CN117887845A - Stk24在肝癌放疗敏感性评估及放疗增敏中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测评估肝癌放疗敏感性的试剂盒，包括检测STK24基因表达水平的引物和/或检测STK24蛋白含量的试剂。本发明对通过大量研究和筛选，发现STK24是一个与肝癌放疗耐受极为相关的基因，在临床回顾性研究分析和体内外功能分析中发现，STK24较高的表达水平与放疗后肿瘤退缩不良存在明显的正相关性，可以用以预测肝癌放疗耐受以及敏感程度，为患者接受术前治疗的联系提供提前评估。本发明通过揭示STK24基因与肝癌放疗耐受的关联性，其对于解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题，更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为人类攻克肝癌提供了一个新的药物治疗靶点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及STK24在肝癌放疗敏感性评估及放疗增敏中的应用。
背景技术
原发性肝癌(Primary Hepatocellular carcinoma，PHC)是目前第四位常见恶性肿瘤及第二位肿瘤致死病因，严重威胁人民的生命和健康。PHC的治疗方法主要包括肝切除术、肝移植术、局部消融治疗、放疗、肝动脉化疗栓塞(TACE)及全身治疗等多种手段。然而，PHC发病隐匿，确诊时大部分患者已达中晚期，并且伴有多发病灶及并发肝硬化等诸多因素，能获得手术切除机会的患者仅占20％-30％。放疗是针对无手术切除或局部消融治疗适应症患者的一个主要方法，可改善局部控制率，明显延长生存时间；也可减轻淋巴结、肺、骨、脑或肾上腺转移所致疼痛、梗阻或出血等症状；一部分无法手术切除的肿瘤放疗后缩小或降期，可转化为手术切除。
然而，由于放疗在杀灭肿瘤细胞的同时，也会对肝脏正常组织造成损伤，肝脏放射性损伤后会造成诸多不利影响，藉此，放疗方案的剂量设计就不得超过周围正常组织耐受剂量，这样就会使肿瘤照射剂量不足，最终导致疗效不佳。因此，肿瘤对放疗的敏感性是影响患者预后的重要因素。
随着现代精确放疗技术的迅猛发展，以三维适形放疗(3D-CRT)、调强适形放疗(IMRT)与立体定向放疗(SBRT)等新技术为代表的放射治疗手段，联合手术、肝动脉栓塞化疗(TACE)、系统性药物及免疫治疗已然成为原发性肝癌肝内或肝外病灶治疗的重要组成部分。近年来，国内外学者陆续报道了新放疗技术在疗效上的独特优势：放疗后3年生存率可达30％左右；经过预测，65％的原发性肝癌患者在疾病进展的某一或某些阶段需要接受放疗。藉此，NCCN指南及CSCO指南均推荐放疗(根治性或者姑息性)作为原发性肝癌的标准治疗方案。具体在放疗剂量的选择上，一般采用常规分割放射(2Gy/天，5次/周，总剂量为50-62Gy)方式，这种长程小剂量放疗可以实现对正常肝组织的放射剂量维持在限量以下，又能明显杀伤靶区内肿瘤；然而，对于需在短期内明显控制肿瘤进展的患者，更适用于大分割放射(5Gy/次，3次/周，总剂量为50Gy)短程治疗模式，这种方式会使肿瘤退缩较快，症状改善明显，但是对正常肝脏的放射损伤较大。
射线对正常肝组织的照射剂量累积到一定程度会造成患者在治疗期间出现不良反应，较为严重的直接影响到放疗方案的执行。另外，在放疗结束后一部分患者还会发生典型的或非典型的放射性肝病(RILD)，以上这些都会给预后带来诸多不利影响。因此，需要寻找解决方案来实现“既安全，疗效又能保证”的要求，如何提高放疗敏感性进而减少放疗剂量和次数，是目前亟需解决的临床问题。一方面要在技术上精进，实现更加精准的定位和设计；另一方面，就是要筛选鉴定出介导肝癌放疗抵抗的关键靶点，并且基于其作用机制发展一系列干预策略，用于提升肝癌放疗敏感性。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中利用治疗前临床分期来预估放化疗敏感性所存在的局限性，从而提供了一种用于检测评估癌症放疗敏感性的试剂盒。通过检测体内生物标记物STK24的表达情况，从而预期放疗耐受情况，为后期的治疗方案的制订以及预后评估提供辅助诊断依据。
