CN117897229A - 一种用于实体活检组织的分离的系统和用于检查的方法 - Google Patents

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沙达·霍费米尔·阿布·哈图姆
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Abstract

本发明涉及用于分析组织的系统，该系统包括：分离装置，该分离装置用于至少部分分离组织样本、以获得单个细胞；微流体流动设备，能够使含经分离的细胞的流体流动通过该微流体流动设备；以及评估设备，该评估设备被布置为在通过微流体流动设备输送细胞时对细胞进行评估，该系统优选地被布置为用于组织的无标记分析。

Description

一种用于实体活检组织的分离的系统和用于检查的方法
技术领域
本发明涉及用于分析组织的系统和方法。
背景技术
活检组织检查(biopsy inspection)是用于研究组织和诊断可能的疾病(诸如，癌症、感染和炎症)的最常见的程序之一。在这种实践中，典型地使用针经皮移除、或通过外科手术移除活检组织。在这样的移除后，准备活检组织以用于病理检查，其中，准备方法根据待由医生执行的所需测试而不同。
为了确定疾病的类型或严重程度，执行图1中所概括的常规活检组织检查(截取自https://labpedia.net/surgical-pathology-part-1-histopathology-biopsies/)。
从流程图可以看出，在获得活检组织后，接下来进行粗处理步骤(grossingstep)。随后，用福尔马林固定样本。这需要约8至10小时。然后，使用酒精执行脱水步骤，这典型地需要4至6小时。
随后，用二甲苯清洁(clean)样本1至2小时，并且将因此而获得的样本典型地嵌入石蜡中，这需要约2至4小时。由嵌入的样本制备块状物，然后将其切割并安装在载玻片上。执行染色步骤，并对样本进行分析，典型地使用显微镜。基于该分析为医生准备报告，然后医生能够决定需要对活检组织做出什么样的反应(如果有的话)。
仅从该程序所涉及的时间尺度来看，很明显，如果该程序能够加快，则将是有利的。此外，时间尺度阻碍了术中评估和延迟治疗，因为如果在手术期间获得活检组织样本，通常需要中断手术，以便分析样本，并且需要随后在必要时恢复样本。因此，增加了患者的负担且延迟了治疗。特别是，如果需要将未来的治疗方案需要确定为紧急事项，则后一点可能变得至关重要。在这种情况下，延误活检组织的结果对患者来说可能是致命的。
为了加速该程序并允许术中进行病理学检验(即，能够在患者手术期间执行的检验)，活检组织样本的快速冷冻能够缩短准备时间。在这种情况下，将活检组织样本浸入最佳切割温度(optimal cutting temperature，OCT)的化合物中，以便被冷冻成块状物中且然后进行切片，如图2所示(截取自Todd C.Hollon等人的“Near real-timeintraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology anddeep neural networks”,Nature Medicine,26,52–58(2020))。根据该方法，组织首先被输送到待进行分析的位置。随后，将组织浸入OCT溶液中，组织在OCT溶液中被冷冻。冷冻的样本在低温恒温器中进行切片且随后被安装在载玻片上。载玻片用醋酸固定，然后用苏木精和伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色，并且然后用乙醇脱水。随后，用二甲苯清理(clear)样品并安装。然后，病理学医师解释结果，并将诊断结果传达给随后能够决定如何最好地进行手术的外科医生。
在图2中所示的程序中，由于该程序是在手术仍在进行的情况下执行的，因此病理学医师需要在将结果报告反馈给外科医生之前迅速地对活检组织进行固定、清洁、染色和检查，因此，在某些情况下，会给他带来很大的时间压力。该程序的范围从10分钟到几周不等，并且通常依赖于各个医疗人员(诸如，病理学医师、血液科医生、皮肤科医生、…)的知识。因此，需要开发一种更快、更不容易出现人为错误的程序。
