CN117898069A - 一种辣椒种子携带辣椒轻斑驳病毒的综合脱毒处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱除辣椒种子携带辣椒轻斑驳病毒的方法，属种子处理技术领域。具体通过以下步骤完成：(1)酸处理，(2)碱处理，(3)引发，(4)干燥，(5)发芽检测，(6)病毒检测。该方法克服了现有技术的不足，利用本发明提供的方法不仅有效脱除辣椒种子中的辣椒轻斑驳病毒，而且在不影响辣椒种子发芽率的同时提高了种子的发芽势。本发明提供的辣椒种子脱毒方法和引发技术不受时间限制、环境的影响，可常年在实验室或种子生产企业应用，非常实用，可用于脱毒辣椒种子的规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及种子消毒处理领域，具体涉及一种有效脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的综合脱毒方法。
背景技术
辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus，PMMoV)是一种世界性病害，已在全世界范围内对辣椒造成重要经济损失。PMMoV属于帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，基因组含有一条正义单链RNA，基因组全长约6356nt，编码4个开放阅读框(Open reading frames，ORFs)。自然条件下，PMMoV侵染辣椒后可引起植株生长缓慢，叶片可出现褪绿斑驳和花叶症状；果实变小，表面出现凹凸斑点。PMMoV在辣椒的叶片、花粉、果实、和种子等组织中分布，可通过种子进行传毒，也是该病毒远距离传播的重要途径。因而，有效消除辣椒种子中的PMMoV是辣椒安全生产的重要基础保障。
目前，生产上主要采用10％磷酸三钠(TSP)进行种子消毒处理，但是处理效果参差不齐。处理时间过短，PMMoV依然具有侵染活性，不足以抑制病毒活性。但如果延长处理时间则可能对种子造成伤害，影响种子质量，如降低发芽率和发芽势，甚至丧失种子活力等。因此，如何有效钝化种子中的病毒，同时保持种子质量，是当前种子消毒处理的难点和关键。
尤其是，采用酸碱依次处理种子，可有效抑制PMMoV的侵染活性，但是对种子的伤害也更加明显。如果采用有效挽救措施则在很大程度上减少了消毒处理对种子的伤害。
种子引发处理技术是一种先进的种子处理技术，能够改善种子的萌发特性。主要表现为：明显提高种子萌发速度和出苗一致性；克服不适环境造成的萌发障碍，提高种子发芽率和成苗率；克服种子自身结构等引起的萌发障碍；提高未成熟种子和老化种子的活力。消毒处理对种子造成的伤害在未造成不可逆影响的情况下，及时终止并加以挽救，有可能减少伤害，并且利用引发处理的作用改善萌发特性。
目前，种子脱毒效果可以采用多种方法进行检测。如，出苗后症状观察，酶联免疫吸附法，PCR方法等。由于病毒症状受温度、病毒含量以及寄主等多因素的影响，症状存在差异且存在潜隐性；此外，当种子进行了病毒的钝化处理后，采用酶联免疫吸附法和PCR的方法不能判断种子携带病毒的活性。因此，难以确定种子脱毒效果以及是否影响种子质量。因而，本研发采用出苗以及PCR相结合的方法，不仅可以检测种子脱毒处理后对种子质量的影响，而且可同时有效检测脱毒效果。此外，种子脱毒后进一步采用了引发处理，一方面能够最大限度的降低脱毒处理对种子质量的影响，另一方面促进种子的出苗整齐度，更适合现代工厂化育苗模式。目前，尚未见种子脱毒技术与引发技术相结合的方法进行辣椒种子脱毒处理。
发明内容
本发明的目的在于针对辣椒种子中携带的主要病毒PMMoV，提供一种辣椒种子高效、安全脱毒的方法；同时提供一种对脱毒效果进行评价的出苗检测方法，做到既能最大限度地抑制病毒侵染活性，又不降低种子的发芽和活力。