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
本发明第一方面提供了一种用于检测癌症放疗敏感性和/或疗效的试剂盒，包括检测STK24基因表达水平的引物和/或检测STK24蛋白含量的试剂；以及PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。
作为优选地，所述检测STK24基因表达水平的引物选自下列引物对中的至少一对：
引物对1：上游引物序列如SEQ ID NO：1(5’-GACATTGCAGCACTGGTGAC-3’)所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2(5’-CCAAAGGAGCCCTTCCCAAT-3’)所示；
引物对2：上游引物序列如SEQ ID NO：3(5’-GGCTTTGGGTTAGGGAGAGT-3’)所示，下游引物序列如SEQ ID NO：4(5’-GTCAGTAACCCCCTTCTCGC-3’)所示。
作为优选地，所述检测STK24蛋白含量的试剂选自STK24单克隆抗体和/或STK24多克隆抗体。
作为优选地，所述检测STK24蛋白含量的试剂选自Anti-STK24antibody(Abcam，ab96705)。
作为优选地，所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。
作为优选地，所述癌症为肝癌。
本发明第二方面提供了一种检测STK24表达水平的试剂在制备用于检测癌症放疗敏感性和/或疗效预测的组合物中的应用。
作为优选地，所述检测STK24表达水平的试剂包括检测STK24基因表达水平的引物和/或检测STK24蛋白含量的试剂。
作为优选地，所述检测STK24基因表达水平的引物选自下列引物对中的至少一对：
引物对1：上游引物序列如SEQ ID NO：1(5’-GACATTGCAGCACTGGTGAC-3’)所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2(5’-CCAAAGGAGCCCTTCCCAAT-3’)所示；
引物对2：上游引物序列如SEQ ID NO：3(5’-GGCTTTGGGTTAGGGAGAGT-3’)所示，下游引物序列如SEQ ID NO：4(5’-GTCAGTAACCCCCTTCTCGC-3’)所示。
作为优选地，所述检测STK24蛋白含量的试剂选自STK24单克隆抗体和/或STK24多克隆抗体。
作为优选地，所述检测STK24蛋白含量的试剂选自Anti-STK24antibody(Abcam，ab96705)。
作为优选地，所述癌症为肝癌。
本发明第三方面提供了一种组合物在制备检测癌症放疗敏感性和/或疗效预测的试剂盒中的应用，所述组合物包括检测STK24基因表达水平的引物和/或检测STK24蛋白含量的试剂。
作为优选地，所述检测STK24基因表达水平的引物选自下列引物对中的至少一对：
引物对1：上游引物序列如SEQ ID NO：1(5’-GACATTGCAGCACTGGTGAC-3’)所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2(5’-CCAAAGGAGCCCTTCCCAAT-3’)所示；
引物对2：上游引物序列如SEQ ID NO：3(5’-GGCTTTGGGTTAGGGAGAGT-3’)所示，下游引物序列如SEQ ID NO：4(5’-GTCAGTAACCCCCTTCTCGC-3’)所示。
作为优选地，所述检测STK24蛋白含量的试剂选自STK24单克隆抗体和/或STK24多克隆抗体。
作为优选地，所述检测STK24蛋白含量的试剂选自Anti-STK24antibody(Abcam，ab96705)。
作为优选地，所述癌症为肝癌。
本发明第四方面提供了STK24抑制剂在制备提高癌症放疗敏感性的产品中的应用。
作为优选地，所述STK24抑制剂选自基于STK24设计的shRNA、sgRNA、siRNA中的一种或多种。
