CN117897166A - 含有角膜内皮替代细胞的治疗用组合物 - Google Patents

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CN117897166A
CN117897166A CN202280048101.9A CN202280048101A CN117897166A CN 117897166 A CN117897166 A CN 117897166A CN 202280048101 A CN202280048101 A CN 202280048101A CN 117897166 A CN117897166 A CN 117897166A
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吉崎慎二
羽藤晋
冢本雅志
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Sairuiming Co ltd
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Sairuiming Co ltd
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Abstract

本发明的目的在于提供一种治疗用组合物、特别是移植治疗用组合物，其能够冷冻保存，不会因解冻而对细胞造成损伤，而且，不经过对解冻后的细胞的清洗或离心分离等附加过程就能够直接施用于患者。一种用于移植的治疗用组合物，其包含具有CD24阳性表型的角膜内皮替代细胞、酚酞衍生物和冷冻保护剂。尽管该治疗用组合物含有冷冻保护剂，但可安全地移植在眼房内。由于CD24呈阳性，因此可以期待从吞噬作用逃逸的效果。

Description

含有角膜内皮替代细胞的治疗用组合物
技术领域
本发明涉及含有角膜内皮替代细胞的治疗用组合物，特别涉及移植用的治疗用组合物。
背景技术
由于角膜内皮细胞的减少等角膜内皮的损伤，使得角膜内皮细胞的功能受损，角膜实质部中发生水肿。这导致角膜透明性降低，视力下降。这种状态被称为大疱性角膜病。另一方面，已知人的角膜内皮细胞一旦受到损害，几乎不具有再生的能力。因此，如果角膜内皮细胞由于某些伤害而减少，则角膜移植是唯一有效的治疗手段。实际上，由于角膜内皮功能障碍引起的大疱性角膜病占角膜移植适应症病例的约一半。
目前，通过移植角膜的上皮、实质和内皮三层结构的全部的全层角膜移植对角膜内皮损伤患者进行处理。全层角膜移植虽然是已经确立的技术，但现状是在日本角膜提供不足，另外，排斥反应也成为问题。为了解决上述问题，只移植受到损伤的组织的“零件移植”正在普及。已知有保留角膜内皮，只移植供体的上皮和实质的深板层角膜移植(DeepLamellar Keratoplasty:DLKP)、只移植包含内皮的一部分角膜的角膜内皮移植等。但是，例如在角膜内皮移植的情况下，作为该移植材料的供给源的仍然是角膜内皮本身，鉴于角膜的提供者有限，与全层角膜移植一样，不能克服供体不足的问题。而且，角膜内皮细胞难以培养，对于制备足够移植数量的培养细胞，在时间上和费用上的负担较大。
为了解决供体不足的问题，正在尝试创建角膜内皮细胞、以及具有与角膜内皮细胞同等功能的、替代角膜内皮细胞的细胞。
例如，报道了从iPS细胞或ES细胞诱导替代角膜内皮细胞的细胞的方法。关于从iPS细胞或ES细胞向角膜内皮细胞(实际上，由于对角膜内皮细胞有特异性的表面标记物等目前还没有确立，因此为性质接近角膜内皮细胞的细胞、所谓的角膜内皮样细胞(Cornealendothelial like cell))的诱导法、细胞培养法，在非专利文献1中进行了综述。另外，本发明的发明人到目前为止确立了具有与角膜内皮细胞同等功能的、替代角膜内皮细胞的细胞的制造方法(专利文献1～3)，将通过该方法得到的角膜内皮样细胞命名为“角膜内皮替代细胞”。源自iPS细胞的角膜内皮替代细胞针对大疱性角膜病的临床研究也已开始。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO/2013/051722
专利文献2：WO/2016/093359
专利文献3：WO/2019/142833
非专利文献
非专利文献1：Hatou S,Shimmura S；Inflamm Regen.2019；39:19。
发明内容
发明要解决的问题
为了将培养的角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞用于实际临床治疗，必须能够将所制造的细胞稳定地保存到治疗时，并从制造基地运输到医院或诊所等。但是，由于根据细胞加工物的剂型、保存·运输的温度区域，细胞的存活率和质量变动，因此能够稳定的保存·运输的剂型和温度区域的设定是重要的。另外，在治疗时期望是用户友好的剂型。
作为使移植用的细胞稳定的保存·运输成为可能的手段，可以列举出将细胞或细胞团或其细胞加工物悬浮于冷冻保存液中进行冷冻保存的方法。冷冻保存液中含有二甲基亚砜(DMSO)等冷冻保护剂。一般来说，冷冻保护剂的存在会影响细胞和施用其的生物体。因此，在为了治疗而使用细胞、细胞团或细胞加工物时，解冻后需要清洗/除去冷冻保护剂。冷冻保护剂的清洗/除去步骤的实施在时间和成本上是不希望进行的，而且对细胞的损伤很大。
因此，本发明的目的在于提供一种治疗用组合物，特别是移植治疗用组合物，该组合物能够冷冻保存，不会因解冻而对细胞造成损伤，而且，不经过对解冻后的细胞的清洗或离心分离等附加过程就能够直接施用于患者。
角膜内皮替代细胞通过分化和诱导多能干细胞，特别是人工多能干细胞来制备。但是，对于所有的多能干细胞，诱导成目标角膜内皮替代细胞是较难的，部分存在作为来源的干细胞、或在向角膜内皮替代细胞的分化、诱导途中的未分化细胞残留的情况。这样的未分化细胞具有增殖活性，分化为角膜内皮替代细胞以外的细胞，另外，如果移植到生物体内，则有形成畸胎瘤的危险。因此，本发明中使用的含有角膜内皮替代细胞的细胞群优选未分化细胞的比例尽可能降低。
解决问题的手段
鉴于上述课题，本发明的发明人对细胞、特别是培养的角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞能够稳定保存、运输的剂型和温度区域进行了深入研究，结果发现，通过将细胞悬浮于保存液中并冷冻保存，能够稳定地保存、运输，而且，通过将所得到的含有细胞的组合物在酚酞衍生物存在下解冻、稀释，可以制成适合移植的治疗用组合物。该治疗用组合物不需要通过清洗等除去冷冻保存液中含有的冷冻保护剂。而且确认了冷冻保存后的细胞在解冻后也保持角膜内皮功能，从而完成了本发明。
此外，本发明的发明人调查了在含有源自干细胞的角膜内皮替代细胞的治疗用药物组合物中未分化细胞的比例(以下也称为未分化细胞残存率)，发现了在医药上可接受的未分化细胞残存率。
即，本发明提供以下内容。
[1]一种治疗用组合物，其包括具有CD24阳性表型的角膜内皮替代细胞，以及任选地还包括酚酞衍生物。
[2]根据上述[1]所述的组合物，其还包括冷冻保护剂。
[3]根据上述[2]所述的组合物，其中，冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)。