本发明提供一种脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，包括以下步骤实：
1)酸处理:将携带辣椒轻斑驳病毒的辣椒种子加入酸溶液中浸泡，清洗；
2)碱处理：将步骤1)清洗后的辣椒种子，在碱溶液中浸泡后，清洗；
3)引发：将步骤2)清洗后的辣椒种子置于聚乙二醇溶液中，浸泡；
4)干燥：将步骤3)中得到的辣椒种子用清水清洗至去除种子表面的聚乙二醇，干燥，得到脱除辣椒轻斑驳病毒的辣椒种子。
其中，所述步骤1)中的酸溶液为盐酸溶液，所述盐酸溶液的浓度为1～5％；所述浸泡时间为10～60min；浸泡过程中搅拌2～3次；所述盐酸溶液的用量为种子体积的2～8倍；所述清洗为清水清洗1～2次。
其中，所述步骤1)中，所述盐酸溶液的浓度为2％；所述浸泡时间为30min；所述盐酸溶液的用量为种子体积的5倍。
其中，所述步骤2)中，碱溶液为Na3PO4溶液；所述Na3PO4溶液的浓度为5～15％；所述浸泡时间为45～75min；浸泡过程中搅拌2～3次；所述Na3PO4溶液的用量为种子体积的2～8倍；所述清洗为清水清洗3～5次。
其中，所述步骤2)中，所述Na3PO4溶液的浓度为10％；所述浸泡时间为75min；所述Na3PO4溶液的用量为种子体积的5倍；
其中，所述步骤3)中，所述聚乙二醇溶液的浓度为10％；浸泡时间为5天，浸泡过程中每30min搅拌2min。
其中，所述步骤4)中，去除种子表面的聚乙二醇的标准为：在清洗辣椒种子过程中，搅拌时水面泡沫保持不超过2s；所述干燥方法为：将辣椒种子放于吸水纸上，室温晾干或不加热吹干。
其中，所述方法还包括：
5)发芽检测：将步骤4)得到的脱除辣椒轻斑驳病毒的辣椒种子室温放置至少1天后置于发芽纸上进行发芽，观察种子的发芽情况，测定种子发芽势和发芽率，并计算发芽指数；
6)种苗病毒检测：利用RT-PCR的方法对步骤5获得的种苗进行病毒检测；
7)穴盘检测：将步骤4)干燥的种子室温放置至少1天后置于穴盘内进行育苗，以评估脱毒处理的种子在实际生产中的出苗情况。
其中，所述步骤5)中，种子发芽势和发芽率的测定方法为：种子置床7d后进行正常苗记数,其比例为种子发芽势；置床14d后正常苗比例计为种子发芽率。
其中，所述步骤5)中，发芽指数(GI)测定方法为：将胚根尖露出种皮计为萌发，置床3d，5d，7d后记录胚根已经伸出种皮的种子数量，按下面公式进行计算：GI＝(G3/3+G5/5+G7/7)，其中G3、G5、G7分别为置床3d、5d和7d记录的萌发率。
所述萌发率是指萌发的种子与种子总数的比值，种子的发芽指数(GI)越高，种子活力越高。
所述步骤6)中的病毒检测具体步骤如下：
61)提取辣椒种子总RNA：随机选取500粒脱毒处理的种子和500粒未脱毒处理的种子，分别在液氮中研磨至粉末，利用植物总RNA提取试剂盒提取样品的总RNA，RNA产物加入DEPC-ddH2O溶解，-80℃保存备用；
62)提取辣椒种苗总RNA：选取脱毒处理的辣椒种子400粒，每个发芽盒播种100粒，14d后将出苗的种苗分成2组进行核酸提取。
63)一步法RT-PCR检测：以提取的植物总RNA为模板，利用PMMoV特异性引物对进行一步法RT-PCR法进行扩增；
一步法RT-PCR检测体系为25μL：、PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl、2x 1stepBuffer(Dye Plus)12.5μl、模板1μL(即步骤1提取的总RNA,浓度100ng-200ng/μL)、余量用无RNase的水补足25μl。其中，PrimeScript 1Step Enzyme Mix和2x 1step Buffer(DyePlus)来源于PrimeScriptTM One Step RT-PCR KitVer.2(Dye Plus)。
反应程序为：
1)50℃预处理30min；
2)94℃预变性2min；