作为优选地，所述shRNA序列选自SEQ ID NO：5(5’-CCGGGCAGGGTTTGTCATTAATAATCTCGAGATTATTAATGACAAACCCTGCTTTTT-3’)、SEQ ID NO：6(5’-CCGGACAGAGACATTAAAGCGGCCACTCGAGTGGCCGCTTTAATGTCTCTGTTTTTT-3’)中的一种或多种；所述siRNA序列选自SEQ IDNO：7(5’-GCAGGGTTTGTCATTAATAAT-3’)、SEQ ID NO：8(5’-ACAGAGACATTAAAGCGGCCA-3’)中的一种或多种；所述sgRNA序列选自SEQ ID NO：9(5’-CGTGCAGTACCAGTTCGAGA-3’)、SEQ IDNO：10(5’-CGCTCCATTAACGTCACAAG-3’)中的一种或多种。
作为优选地，所述癌症为肝癌。
应理解的是，在没有特别说明的情况下，在本发明上下文中，所述引物和/或引物对是指用于在PCR中合成STK24基因cDNA链的PCR引物，从而用于检测STK24基因mRNA的表达水平。除本发明所列出的引物和/或引物对外，本领域技术人员完全有能力根据STK24的基因序列采用包括但不限于分子生物学等本领域的常规方法手段进行相应引物和/或引物对的设计，并通过常规实验手段对所设计的引物和/或引物对进行筛选，只要能够实现特异性检测STK24表达水平即可。所述STK24抑制剂是指能够特异性下调STK24表达水平和/或其成熟mRNA的转录水平和/或STK24蛋白表达水平或活性的物质，例如采用反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、sgRNA、antagomiRs、miRNA海绵、miRNA Erasers、Target Masking和/或多靶点等方法以下调STK24表达水平和/活性，只要是能够实现STK24的水平和/或活性降低均可。
激酶(Kinase)是催化高能供体分子将磷酸基团转移到特定底物的一类生物化学酶系，研究显示，它们往往在肿瘤的发生、发展及应激性防御等过程中发挥重要的作用，因此，常常作为药物靶标开发应用。发明人在前期的研究工作中，利用转录组学分析发现，放疗后未退缩的患者肿瘤中众多激酶基因相较于放疗前，出现了明显的上调。提示这些上调的激酶中可能参与放疗耐受调控。利用sgRNA文库结合二代测序构建高通量筛选模型筛选功能基因，是一种广泛公认且行之有效的方法。对此发明人选择肝癌细胞，构建激酶sgRNA文库(2614个sgRNA序列，靶向698个激酶基因)进行放疗耐受基因高通量筛选，在体内外分别设置三种放射组和非放射组的对照模型，进行二代测序分析后，最终筛选出了可能与放疗耐受相关基因STK24，初步推测STK24的表达下调可能使肝癌细胞对放疗增敏。
进一步地，发明人在体外细胞水平进行了功能验证，在肝癌细胞中，经放射干预后，发现稳定敲STK24能显著提升放疗敏感性。在HT29细胞中进一步验证功能，发现稳定敲除STK24均能增敏放疗。此后的体内实验也验证了STK24与放疗耐受的相关性。基于以上功能结果可以明确STK24为肝癌放疗耐受相关基因。
本发明相对于现有技术具有如下技术效果：
(1)本发明对通过大量研究和筛选，发现STK24是一个与肝癌放疗耐受极为相关的基因，在临床回顾性研究分析和体内外功能分析中发现，STK24较高的表达水平与肿瘤退缩不良存在明显的正相关性，可以用以预测肝癌放疗耐受以及敏感程度，为患者接受术前治疗的联系提供提前评估。
(2)本发明通过揭示STK24基因与肝癌放疗耐受的关联性，其对于解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题，更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为人类攻克肝癌提供了一个新的药物治疗靶点，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。
附图说明
图1为CRISPR-sgRNA激酶文库筛选STK24作为肝癌放疗耐受型激酶的流程图。
图2为肝癌细胞Huh7中敲除STK24对放疗敏感性影响的结果示意图。
图3为肝癌细胞SNU449中敲除STK24对放疗敏感性影响的结果示意图。