另一令人担忧的问题是，从不想影响正在收集的样本的角度来看，如果能够加速该程序，则将是可取的。存在的担忧是，如果样本已经从人体中取出了一段时间，其性质将会发生变化，因此使用该样本所获得的任何发现对正在进行手术的患者的潜在医疗状况都可能是没有意义的。因此，从诊断准确性的角度来看，加速该程序也将是有利的。
发明内容
本发明旨在解决或至少缓解前面提及的至少一些问题。
本发明由独立权利要求所限定。优选实施方案在各自的从属权利要求中进行了陈述。
根据权利要求1，一种用于分析组织的系统包括分离(dissociation)装置。分离装置是能够用于将组织样本至少部分地分离成单个细胞的工具。一种这样的分离装置是以“TissueGrinder(组织研磨器)”的名称出售的，它可以购自德国的Fast ForwardDisfinies有限公司。
此外，提供了一种微流体流动设备，其使含经分离的细胞的流体能够流动通过该微流体流动设备。该流动设备可以直接连接到分离装置，使得将分离装置的输出直接输入到该装置中，或者可以将该设备布置为单独的实体，使得分离装置的输出在被输入到能够对其进行分析的微流体流动设备中之前能够首先被保持在一些其它容器或更通用的保持设备中。
随后，布置评估设备以在通过微流体流动设备输送细胞时评估细胞。这样的评估设备(特别是如果通过微流体流动装置输送细胞、使得能够分析单个细胞)能够在细胞水平上提供关于细胞的重要信息，这因此就为外科医生带来有意义的结果。该评估设备能够基于诸如机械性能、细胞尺寸和质量密度的物理性质进行分析。
通过专注于单个的、经分离的细胞，可以获得比通过检验更大的样本所获得的结果更有意义的结果。此外，由于微流体流动设备可以用于部分分离的组织样本，这些部分分离的组织样本不需要使用前面提及的相当复杂的程序来制备，因此该系统能够加速组织的分析。无论经分离的细胞是从分离装置直接输入到微流体流动设备中，还是作为程序的一部分储存一段时间，这都是适用的。
在这种情况下，如果将该系统布置为组织的无标记分析，则是优选的。也就是说，单个细胞不会受到任何染色程序或任何其他类型的标记。利用这种无标记分析，避免了待分析的细胞被标记过程改变。因此，这种方法有可能产生特别有意义的结果。
优选地，该评估设备包括成像装置，该成像装置布置为在通过微流体流动设备输送细胞时获得细胞的图像。这种光学分析特别有用，并且已经得出了特别好的结果，这也是因为人们能够通过测量变形并通过将它们与由于流动而作用在细胞上的力相关联来获得例如细胞机械性能的结果。成像装置能够补充或替换为产生其他光信号(诸如，布里渊散射(Brillouin scattering)或拉曼散射(Raman scattering))的装置。
优选地，成像装置包括图像分析设备，该图像分析设备分析获得的细胞的图像。因此，利用这样的图像分析设备，能够分析由成像设备获得的数据。然而，也可以只将图像提供给能够对正在分析的细胞的状态做出推论的外科医生。
优选图像分析设备被布置为实时分析图像，也就是说，在由成像装置输出时或以不显著的延迟输出时分析图像。这带来了特别快的诊断结果。
另外地或替代地，图像分析设备可能使用监督式或无监督式学习技术，优选为神经网络，以用于分析图像。这种图像分析的方法已经证明是分析诸如图像的复杂数据的特别有效的方法。还可以使用随机森林或PCA作为实现无监督式学习的其他方式。
另外地或替代地，对于成像装置，评估设备可能包括电特性测量装置，该电性测量装置被布置为在通过微流体流动设备输送细胞时测量细胞的电特性。这样的分析可以带来有用的诊断信息。优选地，电特性测量装置包括阻抗测量装置，该阻抗测量装置被布置为在通过微流体流动设备输送细胞时测量细胞的阻抗。利用这种能够被配置为测量单个细胞的阻抗的装置，能够获得有用的诊断数据。
如果该系统包括布置为过滤掉在组织样本分离期间产生的碎屑的过滤装置，则是优选的。由于从待分析的样本中移除了碎屑，因此分析的结果更有意义。
优选地，该系统被布置为使得在分离装置输出单个细胞时、使单个细胞流动通过微流体流动设备。因此，能够实现显著的加速，并且还可以将系统集成到单个外壳中，从而改善系统的紧密度。
如果该系统包括用于在通过评估设备评估细胞之前向经分离的细胞添加物质、优选药物的装置，则是更加优选的。这允许用于药物筛选，或者更普遍地，用于检查物质如何影响细胞。因此，能够测试某种物质(药物)是否有助于治疗患者经历的某种状况。
如果分离装置使用酶分离方法和/或机械分离方法，则是优选的。这种方法特别有效，并且给分离的细胞带来了良好的结果。