[4]根据上述[3]所述的组合物，组合物中的DMSO浓度为1-10％。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的组合物，其中，酚酞衍生物选自酚磺酞(酚红)、酚酞、溴酚蓝、异戊酰酚酞、乙酰酚酞、酚酞二丁酸酯、酚酞二磷酸酯、酚酞二硫酸酯、酚酞葡糖醛酸、酚酞单-β-葡糖苷酸、酚酞单-β-葡糖醛酸、酚酞单磷酸酯和甲酚红。
[6]根据上述[1]～[4]中任一项所述的组合物，其中，酚酞衍生物为酚红。
[7]根据上述[6]所述的组合物，其中，组合物中的酚红浓度为1～20mg/L。
[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的组合物，其中，组合物中的细胞浓度为0.5×106～10×106细胞/mL。
[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的组合物，其是细胞球状体悬浮液的剂型。
[10]根据上述[9]所述的组合物，其中，组合物中所含的细胞群包含等效面积直径为30μm以上的球状体，该球状体中50％以上的等效面积直径为30～90μm。
[11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的组合物，其中，角膜内皮替代细胞来源于干细胞。
[12]根据上述[11]所述的组合物，其中，干细胞是多能干细胞。
[13]根据上述[12]所述的组合物，其中，多能干细胞源自iPS细胞(包括通过基因编辑或基因导入赋予了附加功能的细胞)。
[14]根据上述[13]所述的组合物，其B2M表达量低于人角膜内皮细胞或培养的内皮细胞。
[15]根据上述[1]～[14]中任一项所述的组合物，其用于移植。
[16]根据上述[15]所述的组合物，其用于移植到前房内。
[17]根据上述[16]所述的组合物，其用于治疗需要角膜内皮移植的疾病。
[18]根据上述[17]所述的组合物，其中该疾病是选自大疱性角膜病、圆锥角膜、角膜炎、角膜化学烧伤、角膜基质营养不良、角膜水肿和角膜白斑中的一种。
[19]具有CD24阳性表型的角膜内皮替代细胞用于制造需要角膜内皮移植的疾病的治疗用组合物的用途。
[20]根据上述[19]所述的用途，其中，该治疗用组合物任选地包括酚酞衍生物。
[21]根据上述[19]或[20]所述的用途，其中，该治疗用组合物还包括冷冻保护剂。
[22]根据上述[19]～[21]中任一项所述的用途，该疾病是选自大疱性角膜病、圆锥角膜、角膜炎、角膜化学烧伤、角膜基质营养不良、角膜水肿和角膜白斑中的一种。
[23]一种用于治疗需要角膜内皮移植的疾病的治疗用组合物，其包括：具有CD24阳性表型的角膜内皮替代细胞。
[24]根据上述[23]所述的组合物，任选地包括酚酞衍生物。
[25]根据上述[23]或[24]所述的组合物，其还包括冷冻保护剂。
[26]根据上述[23]～[25]中任一项所述的组合物，其中，该疾病是选自大疱性角膜病、圆锥角膜、角膜炎、角膜化学烧伤、角膜基质营养不良、角膜水肿和角膜白斑中的一种。
[27]一种需要角膜内皮移植的疾病的治疗方法，其包括：将有效量的包含具有CD24阳性表型的角膜内皮替代细胞的治疗用组合物移植到需要其的患者的前房内。
[28]根据上述[27]所述的治疗方法，其中，该治疗用组合物任选地包括酚酞衍生物。
[29]根据上述[27]所述的治疗方法，其中，该治疗用组合物还包括冷冻保护剂。
[30]根据上述[27]～[29]中任一项所述的治疗方法，其中，该疾病是选自大疱性角膜病、圆锥角膜、角膜炎、角膜化学烧伤、角膜基质营养不良、角膜水肿和角膜白斑中的一种。
[31]一种治疗用组合物的制造方法，其包括：在冷冻保护剂的存在下、以-20℃以下冷冻的角膜内皮替代细胞的细胞悬浮液或细胞球状体悬浮液中加入包括酚酞衍生物的移植用基材。
[32]根据上述[31]所述的方法，其中，该角膜内皮替代细胞具有CD24阳性表型。
[33]一种含有源自干细胞的角膜内皮替代细胞的治疗用组合物，其特征在于，未分化细胞残存率小于1％。
[34]根据上述[33]所述的组合物，其中，该角膜内皮替代细胞具有CD24阳性表型。
[35]根据上述[33]或[34]所述的组合物，其中，未分化细胞残存率为0.1％以下。
[36]根据上述[33]～[35]中任一项所述的组合物，其中，干细胞为多能干细胞。
[37]根据上述[36]所述的组合物，其中，多能干细胞源自iPS细胞(包括通过基因编辑或基因导入赋予了附加功能的细胞)。
[38]根据上述[33]～[37]中任一项所述的组合物，其B2M表达量低于人角膜内皮细胞或培养的内皮细胞。
[39]根据上述[33]～[38]中任一项所述的组合物，其中，通过未分化细胞标记物的表达谱来评价未分化细胞残存率。
[40]根据上述[33]～[39]中任一项所述的组合物，其用于移植。
[41]根据上述[40]所述的组合物，其用于移植到前房内。
发明效果
根据本发明，能够提供能够冷冻保存，不会因解冻对细胞造成损伤，而且，不经过对解冻后的细胞的清洗或离心分离等附加过程就能够直接施用于患者的治疗用组合物，特别是移植治疗用组合物。本发明的治疗用组合物可用于在全世界约占角膜移植适应症病例50％的大疱性角膜病中角膜内皮替代细胞的移植。
根据本发明，通过确认在治疗用组合物、特别是移植用组合物中其未分化细胞残存率，可以进行无副作用的移植。
附图说明
图1是示出对冷藏保管角膜内皮替代细胞时和冷冻保管角膜内皮替代细胞时的细胞状态进行比较的结果的图。可知：冷冻保管可以长期维持细胞团。
图2是示出本发明的治疗组合物中在解冻后的角膜内皮替代细胞的边界上形成紧密连接的图。在细胞边界发现ZO-1的表达。
图3是示出对未分化细胞残存率进行研究的结果的图。
图4是研究未分化细胞尖峰率对畸胎瘤形成的影响的图。畸胎瘤形成需要1％以上的尖峰率，尖峰率为0.1％、0.01％时未确认到畸胎瘤形成。
图5是表示根据未分化iPS细胞尖峰试验的存活曲线(Kaplan-Meier曲线)的图。
图6是表示将未分化细胞残存率为0.1％以下的角膜内皮替代细胞移植到裸大鼠前房内，观察经过的结果的图。观察经过至最长26周，没有确认到致瘤性。
图7是示出验证了球状体化的角膜内皮替代细胞的大小的结果的图。
图8是冷冻保护剂的不同浓度下的CECSi细胞的显微镜观察图像。
图9是冷冻保护剂的不同浓度下的CECSi细胞的抗ZO-1抗体的染色图像。
图10是表示比较人角膜内皮细胞、iPS细胞(Ff-I01s04)及CECSi细胞中β2微球蛋白(B2M)的表达量的结果的图。
图11是示出CECSi细胞球状体悬浮液的显微照片的图(左；无酚红，右；有酚红)。
具体实施方式
以下，说明本发明。除非另外指出，本文中使用的术语具有在该领域中通常使用的含义。
1.治疗用组合物
本发明提供一种治疗用组合物、特别是移植治疗用组合物，其含有培养的角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞、和酚酞衍生物。优选为含有角膜内皮替代细胞和酚酞衍生物的治疗用组合物、优选移植治疗用组合物。本发明还提供一种含有源自干细胞的角膜内皮替代细胞的治疗用组合物，其特征在于，未分化细胞残存率小于1％。本文中，有时将它们统称、简写为本发明的治疗用组合物。该治疗用组合物适用于将角膜内皮替代细胞或培养的角膜内皮细胞移植到眼内，特别是移植到前房内。
