿孔介导的编辑程序进行并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12 neoTCR构建体。通过neoTCR特异性dextramer染色通过流式细胞术评估工程化T细胞的编辑效率。如图27A中示出的，来自健康供体和患者供体的T细胞以相似的效率进行编辑。

如描述的，评估工程化T细胞的抗原特异性T细胞介导的杀伤。如图27B中示出的，当靶细胞用它们各自的关联肽以肽浓度依赖的方式脉冲(图27B，0-1000ng/ml)或被工程化为表达肽/HLA复合体(图27B，“Neo12 HLA”)时，当靶细胞与来源于健康供体和患者供体的经编辑的表达Neo12的T细胞共孵育时(E∶T比例4∶1)，靶细胞被杀伤。值得注意的是，被工程化为表达非关联肽/HLA复合体的靶细胞没有显示出显著的杀伤(图27B，“MART1 HLA”)。此外，当使用经历模拟编辑程序的T细胞时，没有观察到杀伤。因此，工程化的健康供体来源和患者来源的T细胞显示出对靶细胞的抗原特异性杀伤，证明了其在临床环境中的适用性。

如描述的，评估工程化的健康和患者供体来源的T细胞的抗原特异性T细胞增殖。如图27C中示出的，当与用Neo12关联肽以肽浓度依赖的方式脉冲(图27B，0-1000ng/ml)或被工程化为表达肽/HLA复合体(图27C，“Neo12HLA”)的靶细胞共孵育时(E∶T比例4∶1)，表达Neo12的供体T细胞增殖。值得注意的是，被工程化为表达非关联肽/HLA复合体的靶细胞没有显示出T细胞增殖(图27C，“MART1 HLA”)。此外，当T细胞进行模拟处理时，没有观察到T细胞增殖。因此，当与递呈关联肽的靶细胞共孵育时，工程化的健康和患者供体来源的T细胞显示出抗原特异性增殖。

评估工程化的健康和患者供体来源的T细胞的抗原特异性细胞因子产生。如图27D中示出的，当与用100nM Neo12关联肽脉冲的靶细胞共孵育时(E∶T比例4∶1)，表达Neo12的T细胞产生细胞因子。值得注意的是，细胞因子谱显示产生Th1促炎细胞因子IFNγ、IL-2、TNFα和少量IL-6。因此，当与靶细胞共孵育时，工程化的健康和患者供体来源的T细胞显示出抗原特异性促炎性Th1细胞因子谱。

值得注意的是，工程化供体来源的T细胞在进行测定前未被分选，证明工程化的供体来源的T细胞在没有另外的富集步骤的情况下是有功能的。

实施例16：表达多种neoTCR的供体来源的T细胞是有功能的

评估T细胞编辑后的T细胞功能。将Neo12 neoTCR和MART-1neoTCR两者整合到TCRα基因座中。对来自同一供体的T细胞进行编辑，其按照标准电穿孔介导的编辑程序进行并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ IDNO：10)编码的MART-1neoTCR构建体、或由NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12 neoTCR构建体。通过neoTCR特异性dextramer染色通过流式细胞术评估工程化的T细胞的编辑效率。如图28A中示出的，对于Neo12构建体和MART-1(“F5”)TCR构建体两者，来源于同一供体的T细胞以的相似的效率对进行编辑。