3)95℃变性30s，60℃退火、延伸35s，循环30次；
4)72℃反应10min；
64)带毒量检测：反应结束后通过对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，实现对种子脱毒效果的评价。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的辣椒种子脱毒方法与现有方法相比，本发明先用酸处理，然后再用碱处理，极大的提高了种子的脱毒效果。
2、本发明在对种子进行脱毒处理的同时结合了引发处理，不仅有效抑制了辣椒种子携带的病毒活性，而且在不影响种子发芽率的同时提高了发芽势。
3、与目前常用的血清学技术、RT-PCR检测方法相比，本发明提供的出苗与RT-PCR检测相结合的方法，不仅能检测脱毒后对种子的发芽率和发芽势的影响，同时还能进一步通过分子的方法判断脱毒后种苗是否带毒。解决了传统检测方法如酶联免疫吸附法，荧光定量PCR等方法直接检测种子时不能有效判断病毒活性问题，而且更适用于生产。
附图说明
图1为10％Na3PO4处理不同时间后辣椒种子带毒检测结果，图1中胶孔分别代表：CK+：PMMoV阳性对照、M：DL2000 DNA Marker；1-4代表10％Na3PO4处理种子60min后种子中的PMMoV检测结果、10％Na3PO4处理种子75min后种子中的PMMoV检测结果、10％Na3PO4处理种子45min后种子中的PMMoV检测结果、10％Na3PO4未处理种子的PMMoV检测结果。
图2为不同浓度的HCl与10％Na3PO4处理后辣椒种子带毒检测结果；A中胶孔分别代表：CK+：PMMoV阳性对照、M：DL2000 DNA Marker；1-4代表5％HCl+10％Na3PO4处理种子的PMMoV检测结果；5-8代表2％HCl+10％Na3PO4处理种子的PMMoV检测结果；9-12代表10％Na3PO4处理种子的PMMoV检测结果；B中胶孔分别代表：1-4代表1.5％HCl+10％Na3PO4处理种子的PMMoV检测结果；5-8代表1％HCl+10％Na3PO4处理种子的PMMoV检测结果；9-12代表10％Na3PO4处理种子的PMMoV检测结果。
图3为用2％HCl与10％Na3PO4处理不同批次的辣椒种子带毒检测结果；图3中胶孔分别代表：CK+：PMMoV阳性对照、M：DL2000 DNA Marker；1-4代表批次1种子的PMMoV检测结果；5-8代表批次2的种子的PMMoV检测结果；9-12代表批次3的种子的PMMoV检测结果；13-16代表批次4的种子的PMMoV检测结果；17-20代表批次1未处理种子的PMMoV检测结果；21-24代表批次2未处理种子的PMMoV检测结果；25-28代表批次3未处理种子的PMMoV检测结果；29-32代表批次4未处理种子的PMMoV检测结果。
图4为用2％HCl与10％Na3PO4处理辣椒种子后发芽第7天的种子发芽结果。取400粒处理的种子，每100粒播种于一个发芽盒内。其中图A、B、C和D分别表示每个发芽盒内100粒种子发芽结果。
图5为消毒和引发技术综合处理的辣椒种子的发芽结果，其中T0为未处理的种子发芽结果；T1为消毒后未引发的种子发芽结果；T2为消毒和引发技术综合处理的种子发芽结果。
图6为消毒和引发技术综合处理的辣椒种子发芽结果和种苗带毒检测结果，其中，A和B为未处理种子部分发芽结果；C和D为处理种子发芽结果。取发芽的种苗每50棵为1组进行核酸提取。其中，A和B种苗数量较少，仅各取一个小样；图6E中胶孔分别代表：CK+：PMMoV阳性对照、M：DL2000 DNA Marker；1-8代表图6C中处理后的辣椒种苗PMMoV检测结果；9-12代表图6D中的未处理种子的种苗携带PMMoV检测结果。