(细胞)
在本发明的治疗用组合物中，使用培养的角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞，优选使用角膜内皮替代细胞，更优选使用源自iPS细胞的角膜内皮替代细胞。
作为培养的角膜内皮细胞，可以是原代培养细胞也可以是株化细胞，但由于角膜内皮细胞难以进行原代培养，因此优选使用株化细胞。
在本发明中，角膜内皮替代细胞是由iPS细胞、ES细胞、或通过对它们进行基因编辑或基因导入而赋予了附加功能的细胞等干细胞诱导的、能够治疗角膜内皮功能障碍的、可以替代角膜内皮细胞的细胞。即，角膜内皮替代细胞具有与角膜内皮细胞同等的生理功能。
干细胞是指能够在体外培养，并且能够分化为构成生物体的多个谱系细胞的细胞，具体地，可列举出胚胎干细胞(ES细胞)、源自胎儿原始生殖细胞的多能干细胞(EG细胞)、源自睾丸的多能干细胞(GS细胞)、源自体细胞的人工多能干细胞(诱导多能干细胞；iPS细胞)、人成体干细胞(组织干细胞)。作为iPS细胞，可以使用源自任意温血动物、优选哺乳动物的细胞。作为哺乳动物，可以列举出例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴子、人等。优选可以使用源自人的iPS细胞。
具体地，作为iPS细胞，可以列举出例如在皮肤细胞等体细胞中导入多个基因而得到的、获得了与ES细胞同样的多分化能力的细胞，可以列举出例如通过导入Oct3/4基因、Klf4基因、C-Myc基因和Sox2基因而得到的iPS细胞、通过导入Oct3/4基因、Klf4基因和Sox2基因而得到的iPS细胞(Nat Biotechnol 2008；26:101-106)等。另外，对于iPS细胞的制作方法，如进一步减少导入基因的方法(Nature.2008Jul 31；454(7204):646-50)、利用低分子化合物的方法(Cell Stem Cell.2009Jan 9；4(1):16-9、Cell Stem Cell.2009Nov 6；5(5):491-503)、利用转录因子蛋白代替基因的方法(Cell Stem Cell.2009May 8；4(5):381-4)等深入进行了技术上的改良，但所制作的iPS细胞的基本性质、即具有多分化能力这一点无论制作方法如何都是相同的，都可以成为本发明中所用角膜内皮替代细胞的来源。
具体地，作为iPS细胞，可以使用201B7、201B7-Ff、253G1、253G4、1201C1、1205D1、1210B2、836B3、FF-I14s03、FF-I01s04、MH09s01、Ff-XT18s02、Ff-WIs03、Ff-WJs513、Ff-CLs14、Ff-KVs09、QHJI14s03、QHJI01s04、RWMH09s01、DRXT18s02、RJWIs03、YZWJs513、ILCLs14、GLKVs09、Ff-XT28s05-Abo_to、Ff-I01s04-ABII-KO、Ff-I14s04-ABII-KO(均为iPSAcademia Japan,Inc.或京都大学iPS研究财团)、Tic(JCRB1331株)、Dotcom(JCRB1327株)、Squeaky(JCRB1329株)、Toe(JCRB1338株)、Lollipop(JCRB1336株)(以上均为日本国立成育医疗研究中心、国家生物医学创新研究所难病与疾患资源研究部·JCRB细胞库)、UTA-1株及UTA-1-SF-2-2株(均为东京大学)、21526株、21528株、21530株、21531株、31536株、31538株(均为富士胶片细胞动力公司)等。
包含在本发明的治疗用组合物中的角膜内皮替代细胞是例如由本发明的发明人开发的角膜内皮样细胞(专利文献1～3)，可以通过专利文献1～3中记载的方法制造、制备。优选特征为具有角膜内皮细胞样的性状及功能，且NR3C2(核受体亚家族3，组C，成员2)的基因表达量增强的、源自iPS细胞(包括通过基因编辑或基因导入赋予了附加功能的细胞)的角膜内皮替代细胞(Corneal Endothelial Cell Substitute from iPS cells；CECSi细胞)(专利文献3)。
作为角膜内皮替代细胞所具有的角膜内皮细胞样的性状和功能，具体地可列举出以下特征(i)～(iv)，角膜内皮替代细胞具有这些特征中的至少一个、优选两个、更优选三个、更优选四个全部特征。
(i)细胞间粘附由N-钙粘蛋白形成。
(ii)细胞间形成有紧密连接(tight junction)。
(iii)在细胞膜上表达Na,K-ATP酶α1亚基。
(iv)细胞核中观察到转录因子PITX2的表达。
可以通过对N-钙粘蛋白的免疫染色来确认细胞间粘附是否由N-钙粘蛋白形成。
细胞间是否形成了紧密连接，可以通过对ZO-1的免疫染色来观察作为构成紧密连接的蛋白质的ZO-1的存在进行确认。另外，也可以通过电子显微镜直接观察结构来确认。
细胞膜上是否表达了Na,K-ATP酶α1亚基，可以通过利用对ZO-1和Na,K-ATP酶α1亚基的免疫染色，使两者共染色来确认。
细胞核中是否表达了转录因子PITX2，可以通过对PITX2的免疫染色来确认。
作为本发明的一个实施方式，包含在本发明治疗用组合物中的角膜内皮替代细胞的特征在于，其具有CD24阳性表型。CD24是高度糖基化的小的粘蛋白样糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl-inositol，GPI)锚定的细胞表面蛋白质。CD24在B细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞等造血细胞，以及神经细胞、神经节细胞、上皮细胞、角化细胞、肌肉细胞、胰腺细胞和上皮干细胞等非造血细胞中高水平表达。近年来，有报告称CD24具有逃逸巨噬细胞吞噬作用的功能。因此，包含具有CD24阳性表型的角膜内皮替代细胞的本发明治疗用组合物有望降低移植时的排斥反应。另一方面，有报告称，人角膜内皮细胞为CD24阴性(日本特表2019-510509号公报、日本特开2020-073602号公报)。
CD24阳性表型的有无可以通过对细胞表面上表达的CD24抗原的免疫染色来确认。
各免疫染色在本领域常规地被实施，另外，所使用的试剂或仪器等可以以商业途径得到，或者可以根据现有报道进行制备。
治疗用组合物中的培养的角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞优选为球状体。在本文中，“球状体”是由数十个或数百个细胞聚集的细胞团，通常呈球状。在此，所谓“球状”，除了完全为球形的情况之外，还包括卵形或橄榄球状这样的大致球形的形状。
该球状体例如直径或等效面积直径优选为10～200μm的范围，更优选30～150μm的范围，特别优选30～100μm的范围，更加优选30～90μm的范围，进一步更加优选40～80μm的范围。如果球状体过大，植入中会产生不均匀而不能同样地植入，如果球状体过小，则难以沉着，植入效率降低，但如果球状体的大小在该范围内，则细胞在移植部位中有效地植入。“等效面积直径”是指与颗粒(在本申请的情况下为球状体)的投影面积相等的圆的直径，也被称为海伍德直径或圆当量直径。即，是具有与大致球形形状的球状体的投影面积相等的面积的圆的直径。