图4为肝癌细胞Huh7中过表达STK24对放疗抵抗影响的结果示意图。
图5为肝癌细胞SNU449中过表达STK24对放疗抵抗影响的结果示意图。
图6为STK24对MHCC97H荷瘤小鼠放射治疗肿瘤生长体积影响示意图。
图7为STK24对MHCC97H荷瘤小鼠放射治疗生存情况影响结果示意图。
图8为STK24敲除对DNA损伤的同源重组修复效率影响的结果示意图。
图9为STK24过表达对DNA损伤的同源重组修复效率影响的结果示意图。
图10为肝癌细胞SNU449中敲除STK24对同源重组修复效果指征蛋白细胞核内分布影响的结果示意图。
图11为肝癌细胞Huh7中敲除STK24对同源重组修复效果指征蛋白细胞核内分布影响的结果示意图。
图12为肝癌细胞MHCC97H中敲除STK24对同源重组修复效果指征蛋白细胞核内分布影响的结果示意图。
图13为STK24对肝癌患者放疗后生存情况影响示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包Huh7、SNU 449及MHCC97H等细胞系均按照现有技术进行培养，所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心(武汉)短串联重复分析鉴定，并使用PCR检测试剂盒(上海Biothrive Sci)验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。对于临床标本的使用，均与患者签署了知情同意书，相关程序及方法符合医学伦理学要求以及药物临床试验质量管理规范。本发明所使用的实验方法，例如DNA提取、全基因组测序、引物设计、免疫组化、Western blot、细胞实验、动物实验等均为本领域的常规方法和技术。
生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有体外实验至少重复三次，动物实验重复两次。数据采用GraphPad Prism 8.0或SPSS22.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。
实施例1肝癌放疗抵抗相关激酶的筛选与鉴定
激酶(Kinase)是催化高能供体分子将磷酸基团转移到特定底物的一类生物化学酶系，研究显示，它们往往在肿瘤的发生、发展及应激性防御等过程中发挥重要的作用，因此，常常作为药物靶标开发应用。申请人团队在前期的研究工作中，利用转录组学分析发现，放疗后未退缩的患者肿瘤中众多激酶基因相较于放疗前，出现了明显的上调。这提示这些上调的激酶中可能参与放疗耐受调控。据此，在肝癌细胞(Huh7)中，利用激酶-sgRNA文库开展放疗耐受的功能筛选：构建含有激酶sgRNA文库(2614个sgRNA序列，靶向698个激酶基因)的稳定细胞株(混合式，保证每个细胞中含有1条sgRNA)，然后分别对小鼠移植瘤或细胞放射处理。随后，通过分析放疗后残存文库细胞中sgRNA拷贝数下调对应的基因，并且设定了筛选条件：|Log2(Fold Change)|＞2，捕获到的sgRNAs条数＞2，且在三个治疗方案中均满足，旨在发现与放疗耐受相关的激酶。结果发现1个最符合筛选条件的激酶：STK24，它可能与放疗耐受相关的激酶。初步推测TPK1表达下调能提升下咽癌的放疗敏感性。
进一步地，为了明确STK24与肝癌发生发展尤其是放疗敏感性之间的相关性，利用全基因组sgRNA文库对肝癌细胞放疗耐受相关基因进行筛选和验证，相关流程示意图参见图1，具体步骤如下：
(1)将激酶sgRNA文库(2614个sgRNA序列，靶向698个激酶基因)利用慢病毒载体转染至肝癌细胞(Huh7)中。
(2)经过嘌呤霉素稳定筛选后，将细胞分为实验组和对照组，其中实验组采用图1中的方式进行射线放射处理，对照组不进行处理。
(3)放射处理完成后按照图1中的细胞收取时间，提取细胞全基因组DNA进行PCR扩增，富集sgRNA后进行高通量二代测序分析后，采用MAGeCK分析法进行分析，筛选出可能的放疗耐受相关基因，具体筛选条件如下：
(a)log2(fold change)＜-2.0；
(b)捕获到的sgRNAs条数＞2；
(c)在三个治疗方案中均满足。