图7为消毒和引发技术综合处理的辣椒种子穴盘种植结果，其中，A中为消毒和引发综合处理的种子穴盘种植结果，B为未处理的种子穴盘种植结果，C，D和E图为消毒和引发综合处理的种子穴盘种植后期的生长情况。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所述的浓度均为质量百分比浓度，所述盐酸溶液、Na3PO4溶液、聚乙二醇溶液的溶剂均为水。
下述实施例中的试验药品：植物总RNA提取试剂盒(RNAprep pure Plant Kit)、一步法RT-PCR试剂盒(2×One Step Mix(Dye Plus)，TAKARA)、Ex-Taq DNA聚合酶、Na3PO4购自北京天根生化科技有限公司；PMMoV特异性引物对PMMoV-F/PMMoV-R由上海生工生物工程股份有限公司合成，具体为：PMMoV-F：5’-AGAACTCGGAGTCATCGGAC-3’(如序列表中的序列1所示)；PMMoV-R：5’-GAGTTATCGTACTCGCCACG-3’(如序列表中的序列2所示)。
下述实施例中的试验材料：采集于北京的辣椒种子，经过RT-PCR扩增、测序鉴定为PMMoV感染的辣椒种子样品为阳性材料，健康辣椒种子样品为阴性材料。
实施例1.不同脱毒方法的脱毒效果比较
本实施例设计7种脱毒方法对辣椒种子进行脱毒处理，以未脱毒辣椒种子作为对
照，每种处理的种子量约为500粒饱满带毒辣椒种子。种子脱毒处理后利用一步法RT～PCR检测技术对辣椒种子携带的PMMoV进行定性检测，比较各脱毒方法的脱毒效果。
1.脱毒方法设计如下：
(1)10％Na3PO4处理法：取500粒带毒种子，置于5倍体积的10％Na3PO4溶液浸种45min；药剂处理结束后，滤去10％Na3PO4溶液，用无菌水清洗辣椒种子3～5次；滤干水溶液后及时将处理种子放于室温干燥。
(2)10％Na3PO4处理法：取500粒带毒种子，置于5倍体积的10％Na3PO4溶液浸种60min；药剂处理结束后，滤去10％Na3PO4溶液，用无菌水清洗辣椒种子3～5次；滤干水溶液后及时将处理种子放于室温干燥。
(3)10％Na3PO4处理法：取500粒带毒种子，置于5倍体积的10％Na3PO4溶液浸种75min；药剂处理结束后，滤去10％Na3PO4溶液，用无菌水清洗辣椒种子3～5次；滤干水溶液后及时将处理种子放于室温干燥。
(4)5％HCl处理30min+10％Na3PO4处理75min：取500粒带毒种子，置于5倍体积的5％HCl处理30min，用清水清洗1～2次；置于5倍体积的10％Na3PO4溶液浸种75min。药剂处理结束后，滤去10％Na3PO4溶液，用无菌水清洗辣椒种子3～5次；滤干水溶液后及时将处理种子放于室温干燥。
(5)2％HCl处理30min+10％Na3PO4处理75min：取500粒带毒种子，置于5倍体积的2％HCl处理30min，用清水清洗1～2次；置于5倍体积的10％Na3PO4溶液浸种75min。药剂处理结束后，滤去10％Na3PO4溶液，用无菌水清洗辣椒种子3～5次；滤干水溶液后及时将处理种子放于室温干燥。
(6)1.5％HCl处理30min+10％Na3PO4处理75min：取500粒带毒种子，置于5倍体积的1.5％HCl处理30min，用清水清洗1～2次；置于5倍体积的10％Na3PO4溶液浸种75min。药剂处理结束后，滤去10％Na3PO4溶液，用无菌水清洗辣椒种子3～5次；滤干水溶液后及时将处理种子放于室温干燥。
(7)1％HCl处理30min+10％Na3PO4处理75min：取500粒带毒种子，置于5倍体积的1％HCl处理30min，用清水清洗1～2次；置于5倍体积的10％Na3PO4溶液浸种75min。药剂处理结束后，滤去10％Na3PO4溶液，用无菌水清洗辣椒种子3～5次；滤干水溶液后及时将处理种子放于室温干燥。
(8)对照：以未脱毒处理的带毒辣椒种子作为对照。
2.种子的引发：