本发明的治疗用组合物以培养的角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞的细胞悬浮液、优选球状体悬浮液的剂型提供。
治疗用组合物中的培养的角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞的浓度通常为0.5～10×106细胞/mL，优选1.0～5×106细胞/mL。细胞浓度无论过高或过低，细胞在移植部位的植入效率都降低。
细胞浓度的确定使用如下测量结果进行，在本发明的治疗用组合物的剂型为细胞悬浮液的情况下，采集一部分细胞悬浮液作为样品，测量该样品中的细胞数；在剂型为球状体悬浮液的情况下，采集一部分球状体悬浮液作为样品，对该样品中的球状体进行酶处理，使细胞一个一个地分散，测量细胞数。
在剂型为球状体悬浮液的情况下，本发明的治疗用组合物中所含的细胞群包含等效面积直径为30μm以上的球状体。球状体悬浮液中所含的球状体中50％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上包含在直径或等效面积直径的中值±30μm的范围内。一球状体的直径或等效面积直径的偏差较小时可有效且均匀地覆盖植入表面。作为实施方式，球状体的50％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上为直径或等效面积直径30～90μm的大小。
本发明的包含角膜内皮替代细胞的治疗用组合物可以含有作为来源的干细胞，例如iPS细胞、处于向角膜内皮替代细胞分化、诱导过程中的细胞等(以下也称为未分化细胞)。未分化细胞的比例越大，移植到生物体时越容易发生形成畸胎瘤等副作用。本发明的包含角膜内皮替代细胞的治疗用组合物优选未分化细胞残存率小于1％，更优选为0.1％以下，更加优选为0.01％以下。通过将未分化细胞残存率抑制在小于1％，能够抑制移植到生物体时的畸胎瘤形成和肿瘤形成。
在此，“未分化细胞残存率”是指未分化细胞在本发明的治疗用组合物中所含的全体细胞中的比例。当未分化细胞率为0％时，意味着本发明的治疗用组合物中的全部细胞为角膜内皮替代细胞，当未分化细胞率为100％时，意味着本发明的治疗用组合物中的全部细胞为未分化细胞。当未分化细胞残存率为小于1％、0.1％以下、0.01％以下时，分别意味着本发明的治疗用组合物中总细胞的小于1％、0.1％以下、0.01％以下为未分化细胞。本发明的治疗用组合物中的总细胞数为1×104细胞的情况下，当未分化细胞残存率为小于1％、0.1％以下、0.01％以下时，分别意味着小于100个、10个以下、1个以下的细胞可以是未分化细胞。
未分化细胞残存率的测定没有特别限定，例如可以通过评价未分化细胞特异性的细胞标志物(以下也称为“未分化细胞标志物”)的表达谱来进行。本文中的未分化细胞标志物是在作为来源的干细胞中特异性表达的基因或蛋白质，可列举出转录因子NANOG、OCT4和SOX2、表面抗原SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81等。优选通过评价OCT4表达来实施(Stem CellResearch 55(2021)102497)。OCT4是作为具有多能性的细胞的标记物使用的因子，ES细胞或iPS细胞表达该基因，但皮肤细胞或心脏细胞等没有多能性的细胞不表达OCT4。具体地，可以通过实施例中记载的方法进行评价，但对组合物实施OCT4的定量PCR，在作为人角膜内皮细胞的构建株的B4G12细胞中OCT4表达量的4.0倍以下的情况相当于“未分化细胞残存率0.1％以下”。对于其他未分化细胞标记物，也同样地通过预先确认表达量与未分化细胞残存率的相关性，可以知道本发明的含有角膜内皮替代细胞的治疗用组合物是否适合移植。
(酚酞衍生物)
本发明的治疗用组合物的特征在于，除了上述细胞之外，还含有酚酞衍生物。酚酞衍生物，只要具有下式所示的基本骨架，能够得到所期望的效果，就没有特别限定。
式中，-X-是-SO2-或-CO-，环Ar1和环Ar2相同或不同，是可以具有1～3个取代基(例如，甲基、乙基、丙基、异丙基等碳原子数为1～3的可以具有支链的烷基；溴原子、氯原子等卤素原子；乙酰基、异戊酰基等酰基)的碳原子数为6或12的芳香环(例如苯、萘)。
优选地，-X-是-SO2-。环Ar1和环Ar2相同或不同，是可以具有1～3个、优选1个或2个取代基(例如甲基、异丙基、溴原子)的苯。
该酚酞衍生物可以是其盐或其酯。或者也可以是酸加成物。
作为酚酞衍生物，可列举出例如酚磺酞(酚红)、酚酞、溴酚蓝、异戊酰酚酞、乙酰酚酞、酚酞二丁酸酯、酚酞二磷酸酯、酚酞二硫酸酯、酚酞葡糖醛酸、酚酞单-β-葡糖苷酸、酚酞单-β-葡糖醛酸、酚酞单磷酸酯、甲酚红。酚酞衍生物可以通过本身已知的方法制造。众所周知，酚酞衍生物可以用邻苯二甲酸和相应的各种酚类合成，如果使用的酚类为苯酚，则可以合成酚酞。另外，各种酚酞衍生物可以商业性地获得。从简便性和质量稳定性的角度考虑，优选使用商业途径获得的产品。作为酚酞衍生物，优选为下述结构的酚红(也称为酚磺酞)。酚红通常作为pH指示剂包含在培养基中，但从细胞培养的角度考虑是任意的添加成分，也市售有不含酚红的培养基。本发明的治疗用组合物中所含的酚红的浓度通常为1～20mg/L，优选为1～15mg/L，更优选为5～10mg/L。酚红以外的酚酞衍生物的浓度也通常为1～20mg/L，优选为1～15mg/L，更优选为5～10mg/L。
酚酞衍生物所具有的“期望的效果”是促进移植后的细胞植入的效果。
作为本发明的治疗用组合物的施用对象，可以列举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、猫、狗、牛、马、羊、猴子、人等哺乳动物，但优选为人。
作为本发明的治疗用组合物的施用量，根据施用对象的体重、年龄、症状等并不能一概而论地规定的，例如，如果是体重25～300Kg、年龄16～100岁、症状是大疱性角膜病的人，则每只眼通过注射在前房内施用50～200μL。本发明的包含冷冻保护剂、移植用基材和细胞或细胞球状体的治疗用组合物的前房内注射中，不会产生眼压上升或明显炎症等副作用，是安全的。
本发明的治疗用组合物可以适用于治疗需要角膜内皮移植的疾病。作为该疾病，可以列举出但不限于大疱性角膜病、圆锥角膜、角膜炎、角膜化学烧伤、角膜基质营养不良、角膜水肿和角膜白斑等。
另外，本发明可提供需要角膜内皮移植的疾病的治疗方法，其包括将治疗组合物的有效量移植到需要其的患者的前房内的步骤。在此，作为适应疾病、施用量，可以列举出上述的疾病、施用量。
2.治疗用组合物的制造方法
本发明的治疗用组合物可以例如通过将上述培养的角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞、优选角膜内皮替代细胞、更优选CECSi细胞在球状体化后悬浮于冷冻保存液中冷冻，保存一定时间后，在酚酞衍生物存在下解冻、稀释来制备。