根据本发明的另一方面，本发明由独立方法权利要求所限定。关于设备权利要求的相同解释适用于此。值得注意的是，优选地，该方法能够使用前述的系统来执行。
附图说明
图1和图2示出了现有技术的活检组织方法。
图3示出了根据本发明的实施方案的分析活检组织样本的方法。
图4示出了图3的实施方案的细节。
图5和图6示出了分析结果。
图7示出了根据本发明第一实施方案的系统的示意图。
图8示出了本发明的第二实施方案的方面。
图9示出了本发明的第三实施方案的方面。
图10示出了本发明的第四实施方案的方面。
具体实施方式
图3示出了根据第一实施方案的方法中待执行的步骤。
作为第一步(步骤S10)，将活检组织样本放置在将典型地包括培养介质的分离元件中。
在该分离元件中，执行样本的分离(步骤S12)。
之后(步骤S14)，例如使用泵使具有经分离的组织的介质流动通过过滤器(例如，30-100μm)，该过滤器允许小于特定尺寸(例如，30-100μm)的颗粒通过。
在接下来的步骤(步骤S16)中，浓缩滤液，例如通过将滤液注入离心管中然后进行离心来浓缩。施加例如100-500×g的离心加速度数分钟、典型地为2-10分钟来将细胞从培养介质中分离出来、并将这些细胞重新悬浮在粘度高于细胞培养介质的测量介质中。值得注意的是，不需要使用离心机，并且相反地，能够采用任何浓缩细胞的方法。还应注意的是，确保细胞悬浮在粘度高于细胞培养介质的介质中的步骤是可选的。
随后，如步骤S18中所示的，评估细胞。例如，例如使用泵使高粘度的细胞悬浮液通过管道流动到微流体通道中，在该微流体通道中执行评估步骤。例如，该评估步骤能够通过在微流体通道的收缩区域中对细胞进行成像并使用不同的流速来改变细胞上的水动力(hydrodynamic forces)来执行。
随后，在步骤S20中，能够执行对细胞的评估的分析。如果评估包括获得图像，则能够分析图像以提取诸如形状或像素参数的参数。这能够实时完成，或者能够使用后处理步骤完成。细胞的机械参数能够衍生自形状参数，例如，衍生自圆形形状的偏差，这符合“RAPID”(real-time analysis of physical phenotype in deformational flow，实时分析变形流中的物理表型)技术。这种技术的一个示例是实时可变形性细胞计数(real timedeformability cytometry，RT-DC)。
图4中可以看到更详细的实施方案。在第一步骤中，从器官解剖组织样本108，这些组织样本能够在手术期间提取。随后，在分离装置110中，分离单个细胞。值得注意的是，除了机械组织研磨机之外，能够使用采用酶分离方法的替代分离方法。组织解剖和组织分离每次典型地进行少于5分钟。
将经分离的样本离心并重新悬浮，这典型地需要进行少于20分钟，并且然后将经分离的样本引入能够使用快速技术设备的组织分析装置中。这种技术能够依赖于WO 2015/024690 A1中描述的RT-DC功能。
使用该技术，将经悬浮的细胞引入RAPID-设备的鞘入口，并且然后引导通过微流体通道114，在该微流体通道中布置成像设备(未示出)以对单个细胞进行成像。随后，使用出口将经悬浮的细胞引出。
更详细地，用于实体活检组织的机械分离的方案可以如以下执行：
1.病理学医师从肿瘤活检组织、健康器官或患病器官中提取一块组织。
2.立即将活检组织放入储存在4℃下的、补充有10％ FBS(Foetal Bovine Serum，胎牛血清)、1％GlutMAXTM、1％ HEPES(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethane-1-sulfonic acid，2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙烷-1-磺酸)和1％青霉素/链霉素的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)高级介质中，立即处理，或冷冻在液氮中供以后使用。储存介质不限于该制剂。
3.将部分活检组织解剖成约2mm(2-4mm)尺寸的块状物并放入组织研磨单元中，该组织研磨单元包含800-1000μl的、补充有2％的FBS的DMEM。每次研磨增加约10x 2mm的块状物。
4.使用细胞过滤器(网格尺寸：100μm)和倒置的离心管来封闭研磨单元、并放置在TissueGrinder设备上。