筛选结果如图1所示。通过筛选发现，在放射后有关STK24的sgRNA拷贝数出现了显著降低，从而提示STK24可能与肝癌放疗耐受存在明显相关性，通过STK24基因的表达下调可能使肝癌细胞对放疗增敏。
实施例2STK24敲除或者过表达对肝癌细胞放疗敏感性的影响
(1)利用sgRNA(sg1序列如SEQ ID NO：9(5’-CGTGCAGTACCAGTTCGAGA-3’)所示、sg2序列如SEQ ID NO：10(5’-CGCTCCATTAACGTCACAAG-3’)所示)在Huh7及SUN449细胞中构建STK24敲除稳定细胞株。
(2)利用过表达质粒在Huh7及SUN449细胞中构建STK24过表达稳定细胞株。
(3)将对数生长期的细胞按1000/孔接种于6孔板。
(3)24小时后进行0-8Gy放疗干预；继续培养10～14天。
(4)弃培养基，每孔加入含0.5％结晶紫的甲醇1mL，染色30min；弃甲醇，用水清洗残留的甲醇，即可观察到细胞克隆；显微镜下观察，细胞数＞50个才计为一个有效克隆，计数各组的克隆总数。
结果如图2-5所示。结果显示，敲除STK24能够显著提高肝癌细胞及肝癌细胞对放疗的敏感性，即抑制细胞内STK24的表达能够有效提高放疗的治疗效果，抑制放疗耐受的产生(参见图2-3)。而过表达STK24则能显著提升肝癌细胞对放疗的抵抗程度(参见图4-5)，证明STK24的存在及其含量的多少与肝癌放疗抵抗程度成正相关性。
实施例3STK24对荷瘤小鼠放疗敏感性研究
(1)选取5周龄雌性BALB/c-nu/nu小鼠分为两组，其中一组于皮下注射正常MHCC97H(STK24-WT)细胞，另一组于皮下注射由sgSTK24(sg1，序列如SEQ ID NO：9所示，为5’-CGTGCAGTACCAGTTCGAGA-3’)慢病毒构建的STK24稳定敲除MHCC97H(STK24-KO)细胞。
(2)待成瘤后，将STK24-WT组小鼠随机分为两组，每组10只，分别为组1和组2；STK24-KO组小鼠同样随机分为两组，每组10只，分别为组3和组4。
(3)对组1和组3小鼠不作任何治疗处理，对组2和组4小鼠采用瘤区辐照方式(RS2000 X线辐射仪，源皮距以100cm为标准，采用中长程日均等剂量放射；非瘤区采用小鼠专用铅制配套容器遮挡)进行治疗，2Gy/天，每隔天治疗1次，连续治疗5次；治疗期间定期测量肿瘤体积，治疗后7周处死小鼠，剥离肿瘤，称重计算抑瘤率。
结果如图6所示。结果显示，对于未经放射治疗的小鼠，STK24敲除型荷瘤小鼠肿瘤生长速度、肿瘤体积相对于STK24野生型荷瘤小鼠并没有明显差别，二者差异无统计学意义；而在经过放射治疗后，STK24敲除型荷瘤小鼠相对于STK24野生型荷瘤小鼠肿瘤生长速度明显更慢，肿瘤体积明显更小，抑瘤率显著提高，二者差异具有统计学意义。由上述可知，单纯地抑制肝癌细胞内的STK24表达水平，并不能显著抑制肿瘤细胞的生长；然而，在进行对肝癌细胞放射治疗时，STK24的敲除则能够显著提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性，降低肿瘤细胞的生长速度和体积，明显提高了抑瘤效果，可有效防止放疗耐受的发生。
进一步地，选取新的BALB/c-nu/nu小鼠，重复上述成瘤及治疗实验，区别在于不对小鼠进行人工处死，而是观察各组小鼠生存情况。结果如图7所示，结果显示，STK24敲除型荷瘤小鼠总体生存情况相对于STK24野生型荷瘤小鼠并没有明显差别，二者差异无统计学意义。而在经过放射治疗后，STK24敲除型荷瘤小鼠相对于STK24野生型荷瘤小鼠总体生存时间显著延长，二者差异具有统计学意义。由上述可知，单纯地抑制肝癌细胞内的STK24表达水平，并不能有效提高荷瘤小鼠生存率；然而，在进行对肝癌细胞放射治疗时，STK24的敲除则能够显著提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性，增加治疗效果，延长小鼠的整体生存率，可有效防止放疗耐受的发生。
实施例4STK24对肝癌放疗后DNA双链断裂损伤的同源重组修复的影响