作为使细胞球状体化的方法，已知有悬滴法、旋转培养法、利用低附着性培养容器的培养等。利用低附着性培养容器的培养法，由于操作简便，因此是优选使用的方法。在通常的培养容器中增殖的附着性细胞，在低附着性的容器中培养时，由于细胞自身具有的性质，细胞彼此附着而形成球状体。例如，可以通过在EZSphere(注册商标，AGC TechnoGlass)、WELLBAG(东洋制罐)等容器中浮游培养来使细胞球状体化，在球状体化中优选使用球状体形成培养基。作为球状体形成培养基，可以列举出但不限于例如实施例中记载的培养基。由于球状体形成培养基中不含酚酞衍生物，因此容易形成更多的球状体。
在本发明中，将细胞或球状体化的细胞冷冻的方法和保存它们的方法没有特别限定，可以通过通常在细胞的冷冻保存中实施的方法进行。优选在-70℃以下，更优选在-80℃以下冷冻、保存。保存时间没有特别限定，可以列举出通常数周～半年，优选2周～6个月，更优选4个月的保存时间，可以在不损害解冻后的存活率的情况下保存。
细胞的冷冻保存是指，不进行传代培养而以长期维持细胞为目的，使细胞冷冻保存。已知当直接使细胞冷冻时，由于细胞内含有的水分而会产生冰晶，生长的冰晶破坏细胞膜，即会发生所谓的冻结损伤。因此，在冷冻保存时所使用的冷冻保存液中，为了防止冻结损伤而含有冷冻保护剂。因此，本发明的治疗用组合物除了细胞和酚酞衍生物之外，还可以含有冷冻保护剂。
作为冷冻保护剂，只要可以达到防止冻结损伤的目的就没有特别限定，可以列举出例如细胞渗透性的冷冻保护剂或细胞非渗透性的冷冻保护剂等。可以列举出例如二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、羧基化聚赖氨酸、甘油、丙二醇(1,2-丙二醇)、丝胶、丙烷二醇、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羟乙基淀粉、硫酸软骨素、聚乙二醇、甲酰胺、乙酰胺、阿东糖醇、甘露庚糖醇、棉子糖、乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇等。冷冻保护剂可以单独使用，也可以将2种或3种以上组合使用。优选是通用的DMSO。
冷冻保存液可包含溶解和/或稀释冷冻保护剂以维持细胞存活的介质。作为介质，只要具有上述功能就没有特别限定，可以使用生理盐水、各种生理缓冲液(例如PBS、HBSS等)、以各种细胞培养用的基础培养基为基础的介质等。作为基础培养基，只要是例如MEM培养基、BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM ZincOption培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham培养基(例如F10、F12)、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基以及它们的混合培养基等能够用于动物细胞培养的培养基，就没有特别限定。这些培养基可以商业性地获得。此外，这些培养基可以是含血清培养基、无血清培养基。优选为无血清培养基。本发明中所用的培养基为含血清培养基的情况下，可以使用牛血清(Bovine Serum)、胎牛血清(FetalBovine Serum)等哺乳动物的血清，该血清在培养基中的浓度为0.1～20％(v/v)，优选为1～10％(v/v)。
冷冻保护剂在冷冻保存液中的添加浓度或冷冻保存液中冷冻保护剂的浓度只要是不因冷冻、解冻操作而使细胞质量过度劣化的浓度就没有特别限定，典型地，例如相对于冷冻保存液整体，可以为约1％～约60％(v/v)、约2％～约50％(v/v)、约5％～约40％(v/v)、约5％～约20％(v/v)、约10％～约20％(v/v)等。在冷冻保护剂为DMSO的情况下，例如在冷冻保存液中含有10～20％。
预先含有冷冻保护剂的、作为冷冻保存液市售的商品(例如，CELLBANKER(注册商标)、BAMBANKER(注册商标))也可以适合使用。
将如此冷冻的包含含有培养的角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞(优选角膜内皮替代细胞，更优选CECSi细胞)和冷冻保护剂的冷冻保存液的、冷冻后的组合物称为本发明的“含细胞组合物”。可以通过将含细胞组合物在酚酞衍生物存在下解冻、稀释来制备本发明的治疗用组合物。
将冷冻保存的含细胞组合物在酚酞衍生物存在下解冻、稀释的步骤，具体地，可以通过在冷冻保存的含细胞组合物中添加移植用基材来实施。通常，相对于含细胞组合物1重量份，添加1～9重量份(稀释2～10倍)、更优选4重量份(稀释5倍)的移植用基材。添加移植用基材后的组合物中的冷冻保护剂的浓度优选为2％以下，更优选为1％以下。
酚酞衍生物可以仅包含在移植用基材中，或者包含在冷冻保存液和移植用基材两者中，但优选仅包含在移植用基材中。
酚酞衍生物在冷冻保存液和/或移植用基材中的添加浓度、或冷冻保存液和/或移植用基材中酚酞衍生物的浓度，只要是能够排除冷冻保护剂对细胞和生物体的影响的浓度，就没有特别限定，最终浓度、即治疗用组合物中的浓度可以调整为1～20mg/L，优选为1～15mg/L，更优选为5～10mg/L。例如，在酚酞衍生物为酚红，移植用基材中的浓度为6～12mg/L的情况下，用该移植用基材将含细胞组合物稀释5倍时，治疗用组合物中酚红的浓度为5～10mg/L。
将含细胞组合物用移植用基材稀释2～10倍，、优选稀释5倍来制备治疗用组合物，因此冷冻保护剂在冷冻保存时的治疗用组合物中，可以为0.1～30％(v/v)、0.2～25％(v/v)、0.5～20％(v/v)、0.5～10％(v/v)、1～10％(v/v)等，或者可以为0.2～12％(v/v)、0.4～10％(v/v)、1～8％(v/v)、1～4％(v/v)、2～4％(v/v)等。当冷冻保护剂为DMSO时，例如以10～20％(v/v)包含在冷冻保存液中，以5％(v/v)以下、优选2％(v/v)以下包含在移植时的治疗用组合物中。
作为移植用基材，只要是适合眼内施用、特别是前房内施用的溶液，就没有特别限定，可以使用非刺激性的等渗化后的培养液、生理盐水、缓冲液等。优选使用与对培养的角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞进行培养的溶液相同的培养液。移植用基材中除了酚酞衍生物以外，根据需要还可以含有各种成分。该成分只要对向角膜内皮细胞层分化有用而不使施用(移植)到前房内的培养的角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞脱落，就没有特别限定，优选添加胰岛素或胰岛素样生长因子。此外，视黄酸、EGF和bFGF也是优选添加成分。
[实施例]
以下使用实施例对本发明进行详细说明，但本发明不限定于以下的实施例。另外，只要没有特别限定，所使用的试剂和材料可以商业性地获得。本说明书中使用的缩略语只要没有特别说明，就与本领域通常使用的缩略语相同。
实施例1：球状体化的角膜内皮替代细胞的保存条件的验证
用与专利文献3的实施例4同样的方法从iPS细胞诱导CECSi细胞，在第14天使用Accutase(Nakalai Tesque#12679-54)回收细胞，并以1×107细胞/mL的细胞浓度悬浮在冷冻保存液Bambanker(注册商标)hRM(日本Genetics#CS-07-001；含10％DMSO)中，用-80℃的深冻冰箱(deep freezer)冷冻保存。7个月后，将冷冻保存的细胞解冻，通过使用球状体形成袋(东洋制罐、WELLBAG)培养，将CECSi细胞球状体化。