5.根据实体活检组织的情况，选择合适的研磨方案。这些方案经过预先优化，以确保获得良好的单细胞产量、尽可能少的碎屑。方案的选择是根据实验室中使用的研磨单元定制的，并且如果使用其他研磨设备，则会有所不同。
6.一旦方案完成，将离心管直立放在架子上，旋开，并且用5-10ml的DMEM、2％ FBS清洗研磨单元和细胞过滤器。
7.流经的流体再次通过第二细胞过滤器(网格尺寸：70μm)过滤，并且最终将细胞悬浮液转移到15ml离心管中。
8.细胞悬浮液在300x g下离心8分钟。
9.抽吸上清液，并且将细胞团块重新悬浮在不含Ca2+和Mg2+、补充有FBS或牛血清白蛋白的PBS中。
10.细胞悬浮液再次通过35μm的细胞过滤器过滤并转移到埃彭多夫管(Eppendorftube)中。
11.用摇桶式离心机(swinging-bucket centrifuge)将细胞悬浮液在300x g下离心5分钟。为了使用细胞表面抗体对细胞进行染色，将团块重新悬浮在200μl相应的抗体溶液中，并在室温下温育20分钟。通过添加1ml的含FBS或BSA(牛血清白蛋白)的PBS、在500x g下离心5分钟来将抗体清洗出来。
12.移除上清液，并在粘性测量缓冲液(例如：不含Mg2+或Ca2+的磷酸盐缓冲液中的0.6％(w/v)甲基纤维素)中稀释团块。过滤方法不限于前述能够根据需要改变的网格尺寸。然而，优先采用从大到小的顺序过滤，以移除细胞碎屑。
13.样本已经准备好使用RAPID技术进行测量。
如前所述使用AcCellerator仪器(Zellmachik Dresden有限公司)执行RAPD-测量(Rosendahl,P.,Plak,K.,Jacobi,A.等人的Real-time fluorescence and deformabilitycytometry.Nat Methods 15,355–358(2018))。步骤如下。
1.微流体芯片由结合在盖玻片上的PDMS制成，由通过30x 30或20x 20μm正方形横截面和300μm长度的中央通道收缩连接的样本入口、鞘入口和出口构成。尺寸的选择取决于样本。
2.该芯片安装在配备了CMOS照相机的倒置高速显微镜的工作台上。
3.在每个实验开始之前，将测量缓冲液预先装满芯片，使用1ml的Luer-Lok注射器(BD Biosciences公司)连接到注射泵上，并通过PEEK管(IDEX Health&Science有限责任公司)连接，从而提供鞘流体。
4.然后将细胞悬浮液吸入第二个1ml的Luer-Lok注射器(BD Biosciences公司)，该注射器也连接到注射泵上，从而提供样本流体。
5.鞘流体用于水动力聚焦收缩通道内的细胞。总流速为0.06μl/s，其中鞘流速为0.045μl/s、并且样本流速为0.015μl/s。流速不受这些值的限制。
6.如果使用荧光染色，则基于单个染色对照和未染色样本，相应地调整每个荧光团的激光功率。以2,000fps的帧率在250x 80像素的目标区域中捕获每个细胞的图像(应当注意，目标区域的尺寸和帧率将根据需要进行选择)。实时获取形态参数、机械参数和荧光参数。
这种分析的结果可以在图5和图6中看到。例如，根据这些对细胞变形的测量，可以清楚地区分不同的细胞亚群，这允许基于不同的参数将细胞分类归并成组。在这种情况下，从细胞亚群的平均亮度和细胞亚群的细胞尺寸(以μm2为单位)而言，允许不依赖于它们的细胞尺寸来区分不同的细胞亚群。
图5示出了在人类肾脏的白细胞群中，可以基于细胞尺寸和变形参数来识别四种不同的亚群。
图6示出了在人类结肠样本的细胞内，可以纯粹基于亮度和尺寸来识别约6个细胞亚群。
图7示出了根据第一实施方案的系统的总体配置。将活检组织样本108引入在其中产生单个细胞113的分离装置110。随后，将输出的细胞113引入分析装置112，在这种情况下，分析装置112使用快速技术。
图8示出了在本发明的第二实施方案中能够如何配置分离装置的细节。具体地，可以使用不同的研磨室，具有初始的、更温和的研磨室110a_1以及随后的一个或多个强力研磨室110a_m。如下所示，这能够通过具有彼此以不同的距离布置的不同研磨叶片110b来实现，其中研磨叶片110b之间的较大距离对应于更温和的研磨。值得注意的是，在所有其他方面，第二实施方案与前述的第一实施方案相同。