放射最直接的作用是导致DNA双链断裂(DSBs)，DSBs损伤修复主要存在两种机制，非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)修复。实验原理：同源重组修复HR报告质粒上的GFP基因不同位置的DNA两端带有限制性内切酶I-SceI的酶切位点，若受到I-SceI的酶切，则会产生双链断裂，从而模拟放疗造成的DSB损伤。在HR报告质粒中，是在GFP的1号外显子中间缺失了一段并在该位置插入了一段22bp的序列，该序列两端有限制性内切酶I-SceI的酶切位点，且质粒上存在1号外显子的同源序列(同源序列不含起始密码子)，因此在切口产生后，其将作为同源模板，以HR方式修复，修复完成的细胞表达GFP，发出荧光。将HR报告质粒pCMV-NLS-I-SceI质粒共同瞬时转染进细胞中(pCMV-DsRed可视情况使用)，24h后重新铺板，消化收集细胞，通过流式细胞仪检测荧光细胞的比例比例，即可反映相应通路的活性。结果如图8-9所示，在肝癌细胞中采用sgSTK24(sg1序列如SEQ ID NO：9(5’-CGTGCAGTACCAGTTCGAGA-3’)所示、sg2序列如SEQ ID NO：10(5’-CGCTCCATTAACGTCACAAG-3’)所示)敲除STK24能明显降低同源重组修复效率；然而在肝癌细胞中过表达STK24则能明显提升同源重组修复效率。这就说明STK24对肝癌细胞的同源重组修复效能有着明显的促进作用。
为了明确放射干预后RAD51在核内的定位与状态，在STK24野生型肝癌细胞与STK24敲除型(sg1)肝癌细胞中通过免疫荧光检测放射诱导下的foci(IR-induced foci，IRIF)情况，具体步骤如下：
(1)试剂配置：
封闭液：先用PBS配置0.3％Triton-X 100(v/v)，然后量取0.3％Triton-X-PBS950μL，加入正常羊血清50μL；
抗体稀释液：称取BSA 0.01g，用0.3％Triton-X-PBS 1mL将其溶解；
一抗：按照抗体说明书按比例用抗体稀释液配置一抗；
二抗：按1:1000的比例用抗体稀释液配置荧光二抗；
DAPI：用PBS将DAPI配置成1μg/mL。
(2)细胞处理：干预过程需在玻璃底培养皿中进行，干预结束后，弃培养基，用PBS清洗3次。
(3)弃PBS，加入多聚甲醛1mL，室温固定20min。
(4)弃多聚甲醛，加入PBS1mL，垂直摇床60rpm室温洗涤5min，重复3次。
(5)弃PBS，加入封闭液，37℃封闭1h。
(6)弃封闭液，加入一抗4℃孵育过夜。
(7)回收一抗，加入PBS1mL，垂直摇床60rpm室温洗涤5min，重复3次。
(8)弃PBS，加入二抗避光室温孵育1h。
(9)弃二抗，加入PBS1mL，垂直摇床60rpm避光室温洗涤5min，重复3次。
(10)弃PBS，加入DAPI，避光室温孵育2min。
(11)弃DAPI，加入PBS1mL，垂直摇床60rpm避光室温洗涤5min，重复3次。
(12)用激光共聚焦显微镜观察、拍照。
结果如图10-12所示，结果显示，放射干预后STK24敲除能明显减低RAD51在核内IRIF数量，且能持续存在一段时间。
实施例5STK24对放疗后肝癌患者生存情况研究
(1)选取中山大学附属第一医院肝癌患者放疗前活检样本77例；对于每个入选病例，患者入选要求为确诊肝细胞癌；既往未接受过放化疗，未接受手术；无肿瘤出血、急慢性感染等合并症状。对于所有纳入研究的病例，其临床病理资料均来自于中山大学附属第一医院病案报告，相应的随访资料来自于中心随访科。患者的肿瘤分级均按照UICC/AJCC(第八版)的标准分级。手术病人在术后两年内每三个月随访一次，术后三到四年内每半年随访一次，术后五年及以后每一年随访一次，随访记录患者复发/转移/死亡情况并记录日期。
(2)将活检新鲜组织包埋于石蜡封存，石蜡标本室温保存，切取的白片保存于4℃冰箱。实验时取出77例石蜡切片白片，经过二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、0.3％H2O2溶液去除组织中过氧化物酶、枸橼酸盐溶液微波修复、Invitrogen公司anti-STK24抗体(1：200)和相应种属二抗孵育、DAB与苏木素显色、盐酸酒精分化、梯度酒精脱水，二甲苯通透两次后，中性树胶封片。