回收球状体化的CECSi细胞，并以6×107细胞/mL的细胞浓度悬浮在冷冻保存液Bambanker(注册商标)hRM(日本Genetics#CS-07-001；含10％DMSO)中，用-80℃的深冻冰箱冷冻保存(冻结保管)。7天后，冷冻保存的细胞加入4倍容量的含酚红的移植用基材(含有8.1mg/L的酚红)进行解冻，确认了球状体的形状。作为移植用基材，使用了专利文献3的实施例4中使用的CECSi细胞诱导用(+T)培养基。另外，同样地，将从iPS细胞诱导得到的CECSi细胞球状体化后，在4℃冷藏保存(冷藏保管)，在保存后第1天及第2天确认了球状体的形状。结果如图1所示。
在冷藏保管的情况下，在保存后的第2天，几乎所有的球状体都分散了，但冷冻保存的细胞在冷冻保管7天后，在解冻后几乎所有的球状体中都确认到了形状的维持。
通过这些结果确认了，通过冷冻保存可长期保存球状体化的角膜内皮替代细胞。
此外，将解冻后的球状体化的角膜内皮替代细胞接种到培养容器中，调查角膜内皮替代细胞的角膜内皮样功能是否被维持。
以紧密连接的形成能力为指标，评价了作为角膜内皮替代细胞的重要功能之一的屏障功能。
将冷冻保存前或冷冻保存7天后的球状体化角膜内皮替代细胞接种到48孔板中，使细胞粘附到板上。24小时后，除去培养基并用冰冷后的4％多聚甲醛固定孔上的细胞。用PBS洗涤两次孔后，加入封闭溶液(含有10％正常驴血清(Normal Donkey Serum)的PBST(10％NDS/PBST))，进行30分钟的封闭。然后，以下述抗体量在室温下进行1小时的一次抗体反应。
兔抗人ZO-1；Invitrogen,40-2200,1:500,0.4μL/孔
封闭溶液(10％NDS/PBST)，0.20mL/孔
接着，将孔用PBS洗涤2次后，以下述抗体量在室温下进行1小时的二次抗体反应。
驴抗兔Cy-3；Jackson,711-165-152,1:200,1.00μL/孔
DAPI,1:1000,0.20μL/孔
封闭溶液(10％NDS/PBST)，0.20mL/孔
然后，用PBS洗涤2次后，滴加封固剂，用荧光显微镜观察。
结果如图2所示。在冷冻保存后的球状体中，也与冷冻前一样，在细胞的边界处确认到ZO-1的表达。通过以上结果确认了，冷冻保存后的角膜内皮替代细胞在冷冻保存后仍维持其屏障功能。
实施例2：通过移植用基材稀释的效果的验证
在实施例1中确认了可冷冻保存球状体化的角膜内皮替代细胞，解冻后仍维持角膜内皮功能。但是，冷冻保存中使用了冷冻保存液。该冷冻保存液中含有DMSO作为冷冻保护剂，因此在前房内施用前需要清洗。在本实施例中，研究了解冻后不需要清洗操作等的方法。
为了验证不清洗而通过使用移植用基材进行稀释，是否不受冷冻保存液的影响而维持角膜内皮替代细胞的功能，以紧密连接的形成能力为指标，与实施例1同样地评价屏障功能。其结果发现，通过用移植用基材稀释5倍以上，可以在维持角膜内皮功能的状态下得到角膜内皮替代细胞。进一步地实施动物试验，确认了能够安全施用于前房内。
试验例1:尖峰(Spike)试验(未分化细胞可残留到何种程度的预备试验)
(方法)
为了确定本发明的含有角膜内皮替代细胞的治疗用组合物中可以残留的未分化细胞的比例(也称为“未分化细胞残存率”)的容许范围，通过下述方法实施iPS细胞尖峰试验。
方法：在人成纤维细胞中将未分化的iPS细胞株Ff-I1s04(传代次数P＝20)按下述个数混合，与iPS细胞用培养基AK03N中含有10μM Y27632(ROCK抑制剂)的培养基混合，将该悬浮液与基质胶1:1混合，以1×106个细胞/只移植在裸大鼠眼前房内。另外，通过与作为营养细胞的人成纤维细胞、iPS细胞用培养基以及基质胶一起移植，使混合的未分化iPS细胞的致瘤性扩增。由此，求出更严格、安全性更高的阈值设定。
未分化Ff-I01s04细胞移植数(尖峰率)
1×106个(100％)
1×104个(1％)
1×103个(0.1％)
1×102个(0.01％)
(判定基准)
观察期间：
在同时满足以下两个项目的情况下，判定为“存在肉眼致瘤性”，对该个体在安乐死后摘除移植眼，通过病理组织诊断进行了确诊。
i.有明显的左右差异，移植眼肿大。
ii.移植眼的前房内充满固态组织。
观察期结束后：
所有个体在安乐死后摘除移植眼，采用HE染色进行病理组织诊断。
(结果)
根据判定标准i、ii，通过病理组织诊断确认为前房内畸胎瘤形成的视为“死亡”。图4示出了基于尖峰率的代表性畸胎瘤的组织照片，图5示出了Kaplan-Meier曲线。
Ff-I01s04未分化iPS细胞尖峰率100％(即，只有未分化iPS细胞)组到9周为止存活率为0％。未分化IPS细胞尖峰率1％组到16周为止存活率为16.7％。
另一方面，尖峰率0.1％、0.01％组在最终的病理诊断中也没有确认到畸胎瘤形成，因此存活率为100％。
实施例3:源自iPS细胞的角膜内皮替代细胞在裸大鼠的前房内单次施用致瘤性试验
1.未分化细胞残存率的评价方法
根据已有报道(Stem Cell Res.2021Aug；55:102497.)评价了用于裸大鼠的前房内单次施用致瘤性试验的源自iPS细胞的角膜内皮替代细胞(CECSi细胞)的未分化细胞残存率。具体如下。
将未分化的iPS细胞株(Ff-I01s04和QHJI01s04)以几种浓度混合(尖峰)在B4G12细胞中，分析OCT4的表达水平。以该数据为标尺，对各克隆中残留的未分化iPSC群体进行了定量化(图3)。通过qPCR测定CECSi细胞中OCT4的表达量(第11天)。使用尖峰测试的标尺，确认了源自Ff-I01s04或QHJI01s04的CECSi细胞中的残存未分化细胞为0.1％以下(图3)。
2.致瘤性试验
将含有源自iPS细胞的角膜内皮替代细胞的治疗用组合物(未分化细胞残存率0.1％以下)前房内(右眼)单次施用(2.5×104细胞/5μL/眼)在裸大鼠中，检查致瘤性。
移植用基材：DMEM/F12、ITS补充剂(1×)、IGF1(10ng/mL)、Y27632(100μM)
试验组构成如下。
[表1]
受试物质组1组
*：施用后观察16周结束时前房内细胞团的存在不能被确认时，进行剖检。
使用裂隙灯检查前眼部及中央玻璃体，拍摄前眼部(右眼)的照片。
＜致瘤性的判断基准＞
1)有明显的左右差异，右眼肿大。
2)右眼前房内充满固体组织。
将上述治疗用组合物(未分化细胞残存率0.1％以下)移植到裸大鼠前房内，观察26只随时间变化最长至26周为止。
从移植后12周以后，在前眼部照片中4周以上前房内未观察到细胞的情况下判定为细胞消失，在移植16周以后判定为细胞消失的情况下(图6的a)，在消失判定的第二天实施剖检。
对前房内残留有细胞的动物观察至26周，在观察期结束的第二天实施剖检。如图6的b～e所示，在过程中，前房内细胞团的大小没有变化，没有确认到致瘤性。
实施例4:球状体化的角膜内皮替代细胞大小的验证
1.iPS细胞扩大培养(解冻)
在iPS细胞用培养基AK03N(味之素)中以10μM的浓度加入Y-27632(wako/039-24591)(以下称为AK03N+Y培养基)。