然后，如描述的，评估这些工程化的T细胞的抗原特异性T细胞介导的杀伤，(4∶1E∶T比例)。如图28B中示出的，当靶细胞用它们各自的关联肽以肽浓度依赖的方式(0-1000ng/ml)脉冲或被工程化为表达肽/HLA复合体(“Neo12 HLA”和“MART-1HLA”)时，当靶细胞与表达Neo12(空心方形)或MART-1(实心方形)的经编辑的T细胞共孵育时(E∶T比例4∶1)，靶细胞被杀伤。值得注意的是，工程化为表达非关联肽/HLA复合体的靶细胞没有显示出显著的杀伤，即，Neo12 T细胞没有杀伤表达MART1 HLA的细胞，而MART-1T细胞(“F5”)没有杀伤Neo12HLA细胞。如描述的，评估工程化的供体来源的T细胞的抗原特异性T细胞增殖。如图28C中示出的，当与用它们各自的关联肽以肽浓度依赖的方式(0-1000ng/ml)脉冲或被工程化为表达肽/HLA复合体(“Neo12 HLA”和“MART-1HLA”)的靶细胞共孵育时(E∶T比例4∶1)，表达Neo12(空心方形)或MART-1(实心方形)的供体T细胞增殖。值得注意的是，工程化为表达非关联肽/HLA复合体的靶细胞没有显示出T细胞增殖，即，当与表达MART1 HLA的细胞共孵育时，Neo12 T细胞没有增殖，而当与Neo12 HLA细胞共孵育时，MART-1T细胞(“F5”)没有增殖。因此，工程化的供体来源的T细胞当与递呈关联肽的靶细胞共孵育时显示出抗原特异性增殖，证明了其在多种TCR构建体的临床环境中的适用性。

值得注意的是，工程化的供体来源的T细胞在进行测定前未被分选，证明工程化的供体来源的T细胞在没有另外的富集步骤的情况下是有功能的。

实施例17：经编辑的T细胞维持功能活动

评估工程化的T细胞维持其功能以延长培养的能力。将Neo12 neoTCR和MART-1neoTCR两者整合到TCRα基因座中。对T细胞进行编辑，其按照标准电穿孔介导的编辑程序进行并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS-P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQID NO：10)HR模板编码的MART-1neoTCR构建体、或由NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12 neoTCR构建体。

如图29中示出的，在制造后14天(图29左图)和2个月(图29右图)，Neo12和MART-1工程化的T细胞能够以相当的效率以抗原特异性方式杀伤靶细胞。当靶细胞用它们各自的关联肽以肽浓度依赖的方式(0-1000ng/ml)脉冲或被工程化为表达肽/HLA复合体(“Neo12HLA”和“MART-1HLA”)时，当靶细胞与来源于同一供体的表达Neo12(空心圆形)或MART-1(实心圆形)的经编辑的T细胞共孵育时(E∶T比例4∶1)，靶细胞被杀伤。值得注意的是，工程化为表达非关联肽/HLA复合体的靶细胞没有显示出显著的杀伤，即，Neo12 T细胞没有杀伤表达MART1 HLA的细胞，而MART-1T细胞(“F5”)没有杀伤Neo12 HLA细胞。细胞保持在含有IL7和IL15(没有抗原)的培养基中，并且在培养中是健康的。因此，经编辑的T细胞在一段延长的时间内维持TCR表达和抗原特异性活性，证明了其在临床环境中的适用性。

值得注意的是，工程化的T细胞在进行测定前未被分选，证明工程化的T细胞在没有另外的富集步骤的情况下是有功能的。

实施例18：经编辑的T细胞的表征

评估工程化的供体来源(健康供体)的T细胞编辑后的T细胞功能。将Neo12 neoTCR和MART-1neoTCR两者整合到TCRα基因座中。对T细胞进行编辑，其按照标准电穿孔介导的编辑程序进行并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：10)HR模板编码的MART-1neoTCR构建体、或由NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12 neoTCR构建体。

在每细胞的基础上对表达neoTCR的工程化的T细胞进行单细胞分泌组(secretome)分析(Isoplexis)。Isoplexis平台利用单细胞32重细胞因子测定微设备(单细胞条形码芯片)描绘了T细胞对抗原特异性刺激的应答。使用抗CD4或抗CD8微珠(MiltenyiBiotec，Bergisch Gladbach，Germany)分离CD4+和CD8+T细胞子集。将CD4和CD8细胞分开用特定的肽/靶细胞(与用10nM或100nM特定肽脉冲的靶细胞或与被工程化为表达特定肽/HLA复合体的靶细胞共培养)或对照以1：2的比例在37℃、5％CO2刺激19-21小时。CD4+或CD8+T细胞的存在通过在室温用Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Cell Therapy Systems，Waltham，MA)缀合的抗CD4或抗CD8抗体染色10分钟，用磷酸盐缓冲盐水冲洗一次，并且以1×10⁶个细胞/mL的密度重悬于培养基中来确认。将约30μL的细胞悬液装载到单细胞条形码微芯片中，用于单细胞分泌组评估。对于每个样品，32重测定测量了来自～2000个T细胞的分泌的蛋白。装载到单细胞条形码芯片上的细胞样品的原始显微术和微阵列扫描以及蛋白分泌数据使用Isoplexis软件分析，以确定每个单独细胞分泌的蛋白组合。