(3)组织标本的染色评估由100-200×倒置显微镜拍照，整个组织面取5-10个视野/病例。评分方式：把染色的深浅分为阴性、弱阳性、阳性和强阳性，分别标记为0、1、2、3分。在显微镜下观察组织切片，评定各部分肿瘤组织所占的比例及各自的染色评分，然后进行加权，得到评分结果。
(4)根据77例LARC病例的总生存期数据，利用ROC曲线最高特异性和最强灵敏度的点来确定STK24的表达临界值(H-score＝5)，将STK24分为高表达和低表达两个等级，然后使用SPSS20.0软件中的Kaplan-Meier方法对病人预后进行分析。
其中高水平表达是指H-Score评分≥5；H-Score指免疫组化染色强度×阳性比率。
结果如图13所示，结果显示，肿瘤组织中低表达STK24(H-score＜5)的患者其总生存率显著长于肿瘤组织中高表达STK24(H-score≥5)的患者，进一步表明STK24高表达水平与肝癌放疗效果存在明显相关性，并且与不良预后正相关，阐明了STK24是肝癌新辅助放疗的耐受因素，能够指示患者对放疗的敏感程度。
由上述可以明确，STK24是一个与肝癌放疗耐受极为相关的基因，STK24较高的表达水平与肿瘤退缩不良存在明显的正相关性，可以用以预测肝癌放疗耐受以及敏感程度，为患者接受术前治疗的联系提供提前评估。同时，本发明通过揭示STK24基因与肝癌放疗耐受的关联性，其对于解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题，更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为人类攻克STK24提供了一个新的药物治疗靶点，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.检测STK24表达水平的试剂在制备用于检测癌症放疗敏感性和/或疗效预测的组合物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测STK24表达水平的试剂包括检测STK24基因表达水平的引物和/或检测STK24蛋白含量的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测STK24基因表达水平的引物选自下列引物对中的至少一对：
引物对1：上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；
引物对2：上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物序列如SEQ ID NO：4所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症为肝癌。
5.一种用于检测癌症放疗敏感性和/或疗效的试剂盒，其特征在于，包括检测STK24基因表达水平的引物和/或检测STK24蛋白含量的试剂；以及PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测STK24基因表达水平的引物选自下列引物对中的至少一对：
引物对1：上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；
引物对2：上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物序列如SEQ ID NO：4所示。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述癌症为肝癌。
8.STK24抑制剂在制备提高癌症放疗敏感性的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述STK24抑制剂选自基于STK24设计的shRNA、sgRNA、siRNA中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述癌症为肝癌。
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