通过iMatrix511(Matrixome/892005)、6μg/mL的浓度包被T12.5烧瓶(Corning/353107)。将iPS细胞(FF-I01s04株)以8.0×103细胞/cm2的细胞浓度悬浮在AK03N+Y培养基中，将得到的细胞悬浮液接种到该T12.5烧瓶中。在37℃的CO2孵育器中开始培养，第二天培养基更换为不含Y-27632的AK03N培养基。期中隔2天后连续2天进行培养基更换，在培养的第6天进行传代。
通过iMatrix511(Matrixome/892005)、6μg/mL的浓度包被T12.5烧瓶(住友电木/MS-23050)。将iPS细胞以2.2×103细胞/cm2的细胞浓度悬浮在AK03N+Y培养基中，将得到的细胞悬浮液接种到该T12.5烧瓶中。在37℃的CO2孵育器中开始培养，第二天培养基更换为不含Y-27632的AK03N培养基。期中隔2天后连续2天进行培养基更换，在培养的第6天进行传代。
2.不含酚红的角膜内皮替代细胞诱导用培养基的制备
使用DMEM/F12无酚红(Thermo Fisher/11039-021)作为基础培养基。将ITS-补充剂(Ventria/777ITS091)、IGF1(Orphan Pacific；Somazon注射/858100075、1mg/mL)、LIF(富士胶片和光纯药/125-06661)、IL-6(Miltenyi Biotec/170-076-161)、IL-11(Peprotech/AF-200-11)、TNFα(Miltenyi Biotec/170-076-178)，水溶性氢化可的松(Hydrocortone)注射液(Nichi-lko/620002208)作为添加物加入在基础培养基500mL中。
[表2]
试剂名 添加量 最终浓度
LIF 200 μL 10ng/mL
IL-11 250 μL 5ng/mL
IL-6 250μL 10ng/mL
TNFα 100μL 10ng/mL
ITS-补充剂 5mL 10mL/L
IGF1 5μL 10ng/mL
氢化可的松 20μL 200nM
3.大小的验证
使用表2中记载的角膜内皮替代细胞诱导用培养基，与专利文献3中记载的方法同样地从iPS细胞诱导CECSi细胞。诱导后第14天使用Accutase(Innovative CellTechnologies#AT104-100ML)回收细胞，并以1×107细胞/mL的细胞浓度悬浮在细胞保存液Bambanker(注册商标)hRM(日本Genetics#CS-07-001)中，用-80℃的深冻冰箱冷冻保存。将冷冻保存的角膜内皮替代细胞解冻，立即悬浮在下述记载的球状体形成用培养基中后，以1.2×108个细胞数接种在大型球状体形成袋(东洋制罐、WELLBAG)中，追加球状体形成用培养基以最终达到约400mL。通过将其在37℃孵育器中培养一天，形成CECSi细胞的球状体(细胞团)。用CTS Rotea逆流离心系统(Thermo Fisher)洗涤浓缩该CECSi细胞球状体。对浓缩后的一部分进行取样，用Accumax(Innovative Cell Technologies#AM105)对球状体进行酶处理，测定细胞数。使用此测定结果，并以细胞数为7.5×106细胞/mL的方式将球状体悬浮在细胞保存液Bambanker(注册商标)hRM中，每次分注40μL，在-70℃以下冷冻保存。解冻后，用作为移植用基材的基础培养基使用的DMEM/F12(Thermo Fisher/11330-032)稀释5倍(最终的细胞浓度为1.5×106细胞/mL)、使用iSpect DIA-10(岛津制作所)，测定等效面积直径(颗粒的面积和与颗粒面积相同的圆的直径)为30μm以上的球状体的个数。结果如图7所示。分析结果表明，球状体直径(球状体的等效面积直径)为约30～150μm，其中90％以上为约30～90μm范围内的细胞群。如果球状体直径在该范围内，则能够维持作为治疗用组合物的植入效果。
实施例5:球状体化的角膜内皮替代细胞的DMSO浓度研究
使用表2中记载的角膜内皮代替细胞诱导用培养基，与专利文献3中记载的方法同样地从iPS细胞诱导CECSi细胞。诱导后第14天使用Accutase(Innovative CellTechnologies#AT104-100ML)回收细胞，并以1×107细胞/mL的细胞浓度悬浮在细胞保存液Bambanker(注册商标)hRM(日本Genetics#CS-07-001，含10％DMSO)中，用-80℃的深冻冰箱冷冻保存。将冷冻保存的角膜内皮替代细胞解冻，立即悬浮在下述记载的球状体形成用培养基中，以2×108个细胞/袋的细胞数接种在大型球状体形成袋(东洋制罐、WELLBAG)中。通过将其在37℃孵育器中培养一天，形成CECSi细胞的球状体。将来自球状体形成袋的球状体化的CECSi细胞回收洗涤后，使用细胞保存液Bambanker(注册商标)hRM(日本Genetics#CS-07-001，含10％DMSO)，制备为7.5×106细胞/mL的细胞浓度。将制备好的球状体悬浮液以3×105细胞/40μL的细胞浓度分注在一次容器中，在-70℃以下冷冻保存。
<球状体形成培养基的制备>
使用DMEM/F12(Thermo Fisher/11330-032)或DMEM/F 12无酚红(Thermo Fisher/21041-025)作为基础培养基。将ITS-补充剂(Ventria/7777ITS091)、Y-27632(富士胶片和光纯药/039-24591)、IGF1(Orphan Pacific；Somazon注射/858100075，1mg/mL)作为添加物加入到基础培养基40mL中。
[表3]
试剂名 添加量 最终浓度
ITS-补充剂 400μL 10mL/L
Y-27632 40μL 100μM
IGF1 2μL 50ng/mL
使用各DMSO浓度(100％、50％、25％、10％、5％、2％、1％、0％)的移植用基材将冷冻保存后的CECSi细胞的球状体接种到48孔板(iMatrix511MG包被后)中，并使细胞粘附在板上。24小时后，除去培养基并用冰冻后的4％多聚甲醛对孔上的球状体进行固定。用DPBS洗涤两次孔后，加入封闭溶液(含有10％正常驴血清的PBST(10％NDS/PBST))，进行30分钟的封闭。然后，以下述抗体量在室温下进行1小时的一次抗体反应。
·兔抗人ZO-1；Invitrogen,40-2200,1:500,0.5μL/孔
·鼠抗人Na,K-ATPaseα1；Novus，NB300-146,1:500,0.5μL/孔
·封闭溶液(10％NDS/PBST)，0.25mL/孔
接着，将孔用DPBS洗涤2次后，以下述抗体量在室温下进行1小时的二次抗体反应。
·驴抗兔Cy-3，Jackson，711-165-152,1:200，1.25μL/孔
·驴抗小鼠Alexa flour488，Invitrogen，A21202,1.67μL/孔
·DAPI，1:1000,0.25μL/孔
·封闭溶液(10％NDS/PBST)，0.25mL/孔
然后，用PBS洗涤2次后，加入封固剂，用荧光显微镜观察。如果移植时的DMSO浓度为5％以下，则可以确认有植入能力和紧密连接形成能力。
试验例2:使用FCM的CECSi细胞表面标记物的筛选