将按照步骤1中(5)所示脱毒方法进行脱毒后的种子，置于10％的的聚乙二醇溶液中，浸泡5d，期间每30min搅拌2min；之后用大量清水清洗，尽量去除种子表面的聚乙二醇(搅拌时水面泡沫保持不超过2s),放于吸水纸上，室温晾干或不加热吹干，完成脱毒种子的引发。
3.病毒检测：
(1)提取辣椒种子总RNA
将脱毒处理的干燥后的500粒种子置于研钵中，加入液氮进行研磨至粉末，进一步采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，每个样品提取4个小样。以未脱毒处理的同批次种子500粒作为对照，提取4个小样。抽提RNA产物加入DEPC处理的ddH2O溶解，-80℃保存备用。
(2)提取辣椒种苗总RNA
取400粒脱毒处理粒种子置于发芽盒内，每个发芽盒100粒。播种第14d～21d取种苗，50棵种苗为1组并进行核酸提取。以未脱毒处理的同批次种子400粒作为对照。抽提RNA产物加入DEPC处理的ddH2O溶解，-80℃保存备用。
(3)一步法RT-PCR检测
一步法RT-PCR检测体系为25μL：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl、2x 1
step Buffer(Dye Plus)12.5μl、模板1μL(即步骤1提取的总RNA,浓度100ng-200ng/μL)、余量用无RNase的水补足25μl。其中，PrimeScript 1Step Enzyme Mix和2x1step Buffer(Dye Plus)来源于PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)。
上述一步法RT-PCR的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性2min；按照以下条件进行28个循环：95℃变性30s、60℃退火35s、72℃延伸30s；循环结束后再72℃延伸10min。
(4)带毒量检测：反应结束后通过对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，实现对种子脱毒效果的评价。
4.计算发芽率和发芽势：
按照国家标准《农作物种子检验规程》推荐的方法进行种子发芽势和发芽率测定。将步骤4干燥的种子室温放置至少1d后置于发芽纸上进行发芽，每处理检测400粒种子，分为4个重复，种子置床7d后进行正常苗记数,其比例为种子发芽势；置床14d后正常苗比例计为种子发芽率。在进行发芽指数(GI)测定时，将胚根尖露出种皮计为萌发，置床3d，5d，7d后记录胚根已经伸出种皮的种子数量。按照下述公式计算发芽率、发芽势和发芽指数。
发芽率(％)＝(置床14d后发芽的种子数/供试种子数)×100
发芽势(％)＝(置床7d后的种子发芽数/供试种子数)×100
发芽指数(GI)＝(G3/3+G5/5+G7/7)，其中G3、G5、G7分别为置床
3d、5d和7d记录的萌发率。
5.结果与分析
(1)不同脱毒方法脱毒效果结果
经过RT-PCR检测，脱毒处理方法(1)-(3)的结果如图1所示，图1为10％Na3PO4处理后辣椒种子带毒检测结：具体为用10％Na3PO4处理辣椒种子45min，60min，75min。每个处理500粒，以未处理的辣椒种子作为对照。处理完成后，种子放置室温干燥后，每500粒种子提取4个核酸。图1中胶孔分别代表：CK+：PMMoV阳性对照、M：DL2000DNA Marker；1-4代表10％Na3PO4处理种子60min后种子中的PMMoV检测结果、10％Na3PO4处理种子75min后种子中的PMMoV检测结果、10％Na3PO4处理种子45min后种子中的PMMoV检测结果、10％Na3PO4未处理种子的PMMoV检测结果。图1中的结果表明，仅用10％Na3PO4处理辣椒种子，并不能有效彻底去除辣椒种子中的辣椒轻斑驳病毒。