如图30中示出的，Isoplexis分析证明CD4和CD8 T细胞两者的多功能谱。示出了表达Neo12 neoTCR的工程化的T细胞(图30A)和表达MART-1neoTCR(“F5”)的工程化T细胞(图30B)的CD4(左图)和CD8(右图)的谱图。对于Ne_o12 neoTCR(图30A，右图)和MART-1(“F5”)T细胞(图30B，右图)两者，CD8⁺T细胞显示出剂量依赖的多功能谱(分泌多种细胞因子)，高达40％的细胞(代表在本实验中TCR编辑的细胞的％，因此所有经编辑的T细胞都是多功能的)产生多于一种细胞因子。CD4应答总体上弱于CD8应答，可能是由于稳定MHC-I/TCR相互作用的CD8的不存在。值得注意的是，CD4+MART-1neoTCR(“F5”)T细胞在用肽脉冲(图30B，左图“10nM”和“100nM”)或被工程化为表达MART-1肽/HLA复合体(图30B，左图“MART1 HLA”)的靶细胞进行抗原刺激后，显示出多功能谱。相比之下，CD4⁺Neo12T细胞当用被工程化为表达Neo12肽/HLA复合体(图30A，左图“Neo12HLA”)的靶细胞刺激时显示出可检测的多功能谱，但当与用肽脉冲(图30A，左图“10nM”和“100nM”))的靶细胞孵育时没有显示出可检测的细胞因子产生，同样可能是由于稳定MHC-I/TCR相互作用的CD8的不存在。

另外，如图30C中示出的，尽管工程化T细胞的最大贡献在于IFNγ的总体水平(图30C，左图)，但产生IFNγ的T细胞的百分比少于经编辑的细胞的数目(图30C，右图)，因为本研究的neo12 neoTCR和MART-1 neoTCR(F5)基因编辑效率为～45％(数据未示出)。相比之下，产生TNFα的T细胞的百分比与编辑效率更相关，即TNF的量(～45％)与基因编辑的量(～45％)相关。(图30C，右图且数据未示出)。因此，Isoplexis结果证明，由工程化的T细胞的TNFα分泌与IFNγ分泌相比可能是其体外杀伤活性的更好预测因子。

因此，Isoplexis分析证明，工程化的表达neoTCR的细胞群体具有多功能活性，在低抗原刺激存在的情况下尤其重要(这是体内功效的重要考虑因素)。

实施例19：电穿孔时间控制(timing)效应效率

评估电穿孔前RNP复合体与细胞的孵育步骤的时间控制。在收获激活的T细胞、离心和重悬于电穿孔缓冲液中后，将细胞与RNP复合体混合，并且在室温放置不同的时间段(5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟和少于1分钟)，然后电穿孔和随后的培养。通过流式细胞术分析细胞，通过neoE特异性dextramer染色分析经编辑的T细胞百分比，并且使用细胞计数器分析存活力％。对于45分钟或更短的孵育时间，存活力范围为～20％至～100％，而60分钟的孵育几乎是0％(数据未示出)。在所有测试的时间点(数据未示出)，正确编辑的T细胞的百分比(detramer+/内源TCR-)大于20％。

实施例20：HSC编辑

对人类HSC (也称为HSPC)进行编辑以插入neoTCR。用于HSC编辑的一般工作流程在图31中示出。将分离的HSC(CD34+细胞)CD34+细胞在预刺激培养基中培养48小时(X-VIVO+50ng/ml SCF、TPO、FL-3L和20ng/ml的IL-3)。使用下表10中描述的条件进行核转染。将电穿孔的细胞(即修饰的原代细胞)铺板在BBMM培养基(IMDM，20％FBS，35％BSA，IL35ng/ml，IL610ng/ml，SCF：25ng/ml)中；定期更换培养基，并且在核转染后16天收获细胞。按照标准电穿孔介导的编辑程序并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12 neoTCR构建体对T细胞进行编辑。