图9示出了根据本发明第三实施方案的分离装置110。这里，在实际的分离装置110的下游，布置了用于过滤在组织样本的分离期间产生的碎屑的过滤器111。第三实施方案在所有其他方面与前述的第一实施方案相同。
图10示出了本发明的第四实施方案。将活检组织样本108引入分离装置110。然后，将单个细胞113输送到调节细胞介质116中。在调节细胞介质116中，增加了载流体108的细胞浓度和粘度，这将避免离心和重新悬浮步骤。在本实施方案中，将单个细胞113从调节细胞介质116引入使用RAPID-技术的评估装置112。

Claims (15)

1.一种用于分析组织的系统，所述系统包括：
-分离装置(110)，所述分离装置用于至少部分地分离组织样本、以获得单个细胞，
-微流体流动设备(112)，能够使含经分离的细胞(113)的流体流动通过所述微流体流动设备；以及
-评估设备，所述评估设备被布置为在通过所述微流体流动设备输送细胞时、对所述细胞进行评估，所述系统优选地被布置为用于组织的无标记分析。
2.根据权利要求1所述的系统，所述评估设备包括成像装置，所述成像装置布置为在通过所述微流体流动设备输送所述细胞时获得所述细胞的图像，所述成像装置优选地还包括图像分析设备，所述图像分析设备布置为分析获得的所述细胞的图像，其中，所述图像分析设备更优选地布置为实时分析所述图像、和/或其中所述图像分析设备使用监督式学习技术或无监督式学习技术、优选为神经网络以用于分析所述图像，所述图像分析设备优选被布置为分析光散射。
3.根据权利要求1或2所述的系统，所述评估设备包括电特性测量装置，所述电特性测量装置布置为在通过所述微流体流动设备输送所述细胞时测量所述细胞的电特性，所述电特性测量装置优选包括阻抗测量装置，所述阻抗测量装置布置为在通过所述微流体流动设备输送所述细胞时测量所述细胞的阻抗。
4.根据前述权利要求中任一项所述的系统，所述系统还包括过滤装置(111)，所述过滤装置布置为过滤掉在组织样本分离期间产生的碎屑。
5.根据前述权利要求中任一项所述的系统，所述系统布置为使得在由所述分离装置输出单个细胞(113)时、使所述单个细胞流动通过所述微流体流动设备。
6.根据前述权利要求中任一项所述的系统，所述系统还包括用于在由所述评估设备评估所述细胞之前向所述经分离的细胞添加化学物质的装置。
7.根据前述权利要求中任一项所述的系统，所述分离装置使用酶分离方法和/或机械分离方法。
8.一种分析组织的方法，所述方法包括：
-分离待分析的组织、以获得单个细胞，
-使经分离的细胞流动通过微流体通道，
-在所述细胞流动通过微流体通道时评估所述细胞，其中，所述分析组织的方法优选执行组织的无标记分析，所述方法优选使用根据前述权利要求中任一项所述的设备来执行。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述细胞的评估包括获得在所述细胞流动通过所述微流体通道时所述细胞的图像，其中，所述图像优选被实时分析、和/或其中所述图像使用神经网络来分析。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述评估包括在所述细胞流动通过所述微流体通道时测量所述细胞的电特性，其中，优选在所述细胞流动通过所述微流体通道时测量所述细胞的阻抗。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，所述方法还包括在使经分离的细胞流动通过所述微流体通道之前过滤所述经分离的细胞。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中，所述经分离的细胞在被分离时流动通过所述微流体通道。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，所述方法还包括在评估所述细胞之前向所述经分离的细胞添加化学物质的步骤。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，其中，使用酶分离方法和/或机械分离方法来分离所述细胞。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的系统、或根据权利要求8至14中任一项所述的方法用于筛选化学物质、优选药物的用途。
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