使用人细胞表面标记物筛选板(Human Cell Surface Marker Screening Panel，Lyoplate)，通过流式细胞仪(BD Biosciences，BD LSRFortessaTM X-20)分析CECSi细胞中细胞表面抗原的表达，实施筛选。数据分析使用BD FACSDiva软件ver.8.0.1(Becton,Dickinson，美国BD公司)。
准备3批CECSi细胞(Lot.2020F1，Lot.2020G01，Lot.2020I24)，分别进行规定的抗体反应，在FCM测定之前适量加入7-AAD(BD Biosciences#559925)，对细胞进行染色。AF647(Alexa Fluor 647)检测出80％以上的为强阳性(◎)，检测出10％以上且小于80％的为阳性(○)，5％以上且小于10％的为弱阳性。
其结果发现了CD24作为CECSi细胞中的特征性细胞表面标记物。
[表4]
标记物 Lot.2020F1 Lot.2020G01 Lot.2020I24
缓冲液 — — —
CD24 ◎ ◎ ◎
试验例3:B2M表达量比较
根据DNA微阵列，使用从海外供体研究用角膜采集的真正的人角膜内皮细胞、iPS细胞(Ff-I01s04)、CECSi细胞，进行Agilent Technologies公司制造的DNA微阵列分析(SurePrint G3人GE微阵列8x60K Ver.3.0)，全面分析了基因谱，并根据其结果比较了构成人类白细胞抗原(HLA)的因子之一的β2微球蛋白(B2M)的表达量。显示出：与人角膜内皮细胞相比，IPS细胞和CECSi细胞的B2M表达量相对较低(图3)。因此，在异体移植时，CECSi细胞具有比人角膜内皮细胞更不易引起排斥反应的特征。
实施例6：验证酚红对球状体形成的影响
在填充有球状体形成培养基的中型球状体形成袋(东洋制罐、WELLBAG、容量20mL)中以2.5×106个细胞/袋的细胞数接种。通过将其在37℃孵育器中培养一天，形成CECSi细胞的球状体。将该CECSi细胞球状体收集到15mL离心管(住友电木#MS-90150)中，通过离心分离(条件：200g，5min，25℃)回收后，通过显微镜进行观察(图9)并测定总活细胞数(表5)。其结果显示，通过以DMEM/F12无酚红作为基础培养基的球状体形成培养基来形成球状体时，球状体生成数、总活细胞数均较多。通过使用不含酚红的培养基或附加去除酚红的步骤，可以容易形成球状体。
[表5]
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供能够冷冻保存，不会因解冻对细胞造成损伤，而且，不经过对解冻后的细胞的清洗或离心分离等附加过程就能够直接施用于患者的治疗用组合物，特别是移植治疗用组合物。本发明的治疗用组合物可用于在全世界约占角膜移植适应症病例50％的大疱性角膜病中角膜内皮替代细胞的移植。
本申请以在美国申请的美国临时专利申请63/219086(申请日：2021年7月7日)和美国临时专利申请63/320846(申请日：2022年3月17日)为基础，其内容全部包含在本说明书中。

Claims (27)

1.一种治疗用组合物，其包括具有CD24阳性表型的角膜内皮替代细胞，且任选地还包括酚酞衍生物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其还包括冷冻保护剂。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，组合物中的DMSO浓度为1-10％。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中，酚酞衍生物选自酚磺酞(酚红)、酚酞、溴酚蓝、异戊酰酚酞、乙酰酚酞、酚酞二丁酸酯、酚酞二磷酸酯、酚酞二硫酸酯、酚酞葡糖醛酸、酚酞单-β-葡糖苷酸、酚酞单-β-葡糖醛酸、酚酞单磷酸酯和甲酚红。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中，酚酞衍生物为酚红。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中，组合物中的酚红浓度为1～20mg/L。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的组合物，其中，组合物中的细胞浓度为0.5×106～10×106细胞/mL。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的组合物，其是细胞球状体悬浮液的剂型。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，组合物中所含的细胞群包含等效面积直径为30μm以上的球状体，所述球状体中50％以上的等效面积直径为30～90μm。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的组合物，其中，角膜内皮替代细胞源自干细胞。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中，干细胞是多能干细胞。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中，多能干细胞源自iPS细胞(包括通过基因编辑或基因导入赋予了附加功能的细胞)。
14.根据权利要求13所述的组合物，其B2M表达量低于人角膜内皮细胞或培养的内皮细胞。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的组合物，其用于移植。
16.根据权利要求15所述的组合物，其用于移植到前房内。
17.一种治疗用组合物的制造方法，其包括：在冷冻保护剂的存在下、以-20℃以下冷冻的角膜内皮替代细胞的细胞悬浮液或细胞球状体悬浮液中加入包括酚酞衍生物的移植用基材的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，角膜内皮替代细胞具有CD24阳性表型。
19.一种治疗用组合物，其特征在于，其含有源自干细胞的角膜内皮替代细胞，该治疗用组合物的未分化细胞残存率小于1％。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述角膜内皮替代细胞具有CD24阳性表型。
21.根据权利要求19或20所述的组合物，其中，未分化细胞残存率为0.1％以下。
22.根据权利要求19～21中任一项所述的组合物，其中，干细胞为多能干细胞。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中，多能干细胞源自iPS细胞(包括通过基因编辑或基因导入赋予了附加功能的细胞)。
24.根据权利要求19～23中任一项所述的组合物，其B2M表达量低于人角膜内皮细胞或培养的内皮细胞。
25.根据权利要求19～24中任一项所述的组合物，其中，通过未分化细胞标记物的表达谱来评价未分化细胞残存率。
26.根据权利要求19～25中任一项所述的组合物，其用于移植。
27.根据权利要求26所述的组合物，其用于移植到前房内。
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