为了评估编辑，提取gDNA并进行内-外PCR。如图32中示出的，第5组、第6组、第7组和第10组显示出1Kb扩增的PCR条带，指示正确整合。因此，HSC在TCRα基因座处被正确编辑。

为了进一步评估在HSC中的编辑，如以上进行编辑程序，使用4μg编码在环状质粒(pUCu-Kan TRAC(1k)MNDZsGreen.f-P2hLNGFRt.P2A；SEQ ID NO：15)中的HR模板，该HR模板含有侧接1kb左和右同源臂(“HR臂”)，并且被P2A序列分开的MND启动子驱动的ZsGreen和截短的LNGRF编码序列。在20μL中使用1.13pmol的RNP(Cas9/sgRNA)使用程序EK100对HSC(0.4×10⁶个)进行电穿孔。如通过明视野和荧光显微术评估的，第14天的甲基纤维素菌落表达ZsGreen(数据未示出)。

实施例21：HR臂长度编辑

将MART-1neoTCR整合到TCR_α基因座中。对T细胞进行编辑，按照标准电穿孔介导的编辑程序并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA编码的MART-1neoTCR构建体，其中HR臂长度包括300个碱基对、600个碱基对、1000个碱基对(标准)或2000个碱基。

通过流式细胞术评估工程化T细胞的MART-1neoTCR的表达(MART-1特异性dextramer染色)和内源TCR表达的损失。如表11中总结的，对于所有测试的臂长度，产生正确编辑的T细胞(dextramer+/内源TCR-)的编辑效率大于或等于17.6％，并且对于所有测试的600个碱基对或更大的臂长度，编辑效率大于20％。

表11：使用不同HR臂长度的编辑效率

	TCR+Dex-	TCR+Dex+	TCR-Dex+	TCR-Dex-
					2000bp HR臂#1	3.4	1.04	26.3	69.3
2000bp HR臂#2	5.81	1.18	25.5	67.5
					1000bp HR臂#1(标准)	1.64	0.6	22.7	75.1
600bp HR臂#1	3.94	0.84	20.9	74.3
					600bp HR臂#2	2.32	0.87	21.5	75.3
300bp HR臂#1	1.59	0.43	17.6	80.3
					300bp HR臂#2	1.1	0.52	20.4	78

实施例22：A151抑制剂提高存活力

对T细胞进行编辑，按照标准电穿孔介导的编辑程序并且插入由环状HR模板NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(SEQ ID NO：13)编码的Neo12 neoTCR构建体。通过流式细胞术评估工程化T细胞的Neo12 neoTCR的表达。通过Neo12特异性dextramer染色检测Neo12neoTCR的表达。值得注意的是，这里使用的Neo12构建体被修饰为使得其不被泛TCR抗体结合。

用孵育前加入的不同浓度的A151对T细胞进行编辑。如表12中总结的，虽然产生正确编辑的T细胞(dextramer+/内源TCR-)的编辑效率在A151时没有显著变化，但细胞存活力(如通过细胞的数目评估的)伴随0.1μM或10μM A151的加入得到提高。

用在编辑程序的不同阶段加入的0.1μM A151对T细胞进行编辑。如表13中总结的，虽然产生正确编辑的T细胞(dextramer+/内源TCR-)的编辑效率在所测试的不同阶段在A151时没有显著变化，但经编辑的细胞的细胞存活力(如通过经编辑的细胞的数目评估的)伴随在RNP和细胞孵育前期间A1 51的加入以及在孵育前和电穿孔后两者期间A151的加入得到提高。