经过RT-PCR检测，脱毒处理方法(4)-(7)的结果如图2所示，A中胶孔分别代表：CK+：PMMoV阳性对照、M：DL2000 DNA Marker；1-4代表5％HCl+10％Na3PO4处理种子的PMMoV检测结果；5-8代表2％HCl+10％Na3PO4处理种子的PMMoV检测结果；9-12代表10％Na3PO4处理种子的PMMoV检测结果。B中胶孔分别代表：1-4代表1.5％HCl+10％Na3PO4处理种子的PMMoV检测结果；5-8代表1％HCl+10％Na3PO4处理种子的PMMoV检测结果；9-12代表10％Na3PO4处理种子的PMMoV检测结果。从图2可以看出，当先用不同浓度的(5％,2％,1.5％和1％)HCl处理30min后，在用10％Na3PO4处理75min，可显著提高脱毒效率，脱毒效果要比用单一方法好，尤其是5％HCl+10％Na3PO4和2％HCl+10％Na3PO4。
由于高浓度盐酸有可能会影响种子质量，因而进一步采用2％HCl+10％Na3PO4，并处理其它批次的辣椒种子时，脱毒效果也非常明显，如图3所示，图3为用2％HCl与10％Na3PO4处理4个不同批次的辣椒种子带毒检测结果：采用2％的HCl先处理30min后，然后用10％Na3PO4处理辣椒种子75min。每个处理500粒，以未处理的辣椒种子作为对照。处理完成后，种子放置室温干燥后，每500粒种子提取4个核酸进行病毒检测。图3中胶孔分别代表：CK+：PMMoV阳性对照、M：DL2000 DNA Marker；1-4代表批次1种子的PMMoV检测结果；5-8代表批次2的种子的PMMoV检测结果；9-12代表批次3的种子的PMMoV检测结果；13-16代表批次4的种子的PMMoV检测结果；17-20代表批次1未处理种子的PMMoV检测结果；21-24代表批次2未处理种子的PMMoV检测结果；25-28代表批次3未处理种子的PMMoV检测结果；29-32代表批次4未处理种子的PMMoV检测结果。
(2)采用2％HCl+10％Na3PO4处理会影响辣椒种子的发芽率及发芽势
选取采用2％HCl+10％Na3PO4脱毒处理及未脱毒处理的辣椒种子各400粒，在发芽盒中进行发芽测试，发芽温度为30℃。种子置床7d后进行正常苗记数,其比例为种子发芽势；置床14d后正常苗比例计为种子发芽率。在进行发芽指数(GI)测定时，将胚根尖露出种皮计为萌发，置床3d，5d，7d后记录胚根已经伸出种皮的种子数量，按下面公式进行计算：GI＝(G3/3+G5/5+G7/7)，其中G3、G5、G7分别为置床3d、5d和7d记录的萌发率。
采用2％HCl+10％Na3PO4脱毒处理后，继续用10％的的聚乙二醇溶液中进行种子引发处理。选取采用2％HCl+10％Na3PO4脱毒处理及脱毒结合引发处理的辣椒种子各400粒，置于发芽纸上进行发芽，分为4个重复，种子置床7d后进行正常苗记数,其比例为种子发芽势；置床14d后正常苗比例计为种子发芽率。在进行发芽指数(GI)测定时，将胚根尖露出种皮计为萌发，置床3d，5d，7d后记录胚根已经伸出种皮的种子数量，按下面公式进行计算：GI＝(G3/3+G5/5+G7/7)，其中G3、G5、G7分别为置床3d、5d和7d记录的萌发率。
种子萌发试验结果表明(见表1，图4)，采用2％HCl+10％Na3PO4脱毒处理后，辣椒种子的发芽势及发芽率分别为69％和85％，脱毒和引发综合处理的辣椒种子发芽率和发芽势分别为95％和95％；而未处理的辣椒种子的发芽势、发芽率分别为40％和95％。
表1不同处理对辣椒种子萌发的影响
当脱毒处理后，对辣椒种子进一步引发处理。结果表明，两项技术结合不仅能有效去除辣椒种子携带的辣椒轻斑驳病毒(图6E)，而且引发处理后在不影响辣椒种子发芽率的同时明显提高了种子的发芽势(图5，图6A-D)，且在实际工厂化穴盘种植时，表现出出苗整齐、根系发达，长势旺盛等优点(图7)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)酸处理:将携带辣椒轻斑驳病毒的辣椒种子加入酸溶液中浸泡，清洗；