表12：使用不同浓度的A151的编辑效率和存活力

TCR＝IP26抗体，百分比表示为CD8+细胞的百分比

表13：在不同时间在A151孵育后的编辑效率和存活力

TCR＝IP26抗体，百分比表示为CD8+细胞的百分比

实施例23：肿瘤模型中的工程化T细胞功效

针对表达特异性新抗原和HLA分子的人类肿瘤细胞，诸如被转导为组成型表达特异性抗原和HLA的K562或内源表达特异性新抗原和匹配HLA的人类原代肿瘤细胞，评估TCR工程化人类T细胞的体内功效。将肿瘤细胞(1×10⁶个或3×10⁶个)皮下接种在8周龄的NSG小鼠(Jackson Laboratory)的侧腹。通过每周测量肿瘤大小(使用卡尺)2-3次对肿瘤生长进行监测。使用以下公式计算肿瘤大小：(长度×宽度²)/2)。当肿瘤大小达到～100mm³时，对小鼠给药1×10⁶个或5×10⁶个TCR工程化人类T细胞(治疗组)或给药PBS或模拟T细胞(电穿孔而没有RNP或HR模板)对照组。随着时间的推移，对肿瘤生长进行监测，并且当肿瘤大小达到2000mm³时，对小鼠实施安乐死。在早期时间点(T细胞施用后4-7天)将来自各组的一个群组的小鼠处死。收集血液、脾和肿瘤。通过qPCR和流式细胞术评估血液中经编辑的人类T细胞的存在。通过qPCR、流式细胞术和免疫组织化学评估肿瘤中经编辑的人类T细胞的存在/浸润。

结果证明了针对人类肿瘤细胞进行评估的TCR工程化人类T细胞的体内功效。

实施例24：NK编辑

对人类自然杀伤细胞(NK细胞)进行编辑，将ZsGreen报告物构建体整合到TCRα基因座中。通过首先从CD4/CD8阳性选择分离物(isolation)(Miltenyi，CliniMACS)中收集流通液(flow-through)来分离NK细胞。使用Ficoll(标准程序)分离单核细胞，并且然后使用NK细胞分离试剂盒(Miltenyi)特异性分离NK细胞。将分离的NK细胞(1×10⁶个)在含有NKMACS完全培养基(Miltenyi)、5％hABS(Valley Biomedical)、200ng/mL IL-2(Miltenyi)、12.5ng/mL IL-15(Miltenyi)和Miltenyi NK激活珠(5uL/10⁶个细胞，根据制造商的说明)的培养物中激活。在激活后第3天，根据下表14中列出的参数，在100μL体积中对激活的NK细胞(3×10⁶个)进行电穿孔。同源修复模板编码在环状质粒中(pUCu-Kan TRAC(1k)MNDZsGreen.f-P2A.LNGFRt.P2A；SEQ ID NO：15)中，含有侧接1kb左和右同源臂(“HR臂”)，并且被P2A序列分开的MND启动子驱动的ZsGreen和截短的LNGRF编码序列。

在第4天、第7天和第11天，通过流式细胞术评估各组的GFP表达。如表14中总结的，早在第4天(第12组和第13组)就观察到ZsGreen表达。到第11天，使用程序EN-138和EK-100，大于20％的细胞为ZsGreen(第11组、第12组、第14组和等15组)。显示在第11天的ZsGreen表达(第12组)的代表性图在图33中示出。

使用内-外PCR技术进行整合的分子分析，以确认表达构建体到TCRα基因座的精确基因组整合。PCR使用了在先前TCR整合分析中使用的上游正向引物((SEQ ID NO：1)，同时使用对MND插入特异性的上游反向引物作为反向引物(AGGGTCATTTCAGGTCCTT，SEQ ID NO：23)，差别是阳性对照使用来自经编辑的T细胞的gRNA及其各自的反向引物(SEQ ID NO：2)。如表14中总结的和图34中示出的，第11组-第18组显示出1Kb扩增的PCR条带，指示正确整合。因此，NK细胞在TCRα基因座处被正确编辑。值得注意的是，PCR条带强度与表达ZsGreen的细胞百分比相关，即具有最高ZsGreen百分比的样品产生最亮的PCR条带。

表14：NK细胞编辑的总结

NP＝未进行；对于所有组n＝1

实施例25：原代细胞编辑

按照以上描述的程序对原代细胞进行编辑。该程序，包括但不限于电穿孔条件和试剂的改变，根据待编辑的精确原代细胞进行调整。原代细胞包括干细胞、人类干细胞、胚胎干细胞和免疫细胞。免疫细胞的实例包括但不限于，B细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞。

另外的实施方案和参考文献的并入

尽管已经参考优选的实施方案和多种替代实施方案特别地示出和描述了本发明，但相关领域技术人员将会理解，可以对其进行形式和细节的多种改变而不偏离本发明的精神和范围。

在本说明书正文中引用的所有参考文献、已授权的专利和专利申请在此出于所有目的通过引用以其整体并入。

Claims

1.一种修饰的细胞，所述修饰的细胞包含：

包含外源核苷酸序列的环状多核苷酸，所述外源核苷酸序列包含：

a)编码基因的至少一部分的核苷酸序列；

b)与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和

c)与所述内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，

与所述内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进所述内源基因组靶基因座处的同源重组，并且

其中所述修饰的细胞基本上不含病毒介导的递送组分。

2.一种修饰的细胞，所述修饰的细胞包含T细胞，所述T细胞包含：

a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；

b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；

c)编码第一接头多肽序列的核苷酸序列；

d)编码第二接头多肽序列的核苷酸序列；

其中所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列以及所述编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和所述编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被整合到内源TCR-α基因座中，

所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列以及所述编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和所述编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被取向为使得所述多肽序列的每一个能够被表达为单一多肽，其中所述第二接头多肽序列位于所述TCR-α多肽序列和所述TCR-β多肽序列之间，

所述第一接头多肽和所述第二接头多肽是能够在所述T细胞中被裂解使得所述TCR-α多肽序列和所述TCR-β多肽序列各自形成单独的多肽的可裂解接头多肽，其中所述单独的多肽能够缔合在一起形成功能性TCR，

其中所述修饰的细胞基本上不含病毒介导的递送组分，并且

其中内源TCR-β基因座被破坏。

3.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含整合的核苷酸序列，其中所述整合的核苷酸序列包含与所述编码基因的至少一部分的核苷酸序列相同的序列，所述整合的核苷酸序列被整合在所述内源基因组靶基因座处，并且所述整合的核苷酸序列被取向为使得所述基因的至少一部分能够被表达。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含能够裂解所述内源基因组靶基因座内的指定的核苷酸序列的核酸酶组合物。

5.一种修饰的细胞，所述修饰的细胞包含T细胞，所述T细胞包含：

a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；

b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；

c)编码第一接头多肽序列的核苷酸序列；

d)编码第二接头多肽序列的核苷酸序列；

其中所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列以及所述编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和所述编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被整合到内源TCR基因座中，

所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列以及所述编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和所述编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被取向为使得所述多肽序列的每一个能够被表达为单一多肽，其中所述第二接头多肽序列位于所述TCR-α多肽序列和所述TCR-β多肽序列之间，并且

所述第一接头多肽和所述第二接头多肽是能够在所述T细胞中被裂解使得所述TCR-α多肽序列和所述TCR-β多肽序列各自形成单独的多肽的可裂解接头多肽，其中所述单独的多肽能够缔合在一起形成功能性TCR。

6.根据权利要求5所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含含有外源核苷酸序列的环状多核苷酸，所述外源核苷酸序列包含：

a)编码以下的核苷酸序列：编码TCR-α多肽序列的所述核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的所述核苷酸序列以及编码第一接头多肽序列的所述核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的所述核苷酸序列；

b)与所述内源TCR基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和

c)与所述内源TCR基因座的第二区域相同的核苷酸序列，并且

与所述内源TCR基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进所述内源TCR基因座处的同源重组。

7.根据权利要求5或6所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞基本上不含病毒介导的递送组分。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含能够裂解所述内源TCR基因座内的指定的核苷酸序列的核酸酶组合物。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含突变，所述突变产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因。

10.根据权利要求9所述的修饰的细胞，其中产生所述无功能基因的突变包括在所述基因的编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：导致被翻译的蛋白的读框改变的移码突变、引起氨基酸被终止密码子取代的无义突变以及导致一种氨基酸被另一种氨基酸取代的错义突变。