2)碱处理：将步骤1)清洗后的辣椒种子，在碱溶液中浸泡后，清洗；
3)引发：将步骤2)清洗后的辣椒种子置于聚乙二醇溶液中，浸泡；
4)干燥：将步骤3)中得到的辣椒种子用清水清洗至去除种子表面的聚乙二醇，干燥，得到脱除辣椒轻斑驳病毒的辣椒种子。
2.根据权利要求1所述的脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于，所述步骤1)中的酸溶液为盐酸溶液，所述盐酸溶液的浓度为1～5％；所述浸泡时间为10～60min；浸泡过程中搅拌2～3次；所述盐酸溶液的用量为种子体积的2～8倍；所述清洗为清水清洗1～2次。
3.根据权利要求2所述的脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述盐酸溶液的浓度为2％；所述浸泡时间为30min；所述盐酸溶液的用量为种子体积的5倍。
4.根据权利要求1所述的脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于，所述步骤2)中，碱溶液为Na3PO4溶液；所述Na3PO4溶液的浓度为5～15％；所述浸泡时间为45～75min；浸泡过程中搅拌2～3次；所述Na3PO4溶液的用量为种子体积的2～8倍；所述清洗为清水清洗3～5次。
5.根据权利要求5所述的脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述Na3PO4溶液的浓度为10％；所述浸泡时间为75min；所述Na3PO4溶液的用量为种子体积的5倍。
6.根据权利要求1所述的脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述聚乙二醇溶液的浓度为10％；浸泡时间为5天，浸泡过程中每30min搅拌2min。
7.根据权利要求1所述的脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于，所述步骤4)中，去除种子表面的聚乙二醇的标准为：在清洗辣椒种子过程中，搅拌时水面泡沫保持不超过2s；所述干燥方法为：将辣椒种子放于吸水纸上，室温晾干或不加热吹干。
8.根据权利要求1-7任一所述的脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于，还包括：
5)发芽检测：将步骤4)得到的脱除辣椒轻斑驳病毒的辣椒种子室温放置至少1天后置于发芽纸上进行发芽，观察种子的发芽情况，测定种子发芽势和发芽率，并计算发芽指数；
6)种苗病毒检测：利用RT-PCR的方法对步骤5获得的种苗进行病毒检测；
7)穴盘检测：将步骤4)干燥的种子室温放置至少1天后置于穴盘内进行育苗，以评估脱毒处理的种子在实际生产中的出苗情况。
9.根据权利要求8所述的脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于，所述步骤5)中，种子发芽势和发芽率的测定方法为：种子置床7d后进行正常苗记数,其比例为种子发芽势；置床14d后正常苗比例计为种子发芽率。
10.根据权利要求8所述的脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于，所述步骤5)中，发芽指数(GI)测定方法为：将胚根尖露出种皮计为萌发，置床3d，5d，7d后记录胚根已经伸出种皮的种子数量，按下面公式进行计算：GI＝(G3/3+G5/5+G7/7)，其中G3、G5、G7分别为置床3d、5d和7d记录的萌发率。
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